Universidad Autnoma de Sinaloa.

Facultad de Ciencias Qumico Biolgicas.

Materia:
Biologa Celular.
Alumno(s):
Aguirre Valencia Edmundo Elas.
Arellano Morales Emily Evelina.
Castrejn Ramrez Airam Aleydis.
Castro Lpez Hugo Csar.
Leal Armburo Lidia.
Mendoza Verdugo Michelle.
Snchez Barraza Alicia Yareli.
Grado: 2. Grupo: 5.
Maestro(a):
M.C. Ana Edith Ayala Rodrguez.
Equipo: 2.
Tema a investigar:
Tcnicas de tincin.

Culiacn Rosales, Sinaloa, a 03 de marzo del 2017.

Los microorganismos, concretamente las bacterias, pueden observarse directamente al
microscopio de campo claro. Sin embargo, debido al bajo contraste entre las clulas y su
entorno, estos procedimientos se utilizan en ocasiones muy limitadas, como por ejemplo
para la observacin de la movilidad bacteriana.
La tincin es un mtodo sencillo para incrementar el contraste entre la clula y su entorno
y por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Aunque los microorganismos vivos
se pueden observar directamente en fresco al microscopio ptico, la mayora de las veces
es necesario teirlos para que por medio del uso de colorantes, sea mucho ms fcil su
identificacin; adems, la presencia de ciertas estructuras, as como su reaccin a
determinadas tcnicas, nos permite clasificar a las bacterias.
Para poder teir cualquier muestra biolgica, se necesitan ciertos materiales y
procedimientos, como el colorante, el mordiente y la fijacin, aunque este ltimo aplica
para determinadas tcnicas de tincin.
Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a clulas, tejidos, fibras,
etctera. De acuerdo con su origen, se pueden dividir en: colorantes naturales, los cuales
son extrados de plantas o animales, y colorantes artificiales, que son aquellos de minerales
procesados y manipulados en el laboratorio. Qumicamente, el colorante est constituido
de un componente cromforo y un auxcromo.
El cromforo es todo grupo aislado, covalente e insaturado, que tiene una absorcin
caracterstica en la regin ultravioleta o visible. Los cromforos son principalmente grupos
funcionales con dobles y triples enlaces carbono-carbono, anillos aromticos, grupos
carbonilos, imino, diazo, nitro y enlaces entre carbono-y, siendo y un tomo con pares de
electrones libres.
Los auxcromos son grupos funcionales o radicales que constituyen una molcula y poseen
carga parcial positiva; su funcin es desplazar a los cromforos hacia longitudes de ondas
largas para aumentar la intensidad.
Los siguientes grupos funcionales son considerados auxcromos: grupo metilo, halgenos,
hidroxi, alcoxi y amino.
As pues, los colorantes tienen las siguientes funciones:
1. Permiten hacer visibles a los objetos microscpicos y transparentes.
2. Revelan su forma y tamao.
3. Muestran la presencia de estructuras internas y externas.
4. Producen reacciones qumicas especficas.
Adems, para que un colorante pueda ser llamado como tal, debe cumplir con los siguientes
requisitos:
1. Debe contar con la capacidad de reaccionar qumicamente con biomolculas, como
protenas, glicoprotenas, peptidoglicanos, lpidos, glicolpidos, lipoprotenas,
pigmentos, cidos pcticos y nucleicos.
2. Deben de ser capaces de preservar la estructura de los microorganismos una vez
utilizado.
3. De ser posible, mantener la integridad de las biomolculas presentes.
Algunos colorantes ms utilizados en las pigmentaciones de laboratorio son el cristal
violeta, el azul de metileno, la fucsina, verde malaquita, la safranina, rojo Congo, rosa de
bengala y la eosina.
En ocasiones se incorpora una sustancia a la solucin con el pigmento para intensificar su
coloracin; este aditivo se le denomina como mordiente. Una de sus funciones es
incrementar la afinidad de una muestra biolgica obtenida por un colorante en un
comienzo; otra es cubrir una determinada estructura del microorganismo a tratar, por
ejemplo: un flagelo, para darle mayor espesor y as facilitar su observacin despus del
teido. Ejemplos de mordientes comnmente manejados son el yodo lugol y el fenol.
Anteriormente se mencion que algunas tcnicas de tincin requieren un proceso conocido
como fijacin, que bsicamente se utiliza para preservar las estructuras celulares. Existen
dos tipos de fijacin:
Fijacin fsica: Tambin conocida como fijacin por calor, consiste en pasar el
portaobjetos, con la suspensin bacteriana extendida y seca, a travs de una llama
de un mechero. Este tipo de fijacin preserva la morfologa externa de los
microorganismos; pero no las estructuras internas.
Fijacin qumica: De manera contraria a la fijacin fsica, la fijacin qumica preserva
las estructuras internas y ofrecen mejores resultados.

Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tie del mismo
color y se utiliza un slo colorante (azul de metileno o tinta china); tincin diferencial,
cuando se visualiza ms de un color porque se utiliza ms de un colorante (Gram o Ziehl-
Neelsen); tincin especfica, cuando se utilizan anticuerpos marcados con una molcula
fluorescente para identificar una estructura celular en particular (cpsulas, esporas,
flagelos, etc.)

Tincin de Gram

Esta tincin diferencial fue propuesta por el medico dans Christian Gram que examinando
tejido pulmonar de enfermos fallecidos por neumona observ que la bacteria
Streptococcus pneumoniae, presente en los pulmones, retena el colorante conocido como
marrn Bismark (sustituido posteriormente por el cristal violeta), mientras que el tejido
pulmonar no era capaz de retener el colorante.
Es la tincin diferencial ms utilizada de forma rutinaria y prcticamente la primera prueba
a la que se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio. Proporciona una
informacin esencial, adems de sobre la forma, tamao y agrupacin celular, como es el
tipo y composicin de la pared que presentan las bacterias. La tincin de Gram divide a las
bacterias con pared del Dominio Bacteria en dos grandes grupos: bacterias con pared de
tipo gram positiva y bacterias con pared de tipo gram negativa.
La diferente estructura y organizacin de la pared celular en estos dos tipos de organismos
hace que ambos grupos respondan de manera distinta, as mientras las bacterias gram
positivas mantienen y conservan el complejo cristal violeta-iodo, las bacterias gram
negativas se decoloran rpidamente con la aplicacin del alcohol, admitiendo el colorante
de contraste que proporciona un color entre rosa y rojo que contrasta con el intenso color
violeta.
Se han propuesto diferentes explicaciones para justificar la respuesta de los
microorganismos a esta tincin, parece que la diferencia se debe tanto a la estructura fsica
como a la composicin de la pared celular, en bacterias gram positivas la gruesa capa de
pptidoglicano con abundantes entrecruzamientos parece contribuir a la retencin del
colorante fundamental, cristal violeta, mientras que en bacterias gram negativas la delgada
capa de pptidoglicano junto con la abundancia de lpidos en la membrana externa de la
pared celular incrementan la porosidad y por ello, contribuyen a la prdida del colorante
fundamental despus de la decoloracin con alcohol.
Generalmente se utiliza al yodo lugol como mordiente en este mtodo; pero tambin se
recomienda utilizar metanol en lugar del yodo lugol, esto se debe a que se encuentra al
alcance de todos los laboratorios; es un reactivo reductor, deshidratador, y es clasificado
como fijador coagulante, de tal manera, coagula protenas y las hace insolubles, pero sin
desnaturalizarlas. Se preserva la arquitectura de la pared celular y evita la sobrecoloracin.
Adems mantiene la integridad de los cidos nucleicos.

Tincin de Ziehl-Neelsen

Permite poder distinguir aquellos microorganismos cuya coloracin resiste la accin de

alcoholes y cidos suaves (cido-alcohol resistentes) de otros que no resisten la
decoloracin (no cido-alcohol resistentes).
Dentro de las bacterias cido-alcohol resistentes encontramos dos importantes patgenos:
Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, microorganismos responsables de la
tuberculosis y la lepra respectivamente.
Estas bacterias son resistentes al tratamiento con alcoholes y cidos suaves conservando el
colorante fundamental, mientras que organismos que no posean esta caracterstica son
rpidamente decolorados y pueden teirse con el colorante de contraste en este caso azul
de metileno.
En este tipo de tincin se utiliza al fenol como mordiente. El papel del cido carblico (fenol)
como mordiente es definitivo porque fomenta la penetracin de la fucsina en los pptido-
glucolpidos bacilares; la hace ms liposoluble y menos hidrosoluble. El alcohol en que se
disuelve la fucsina tambin es esencial para obtener la cido-alcohol resistencia (AAR); pero
su forma de actuar es menos conocida. El mecanismo de la AAR es un fenmeno doble que
requiere la penetracin de la fucsina al citoplasma bacilar, as como su interaccin qumica
con los cidos miclicos de los pptido-glucolpidos presentes en la pared celular de las
micobacterias. Esta reaccin impide la salida de la fucsina atrapada en el citoplasma bacilar.
Se aseguran as la brillantez y el color rojo intenso de los grmenes que resisten la
decoloracin con alcohol y cidos.
Tincin de cpsulas

La cpsula es una estructura que rodea externamente la pared de algunos microorganismos

y constituye una barrera fsica que protege a la clula del ambiente externo,
proporcionando numerosas ventajas a los microorganismos que son capaces de sintetizarla,
por ejemplo, en las bacterias patgenas la cpsula permite la adhesin al hospedador o
protege de la fagocitosis, en otros casos incrementa las posibilidades de sobrevivir en
condiciones de desecacin en bacterias que colonizan ambientes naturales, o bien
previenen el ataque de algunos virus, en otras ocasiones son importantes factores de
virulencia en algunas especies clnicamente relevantes como es el caso de Streptococcus
pneumoniae y tambin proporcionan importantes ventajas al facilitar la adhesin a
superficies slidas. El procedimiento para la realizacin de la tincin de cpsulas es el mismo
que se ha explicado para la tincin negativa. Las cpsulas aparecen rodeando a las clulas
como estructuras sin teir sobre un fondo oscuro.

Tincin de esporas

Una endospora es una estructura especial, resistente y latente que se forma dentro de una
clula y que protege a una bacteria de las condiciones ambientales adversas. Las
endosporas no se tien con los mtodos comunes, como la tincin simple o la tincin de
Gram, porque estos colorantes no atraviesan sus paredes.
La ms utilizada para este fin es la tincin de Schaeffer-Fulton para endosporas. Se aplica el
colorante primario verde malaquita a un extendido fijado con calor y se le calienta hasta la
emisin de vapores durante alrededor de 5 minutos. El calor ayuda a que el colorante
atraviese la pared de la endospora. Luego se lava el preparado con agua durante cerca de
30 segundos para eliminar el verde malaquita de todas partes de la clulas salvo las
endosporas. A continuacin se aplica sobre el extendido safranina, un colorante de
contraste, para teir las porciones de la clula distintas de las endosporas.

A pesar de que existen estas tcnicas de tincin para diferenciar entre un microorganismo,
existen sustancias biolgicas que pueden ser detectadas o clasificadas sin utilizar pigmentos
debido a su composicin qumica. En el campo de la criminalstica se utiliza mucho un
compuesto para visualizar residuos de sangre denominado Luminol.
El luminol (C8H7N3O2) es un derivado del cido ftlico, slido a temperatura ambiente, de
color amarillo plido, soluble en la mayora de solventes orgnicos y ligeramente soluble en
agua. Es una molcula sencilla, sin centros asimtricos, que se prepara comercialmente a
partir del cido 3-nitroftlico mediante la condensacin de este cido con hidracina (N2H4).
Sin embargo, la aplicacin directa del luminol a un rea con sangre no produce la
luminiscencia.
Para que ocurra la luminiscencia es necesario activar al luminol. Esto ocurre preparando
una solucin acuosa de luminol con un agente oxidante, como el agua oxigenada (H2O2), y
un hidrxido que proporcione un medio bsico. En presencia de estas sustancias la
oxidacin del luminol ocurre lentamente.
En un primer paso, la base atrapa los hidrgenos unidos a los tomos de nitrgeno. Luego,
la reaccin del dianin resultante con oxgeno molecular permite el intercambio de las
amidas por los correspondientes steres, mediante una adicin cclica. Este paso est muy
favorecido dado que se forma nitrgeno molecular, un muy buen grupo saliente debido a
su mnima reactividad. El perxido formado, muy inestable, se rompe dando lugar al anin
3-aminoftalato. Sin embargo, tal ruptura del perxido produce esta molcula en estado
excitado. Esto origina que, cuando la molcula alcanza su estado basal, libera energa en
forma de luz, de una coloracin azul.
Otra sustancia en la que se aprovecha su composicin qumica para detectarla es el semen.
El semen contiene dos aminocidos esenciales, que son el triptfano y la fenilalanina y otro
aminocido no esencial que es la tirosina. Estos tres aminocidos poseen anillos de
benceno, dichos anillos en presencia de luz ultravioleta pueden emitir cierta luminiscencia.
En inmunohistoqumica se hace mucho la deteccin de antgenos. Cuando un ser vivo es
sometido a un ataque bacteriano o de algn virus, el sistema inmune, en trminos de
sistema de defensa se activa en presencia de algn agente patgeno y manda a los
antgenos, que en este caso se llama antgenos a los anticuerpos que son enviados a atacar
a dicho agente patgeno, principalmente en los casos de los virus. Los antgenos
generalmente son de naturaleza protenica, dependiendo el tipo de antgeno se pudiera
utilizar cierta tcnica de tincin para detectarlo.
Bibliografa

Covadonga, A. M., De Silniz, M. I. y Serrano, S. (2010). Tcnicas bsicas de Microbiologa:

Observacin de Bacterias. Reduca (Biologa), 3(5), 15-38.
Lpez, L. E., Hernndez, M., Coln, C. A., Ortega, S., Cern, G. y Franco, R. (2014). Las
tinciones bsicas en el laboratorio de microbiologa. Investigacin en Discapacidad, 3(1), 10-
18.
De Naranjo, P., Rodrguez, G., Rodrguez, J. y Caldas, M.L. (1988). La coloracin de Ziehl-
Neelsen en histopatologa. Biomdica, 8(1-2), 84-93.
Tortora, G. J., Funke, B. R. y Case, C. L. (2007). Introduccin a la microbiologa. Buenos Aires:
Mdica Panamericana. 68-72.

Cedrn, J. C. (2011). El Luminol. Revista de Qumica PUCP, 25(1-2), 13-14.