INVESTIGACIN DE LA BIO-REMOCIN DE HIDROCARBUROS POR LAS

BACTERIAS INDGENAS AISLADAS

SUELOS CRUDOS CONTAMINADOS

resumen

El presente estudio describe la capacidad de degradacin de hidrocarburos de

dos cepas bacterianas aisladas de suelos contaminados con petrleo crudo. Se
aislaron dos cepas bacterianas nativas (Bs1 y Bs2) de suelos contaminados
alrededor de los depsitos de petrleo, Ahvaz, Irn. Se investigaron sus
capacidades para degradar diferentes hidrocarburos, incluyendo aceite de
oliva, petrleo crudo y alquitrn de hulla, utilizando la medicin del carbono
orgnico total (TOC) suplementado como nica fuente de carbono en el medio
mineral. Para identificar los aislamientos bacterianos, morfologa y
caractersticas bioqumicas junto con 16S rDNA anlisis fueron considerados.
Los resultados mostraron que la cepa Bs1 pudo consumir ms del 34% de
alquitrn de hulla, 61% de crudo y 81% de aceite de oliva durante 14 das de
incubacin. La capacidad de degradacin de hidrocarburos de Bs _ {2} fue de
24, 39 y 68% en presencia de alquitrn de hulla, aceite crudo y aceite de oliva,
respectivamente, como nica fuente de carbono. Adems, su cultivo mixto de
dos aislamientos llev a un aumento del 5% en su eficacia de biodegradacin.
La posterior caracterizacin morfolgica y bioqumica y los anlisis
filogenticos mostraron la estrecha relacin de Bs1 y Bs2 (aproximadamente
98 y 99%) con las cepas de Pseudomonas aeruginosa de CMG581 y BM8,
respectivamente.

Introduccin

La industria del petrleo es la columna vertebral de la economa de Irn, lo

reconoce como uno de los pocos pases con una gran cantidad de depsitos
subterrneos de petrleo. Por lo tanto, las actividades relacionadas con la
exploracin, refinacin y transporte de petrleo dan lugar a derrames y
acumulacin de grandes cantidades de petrleo crudo y otros contaminantes
del petrleo en los ambientes marinos y terrestres (Hassanshahian et al., 2012;
Zolfaghari Baghbaderani et al., 2012) . Adems, las repercusiones
impredecibles de los contaminantes del petrleo, el impacto de estos desechos
peligrosos en la salud humana es complicado debido a su descomposicin
incompleta a productos finales inofensivos, adquiriendo potenciales txicos y
carcingenos (Sathishkumar et al., 2008).

Teniendo en cuenta el impacto perjudicial de los hidrocarburos del petrleo en

los aspectos vivos de los ecosistemas, una preocupacin global ha aumentado
no slo entre las organizaciones de proteccin ambiental, sino tambin entre la
poblacin entera (Silva-Castro et al., 2013; Zolfaghari-Baghbaderani et al. ,
2012).
Este nmero insta a las empresas industriales asociadas al petrleo a
desarrollar tecnologas limpias y estrategias ecolgicas que destacan la
biorremediacin. La biorremediacin se define como el uso de microorganismos
para eliminar los contaminantes ambientales del agua y del suelo, a travs de
la degradacin completa de diferentes hidrocarburos en dixido de carbono y
agua o la conversin de ellos en subproductos inofensivos. Sin embargo, se
seala que las reas contaminadas con aceite contienen una amplia variedad
de compuestos estructuralmente diferentes, con un efecto de apoyo o de otro
modo sobre la microflora local, dependiendo de sus concentraciones
individuales y naturaleza (Das y Chandran, 2011).

El lodo aceitoso es un residuo recalcitrante muy complicado, compuesto por

diferentes aceites, grasas, slidos, compuestos orgnicos y metales. Existe
estructuralmente una gran diversidad entre los compuestos orgnicos, desde
las formas ms fcilmente degradables, tales como los alcanos lineales de
cadena corta (conocidos como alifticos) hasta los ms complejos y menos
degradables con uno o ms anillos cclicos (aromticos) como cicloalcanos,
benceno, tolueno , Xilenos, fenoles y, en la parte superior, hidrocarburos
aromticos policclicos (Bamforth y Singleton, 2005; Xu y Obbard, 2004). En
cuanto a la estructura muy compleja de algunos constituyentes de lodos
aceitosos, se han demostrado las interacciones sinrgicas entre los miembros
de las asociaciones de micro-flora y se ha favorecido sobre los cultivos puros
en la estrategia de bioaumentacin (Alvarez et al., 2011, Domde et al., 2007,
Maqbool Et al., 2012). El presente trabajo tiene como objetivo estudiar la
capacidad de degradacin de los dos aislamientos ms eficientes, incluyendo
Bs1 y Bs2, que fueron investigados en inoculacin pura y en mezcla con
medios minerales suplementados con diferentes hidrocarburos orgnicos.

Materiales y mtodos

Medio cultural

Agar nutriente (Oxoid) y composiciones de medios minerales de Merck,

Alemania

Fueron explotados para el enriquecimiento bacteriano respectivo y las etapas

experimentales. El medio mineral constaba de los siguientes constituyentes:
NH4Cl (1,95 g / l); NaCl

(0,85 g / l); Na _ {2} HPO _ {4} (0,24 g / l); KCl (0,05 g / l); MgSO _ {4} (0,01
g / l); Calcio

Cloruro de CaCl _ {2} (0,01 g / l); FeSO _ {4} (0,01 g / l); Y oligoelementos
(Monteiro et al.,

2009).
Recoleccin de muestras y aislamiento bacteriano Las muestras de lodo oleoso
y de suelo se recolectaron de los sitios de exploracin de petrleo en reas
desrticas alrededor de Ahvaz, al sur de Irn; Y se transfirieron al laboratorio
en botellas estriles.

Para aislar la comunidad bacteriana, se mezclaron 10 g de muestras de suelo

con 100 ml de agua destilada asptica en matraces de 250 ml y despus se
agitaron a 100 rpm durante 10 min.

Despus de la sedimentacin de los suelos, los sobrenadantes se diluyeron en

serie de 10 ^ {- 1} a 10 ^ {- 10}. De cada dilucin en serie, se colocaron 100
l en placas de agar nutritivo mediante una varilla de vidrio en forma de L.
Todas las placas, a continuacin, se incubaron a 32 C durante 72 h. Las
colonias aparecidas en placas de agar se ensayaron para poseer capacidad de
degradacin de hidrocarburos mediante cultivo en 100 ml de medio mineral
suplementado con 500 mg de alquitrn de crudo o de carbn como nico
carbono y fuente de energa. Las condiciones de cultivo para la primera etapa
se ajustaron como temperatura 32C, pH 8 y agitacin orbital a 100 rpm
durante un perodo de incubacin de dos semanas.

Optimizacin de la eficiencia de biodegradacin

Para ensayar la biodegradabilidad de los respectivos hidrocarburos de alquitrn

de hulla, aceite crudo y aceite de oliva, se prepararon 100 ml de medio mineral
en matraces de 250 ml que contenan 500 mg de cada hidrocarburo.
Posteriormente, se aadieron a los matraces 1 ml de cada aislado,
separadamente y ambos como co-cultivo con la turbidez de 0,5 McFarland (1,5
x 108 clulas / ml) como inculos iniciales. El control preparado con las mismas
condiciones, se consideran para los experimentos bacterianos, pero sin inculo
inicial. Simultneamente, todos los matraces se incubaron a 32 C durante dos
semanas en un agitador orbital con 100 rpm. Todos los experimentos se
realizaron por triplicado.

Crecimiento de la biomasa y medicin de la reduccin del sustrato

El ensayo de protena total se emple como indicador de crecimiento

bacteriano a travs del mtodo de protena Bradford cada dos das durante el
perodo de incubacin. Brevemente, se centrifugaron 1 ml de las muestras a
10000 rpm durante 10 min. Los sedimentos celulares se volvieron a suspender
en 1 ml de agua destilada y se digirieron con NaOH (0,3 M) sometindose en el
bao de agua a aproximadamente 60 C durante 90 minutos. Finalmente, la
absorbancia espectrofotomtrica para cada muestra se registr a 595 NM. Se
determin el contenido de protena total a travs de la comparacin de la curva
estndar preparada con albmina de suero bovino. La tasa de consumo de
hidrocarburos para cada colonia individual o cultivo mixto se midi usando el
ensayo de carbono orgnico total segn Walkley y Black (1934) con pequeas
modificaciones. El ensayo se modific a medida que el contenido restante de
carbono, que representa el hidrocarburo restado en los medios lquidos de
clulas libres, se oxid con una cierta cantidad de dicromato de potasio
concomitante de cido sulfrico al 98%, luego con la adicin de solucin
ferrosa 0,5 M (como agente de titulacin ) Y ferrozina (como indicador) se
determin indirectamente la cantidad de dicromato de potasio sin reaccionar.
De hecho, el catabolismo de carbono orgnico se evalu indirectamente
monitorizando la reduccin del carbono orgnico total en los sobrenadantes
simultneamente con el ensayo de protena total.

Identificacin de las colonias que degradan el aceite

La caracterizacin morfolgica y bioqumica se determin con referencia al

manual de bacteriologa determinante de Bergey (Holt et al., 1994).
Phylogenetic identificacin se realiz mediante 16S rDNA anlisis. En este
orden, el ADN genmico se extrajo a travs del fenol / cloroformo / alcohol
isoamlico de acuerdo con Sambrook et al. (2001). El fragmento del gen rDNA
16S se amplific mediante reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) con un
conjunto de cebador universal que inclua Fd1 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
') y Rd1 (5'- AGGAGGTGATCCAGCC-3'). La mezcla de amplificacin por PCR de
16 l contena el ADN bacteriano (de aproximadamente 200 ng), 1 l (3
unidades) de ADN polimerasa Taq, 5 l de tampn Taq (TAPS, pH 8,8, MgCl2 3
mM, KCl 50 mM), 5 l de mezcla de dNTP 2 mM y 5 l de cada cebador (10
M / l). El programa de amplificacin se fij durante 30 ciclos; Cada uno
consista en una desnaturalizacin a 96 oC durante 10 s, un recocido a 50 oC
durante 10 seg y un paso de extensin a 60 oC durante 4 min, seguido de un
paso de extensin final a 72 oC durante 5 min. Posteriormente, los productos
de PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se
visualizaron usando bromuro de etidio. Los fragmentos de ADN se secuenciaron
mediante un secuenciador (SEQLAB, Alemania). Finalmente, se compararon
todas las secuencias con secuencias de referencia de las bases de datos NCBI
(http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank) usando el software Blast. Phylogenetic
anlisis se realiz utilizando MEGA software de la versin 4 y la relacin
gentica se mostr en base a la 16S rDNA secuencia de genes de vecinos de
unin rbol con bootstrap valor de 1000 de replicacin.

Resultados y discusin

Identificacin bacteriana

Entre 6 colonias aisladas como bacterias biodegradables de aceite se

seleccionaron dos colonias que tienen una biodegradabilidad de alto potencial
para estudios adicionales. Las caractersticas morfolgicas y bioqumicas de
dos aislamientos se resumen en la pestaa 1, que corresponde a las del gnero
Pseudomonas. Adems, su 16S rDNA secuencias de alineaciones con referencia
secuencias presentes en NCBI indic su estrecha relacin con Pseudomonas
aeruginosa. Como se muestra en la Figura 1, las cepas Bs1 y Bs2 presentaron
una similitud del 98% con la cepa CMG581 y BM8 de P. aeruginosa y con
nuestras respectivas cepas bacterianas correspondientes (Bs1 y Bs2).

Tabla 1 Anlisis morfolgico, bioqumico y fisiolgico de bacterias aisladas de

reas contaminadas con aceite