Creacin de bioinsecticida utilizando como principio activo la 8-

endotoxina de Bacillus thuringiensis, introduciendo el gen que

codifica para esta endotoxina en cepas de E.colli

El estado de Yucatn es el mayor productor de leguminosas a nivel pennsula,

las plagas son el principal problema ya que daan a las plantas directamente al
alimentarse del follaje o las races, o indirectamente por transmisin de
patgenos mientras accionan sobre la planta. Varios insectos como Wiseana
spp, Costelytra zealandica, Teleogryllus commodus, Sminthurus viridis, Sitona
spp, Coleophora spp, Inopus rubriceps y Acyrthosiphon spp pueden causar
daos significativos.

Se pretende hacer la creacin de un bioinsecticida utilizando como principio

activo la 8-endotoxina de Bacillus thuringiensis, utilizando el gen que codifica
para esta endotoxina e introducindolo en cepas de E.colli para su procuccion
en masa.

Diseo experimental:

Crear un bioinsecticida utilizando la 8-endotoxina de Bacillus thuringiensis en

E.colli para su produccin en masa.

La 8-endotoxina de Bacillus thuringiensis es letal para larvas de insectos

lepidpteros y colepteros, entre otros. Su modo de accin es a nivel intestinal
provocando la lisis de las clulas epiteliales.

Las cepas bacterianas a utilizar sern: Escherichia coli como receptora de los
plsmidos que sern utilizados en los experimentos de transformacin.

Bacillus thuringiensis subsp kurstaki, que se usar como fuente del gen crylAd,
ya que esta cepa contiene nicamente el gen cry (endotexina) en forma
natural.

Paso 1 Delimitacin de los genes de inters:

Obtencin de secuencias de cry1Ac1 y cry3Aa1 (endotexinas).

Las secuencias de los genes de interes se obtendrn del Genbank mediante

Internet. Las claves de acceso para la bsqueda de secuencias son: para
crylAd, M11068 (Adang, et. al 1985) y para cry3Aa1, Y00420 0 (Hfte, et. al
1987).

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Pas 2 Diseo de oligonucletidos por medio de Bioinformtica:

Para los experimentos de PCR, se disearn oligodesoxirrbonucletidos

(oligos) que flanquearn cada dominio en sus extremos 5' y 3' y que a la vez
introducirn sitios nicos para enzimas de restriccin. Para este diseo se
utilizara el software OLIGO y AMPLIFY para analizar la capacidad de los oligos
para iniciar la PCR en un ensayo simulado de amplificacin gnica.

Paso 3 Delimitacin y amplificacin del gen de inters por medio de PCR:

Para introducir los sitios de restriccin en los lmites de cada gen, se usar la
Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR). Los oligos se sintetizarn en el
Instituto de Biotecnologa de la UNAM, (Cuernavaca, Mor.). Los ensayos se
harn por duplicado, a fin de obtener mayor cantidad de cada gen para las
manipulaciones subsecuentes. A todas las reacciones de PCR exitosas se les
eliminar el aceite y el ADN ser purificado.

PCR de cry3Aa1:Para las PCR de los dominios de cry3Aa1 se usar como

templado el plsmido denominado pBT3A2 purificado.

PCR de cry1Ac1: Para obtener la muestra del ADN templado se someter a una
lisis por ebullicin de las clulas de B. thuringiensis. Se colocar una asada de
un cultivo de 12 h de la cepa crecida en agar LB, y se hervir a bao mara
durante 10 min. De este lisado se tomarn 30 micro litros y se usarn para
montar la PCR.

Paso 4 Preparacin del ADN vector e inserto y verificacin mediante

electroforesis en gel de agarosa:

El plsmido pBT3A2 y los los dos genes en estudio, una vez purificados sern
restringidos con las enzimas Psfl (cry1Ac1) o H/ndIII (c/y3Aa1). Despus se
purificarn de nuevo y se verificar el xito de la restriccin observando la
linearizacin del pBT3A2 en un gel de agarosa. Se efectuar una segunda
restriccin de ambos genes y del vector, se purificar el ADN y se verificar el
funcionamiento de la enzima en un gel de agarosa.

Paso 5 ligamientos de los genes con el pBT3A2.

Se mezclarn los genes con el pBT3A2 en una proporcin 10:1 inserto.vector, y

se agregn 0.5 unidades de enzima ligasa. Se incubarn a 4C por 16 h. La
reaccin se detendr colocndola 10 min a 65. La mezcla del ligamiento se
usar para transformar clulas competentes de E. colli.

Paso 6 Introduccin del DNA recombinante (Plsmido) por propagacin

bacteriana a travs de choque trmico.

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Se coloca la poblacin de clulas de E. colli a un medio con una concentracin
salina alta y se somete enfriamiento, de manera que se permeabiliza la clula
y en ese estado introducir el material gentico. Introducimos en la clula el
ADN recombinante, obteniendo as una clula recombinante de E. colli.

Paso 6 Produccin en masa de las clulas de E. colli para el beneficio

industrial a travs de un proceso fermentativo.

Un proceso fermentativo es un esquema de procesos que nos permitan un

cultivo a gran escala de los MO de utilizacin industrial. Se utilizara un

fermentador que nos permite desarrollar el microorganismo modificado; tiene

que cubrir los requisitos esenciales, es necesario garantizar que estn los

nutrientes en contacto con las clulas, se aadir un sistema de generacin.

Clulas que hemos obtenido y que nos interesan: Estas clulas tienen que

seguir unos protocolos para que no cambien, a partir de una alcuota pequea

de estas, tenemos que generar un inoculo que tenga la cantidad exacta de

clulas y con una calidad contrastada.

Etapa final: purificacin. Se obtiene un caldo de fermentacin, con dos

elementos, las clulas y el sobrenadante de cultivo. Se Realizar la separacin

de estos dos elementos. Un vez separado, hay q tener en cuanta q nos

interesa, obtenemos las clulas. Primero se romper la biomasa. Con la clula

rota se vuelve a separar sobrenadante del resto.