h* I. R. E.

- 4/1973
O)

LU
Of

RADIOIMMUNOASSAYS
Principe

et

Techniques
A. M. REUTER J. C. HENDRICKX P. FRANCHIMONT

AVRIL 1973

INSTITUT NATIONAL DES RADIOELEMENTS

NATIONAAL INSTITUUT VOOR RADIO-ELEMENTEN
BELGIQUE - BELGI
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 I. R. E. - 4 1973

RADIOIMMUNOASSAYS
Principe

et

Techniques
A. M. REUTER (*) J. C. HENDRICKX (**) P. FRANCHIMONT (***)

AVRIL 1973

(*) Docteur en Sciantes

Chef de la section - Radioimmunoassays de CIRE.
(*") Docteur en Biomdecine
Aspirant chercheur du F.N.R.S.
Laboratoire de Radiotmmunologie de l'Universit de Lige
(***) Docteur en Mdecine
Agrg de l'enseignement suprieur
Charg de cours associ l'Universit de Lige
Laboratoire de Radioimmunologie de l'Universit de Lige
A.M. REUTER, J.C. HENDRICKX, P. FRANCHIMONT
Radioimmunoassays - Principe et Techniques
Rapport I.R.E. - 4/1973. 16 p.

Rsum

Les principes gnraux de la mthode radioimmunologique sont dfinis ainsi

que ies conditions indispensables la realisation d'un dosage raclioimmuno-
logique sensible et prcis.

Diffrentes mthodes de sparatiun ont t compares.

Les critres dterminant le choix d'une mthode adquate pour la preparation

de trousses pour dosage radioimmunologique sont exposes

A.M. REUTER, J.C. HENDRICKX, P. FRANCHIMONT

Radioimmunoassays - Principe et Techniques
Rapport -R.E. 4/1973. 16 p.

Samenvatting

De algemene principes van de radioimmuno.ogische methode werden bepaald

alsook de voorwaarden die nodig zijn voor ce verwezenlijking van een gevoe-
lige en betrouwbare radtoimmunologische btpaling.

Verschillende scheidingsmethoden werden vergeleken.

De criteria die de keuze van een aangepaste methode bepalen, voor de

bereiding van de sets voor radioimmunologicho bepalingen, werden uiteen-
gezet.

A.M. REUTER, J.C. HENDRICKX, P. FRANCHIMONT

Radioimmunoassays Principe et Techniques
Rapport I.R.E. - 4/1973, 16 p.

Summary

The general principles of the radioimmunological method have been defined,

as well as the necessary condition for the realization of a sensitive and
precise radioirfimunological determination.

Different separation methods have been compared.

The different criteria determining the choice of an adequate method for the
preparation of kids for the radioimmunological determination have been
discussed.
 RADIOIMMUNOASSAYS
Principe et Techniques
A. M. REUTER J. C. HENDRICKX P. FRANCHIMONT

La mthode radioimmunologique a t cre il y a 12 ans par YALOW et BERSON (1).

Actuellement, elle connat une extension considrable et est applique non seulement au
dosage de trs nombreuses hormones protiques et polypeptidiques mais aussi des enzymes
et mme des molcules dpourvues de proprits antigcniques propres teiies ies steroides.

Deux grandes techniques sont actuellement utilises : l'une est base sur les antignes
marqus, l'autre sur les anticorps marqus.

I. La technique originale de BERSON reste encore la plus gnrale. Elle est base sur la
comptition entre un antigne marqu Ag* et un antigne non marque Ag pour un anti-
corps spcifique Ab.

Ag* + Ag + Ab ^ Ag* Ab + Ag Ab

Si l'antigne marqu est ajout en quantit constante ainsi que l'anticorps, l'antigne non
marqu dterminera la quantit d'antigne marqu lie aux anticorps.

Aq* Ab
Le rapport ^-t sera d'autant plus faible que la quantit d'hormone non marque
Ag
ajoute au milieu d'incubation sera plus leve.
Pour raliser un dosage il faut donc d'abord tablir une courbe standard en portant en
ordonne l'activit du complexe Ag*Ab et en abscisse la quantit progressivement crois-
sante d'antigne non marque ajoute au milieu d'incubation. Lorsque la solution d'anti-
gne non marque est remplace par un srum ou un milieu biologique dont on dsire
connatre le taux en antigne, il suffit de dduire de la courbe la concentration en antigne
correspondant l'activit du complexe Ag*Ab mesure dans ce cas (fig. 1).
Les conditions indispensables la ralisation d'un dosage radioimmunologique sen-
sible et prcis ont t dcrites par YALOW et BERSON (2). FELBER et coll. (3),
FRANCHIMONT (4). .

Elles sont :

1. L'antignicit de l'hormone et la production d'un antiserum spcifique

Les hormones protiques et polypeptidiques induisent facilement la formation d'anti-

corps chez un animal d'une autre espce pour autant que le poids molculaire ne soit
pas infrieure 10.000 et qu'il existe une spcificit d'espce. L'immunisation est
beaucoup plus difficile lorsque le poids molculaire est infrieur 10.000.. Des anti-
serums ont cependant t obtenus contre la vasopressine et l'ncytocine sans prtrai-
tement de l'hormone alors que ces polypeptides n'ont qu'un poids molculaire de
1.100. On peut augmenter l'antignicit des molcules en les couplant chimiquement
de grosses protines. Ce procd est utilis pour obtenir des anticorps dirigs contre
les strodes. L'antisrum doit tre spcifique, c'est--dire qu'il doit tre dpourvu d'anti-
corps dirigs contre les antignes de structure voisine (fig. 2).

1
2. U possibilit ils marquer l'antigne i hauts activit spcifique

Pour obtenir une sensibilit suffisante, il est vident que la quantit d'antigne marqu
ne doit pas tre trop importante compare la quantit d'antigne non marqu. Il faut
donc marquer l'antigne une activit spcifique suffisante. Le marquage s'effectue
gnralement par l'iode radioactif ' : -l et -) I et la technique la plus utilise est la tech-
nique de GREENWOOD et coll. (5). Le Nal marqu est d'abord oxyd par la chlora-
mine T qui agit comme I'hypochlorite :

( H a C - ^ ^ A - SO.-N-CI ) Na* + teO - * H a C - \ _ j ) ~ $&- - Nrfc + NaOCI

La raction suivante consiste en une substitution de l'I cationique sur les groupes
tyrosifes des protines.

Des quantits de l'ordre de 2 5g de protines ont gnralement t marques avec

2 mCi d I radioactif avec un rendement, qui est videmment variable mais qui atteint
environ 50 % dans le cas des hormones glycoprotiques. L'I libre est limin par fil-
tration sur une colonne de Sephadex G 50 car le marquage provoque toujours une
dgradation de certaines molcules. L'importance de la fraction endrommage varie
avec la protine marquer et la qualit de l'I radioactif utilis. La prsence de cette
fraction rduit la sensibilit du dosage puisqu'elle rag:t diffremment avec les anti-
corps et peut se fixer de faon non spcifique aux protines sriques normales. Les
produits dgrads ont perdu la proprit de ragir avec un changeur d'ions.

Diffrentes mthodes ont t proposes pour liminer l'hormone dgrade :

filtration sur colonne de cellulose (l'hormone dgrade ne s'adsorbe pas) ;
filtration sur Sephadex G 200 :
purification sur DEAE cellulose.

Assez rcemment. THORELL et JOHANSSON (6) ont dcrit une technique enzymatique
pour marquer des protines et polypeptides haute activit spcifique en utilisant la
lactoperoxydase. Cette mthode permet de rduire la di turation de protines. Elle
n'est cependant pas applicable en prsence d'azide de sodium souvent prsent dans
les prparations commerciales d'hormones.

3. Una bonne mthode de sparation de l'hormone libre et de l'hormone fixe aux anti-

Diffrentes mthodes ont t proposes pour sparer l'hormone marque libre et l'hor-
mone marque fixe aux anticorps.

A. L'lectrophorse

a) Sur papier, cette technique a t prconise pour le dosage de l'insuline par

YALOW et BERSON (1).
L'hormone libre est adsorbe sur papier au point de dpart tandis que le com-
plexe hormone anticorps migre sous l'action du courant lectrique avec les y
globulines (fig. 3).

b) Sur gel d'amidon et de polyacrylamide.

Dans les deux cas, l'hormone libre migre dans une zone qui est propre sa taille
et sa charge tandis que le complexe antigne-anticorps est fortement frein par sa
taille.

B. L'imn' inoprcipitation

Cette mthode encore appellee technique du double anticorps , est actuellement

la mthode la plus utilise pour sparer l'hormone libre du complexe hormone
 marque-anticorps. Elle repose sur !a prcipitation du complexe antigne-anticorps
par un srum anti y globulines :

W
Ag* + Ab Ag* Ab

Ag* Ab + anti y G - > A g ' Ab anti y G

La prcipitation et la sparation du prcipit peut tre ralise de deux faons.

La premire, sans addition de y G comme entraneurs. Dans ce cas, pour obtenir

l'quivalence, ie srum y G doit tre fortement dilu ; le prcipil est faible et la
sparation doit tre ralise sur filtre d'actate de cellulose.

Dans !a deuxime faon, on ajoute des y globulines normales et une plus forte
concentration en anti G pour raliser l'quivalence (ta quantit d'Ag* Ab est ngli-
geable devant les y globulines normales et ne modifie pas la zo^e d'quivalence).

C. La filtration sur Sephadex

La diffrence de taille entre l'antigne libre et le complexe antigne-anticorps per-

met de les sparer par filtration sur Sephadex.

D. Prcipitation du complexe antigne-anticorps

Cette prcipitation peut tre ralise par des sels minraux comme le sulfate ammo-
nique et par dos solvar.ts organiques comme le dioxane.

E. Mthode d'adsorption de l'hormone libre sur un substrat solide

Par cette technique l'hormone libre s'adsorbe ta matire solide tandit que le
complexe antigne marqu-anticorps reste dans le surnageant. Los substrats solides
proposs par diffrents chercheurs sont les silicates : talcs et kaolin et le charcoal-
dextran. La fixaion de l'hormone libre est piatiquement instantane alors que la
mthode du double anticorps requiert une incubation de un deux jours.

F. Mthode d'changeurs ioniques

Certaines hormones ragissent avec les changeurs d'ions tandis que les complexes
antigne-anticorps ne ragissent pas. Cette proprit a t normalement utilise
dans le cas du dosage de l'hormone de croissance qui se fixe l'amberlite 400.

G. Mthode de fixation de l'anticorps un substrat solide

WIDE et PORATH (7) ont dvelopp une mthode permettant de coupler les anti-
corps des particules insolubles de polysaccharides telles que Sephadex et cellu-
lose grce au bromure de cyanogne.

La raction peut tre schmatise comme suit :

\
CH-OH CK-0 R : O, R
| + CN2r | C = NH + H 2 N - 6 - p r o t i n e - > j ^ - - N --protine
CH-OH H-O^ H CH-0 H
/

Dans ce cas. l'antigne ragit directement avec l'anticorps coupl au polysaccharide

activ. La sparation se fait par centrifugation, lavage et comptage du prcipit.

Cette technique particulirement lgante et rapide (elle peut tre ralise en une
seule tape et ne requiert qu'un jour d'incubation) prsente cependant des inconv-
nients majeurs. Lors du couplage, l'anticorps perd une grande partie de son immu-
noractivit. Ainsi, le rendement de couplage considr, non pas comme la qualit
de protine fixe (qui elle est gale 95 % ) , mais au nombre d'incubations pou-

3
 vant tro ralises avec 1 ml d'anticorps, n'est que de 20 % par rapport la
mthode du double anticorps . La sensibilit du dosage est moins grande (fig. 4)
et l'influence des protines sriques est trop importante (30 50 %) (fig. 5).
(A. M. REUTER et coll.) (8).

On peut ainsi, au lieu de coupler directement l'anticorps antihormone, coupler le

double anticorps (c'est--dire les anti y). Cette variation a t propose par DEN
HOLLANDER et coll. en 1971 (9). Nous en avons fait une tude complte et com-
parative avec le double anticorps classique et l'immunosorbant de WIDE (10) et
nous sommes arrivs la conclusion que cette combinaison des deux mthodes,
sans en prsenter les inconvnients, permettait d'obtenir les avantages des deux
mthodes, c'est--dire sensibilit trs grande, peu d'influence des protines sriques
(double anticorps), rapidit et reproductibilit (immunosorbant).

4. Le systme immunologique doit tre applicable l'hormone prsente dans le milieu

biologique

Pour cela, diffrantes conditions doivent tre ralises.

A. Le milieu biologique ne peut perturber la raction immunologique de base, ni la

mthode de sparation de l'antigne libre et du complexe antigne-anticorps. Un
exemple en est l'influence des protines sriques dans la mthode de sparation
par immunosorbants.

B. Le comportement immunologique de "hormone prsente dans le milieu biologique

doit tre identique celui de la prparation standard de rfrence. La vrification
de cette condition se fait par dilution successive d'un srum riche en hormones.

Les courbes obtenues avec le standard et le serum doivent tre superposables.

Parfois, on utilise des hormones standard provenant d'espces animales diffrentes
pour l'immunisation et pour le dosage.

Les antiserums obtenus ne peuvent tre utiliss que si le corportement des deux
hormones vis--vis de ces antiserums est identique. Il en est de mme lorsqu'on
utilise deux hormones d'une mme espce mais d'un tissu diffrent. Cette situation
se retrouve lors du dosage de la LH hypophysaire en utilisant de la LH chorionique
(HCG pour l'immunisation) (fig. 6).

Pour terminer, nous devons dire quelques mots d'une technique plus rcente de dosage
radioimmunologique qui utilise les anticorps marquas.

Le principe de cette technique consiste ajouter des anticorps marqus en concentration

constante un milieu contenant des antignes non marqus en quantit progressivement
croissante. La formation de complexes antigne-anticorps marqus sera fonction de la
quantit d'antignes prsents dans le milieu. (11)

Ag + Ab* ^ Ag Ab*

L'application de ce principe peut s'effectusr de deux faons diffrentes :

1. L'essai immunoradiomtrique (fig. 7)

Les anticorps marqus purifis sont incubs avec la solution contenant l'hormone
doser. I! se forme un complexe antigne-anticorps. Les anticorps libres sont limins
par un large excs d'immunosorbant hormone. La radioactivit du surnageant est en
relation directe avec la quantit d'hormone prsente dans le milieu (fig. 8).

2. L'essai en sandwich (fig. 9)

Une quantit constante d'un immunosorbant anticorps est incube avec la solution con-
tenant l'hormone doser. L'immunosorbant est alors centrifug et lav puis incub
 avec des anticorps marqus purifis. Un complexe se forme avec la phase solide. Aprs
centrifugation et lavage, le prcipit est compt.

La radioactivit est en relation directe avec la quantit d'hormone initialement pr-

sente (fig. 10).

Ces mthodes utilisant des anticorps peuvent accrotre nettement la sensibilit du dosage
radioimmunologique. Elles ncessitent un peu plus de manipulations, la stabilit des anti-
corps marqus est parfois moins bonne que celle des antignes et l'influence des proti-
nes sriques n'est pas ngligeable.

Voici en rsum les principaux problmes que nous rencontrons dans la prparation de
trousses pour le dosage radioimmunologique. Ils sont dterminants dans le choix d'une
mthode de dosage adquate mais ils peuvent varier d'un antigne l'autre.

Exemple : la mthode des immunosorbants inapplicables pour la LH cause de la grande

interfrence des protines sriques, est idale dans le cas de la HPL (hormone
lactoplacentaire) o les dilutions du srum sont toujours suprieures 10.

5
 BIBLIOGRAPHIE

(1) YALOW. R. S. ; BERSON. S. A.

J. Clin. Invest. 39, 1157 (1960)

(2) YALOW. R. S. : BERSON. S. A.

Labelled proteins in tracer studies
Euratom Report 2950 ESE. 165-73 (1966)

(3) FELBER. J. P. ; MOODY. A. J. ; VANOTTI. A.

Helv. Med. Acta 5, 378 (1966)

(4) FRANCHIMONT, P.
Ann. Biol. Clin. 28, 3 (1970)

(5) GREENWOOD. F. C. ; HUNTER, W. M. ; GLOVER. J. S.

Biochem. J. 89, 114 (1963)

(6) THORELL. J. I. ; JOHANSSON, B.G.

Biochim. Biophys. Acta 251. 363 (1971)

(7) WIDE, L. ; PORATH. J.

Biochim. Biophys. Acta 130, 257 (1966)

(8) REUTER. A. M. ; HENDRICKX. J. C. ; SULON. J. ; FRANCHIMONT, P.

Acta Endocr. (Kbh) 72, 235 (1973)

(9) DEN HOLLANDER. F. C. ; SCHUURS, A. H. W. M. In : Radioimmunoassay methods.

Ed. KIRKHAM and HUNTER
Churchill Livingstone, London (1971)

(10) WIDE, L.
Acta Endocr. (Kbh) Suppl. 142, 207 (1969)

(11) HENDRICKX, J. C. ; FRANCHIMONT, P.

Ann. Biol. Clin. 30, 113 (1972)
Fig. 2. Pourcentage d'hormone marque FSH* fixe l'anticorps en fonction de la concentration exprime en
ng/0,1 ml en hormone froide ajoute dans le milieu

# # FSH 0 p TSH ^ ^LH^ ^ HCG

^ ,. STH

I
Fig. 4. Comparaison de deux courbes talon obtenues en utilisant la mme hormone LH marque et froide, le mme
antisrum mais deux mthodes de sparation diffrentes

O 0 immunoadsorbant # double anticorps classique.

Il
Fig. 6. La LH et la HCG non marques diminuent de faon identique le pourcentage de LH marque qui se fixe
aux anticorps HCG (fig. de droite) ; il n'en est pas de mme lorsque l'on utilise de la HCG marque
(figure de gauche). Il parait donc exister dans cet antisrum deux populations diffrentes d'anticorps.
reproduit de (4)

III
Fig. 8. Radioactivit compte dans le surnageant en fonction de la concentration en LH standard prsente dans le
milieu d'incubation.

IV
Fig. 10. Radioactivit fixe sur l'immunoadsorbant en fonction de la concentration de PTSH standard prsente
dans le milieu d'incubation.