Teora 2: Vectores de clonado

Una de las operaciones bsicas en ingeniera gentica es lo que se denomina clonado molecular.
Cuando se habla de clonado molecular, se hace referencia concretamente a molculas de DNA. A
partir de una determinada molcula de DNA se puede obtener una gran cantidad o una cantidad
relativamente mayor de molculas de DNA idnticas a la molcula inicial. Por la naturaleza del
proceso de clonado, lo que se puede hacer, tambin, es purificar o separar diversas molculas de
DNA que estaban presentes en la muestra original y obtenerla en grandes cantidades y separadas
una de otras.
Los procesos de clonado molecular tratan en lo siguiente: introducir la o las molculas que se
desea clonar dentro de un organismo vivo, lograr que dicho organismo vivo la o las reproduzca
utilizando su maquinaria de replicacin y luego, a partir de ese organismo vivo, lograr separar y
obtener nuevamente la poblacin de molculas que se han incrementado.
El organismo vivo utilizado por excelencia para el clonado molecular son las bacterias y, dentro de
estas, las bacterias de Escherichia coli, debido a su facilidad de moleculacin, conocimientos que se
tienen en cuanto a su fisiologa y su gentica, el corto tiempo de reproduccin entre otras.

Etapas del clonado

Introduccin del DNA al organismo vivo: este proceso se hace mediante transformacin. Las
bacterias en determinadas condiciones toman DNA exgeno de manera casi espontanea. Otra
manera de introducir DNA es por medio de bacterifagos los cuales son virus de bacterias y lo
que hacen es, por medio de infeccin, introducir su DNA al interior de la bacteria.
Replicacin de DNA dentro del organismo vivo: para que un DNA introducido dentro de un
organismo vivo pueda replicarse, hace falta de una estructura denominada replicador, el cual
tendr el origen de replicacin, y una serie de otros factores que son necesarios para que se
produzca la replicacin. Cuando se introduce DNA en una bacteria, muchos de estos factores
ya se encuentran en el interior de la misma, entonces, lo que debe tener el DNA que se
introduce es el origen de replicacin y algn otro componente especifico para la replicacin. Si
el DNA introducido no posee origen de replicacin, la manera de que se replique es insertarlo
sobre el genoma de la bacteria y que este genoma posee su propio origen de replicacin y por
lo tanto, cuando se replique el genoma de la bacteria, tambin se replicara el DNA introducido.
Recuperacin del DNA: por un lado, se debe tener en cuenta que si el DNA se replica de forma
autnoma al genoma, ser mucho mas fcil recuperarlo que si se inserta en el genoma, ya que,
para recuperarlo se deber purificar el genoma completo de la bacteria y el DNA target estar
mezclado con un montn de DNA que no es de inters. Por otro lado, es conveniente que el
DNA que se produjo sea lo mas abundante posible.

Propiedades de los vectores de clonado

Los vectores de clonado son utilizados ya que estos aportan caractersticas importantes para la
replicacin de DNA en un organismo vivo.
Para que un vector de clonado sea til debe poseer ciertas caractersticas. Por un lado, debe ser
capaz de aceptar DNA, es decir, debe ser posible introducirle el fragmento de DNA que se desea
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clonar, pero, adems, esta insercin de DNA no debe interferir con las propiedades de ese vector. Por
otro lado, tiene que poder ser introduce en forma relativamente sencilla al interior de la bacteria y en
lo posible, que se pueda replicar de manera autnoma al genoma. Por ultimo, debe ser de fcil
purificacin.
 Plsmidos
Son los vectores mas usados para clonado molecular. Son molculas de DNA capaces de subsistir
de forma autnoma al genoma de la bacteria. Son molculas autorreplicantes. Adems, les confieren
a las bacterias que los contienen determinadas ventajas adaptativas, como por ejemplo resistencia a
determinados antibiticos, produccin de ciertos metabolitos entre otras. Los plsmidos utilizados en
ingeniera gentica derivan de plsmidos naturales que han sido modificados para cumplir
eficientemente con el proceso de clonado molecular.
Un plsmido debe poseer tres componentes fundamentales:
Marcador de seleccin: es una secuencia de DNA que permite seleccionar a aquellas bacterias
que contienen el plsmido en su interior. El factor de seleccin mas habitualmente utilizado es el
gen de resistencia a antibiticos; cuando se utilice dicho antibitico, slo van a resistir
aquellas que posean el plsmido en su interior.
Origen de replicacin: le permite replicarse de manera autnoma al genoma en el interior de la
bacteria.
Sitio de mltiple clonado: sitio en el cual se puede introducir la secuencia de DNA que se desea
clonar. Es, habitualmente, un sitio par una enzima de restriccin que permite tratar el plsmido
con esa enzima de restriccin, abrirlo y ligar, en ese sitio, un fragmento de DNA, el cual fue
digerido con las mismas enzimas de restriccin o con alguna que genera sitios compatibles. El
sitio de clonado debe ser nico en todo el plsmido y, adems, no debe interferir con ninguna
de las funciones del plsmido.
Los plsmidos se clasifican, generalmente, segn el nmero de copias que tenga. El nmero de
copias se refiere al nmero de molculas de plsmido que hay en el interior de la bacteria por
molcula de genoma. El numero de copias esta dado sobre todo por el tipo de origen de replicacin
que posean. Se pueden clasificar como:
Alto numero de copia: cuando hay ms de 20 copias de plsmido por molcula de genoma.
Estos plsmidos utilizan sistemas de replicacin distintos al del genoma de la bacteria. La
replicacin se produce por medio de la DNApolI.
Estos tipos de plsmidos poseen dos orgenes de replicacin derivados de los plsmidos pMB1
y ColE1.
La replicacin se inicia a travs de un proceso de transcripcin realizado por la RNApol
bacteriana en un determinado lugar generando un RNAII, el cual ser digerido por una
endonucleasa, la RNAsaH, que reconoce y corta hbridos DNA-RNA, produciendo un extremo 3
que actuar como cebador para que comience a operar la DNA polimerasa. Este proceso esta
regulado por otro RNA que esta codificado por otra regin del plsmido, el RNAI, el cual es
complementario a una determinada regin del RNAII. Al hibridarse el RNAI con el RNAII, se
inhibe la reaccin de la RNAsaH y de esta manera se inhibe el proceso de replicacin ya que el
RNAI no se hibrida al DNA y no puede ser reconocido por la RNAsaH. LEER APUNTES DE
CLASE!!
Bajo nmero de copia: estos plsmidos se replican utilizando la misma maquinaria que replica
el genoma de la bacteria. Como la replicacin del genoma se produce una sola vez antes de
cada divisin celular, el nmero de copias no es alto. La replicacin se produce por medio de la
DNApolIII.
Si prevalece el RNAII, el nmero de copias va a subir, si prevalece el RNAI, el nmero de copias
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disminuye.
La cantidad de RNAI y RNAII depende, por un lado, de las caractersticas del origen de replicacin.
Puede haber mutaciones o cambios en la secuencia de esta regin que hace que prevalezca uno
ms que otro. Por otro lado, hay caractersticas endgenas del metabolismo y la fisiologa de la
bacteria que van a determinar cunto se sintetiza de uno y cunto del otro. Cuando un plsmido entra
a la bacteria, comienza a replicarse y aumenta su nmero de copias.; a medida que va aumentando
su nmero de copias, tambin aumenta la cantidad de RNA inhibitorio y en un momento dado, los dos
procesos llegan a un equilibrio y es esto lo que determina el numero de copias que va a tener la
bacteria.
Cuando hay divisin celular, los plsmidos tienen que repartirse entre distintas clulas. Los
plsmidos de alto numero de copias no tiene un sistema de segregacin como lo tiene el genoma, es
decir, el genoma se divide en dos, una parte va a una clula y la otra a la otra clula; estos plsmidos,
en cambio, se reparten al azar, como son de alto numero de copias, siempre alguna copia ira a parar
a la clula hija. Los plsmidos de bajo nmero de copia s poseen sistema de segregacin, ya que de
otra manera no podra sobrevivir.

Fenmeno de incompatibilidad
Si en el interior de la bacteria se encuentra un determinado plsmido que posee el mismo origen
de replicacin y se intenta introducir y replicar otro plsmido que posea el mismo origen de
replicacin, esta replicacin no ser posible. Esto se denomina fenmeno de incompatibilidad. Dos
plsmidos que posean el mismo origen de replicacin, en principio no pueden sobrevivir en la misma
bacteria; predominara uno u otro. Lo importante es cual estaba primero dentro de la bacteria.
A modo de esquema: se parte de
una mezcla de diferentes molculas de
DNA que se desean clonar y se ligan a
un plsmido. Se obtienen distintos
productos de ligacin posibles y se los
introduce a una bacteria. Una
determinada clula habr recibido de
las molculas de DNA resultantes, otra
clula habr recibido otra molcula y
muchas clulas quizs no hayan
recibido ninguna. Cuando se plaquea
esta transformacin en un medio
adecuado con antibitico, cada clula
que recibi el plsmido que contena
una de las molculas de DNA, va a
empezar a reproducirse y a formar una
colonia, una poblacin de clulas, en
principio, idnticas a la clula original,
con idntico material gentico. Se van a
tener distintas poblaciones de clulas
separadas, distintos clones, y cada una
de estas poblaciones va a estar
reproduciendo en su DNA una de las
molculas originales. De esta manera,
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si se toma una colonia y se la

reproduce, se va a estar reproduciendo
una de las especie. O sea, a partir de
una poblacin original, se va a lograr separa y reproducir individualmente las diferentes molculas de
DNA. Esto se logra por el fenmeno de incompatibilidad. VER ESQUEMA FILMINAS!!
Ejemplos de plsmidos
pBR322:
Es un plsmido poco usado actualmente. Posee
un sitio de replicacin, resistencia a ampicilina y a
tetraciclina, o sea, dos marcadores de seleccin, y
varios sitios de mltiple clonado nicos. Posee sitios
de clonado, sobre todo, en los marcadores de
seleccin. Por ejemplo, si se inserta un fragmento de
DNA en el sitio PstI, se perder la resistencia a
ampicilina pero conservara la de tetraciclina. De la
misma manera, si se inserta en el sitio BamHI, se
perder la resistencia a tetraciclina pero no la de
ampicilina.
Supngase que se clona en el sitio BamHI, se
liga, se transforman bacterias y se plaquea. El plaqueo debe realizarse en un medio que contenga
ampicilina, ya que si se hace en un medio con tetraciclina, se perder lo que se desea obtener. De las
colonias obtenidas, se puede tener el plsmido original (con ambos genes de resistencia) o bien el
plsmido con el inserto. El hecho de haber clonado en este sitio, permite discernir a priori cuales
plsmidos pueden haber recibido el inserto. Una vez que se plaquea en ampicilina, se puede tomar
cada una de estas colonias y plaquearlas en un medio que tenga ampicilina y otro que tenga
tetraciclina. Aquellas colonias
que puedan crecer en los
dos medios, probablemente
tengan el plsmido original;
aquellas que crezcan en
presencia de ampicilina pero
Amp Tet Amp Tet
no en presencia de Posee el inserto en el sitio Plsmido original, no posee
tetraciclina probablemente BamHI inserto
tengan un vector con un
inserto.

pUC19
Es un plsmido que posee un
sitio de mltiple clonado, MCS, que
es una regin en la cual hay muchos
sitios de clonado, diferentes entre si,
agrupados muy cerca unos de otros.
Adems, este MCS est inmerso en
el gen de la -galactosidasa. As,
bacterias que posean el plsmido
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original, van a tener actividad -

galactosidasa. En cambio, bacterias
que posean el plsmido con inserto,
lo ms probable es que hayan
perdido dicha actividad. Entonces, si se plaquean transformantes con estos plsmidos, y al medio de
crecimiento se le agrega un sustrato cromognico para la -galactosidasa (Xgal), se observaran
colonias blancas y azules. Si en la placa se observan colonias azules probablemente, esas bacterias
posean el plsmido original, en cambio, si se observan colonias blancas, poseern el plsmido con el
inserto.
El gen de la -galactosidasa es el gen LacZ del opern lac. El MCS se encuentro solo en un
pedazo de dicho gen, en el extremo que codifica para una regin amino-terminal de la -
galactosidasa. Este fragmento, el fragmento de la -galactosidasa, no tiene actividad, pero si se
junta este fragmento con otro, el fragmento, s posee actividad. Este ltimo fragmento es codificado
por la bacteria. Este fenmeno se denomina -complementacin.
Otra de las cosas que conserva el gen LacZ es el operador, el cual le confiere regulacin al opern
lac por la lactosa. Por ello, para que se exprese en gen LacZ es necesaria la lactosa o un anlogo de
ella en el medio. La lactosa, o el anlogo, se une al represor, ste se libera y el gen se expresa.
Comnmente, se utiliza IPTG como anlogo, que, a diferencia de la lactosa, no es metabolizable ya
que no es sustrato de la -galactosidasa. Entonces, se reemplaz la lactosa por dos componentes:
IPTG para inducir la expresin y Xgal como sustrato.
El IPTG posee algunas ventajas sobre la lactosa. Al no ser metabolizado por la -galactosidasa,
este anlogo permanece ms tiempo en el cultivo y, por lo tanto, provee una mejor induccin.
Adems, es permeable a la membrana celular, es decir, puede penetrar directamente por la
membrana, en cambio, la lactosa ingresa a la clula slo si se encuentra el gen LacY que codifica
para la lactosa permeasa.
Algo que hay que tener en cuenta antes de transformar con este tipo de plsmido es la cepa de
bacteria a utilizar. Una cepa bacteriana utilizada para el plsmido pUC19 debe que expresar el
fragmento, no debe ser resistente a ampicilina, no debe poseer otro plsmido con el mismo origen
de replicacin y no debe expresar la -galactosidasa, ya que, si la expresase, no se podran
distinguir entre colonias debido a que sern todas azules.
Una de las cepas usada de E. coli posee el siguiente genotipo:
recA1(lac-proAB)F(proA+, proB+, lacIg, lacZ AM15)
RecA1: posee una mutacin en el sistema de recombinacin de la bacteria. En clonado se
utilizan, generalmente, bacterias deficientes en el sistema de recombinacin, para evitar que el
DNA que se introdujo, se rearregle en el interior de la bacteria.
(lac-proAB): lac significa una delecin en el opern lac, es decir, no expresa la -
galactosidasa. proAB significa que tiene delecionado el gen de sntesis de prolina, por lo que
no pueden desarrollarse en un medio mnimo (sin prolina).
F(proA+, proB+, lacIg, lacZ AM15): F es el plsmido conjugativo de E. coli y el significa que esta
modificado. El + significa que el F posee el gen de sntesis de prolina, o sea, si la bacteria tiene
el F, puede crecer en medio mnimo. LacI q es un represor muy fuerte del opern lac. LacZ
AM15 es una fragmento del gen LacZ que posee una delecin AM15; posee el fragmento ,
pero no el fragmento ; es decir que estas bacterias no expresan la -galactosidasa.
En el laboratorio se trabaja siempre con medio mnimo para asegurarse de que las bacterias no
hayan perdido el F y den colonias blancas cuando no deban que serlo.
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Derivados de bacterifagos
 Tienen la capacidad de introducir DNA a la bacteria no por transformacin sino por infeccin.
Reproduce su DNA dentro de la bacteria y, muchas veces, en el proceso de reproduccin, las clulas
se lisan generando una poblacin de fagos. Si no se lisan, eliminan el DNA al exterior donde
ensambla el fago dando, en el exterior, una poblacin de fagos.
Entre los bacterifagos utilizados, se encuentran los derivados de fagos filamentosos. Los vectores
desarrollados a base de fagos filamentosos son tiles para obtener DNA simple hebra.
Fagos filamentosos
Poseen un genoma circular de DNA simple hebra. Poseen entre 6000 y 7000 nucletidos y estn
cubiertos por una protena de la cpside que se agrupa alrededor del DNA formando filamentos. Si el
DNA es muy largo, se hace un filamento mas largo y viceversa, o sea, que en principio, no habra
limitacin de tamao y se podran introducir segmentos de DNA siempre y cuando no interfiera con
ninguna de las actividades del fago.
Ciclo del fago filamentoso: lo primero que sucede es que el fago se absorbe a los pelos
conjugativos de la bacteria y luego es llevado al interior de la bacteria e introducen el DNA en su
interior. Una vez que el DNA simple hebra ingreso a la clula, se genera una segunda hebra de DNA,
formando un DNA doble cadena, que se lo conoce como forma replicativa (RF). De esta manera,
comienza a replicarse en el interior de la bacteria, generando una poblacin aumentada de DNA
doble cadena. Cuando el DNA doble hebra llega a un nivel determinado, se produce un corte en una
de las hebras y comienza una replicacin en forma de circulo rodante, en el cual empieza la
replicacin y va girando alrededor de las hebras, es cuando se empieza a producir DNA simple hebra,
que es el genoma del fago.
Cuando se infecta una bacteria con un fago, se empiezan a reproducir, liberan fagos, los cuales
infectaran a bacterias que estn prximas. Estos fagos no son lisognicos, entonces, al no lisar la
clula, se produce un proceso de re-infeccin y en un
momento se va a llegar a un estado estacionario en el
cual se van a tener fagos por fuera de la bacteria, los
cuales estarn infectando bacterias y fagos
reproducindose en el interior de la bacteria.
En un cultivo de bacterias infectadas por fago
filamentoso, se tiene, en el interior de stas, las formas
replicativas, las cuales pueden ser tratadas como
plsmidos. Es decir, la forma replicativa es DNA doble
hebra y, por lo tanto, luego de purificarlo, se puede
digerir con enzimas de restriccin, ligarle un fragmento
de DNA que se desea clonar e introducirlos
nuevamente por transformacin a una bacteria.
Cuando la bacteria empiece a reproducir ese fago, en
determinado momento producir DNA simple hebra y
fagos en el exterior con el fragmento de DNA que se
clono.
El genoma del fago codifica unas 10 protenas que
son requeridas para el proceso de reproduccin del
fago. Alguna son protenas de la cpside y otras
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protenas menores que tambin forma parte de la cpside y algunas enzimas que participan en el
proceso de replicacin. Estas 10 protenas son necesarias para que esto se comporte como fago. Por
lo tanto, un fago filamentoso que se use como vector tiene que tener los 10 genes que codifican
dichas protenas, a no se que estn codificadas en otra parte. Si estos genes no estn, nunca se
replicara como fago.
Uso de fago filamentoso para clonacin: Cuando se utiliza la forma replicativa del fago para clonar
un fragmento y esto se lo introduce a una bacteria, se realiza un proceso de transfeccin. Lo que
sucede es que cuando se introduce en el interior de la bacteria un vector de este tipo, este vector se
va a empezar a replicar como la forma replicativa del fago. Producir DNA doble hebra y en un
momento dado producir DNA simple hebra. Este ltimo sale de la bacteria y, junto con la protena de
la cpside, formara nuevos fagos.
Una vez hecha la transfeccin, a las clulas transformadas se le agrega un cultivo de clulas no
transformadas y luego se plaquea. Como el medio no tiene un antibitico, van a crecer todas las
clulas en toda la placa, pero aquellas clulas que hayan sido infectadas, crecern ms lentamente.
Entonces, en determinados sectores donde haya clulas infectadas se vern regiones ms
translcidas, las cuales se conocen como placas de lisis. No hay lisis, se denominan as por
analoga. Cada placa de lisis representa un clon, se tiene una colonia en una placa de transformacin
con un plsmido, la poblacin de fagos que se originan de un evento de infeccin original. Cada
colonia viene de un evento de infeccin original y representa un clon.
Para reproducir el DNA target, se toma un poco de la poblacin de fagos y se lo repica en un
medio de cultivo, al cual se le agrega el doble de la poblacin de bacterias no infectadas, en medio
liquido. Entonces, los fagos infectaran a las bacterias no infectadas y se va a producir nuevamente el
proceso ya comentado. Si a este cultivo se lo centrifuga, en el sobrenadante se van a encontrar los
fagos que van a contener el DNA que se clono, en forma de simple hebra. Para obtener el DNA que
se encuentra en los fagos (simple hebra), lo nico que se debe hacer es separarlo de las protenas de
la cpside. Por otro lado, en el interior de la bacteria, se tendr la forma replicativa del DNA que se
clono.

M13mpX: es un vector

derivado del fago M13.
Posee un origen de
replicacin del fago, un sitio
de mltiple clonado y adems
tiene codificado el fragmento
de la -galactosidasa. En
los cultivos se observan
placas de lisis azules de las
bacterias que estn
infectadas con este vector,
pero si tiene algo clonado, se
observaran placas de lisis
translcidas.
El numero X de este vector coincide
con el numero de los plsmidos de la serie pUC. Por ejemplo, el M13mp18 tiene el mismo sitio de
clonado que el pUC18. Lo que difiere, a veces, en el M13mpX y el pUCX es que el sitio de clonado es
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idntico que se encuentran invertidos con respecto al otro.

Fagmidos
 Aprovechando las caractersticas de los fagos filamentosos, se generaron plsmidos a los cuales
se les inserto un origen de replicacin de fago filamentoso. Estos plsmidos siguen siendo plsmidos
y no se pueden replicar como fagos ya que no tienen los 10 genes que son necesarios para que se
comporten como tal.
Lo que sucede con estos plsmidos es que, como tienen un origen de replicacin de fago
filamentoso, si las bacterias son infectadas por un fago filamentoso, el cual contenga los 10 genes
necesarios para su proceso de replicacin, en el interior de la bacteria se van a generar todas las
protenas requeridas para que el fago se replique y por lo tanto, este plsmido se replicara como fago
filamentoso. Es decir, las protenas codificadas por el fago, van a reconocer al vector como si fuera la
forma replicativa del fago filamentoso, lo van a cortar en el origen del fago dentro del plsmido y va a
comenzar a replicarse como DNA simple
hebra, el cual ira a parar al exterior de la
bacteria, insertados en las protenas de
la cpside, o sea, formaran nuevos
fagos filamentosos.
Una de las ventajas que poseen
estos vectores e que se puede trabajar
con ellos como si fueran un plsmido,
pero si en algn momento se necesita
producir DNA simple hebra, simplemente
se debe infectar con bacterifagos que
poseen el plsmido en su interior y a
partir del mismo se puede obtener en el
sobrenadante molculas de DNA simple
hebra.
Esos vectores son los denominados
fagmidos y son una mezcla de fago y
plsmido.
Una desventaja que presentan los
fagos filamentosos es que poseen un
tamao relativamente alto. Por el
contrario, como el plsmido posee un
tamao mas pequeo, se replica mas
fcilmente y mas eficientemente,
adems, es mas fcil de purificar y mas
fcil de manipular. Con los plsmidos se
puede trabajar con un marcador de
seleccin, cosa que con el fago no. El
fagmido posee esta ventaja del
plsmido y tambin posee la ventaja del
fago que es obtener DNA simple cadena
cuando se necesite.
Para que los fagmidos acten como fagos, generalmente se utilizan fagos helpers que son fagos
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que poseen orgenes de replicacin defectuosos. Entonces, si se infectan con fagos helpers una
bacteria que contena en su interior un fagmido, se replicara mas eficientemente el fagmido que el
helper, por lo tanto, en la poblacin final se va a tener mayoritariamente fagmido y muy poco fago
helper. El fago helper es quien le provee las protenas necesarias para que el fagmido se replique
como fago.

pBluescript: posee un origen de replicacin igual al pUC, resistencia a ampicilina, un sitio de

mltiple clonado, un promotor lac, el fragmento de la -galactosidasa y tiene, tambin, un origen de
replicacin de fago filamentoso.
Aquellos que en el sitio de multipleclonado poseen como
primer sitio de restriccin un sitio KpnI y el ltimo sitio es un
SacI, se denominan KS. Tambin existe el SK que posee el
sitio de multipleclonado invertido al KS. Adems, de cada
uno de los nombrados, KS y SK, hay una forma [+] y una
[-], que se diferencian en la forma en que se da la
replicacin, debido a que tienen el origen de replicacin al
revs. Estos plsmidos, adems, poseen promotores para
RNA polimerasas.

Fago lambda ()
El fago es un bacterifago que tiene un
genoma de DNA doble hebra lineal y posee
unos 50Kpb. Como cualquier fago, es
capaz de infectar clulas insertando el DNA
en su interior y tiene la capacidad de
reproducirse en el interior de las bacterias.
O sea, ni bien se inserta el DNA, lo primero
que sucede es que el DNA se circulariza
formando un genoma circular y comenzara
a replicarse produciendo nuevos genomas
que terminan expresando las protenas de
la cpside. Finalmente ocurrir el proceso
de lisis. Y se liberaran los fagos
ensamblados.
El genoma del fago es doble hebra y
tiene en sus extremos dos pequeas
regiones simple hebra complementaria una
a otra, por lo que, la circularizacin del fago
se produce por interaccin de estas dos
regiones. Estos extremos se llaman extremos COS. Para que se produzca la circularizacin, debe
actuar la ligasa que forma enlace fosfodiesters entre ellos.
La molcula de DNA, ahora circular, comienza a expresar las protenas del fago y comienza a
replicarse. Inicialmente se produce una replicacin de ese genoma circular, produciendo ms
genomas circulares. En un momento dado, el ciclo de replicacin cambia a una replicacin de tipo
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crculo rodante que produce genomas lineales del fago en forma continua, unidos unos con otros. Es
decir, se generan genomas unidos unos con otros por sus extremos COS. Estas estructuras se
denominan concatmeros.
 Los concatmeros son como el sustrato del ensamblado del fago. Es decir, para poder ensamblar
el fago, hay una enzima que corta en los extremos COS generando, precisamente, las dos regiones
simple hebra. Cada uno de los genomas, entonces, se ira ensamblando con las protenas de la
cpside y las protenas de la cola y el fago finalmente es liberado, produciendo lisis celular.
COS

Genoma fago

El fago, en el interior de bacteria, puede tambin insertarse en el genoma de la misma, es decir,

no va a replicarse ni a reproducirse, sino, a insertarse en el genoma de la bacteria en un determinado
sitio y va a sobrevivir junto con la bacteria. Cuando sucede esto, se dice que el fago entra en
lisogenia. Entonces, cuando se reproduce la bacteria, se reproduce el fago y, ante determinada seal,
es capaz de escindirse e esa regin del genoma, generando genomas independientes al de la
bacteria, produciendo fagos y lisis. Este proceso, en el cual se generan nuevos bacterifagos, se
denomina ciclo ltico.
El ciclo ltico depende de la expresin de todas las protenas de todos los genes que estn
codificados en el fago. La transcripcin del genoma del fago, empieza en una determinada regin en
la cual hay dos promotores, uno en un sentido y el otro lugar en el otro sentido.
La transcripcin se da a partir de dos promotores y dependen, sobretodo, de una protena que esta
codificada, la protena CRO. Esta protena es un factor de transcripcin que esta involucrado en la
estimulacin de la transcripcin de los genes del fago. Si hay protenas CRO, se va a producir la
transcripcin, la expresin de los genes del fago y se va a dar el ciclo ltico. Otra protena codificada
es la protena cI. Que se conoce como el represor del fago. Si hay cI, va a reprimir la expresin de
los genes del fago y el fago va a entrar en lisogenia. Del balance entre cI y CRO depende de que el
fago vaya a lisis o vaya a lisogenia.
Una caracterstica
del proceso de
empaquetamiento del
fago es que, para
que se produzcan
fagos infectivos, el
tamao del genoma
puede variar ms o
menos entre 35 y 52
Kpb, pero si el
genoma es mayor o
menor los fagos que se producen no son infectivos. A diferencia de los fagos filamentosos es que se
puede introducir cualquier segmento de DNA en su interior, ya que existe una amplia regin del
genoma del fago que no es necesaria para el ciclo ltico, se puede reemplazar toda esta regin por
el DNA que se desea clonar sin perder infectividad.
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Clonacin en fago: se obtiene en primer lugar el genoma del fago, se corta con enzimas de
restriccin a los lados de la regin no esencial del
fago, obteniendo dos brazos, el derecho y el
izquierdo requeridos estos para el ciclo ltico.
Posteriormente se procede a la ligacin de ambos brazos del fago con el fragmento a clonar. Lo que
sucede tambin es, adems de ligarse el fragmento a los brazos del fago, se van a ligar estos brazos
con otros brazos mediante los sitios COS.
Se van a generar largas molculas de DNA que van a estar unidas por los sitios COS y van a tener
en su interior, o no, los insertos que se desean clonar. Esto, no es otra cosa que un concatmero.
Una vez lograda la ligacin, lo que se hace es generar fagos infectivos in vitro. Se mezcla producto de
ligacin del DNA con extracto de clulas infectadas que tiene todos los componentes requeridos para
el empaquetamiento. De esta manera, se empaqueta el DNA y se producen fagos infectivos. Con
estos nuevos fagos de infectan bacterias que comenzaran a reproducir el DNA que se clono y a
liberar al exterior fagos que poseen el DNA que se clono.
Una de las ventajas que presenta el fago es que permite el clonado de fragmentos grandes de
DNA. Como la zona no esencial del fago es de entre 15 y 20Kpb, es posible clonar fragmentos de
este tamao.
Otra ventaja es el sistema de seleccin entre fagos que recibieron inserto de los que no. Si se liga
el brazo derecho y el izquierdo sin que haya inserto en el medio, se obtendrn fagos con genomas
demasiados chicos y, por lo tanto, no sern infectivos; de esta manera cuando se infecte con estos
fagos solo se van a reproducir aquellos que poseen inserto.
Una tercera ventaja que presentan los fagos es que tienen una alta eficiencia de clonado; o sea,
que una alta proporcin del DNA que se manipula va a terminar en el interior de la clula
reproducindose. Para un plsmido una alta eficiencia de transformacin significa que puede llegar a
tener alrededor de 108 transformantes.g-1. Cuando se trabaja con fago la eficiencia de
empaquetamiento es de 1 en 10, un decimo de las molculas van a producir fagos infectivos y todos
los fagos infectivos van a introducir el DNA en las celular, se van a reproducir. Esto es una ventaja en
el momento de clonar muchas molculas de DNA diferentes, por ejemplo para construir una biblioteca
de DNA (ver biblioteca).

EMBL3: tiene un brazo de 20Kpb y otro de 9Kpb, una regin central de 14Kpb no esencial que
es la que se reemplaza por el DNA que se desea clonar.

Existen otros vectores derivados del fago en los cuales no se reemplaza un pedazo por otro sino
que se inserta un fragmento de DNA determinado. En este caso lo que se clona no son grandes
fragmentos de DNA sino fragmentos relativamente pequeos, pero se usan especficamente porque
tienen una alta eficiencia de clonado. Los vectores de reemplazo derivados del fago se usan por
ejemplo para construir bibliotecas genmicas.
Imagnese que se desea obtener una poblacin de clones que representen todo el genoma de un
organismo, se tienen que clonar fragmentos que en su conjunto represente todo el genoma. Cuanto
ms grandes sean los fragmentos que se puedan clonar menor ser el nmero de clones que se van
a necesitar. Idealmente para obtener una biblioteca genmica se desean clonar fragmentos los mas
grandes posibles. Ahora bien si lo que se desea clonar es una poblacin de molculas de DNA que
representen los mRNA de un tipo celular lo que se desea no es clonar fragmentos grandes sino clonar
muchas cosas distintas. En este caso, son de utilidad los vectores de insercin y no de reemplazo.
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Csmidos:
 Son vectores que permiten clonar fragmentos mayores a 20Kpb. Son plsmidos que adems de
tener todas las cosas que tiene un plsmido (origen de replicacin, marcador de seleccin y MCS),
posee una regin que codifica para dos sitios COS del fago.
Cuando se desea clonar un fragmento en estos vectores, se los trata como a un plsmido, se los
digiere en un sitio de clonado y se liga con fragmentos de DNA grandes (40-45Kpb) que fueron
cortados con la misma enzima o enzimas compatibles. Se produce as, una legacin entre los
fragmentos del DNA y el csmido de manera de favorecer las ligaciones intermoleculares. Entonces
se va a tener que, en algunos lugares, el csmido se uni al fragmento de 30-40Kpb y a su vez ligado
con otro csmido, y as sucesivamente. Finalmente se van a tener fragmentos de DNA que tienen
sitios COS separado por una distancia de aproximadamente 50Kpb. Estas molculas de DNA son
sustrato de un empaquetamiento in vitro mediante extractos bacterianos de bacterias infectadas por
fago. Entonces, se van a cortar por los extremos COS esos fragmentos de DNA y se van a
empaquetar en un fago. Ese fago, cuando infecte bacterias va a introducir al interior de la bacteria el
DNA, el cual se circularizar por sus extremos COS, pero no se van a poder replicar ya que falta la
maquinaria de replicacin del fago. Entonces, el DNA entra, se circulariza y se transforma en un gran
plsmido que tiene en su interior un inserto de casi 50Kpb.
Un problema que presenta este tipo de sistema que estos plsmidos con grandes fragmentos se
replican muy ineficientemente, porque se replican a partir del origen de replicacin del plsmido que
esta preparado para replicar molculas mas chicas. Por este problema, se han desarrollado otros
csmidos que tienen ms orgenes de replicacin de plsmidos conjugativos, los cuales son ms
grandes y se replican ms eficientemente.

Derivados del fago P1

Es un plsmido que posee un origen de replicacin del fago P1 y algunas otras caractersticas
como la maquinaria de empaquetamiento del fago. Permite clonar fragmentos de hasta 100Kpb y su
replicacin y empaquetamiento es idntico a la del fago. La ventaja que posee es que cuando se
desea clonar DNA se hace una induccin con un fago helper del tipo P1 y tiene fagos con el DNA
clonado en el interior.

Vectores YACs
Son sistemas que permiten clonar fragmentos de DNA grandes, no en bacterias sino en levaduras.
Son cromosomas artificiales de levaduras.
Lo que se generan son verdaderos cromosomas eucariotas, que tiene en su interior el DNA
clonado que se desea mantener. Este cromosoma que se genera posee telmeros, centrmero y un
origen de replicacin.
Son plsmidos circulares que tiene una secuencia de los telmeros, un origen de replicacin de E.
coli, un gen de resistencia a ampicilina, un cetrmero de levadura, un origen de replicacin que
funciona en levaduras (ARS) y un sitio de clonado EcoRI.
Se pueden clonar fragmentos que tienen prcticamente el tamao del cromosoma, entre 200 y
1000Kpb.
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