TEZ DE DOCTORAT CIOCAN (MOCO) OANA ALEXANDRA

REZUMAT

Cuvinte cheie:

antibiorezisten, antibiotipare, identificare, Pseudomonas aeruginosa,

RAPD
Teza de doctorat intitulat Caracterizarea rezistenei la antibiotice
a tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa de origine uman i animal n
Romnia este redactat n 8 capitole i este structurat n dou pri
distincte.
Prima parte intitulat Stadiul actual al cunoaterii a fost
fundamentat teoretic pe consultarea unor surse bibliografice reprezentative
i cuprinde 27 de pagini, reprezentnd 18,75 % din volumul tezei. Informaiile
au fost sintetizate n 2 capitole i 6 subcapitole cu referire la: ecologia i
epidemiologia speciei Pseudomonas aeruginosa, implicarea acestei bacterii
n patologia uman i animal; rezistena la antibiotice a izolatelor de
Pseudomonas aeruginosa i mecanismele de aciune antimicrobian a
acestora; tehnicile fenotipice i moleculare de testare i identificare a tulpinilor
de Pseudomonas aeruginosa, n vederea identificrii fenotipurilor rezistente
la antibioticele utilizate n terapia specific.
Partea a II-a, include Contribuiile proprii, prezentate n 117 de
pagini, reprezentnd 81,25% din lucrare i cuprinde 6 capitole i 9
subcapitole, care descriu scopul i obiectivele, cadrul instituional n care s-au
desfurat cercetrile, metodele folosite pentru izolarea i identificarea
tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa, studiul antibiorezistenei la tulpinile de
Pseudomonas aeruginosa de origine uman i animal, cu analiza
sensibilitii la antibiotice a tulpinilor izolate i identificarea tulpinilor de
Pseudomonas aeruginosa productoare de ESBL i MBL prin metode
fenotipice; verificarea existenei unei legturi ntre izolatele de origine uman
i animal prin metod fenotipic (antibiotiparea) i molecular (RAPD-PCR).
Lucrarea nsumeaz 24 de tabele i 99 de figuri, iar bibliografia
cuprinde 94 de titluri bibliografice.
Capitolul 3, cuprinde Scopul i obiectivele cercetrii. Cercetrile
efectuate au urmrit determinarea sensibilitii tulpinilor de Pseudomonas
aeruginosa la antibioticele folosite n terapie i ncadrarea lor n fenotipuri de
rezisten i testarea comparativ a metodelor fenotipice de identificare a
tulpinilor rezistente la antibiotice, n vederea stabilirii unor metode optime de
detectare corect i precoce a antibiorezistenei n condiiile unui laborator

1
 TEZ DE DOCTORAT CIOCAN (MOCO) OANA ALEXANDRA
clinic, avnd ca scop final antibioterapia int n infeciile cu Pseudomonas
aeruginosa.
Obiectivele propuse: 1. determinarea profilului de sensibilitate la
antibiotice a tulpinilor de P. aeruginosa izolate de la animale i de la oameni;
2. recomandarea, pe baza cercetrilor efectuate a unui protocol de identificare
i supraveghere a tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa multidorg-
rezistente; 3. stabilirea unei legturi genetice a tulpinilor de origine uman cu
cele de origine animal; 4. identificarea i declararea n timp util a infeciilor
cu Pseudomonas aeruginosa att n clinicile veterinare ct i umane pentru a
preveni apariia i evoluia focarelor de infecie nosocomial; 5. valorificarea
i diseminarea rezultatelor obinute prin prezentarea lor la manifestri
naionale i internaionale.
Capitolul 4 prezint cadrul instituional n care s-au desfurat
cercetrile.
n capitolul 5 intitulat Izolarea i identificarea tulpinilor de
Pseudomonas aeruginosa, sunt prezentate etapele examenului
bacteriologic desfurate n vederea identificrii i confirmrii tulpinilor de
Pseudomonas aeruginosa izolate. n urma investigaiilor efectuate au fost
izolate i confirmate molecular 125 de tulpini de Pseudomonas aeruginosa de
la pacienii umani i 57 de tulpini de Pseudomonas aeruginosa de la animale.
Tulpinile de origine uman au provenit din aspirate bronice (15%), aspirate
gastrice (12%), lichide pleurale (10%), colecii purulente post-operatorii (21%),
secreii auriculare i oculare (20%), probe de sput (10%), probe de urin
(12%). Cele de origine animal au fost recoltate din otite (30%), abcese
perianale (44%), septicemii (14%), conjunctivite (12%).
Capitolul 6 intitulat Studiul antibiorezistenei la tulpinile de
Pseudomonas aeruginosa de origine uman i animal. Eficiena unui
tratament cu antibiotice este condiionat, n primul rnd, de sensibilitatea
agentului patogen fa de antibioticul respectiv, proprietate care se apreciaz
n vitro prin antibiogram. Scopul esenial al acestor investigaii a fost acela
de a ajuta decizia terapeutic, fiind util n: supravegherea epidemiologic a
rezistenei bacteriene care va orienta ulterior schemele de antibioterapie;
compararea fenotipurilor de rezisten a tulpinilor presupus responsabile de
infecia nosocomial i verificarea corectitudinii identificrii bacteriene, prin
punerea n eviden a rezistenei naturale. Toate tulpinile au fost testate fa
de cele 13 antibiotice care sunt uzual recomandate n patologia infecioas
produs de Pseudomonas aeruginosa.
Din aspirate bronice prelevate de la pacieni umani (H-1) s-au izolat
19 tulpini de Pseudomonas aeruginosa i dintre acestea 5,27% au fost
simultan rezistente la toate cele 13 antibiotice. Un aspect pozitiv este faptul

2
 TEZ DE DOCTORAT CIOCAN (MOCO) OANA ALEXANDRA
c 15,78% din tulpinile testate au manifestat sensibilitate fa de toate
antibioticele testate.
Din aspirate gastrice prelevate de la pacienii umani (H-2), s-au izolat
15 tulpini de Pseudomonas aeruginosa, 6,66% dintre tulpini fiind simultan
rezistente la 11, 8, 7, 3, 2, 1 dintre antibioticele testate, 60% de tulpinile testate
au manifestat sensibilitate simultan la toate cele 13 antibiotice testate. Nu s-
a izolat nici o tulpin multirezistent fa de antibioticele testate.
Izolatele de Pseudomonas aeruginosa din lichidele pleurale (12 tulpini)
(H-3), 8,33% au fost simultan rezistente la 9 antibiotice i la 3 antibiotice.
Cele 12 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din sput (H-4),
7,69% au fost simultan rezistente: fa de 11 antibiotice; 23,07% tulpini fa
de 10 antibiotice; 15,34% fa de 9 antibiotice; 15,34% tulpini fa de 2
antibiotice i 7,69% dintre tulpini au manifestat rezisten la un singur
antibiotic; 12 tulpini testate la grupul H-4, 8 tulpini au fost rezistente la IPM,
MEM.
Din cele 15 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din probe de
urin (H-5), 20% dintre tulpini au prezentat simultan rezisten fa de: 11
antibiotice, 13,33% tulpini fa de 10 antibiotice; 33,33% dintre tulpini au
manifestat rezisten la un singur antibiotic.
Din 25 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din secreii otice de
la pacienii umani (H-6), 4% tulpini au fost simultan rezistente fa de 10 i
respectiv 8 antibiotice.
Tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din colecii purulente (26
tulpini) (H-7), 3,84% au fost rezistente la 13 antibiotice.
Din secreiile otice provenite de la animale (A-1), s-au izolat 17 tulpini
de Pseudomonas aeruginosa, 11,76% dintre acestea au fost rezistente la 13
antibiotice. Toate cele 17 tulpini testate au fost rezistente la PIP i TAZ.
Din coleciile purulente perianale provenite de la animale (A-2) s-au
izolat 25 tulpini de Pseudomonas aeruginosa din care: 36% au fost rezistente
la cele 13 antibiotice testate.
Grupul A-3: 8 tulpini de Pseudomonas aeruginosa izolate din
hemoculturi provenite de la animale (A-3), 25% au fost rezistente la 12
antibiotice, 7 tulpini au fost rezistente la PB i ATM, 6 tulpini au fost rezistente
la MEM, 5 tulpini au fost rezistente la CIP i IPM, 3 tulpini au fost rezistente la
TOB i 2 tulpini au fost rezistente la AK. Toate cele 8 tulpini testate au fost
rezistente la TZP, PIP,FEP,CAZ i TZP.
Din probele de secreii conjunctivale provenite de la animale (A-4) s-
au izolat 7 tulpini de Pseudomonas aeruginosa din care, 71,42% au fost
rezistente la toate antibioticele testate. Toate cele 7 tulpini testate au fost
rezistente la TZP,CAZ, FEP,CIP,GN, PB, PIP, ATM.

3
 TEZ DE DOCTORAT CIOCAN (MOCO) OANA ALEXANDRA
Utilizarea mediului de cultur Briliance ESBL a permis creterea i
multiplicarea a 68% din tulpinile de Pseudomonas aeruginosa de origine
uman i 100% tulpinile de origine animal.
n urma testului de sinergie ntre dou comprimate pentru detectarea
ESBL lotul de tulpini testat nu a prezentat zone de inhibiie sugestive/relevante
pentru identificarea tulpinilor de ESBL, respectiv creterea zonei de inhibiie
n jurul antibioticului potenat cu inhibitor -lactamaz. Prin metoda discurilor
combinate (Oxoid/Becton Dickinson - "Combination Discs" i Mast "MAST
DD") s-a evideniat o cretere a diametrului de inhibiie cu > 5 mm n prezena
clavulanatului, ceea ce indic prezena de ESBL.
Metoda discului combinat imipenem-EDTA pentru depistarea metalo-
-lactamazelor, aplicat doar pe tulpinile care au fost rezistente la imipenem
(52 tulpini de origine uman i 37 de origine animal) a surprins prin faptul c
toate aceste tulpini elaboreaz enzime metalo-beta-lactamaze. Pentru
susinerea rezultatului, aceleai tulpini de Pseudomonas aeruginosa, au fost
testate i cu E-test MBL. Rezultatele au confirmat faptul c cele 89 tulpini de
Pseudomonas aeruginosa, testate pentru metalo-beta-lactamaze, au fost
pozitive la acest test.
n capitolul 7 intitulat Supravegherea epidemiologic a tulpinilor
de Pseudomonas aeruginosa, sunt prezentate datele privind
supravegherea epidemiologic a tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa
obinute prin antibiotipare i teste moleculare.
Antibiotiparea izolatelor s-a realizat cu programul UPGMA
(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) / Quantity One
Software (Bio Rad Laboratories, SUA), lotul studiat a fost mprit 2 grupuri,
primul cuprinznd 125 tulpini de origine uman i 57 tulpini de origine animal.
Conform acestor rezultate; 57 de tulpini de origine animal izolate au fost
colectate n 4 grupe principale (A1-A4) pe baz de 70% similitudini. Pe de alt
parte, 125 izolatele umane au fost colectate n 7 grupe principale (H1-H7) la
70% similitudine. Antibiotiparea este o metod prin care se identific un tipar
dintr-un lot total analizat, cu ajutorul lui se poate urmri ntr-un circuit nchis
proveniena tulpinilor izolate (ferme, spitale etc.). Antibiotiparea poate fi
utilizat ca metod de supraveghere epidemiologic.
Tulpinile analizate cu tehnica molecular RAPD prezint un grad
ridicat de nrudire genetic, ceea ce poate concluziona c tulpinile provin din
acelai mediu i informaia genetic se transmite de la o tulpin la alt.
Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa au fost grupate n funcie de
proveniena lor: 125 tulpini de Pseudomonas aeruginosa de origine uman,
reunite n 7 grupe (H1-H7); 57 de tulpini de Pseudomonas aeruginosa de

4
 TEZ DE DOCTORAT CIOCAN (MOCO) OANA ALEXANDRA
origine animal, reunite n 4 grupe (A1- A4), izolate din: secreii auriculare,
abcese perianale, septicemii i secreii conjunctivale.
Grupul H-1 (aspirate bronice) a fost alctuit din 3 clustere, fiecare
cluster avnd coeficient diferit de nrudire genetic: cel mai mare grad este
atribuit primului cluster, H1 RD1, H1 RD2 i H1 RD3, respectiv tulpinile
115, 78 i 53, nrudirea profilelor din interiorul lui fiind de 80% - 85 %;al 2-lea
cluster are coeficient de similitudine de 71%, H1 RG1 i H1 RG2,
reprezentat de tulpinile 59 i 52, similar primului cluster cele dou tulpini la
antibiotipare au fcut parte din acelai cluster; al 3-lea cluster are un grad de
nrudire genetic de la 75% la 84%, acest cluster predomin n grupul
analizat. Relaionarea ntre tulpinile 115 i 53 a fost identificat i la
antibiotipare, cele dou tulpini aparinnd aceluiai cluster, ceea ce confirm
nrudirea lor genetic.
Grupul H-2 (aspirate gastrice) a inclus 14 tipuri de profile genetice din
care 4 sunt de tip unic: primul cluster cuprinde 3 tipuri de profile cu grad de
nrudire genetic de 84%; cu predominan n grup este cel de-al 2-lea cluster,
cu coeficient de nrudire de 75%, clusterul fiind format din 7 tipuri de profile;
un grad nalt de nrudire este reprezentat de perechea de profile H2 RF6 i
H2 RF7, fiind vorba de tulpinile 23 i 12
Grupul H-3 (lichide pleurale) a inclus 2 clustere: primul avnd
coeficient de similitudine de 77% i este format din 2 tipuri de profile; al 2-lea
cluster, ce predomin n grup, are 4 tipuri de profile, astfel grupul are 10 tipuri
de profile din care 4 sunt de tip unic. nrudirea genetic ce depete
procentul de 90% o ntlnim ntre profilele H3 RF3 i H3 RF4, fiind
reprezentate de tulpinile 90 i respectiv 87. La antibiotipare cele dou tulpini
au prezentat un coeficient de similitudine de 0,78, similitudine fiind acum
dovedit prin nrudirea genetic de 90%.
Grupul H-4 (sput) a inclus 3 clustere i 4 profile genetice de tip unic:
primul cluster are 2tipuri de profile genetice, coeficientul de nrudire depete
pragul stabilit de 0,70; cel de-al 2-lea cluster este nrudit ntr-un procent de
72%, fiind format din profilul H4 RE1 i H4 RE2, respectiv tulpinile 98 i
97; ultimul cluster este format din 4 tipuri de profile genetice, gradul lor de
nrudire variaz de la 71% la 76%.Toate tulpinile din acest grup provin de la
pacieni cu aceeai patologie de fond, respectiv pacieni diagnosticai cu
Fibroz chistic.
Grupul H-5 (uroculturi) a inclus 3 clustere i 3 tipuri unice de profile
genetice: primul cluster este format din 2 tipuri de profile genetice, avnd
coeficient de nrudire de 79%. cel de-al 2-lea cluster, cu procentajul de
nrudire superior primului, 82%, este format din 2 tipuri de profile, H5 RE1 i
H5 RE2, fiind vorba de tulpinile 114 i 22 izolate de la pacieni cu patologii

5
 TEZ DE DOCTORAT CIOCAN (MOCO) OANA ALEXANDRA
de fond diferite, avnd n comun mediul de provenien; ultimul cluster,
predominant n acest grup, este format din 7 tipuri de profile cu diferite
procente de similitudine, de la 74% pn la 92%. Cel mai mare procentaj de
nrudire fiind la perechea de profile H5 RF1 i H5 RF2, reprezentate de
tulpinile 51 i 32, aceste izolate provin de la pacieni diferii cu patologii diferite.
Grupul H-6 (secreii auriculare) a inclus 4 clustere cu 20 de tipuri de
profile genetice i 2 profile genetice unice: primul cluster fiind reprezentat de
2 profile ce au coeficient de nrudire de 0,78. Similar primului cluster, al 2-lea
i al 3-lea cluster cuprind cte 2 tipuri de profile genetice avnd coeficient de
nrudire inferior primului, respectiv de 0,71 i 0,75, nrudirea lor fiind
semnificativ deoarece depete pragul de 0,70 stabilit prin formul
matematic. Al 4-lea cluster cuprinde 12 tipuri de profile genetice, cu
procentaje diferite de nrudire genetic, de la 74% pn la 90%. H6 RF11 i
H6 RF12, reprezentate de tulpinile 112 i 103, 105, 121 care au profilele
genetice identice de 90%, ele au fost izolate de la pacieni diferii, internai n
uniti diferite deoarece patologiile de fond nu au fost similare.
Grupul H-7 (colecii purulente postoperatorii) a inclus 3 clustere cu 21
de tipuri de profile genetice i 7 profile de tip unic: primul cluster are coeficient
de nrudire de 0,71, n interiorul lui ajungndu-se pn la 92% nrudirea
genetic. Al 2-lea cluster este alctuit din 5 tipuri de profile, coeficientul de
nrudire variaz de la 0,74 pn la 0,90. H7 RI1 i H7 RI2, reprezentate
de tulpinile 38 i 26 au profilul genetic nrudit n proporie de 90%, izolatele
provin de la pacieni diferii cu patologii de fond diferite. Al 3-lea cluster
analizat este format din 6 tipuri de profile genetic nrudite n procentaj de 73%
pn la 93%. Profile H7 RJ5 i H7 RJ6, reprezentate de tulpinile 107 i
99, au coeficient de nrudire de 0,93. Izolatele provin de la pacieni care provin
din acelai mediu social, cu aceeai vrst, dar cu patologii de fond diferite
de tip cronic.
Grupul A-1 (exsudate otice) a inclus 2 clustere cu 9 tipuri de profile
genetice: primul cluster cuprinde 3 tipuri de profile cu coeficient de nrudire de
0,73; cel de-al 2-lea cluster este format din 6 tipuri de profile, nrudirea
genetic variaz de la 72% pn la 94%. Profilele A1 RB5 i A1 RB6,
reprezentate de tulpinile 140 i 131 au gradul superior de nrudire genetic.
Grupul A-2 ( colecii purulente perianale) a inclus 3 clustere cu 18
tipuri de profile genetice i 5 profile de tip unic: primul cluster este format din
2 profile cu coeficient de nrudire genetic de 0,72. Al 2-lea cluster nsumeaz
3 tipuri de profile cu variaii ale coeficientului de nrudire de la 0,71 pn la
0,83. Al 3-lea cluster din acest grup, predominant de altfel, cuprinde 7 tipuri
de profile genetice, similar celui de-al 2-lea cluster i aici ntlnim variaii ale
coeficientului de nrudire, de la 0,72 pn la 0,86. Tulpinile ce reprezint

6
 TEZ DE DOCTORAT CIOCAN (MOCO) OANA ALEXANDRA
profilele genetice din ultimul cluster au n comun rezultatele la antibiogram,
unde ntlnim o rezisten de aproximativ 100%.
Grupul A-3 (hemoculturi) a inclus un cluster cu 5 tipuri de profile
genetice i un singur profil de tip unic. Clusterul are coeficient de nrudire de
0,74. n interiorul lui profilul A3 RB3, reprezentat de tulpinile 149, 150, 151
i 156 i profilul A3 RB4 reprezentat de tulpina 139 prezint 88% nrudire
genetic.
Grupul A-4 (secreii conjunctivale) a inclus un cluster cu 3 tipuri de
profile genetice i un singur profil de tip unic: coeficientul de nrudire ajunge
pn la 79%. A4 RB2 i A4 RB3. Tulpinile prezint 79% grad de nrudire
iar profilul de rezisten este aproximativ identic la aceste tulpini, care provin
de la specii diferite (iepure, pisic, i cine).
Analiza de grup, realizat pe tulpinile reprezentative fiecrui profil a
evideniat un singur cluster i 6 profile de tip unic. Clusterul este format din 5
tipuri de profile genetice, fiecare profil este reprezentat de cte un izolat din
grupe diferite: TRG1 H1 (aspirate bronice recoltate de la oameni), TRG2
A4 (secreii otice izolate de la animale de companie), TRG3 A3 (septicemii
de la animale), TRG4 H7 (izolate din secreiile purulente postoperatorii de
la oameni), TRG5 A2 (izolate din abcese perianale de origine animal). Cele
6 profile de tip unic sunt: TRA H4 (izolate din sput), TRB H6 (izolate din
secreii otice), TRC H3 (izolate din lichide plurale), TRD A1 (izolate din
secreii otice), TRE H5 (izolate din probe de urin), TRF H2 (izolate din
aspirate gastrice). n interiorul clusterului procentele de nrudire genetic
variaz de la 73% pn la 91%. Profilul cu cel mai mare procentaj de nrudire,
respectiv 91%, format din TRG4 H7 i TRG5 A2, a fost reprezentat de
tulpinile izolate de la oameni din secreiile postoperatorii i tulpini izolate din
abcese perianale de la animale care au 91% procentul de nrudire genetic.
n capitolul 8 intitulat Concluzii finale i recomandri, sunt
structurate 9 concluzii principalele i 9 recomandri, desprinse n urma
investigaiilor efectuate.