I.

Historique

Peter Lobban et A. Dale Kaiser taient les premiers scientifiques pour proposer une
technique pour former l'ADN recombinant. Ceci s'est bientt propag d'autres
scientifiques et en 1972 le premier papier qui a dtaill une voie neuve d'insrer
l'information gntique utilisant Escherichia coli a t relch. Peu aprs en 1973,
plusieurs autres papiers ont suivi le btiment sur le concept et des techniques de ajouter
de construction et de formation.

En 1978, Werner Arber, Daniel Nathans et Hamilton Smith ont t attribus le Prix Nobel
en Mdicament pour produire la technologie pour dcouvrir, isoler et appliquer l'ADNr.
Depuis cette poque, les gnes recombins et les protines sont devenus trs utiliss
dans le mdicament et l'agriculture. Ceci offre une mthode nouvelle de manager
quelques tats de sant, tels que l'utilisation de l'insuline recombine dans le diabte,
aussi bien le parasite-control pour des jardins et les fermes.

II. Definition :

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 Les protines recombinantes sont ainsi qualifies dans la mesure o elles sont
produites par des cellules dont l'ADN a t modifi par recombinaison gntique. Au
sens large, un systme de production adapt la fabrication d'une protine
recombinante donne, est un process biotechnologique qui s'appuie principalement
sur l'emploi d'un vecteur d'expression (en gnral un plasmide ou un virus -pour les
vecteurs eucaryotes-), jouant le rle de transporteur gntique du gne d'intrt
codant pour la protine recherche ; l'utilisation d'une cellule hte, charge d'excuter
les instructions fournies par le gne d'intrt qui lui est insr, dans l'objectif de
synthtiser la protine recherche ; une phase de production proprement dite
permettant de fabriquer les volumes de protines souhaits ; enfin, une sparation et
extraction de la protine du milieu de culture, suivie par une purification de celle-ci. Au
sens restreint, un systme de production de protines recombinantes est caractris
par un couple constitu d'un vecteur d'expression et d'un hte (cellule ou organisme).

III. Principe de produit d'ADN recombinant

Figure1: le principe de produit d'ADN recombinant

IV. Les tapes de production de protines recombinants :

Pour produire une protine il faut disposer essentiellement d'un vecteur et d'une cellule
hte. Le systme idal pour produire une protine recombinante comporte les lments
suivants:

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1/ Vecteur d'expression: Le vecteur est un moyen de transport de l'ADN. C'est un fragment
capable de rplication autonome et qui peut supporter l'insertion d'un autre fragment d'ADN de
taille variable (plasmide bactrien).

Figure 2: formation de vecteur recombinant

2/ Cellule hte: doit se multiplier en grande densit dans des fermenteurs. Son temps de
gnration doit tre court et impliquant un milieu de culture cot faible. La cellule hte
peut appartenir des bactries, levures, cellules d'insectes et cellules de mammifres.

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 Figure3: slection de cellule hte

3/ Expression de la protine: La protine doit tre soluble (scrte dans le milieu de culture)
par la transcription d'un gne s'effectue partir d'un seul des 2 brins de l'ADN; ce brin diffre
selon les gnes et traduction partir d'un ARNm, d'une protine. C'est un assemblage, sous forme
d'une structure primaire, d'acides amins dtermins par l'information contenue dans les codons
de l'ARNm

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 Figure 4: la transcription et la traduction de protine

Tableau 01: les avantages et les inconvnients d'un systme d'expression de

protine

4/ Extraction et purification de la protine recombinante:

La protine recombinante doit tre soluble et facile extraire et purifier.

La protine est-elle excrte par la cellule productrice?

Si oui ? rcupration dans le milieu de culture + purification

Si non ? il faut casser les cellules , Avant de casser les cellules : rcupration de
biomasse (centrifugation, dcantation)

Mthodes pour casser les cellules

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- Choc osmotique

- Traitement alcalin

- Extraction par solvants organiques

Figure 5: Mthodes pour casser les cellules

Mthodes pour purifier les protines

Prcipitation --- concentration Par des solvants ou des sels (sulfates dammonium ou de
s+odium)

Purification --- chromatographies diffrents types selon la protine purifier

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 Figure 6: Mthodes pour purifier les protines

_ Stockage

Forme liquide

Forme solide : atomisation, lyophilisation

- Former solide

Pulvrisation de la solution protique dans un une enceinte chauffe 130C

dshydratation : on collecte la poudre

Lyophilisation = cryodessiccation = surglation + pression ---- point triple puis

dessiccation

V. L'exemple des protines recombinantes

Insuline

L'insuline est scrte par les cellules des lots de Langerhans du pancras. Elle exerce
un effet hypoglycmiant.

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 L'insuline est administre aux personnes touches par le diabte qui est une maladie
caractrise par l'augmentation du taux du sucre dans le sang et les urines (glycmie
normale: 0,7 - 1,1 g/L). C'est l'une des maladies les plus rpandues dans le monde (1% de
la population mondiale). Il existe deux formes principales de diabte : le diabte insulino-
dpendant (type I) et le diabte insulino- indpendant (type II).

L'insuline est constitue de deux chanes polypeptidiques (51 acides amins en tout); les
chanes A et B 21 et 30 acides amins, respectivement et relies entre elles par 2 ponts
disulfures et 1 pont disulfure intrachane dans la chane A

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 Figure 07: les tapes de production d'insuline recombinante

Hormone de croissance

L'autre exemple de protines recombinantes est l'hormone de croissance (protine

recombinante) dont le protocole de production est rsum dans la figure. L'hormone de
croissance est une substance chimique naturelle que scrte l'hypophyse. Elle rgle la
croissance et le dveloppement normal chez les enfants. L'hormone de croissance
recombinante humaine (HGHr) est produite partir de cellules modifies par gnie
gntique afin de produire cette hormone. Un dficit en hormones de croissance entrane
une maladie appele le nanisme hypophysaire

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Figure 08: les tapes de production d'hormone de croissance recombinante

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