PCR Real Time

Princpio do mtodo
Deteco de determinado fragmento de DNA amplificando-o (PCR normal) e emitindo fluorescncia
atravs de molculas especficas (exclusivo da PCR real time).

A principal vantagem da PCR em tempo real o monitoramento da quantidade de fluorescncia emitida pelos
fluorforos, que corresponde, na maioria das vezes, quantidade de fitas simples de DNA que foram
amplificadas em cada ciclo da PCR.

Fluofforos
Molculas que absorvem e emitem luz em um comprimento de onda especfico. So usados na PCR em
tempo real para emitir fluorescncia quando encontrar a sequncia de DNA que se procura.
Exemplos: SYBR Green, sonda TaqMan, Molecular Beacons

SYBR Green
um tipo de fluorforo que se liga entre fitas duplas de DNA, emitindo
fluorescncia nessas condies. Com a excitao da luz emitida pelo
termociclador as molculas emitem uma fluorescncia verde.

Material necessrio para a reao:

- Aparelho termociclador conectado a um computador
- Amostra de DNA
- Molculas SYBR Green
- Iniciadores (primers + DNA polimerase)
A reao se d atravs da abertura da fita dupla de DNA e posterior ligao dos primers sequncia
complementar da fita. Essa primeira formao de uma dupla fita j pode ser identificada pelo SYBR Green e
este ligar-se a ela, emitindo fluorescncia. Conforme a amplificao vai acontecendo, as fitas duplas formadas
vo sendo intercaladas pelo SYBR Green e aumentam a emisso de fluorescncia. Em cada ciclo que se inicia e
no qual acontece desnaturao do DNA para amplificao, as molculasde SYBR Green se desligam da fita
dupla (que foi desnaturada), e assim o sinal da fluorescncia diminui, voltando a aumentar aps a amplificao e
formao de novas fitas duplas.
V: baixo custo, facilidade de uso, sensibilidade.
D: ligao em toda fita dupla de DNA formada (incluindo produtos inespecficos e que no se procura),
podendo superestimar a concentrao do fragmento alvo.
O SYBR Green emite uma fluorescncia muito pequena quando no ligado ao DNA, que
descontada do valor final da amplificao pelo computador.

1. Desnaturao do DNA

2. Anelamento (ligao do primer)

3. Extenso da fita complementar e ligao do SYBR Green

TaqMan
um fragmento de DNA marcado com duas pores: Fluorforo (F), que
emitir a fluorescncia, e Quencher (Q), que aceita a energia emitira na
forma de luz por F e a transmite em forma de calor ou luz.

Material necessrio para a reao:

- Aparelho termociclador conectado a um computador
- Amostra de DNA
- Molculas TaqMan
- Iniciadores (primers + TaqDNA polimerase)
Durante a reao de PCR a sonda hibridiza a com a sequncia da fita simples de DNA complementar alvo para a
amplificao. No processo da amplificao a sonda degradada pela atividade de alongamento da cadeia
realizada pela TaqDNA Polimerase (sentido 53), separando as pores F e Q, o que resulta em um aumento da
intensidade da fluorescncia. Dessa forma a fluorescncia aumenta exponencialmente conforme a amplificao
acontece.
V:
D:
A reao com a sonda TaqMan considerada sensvel para determinar a presena ou ausncia de
sequncias especficas em um DNA. A Taq DNA polimerase proveniente da bactria termfila
Thermus aquaticus, sendo a enzima de eleio para a maioria
das aplicaes de PCR (Polymerase Chain Reaction), e com
uma temperatura tima de atividade de 75 C. Esta DNA
polimerase catalisa a sntese do DNA de 5'-3'. Por outro lado,
de 3'-5' no tem atividade exonuclesica e de 5'-3'. A enzima
proveniente de clulas de E. coli com o gene pol de T, aquat

Fluorforo emitindo luz

Molecular beacons
Oligonucleotdeos usados como sondas de fita
simples, que formam uma estrutura secundria
entre as extremidades 5 e 3estrutura chamada
haste-e-loop. O loop contm uma sequncia que
complementar sequncia alvo do DNA que se
estuda. J a haste formada pelo anelamento
(ligao) de duas sequncias complementares, mas
que no se ligam ao DNA em estudo. Um
fluorforo covalentemente ligado no final de uma
extremidade e um quencher na outra.
Material necessrio para a reao:
- Aparelho termociclador conectado a um computador
- Amostra de DNA
- Molecular beacons
- Iniciadores (primers + DNA polimerase)
A reao de amplificao vai acontecendo e conforme o aumento das molculas de DNA, os molecular beacons
vo se ligando e aumentando o sinal de fluorescncia.
Os molecular beacons no emitem fluorescncia quando livres em soluo ou na ausncia de alvos, entretanto,
quando a poro F separada de Q ocorre emisso de fluorescncia.
V: Somente emitem fluorescncia quando ligados sequncia alvo, podem ser fabricados em diferentes
cores de fluorescncia para diferentes alvos deteco de diferentes alvos numa mesma reao
(multiplex), extremamente especficos,
D:

Scorpions
Combina uma sonda ligada a um primer em uma nica molcula.
Na poro terminal 5 contm o fluorforo, e na poro terminal 3
Loop a cadeia do primer. Apresenta a mesma conformao de haste-e-
loop dos Molecular beacons. O loop contm a sequncia
complementar do alvo do DNA que se pesquisa. Um bloqueio
(blocker) une a molcula do quencher com o primer, e impede a
Haste DNA polimerase de estender a cadeia no sentido do loop.
Material necessrio para a reao:
- Aparelho termociclador conectado a um computador
- Amostra de DNA
- Sondas scorpions
- Iniciadores (primers + DNA polimerase)
A reao ocorre primeiramente pela ligao do primer ao DNA, atravs da sequncia complementar. Aps isso, a
DNA polimerase estende a cadeia, formando uma dupla fita. A seguir, aplicado calor para separao das duas
fitas, permanecendo assim a regio haste-e-loop ligada a fita simples que foi recm sintetizada. O calor tambm
permite a abertura do loop e ligao da sequncia deste com a sua complementar, que se encontra na fita recm
sintetizada.

V: altamente seletivos, aplicveis para PCR e genotipagem

D:
1. Aproximao do primer sequncia de DNA de fita
simples

2. Ligao do primer cadeia

3. Extenso da fita a partir do primer pela DNA polimerase

4. Fita j estendida (dupla)

5. Aumento da temperatura e separao das fitas

6. Abertura do loop, separao das pores F e Q e

emisso da fluorescncia

7. Ligao da sequncia do loop sua complementar na fita

recm formada
 PCR Real Time
Vantagens Desvantagens
No necessita de revelao (procedimentos ps No ideal para multiplex
reacionais, no gel de agarose, por exemplo)
No influenciada por amplificao no especfica Alto custo do equipamento
Baixo risco de contaminao no necessita da A padronizao requer alto treinamento
abertura do meio reacional para revelao
Ciclagem ultra rpida (30 minutos a 2 horas) menor Labilidade do DNA (altas temperaturas)
tempo de reao
Requer 1000x menos amostra que outros processos
Visualizao do sinal da amplificao em tempo real
Mais especfico, sensvel e reprodutvel
Coleta de dados na fase exponencial da reao

Aplicaes: as mesmas aplicaes da PCR com alguns acrscimos:

Quantificao de vrus (HIV, hepatite, herpes vrus simples, citomegalovrus)
Quantificao de expresso gnica
Eficcia de terapia medicamentosa
Medida de danos ao DNA
Deteco de patgenos
Genotipagem (discriminao de alelos):
o Trissomia e genes de cpia nica
o Gentipos com microdeleo
o Haplotipagem
o Diagnstico pr-natal atravs de clulas fetais
o Diagnstico de processos carcinognicos
Ensaios de exposio a radiao
Deteco de inativao de cromossomos X
Monitoramento de rejeio de transplantes

A quantificao acontece na fase

exponencial
 Ct = Cycle threshold parmetro utilizado
para a quantificao. o valor que indica o
Threshold (=limiar) Rn ciclo no qual um aumento significativo na
quantidade de amplificado (produto da
reao) primeiramente detectado

Rn = Diferena entre Rn+ (valor de

fluorescncia de todos os produtos gerados
na reao) e Rn- (valor de fluorescncia sem
amostra). o indicador da magnitude do
sinal gerado pela PCR. plotado contra o
nmero de ciclos para gerar Ct e a curva de
amplificao.

RESUMO
PCR Real Time: mtodo quantitativo que analisa fragmentos de DNA que se deseja estudar atravs da emisso
de fluorescncia por determinadas molculas (fluorforos).

Mtodos:
Deteco no-especfica
o SYBR Green
- Emite fluorescncia ao se ligar entre as fitas duplas de DNA formado
- Quando usar: ensaios que no requeiram especificidade, screening inicial antes de passar para
ensaios com sonda, quando o ensaio j est estabelecido e no sero formados produtos que no
aqueles que se deseja
- Quando no usar: ensaios de discriminao de alelos, multiplex, deteces em baixa escala
Deteco especfica
o Oligonucleotdeos marcados
TaqMan
- Se liga a determinada sequncia de DNA e ao ser hidrolisado pela TaqDNA polimerase emite
fluorescncia
-Mais especfico
Molecular Beacons
- Se liga a uma sequncia e j emite fluorescncia
Scorpions
- Um primer se liga sequncia, ocorre extenso da fita, separao e ligao da sequncia do
loop do DNA recm formado

POR QUE NO ESCOLHER PCR NORMAL:

- os gis de agarose so imprecisos e qualitativos (separao das molculas pelo tamanho)
- baixa sensibilidade, preciso e resoluo
- no automatizado
- resultados no numricos
- risco de contaminao
- no confivel quantitativamente