CAPITUI,O III

BACTERIAS H^TEROTROFAS

i. Fijadoras del nitrgeno atmosfrico.

 Como ya se ha ndicado (prmera pare - 2g), las bacterias hete-
rtrofas, al carecer del poder de sntesis, han de utilizar - para la
elaboracin de su propio cuerpo y para obtener la energa necesaria al
mantenimiento de sus funciones vitales - materia orgnica formada
por otros organismos. A estos fines, tales bacterias utilizan compues-
tos orgnicos complejos, tales como los proteidos y los productos de
su hidrlisis, polipptdos e incluso aminocidos, las grasas y cidos
grasos y los glcidos, presentando algunas bacterias preferencia^ por
determinados grupos, raientras que otras pueden utilizar como fuente
de carbono y energfa una gran variedad de materias.
El nitrgeno lo obtienen preferentemente unas bacterias de pro-
tenas complejas, albumosas o peptonas, mientras que otras son ca-
paces de fijar drectamente el nitrgeno atmosfrico. Atendiendo a
este modo de adquirir su nitrgeno, pueden clasificarse las bacterias
hetertrofas de la siguiente forma:

Z. - BACTRRIAS FIJADORAS DRI, NITRbG^NO ATMOSIrk^RICO.

- Anaerobias.
a) Bacterias libres . ^ I
^ II. - Aerobias.
b) Bacterias en simbiosis.

2. - BACTERIAS A^ROBIA5 QU^ NECF.SITAN NITRGRNO COMBINADO.

a) Formando es fioras.

b) No f ormando es^oras.

^. - BACT^RIAS ANA^ROBIAS QUI3 NDC$SITAN NITRGI:NO COMBINADO.

- 45 -
 i. - Bacterias fijadoras del nitrgeno atmosfErico.

a) I. - BACT^ttiAS LisR>rs nxA^xosrAS. -(Vase primera parte,

pginas io$-ii3.)
Para el aislamiento de estas bacterias, tuvo Winogradsky la feliz
idea de utilizar un medio de cultivo desprovisto totalmente de nitr-
geno, en el que slo podran desarrollarse aquellos organismos capaces
de proporcionarse el nitrgeno de la atmsfera. ^1 medio empleado
por Winogradsky (iog) fu el siguiente:
Fosfato bpotsco (S^I3P0^) .... .... .. . . . . . . i,o gramos.
Sulfato magnEsco (MgSO^ ' 7Hy0) ... . . . . . . . . o,x r
Clornro sdico (NaCI) .... . .. . . .. . . . . . . . . . . . o,oi r
Sulfato ferroao (PeSO^ ^H^O) .. . . . . . . . . . . . . o,oi
Snlfato de manganeso (MnSO^ 4Ii^0) .. . . .. . o,oi ^
Glucosa ......... ......................... xo,oo ^
Carbonato clcico (CaCos) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30,00 +
Agua destilada ............................ iooo c.c.

Para evitar la descomposicin de la glucosa, conviene esterilizar

el carbonato de cal separadamente. .
El medio se distribuye en matraces pequeos de i5o c. c. de cabida,
llenos hasta el cuello, que se esterilizan a iio^ durante treinta minu-
tos, aadiendo a cada uno de ellos unos 4 gramos de carbonato de cal.
5e prepara un extracto de suelo pasteurizado, para lo cual se
ponen 5o gramos de1 suelo en 20o c. c. de agua, calentando Ientamente
hasta los $o^, temperatura que se mantiene durante quince minutos.
5e enfa rpidamente, y mediante pipetas esterilizadas se inoculan
los matraces, poniendo en cada uno de ellos io c. c. del e^racto de
suelo. Se incuban a 25^ 30^, observndose la formacin de abundantes
burbujas gaseosas, ndice de la fermentacin butrica que se extiende
por todo el Iquido, mientras que las partculas de carbonato se recu-
bren de un muclago en el que se encuentran bacterias anaerobias
pertenecientes al gnero Clostridium, y especie denominada por Wino-
gradsky Cl. ^astorianum. El cultivo se enriquece haciendo trasplantes
sucesivos en el mismo medio, utilizando como inculo una partcula
del carbonato de cal del fondo del cultivo. I,as observaciones micros-
cpicas hay que efectuarlas en gotas de lquido tomadas del fondo de1
matraz con una pipeta esterilizada.
Para obtener cultivos puros se calienta a 7g^, durante diez minutos,
un cultivo enriquecido, con lo que mueren las bacterias que no forman
esporas, y este cultivo sirve para inocular trozos de patata, que pre-

^46_
viamente han sido espolvoreados con carbonato de cal y esterilizados
en placas de Petri. Las placas inoculadas se incuban a 30^, en condi-
ciones anaerobias, en vaco parcial o en atmsfera de hidrgeno, y
al cabo de unos seis das pueden observarse sobre la superficie de la
patata colonias amarillentas, redondeadas, llenas de burbujas gaseosas,
formadas por Clostridium pastorianum.
Como medio para el aislamiento y cultivo de las bacterias produc-
toras de cido butrico, puede emplearse tambin el siguiente medio
slido (=4):
Glucosa ................................. I,o gramos.
Peptona Witte ........................... I,2
Eztracto de carne I,ebig ......... .. . . . . . . . 0,8
Goruro sdco (NaG) .... . . . . . . . . . . . . . . . . o,z
Agar ................................... I,6
Agua destilada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ioo c, c.
Reacdbn ligeramente alcaliaa.

I,as bacterias del gnero Clostridium son bastoncillos anaerobios

o microaerfilos, que, al esporular, se ensanchan en forma de huso
(Clostridium de Fischer) o de palillo de tambor (Pkctridium de Fis-
cher). Bredeman (i4) incluy en una sola especie, Bacillus amylo-
bacter, todas las bacterias que tienen la propiedad de fijar nitrgeno
atmosfrico y llevar a cabo la fermentacin de diversos gltcidos con
formacin de cido butrico y alcohol butlico. Aun cuando autores
como Omeliansky (76) se mostraron disconformes con esta agrupa-
cin en una sola especie, de bacterias tales como Clostridium, Granu-
lobacter, Plectridium, etc., esta misma norma ha sido seguida por
Bergey en su Manual, que, como se ve a continuacin, incluye en la
especie Clostridium butyricum Prazmowsky una serie de bacterias
descubiertas por diversos investigadores en diferentes medios y pro-
cesos, entre ellas el Clostridium ^astorianum, encontrado por Wino-
gradsky.
Clostridium butyricum Prazmowsky.
(Botan. Zeitung, 37^ 409: 1879)
Slxoxlnaes. - Vibrion butyrique Pasteur (Compt. Rend., 5z^ 334: 1861). Bacillus
amylobacter van Tieghem (Bul1. Soc. Bot. France, z4: Iz8; 1877). Bacillus butyricus
Botkin (Zeit. f. Hyg., II: 42I; 18gz). Granulobacter saccharobutyricum Beijeriack
yGranulobacter lactobutyricum Beijerinck (Verhandl. d. K. Akad. v. Wetenschappen,
Tweede Sectie, Deel I, Amsterdam, 18g3). Granulobacter butylicum Beijerlnck
(Arch. Neerland., zg, 1896). Clostridium pastorianum Winogradsky (Centbl. Bakt., II,
9^ 43: 19oz). Plectridium plectinovorum Storner (Centbl. Bakt., II, Ig: 171; Igo4).
Bacillus amylobacter Bredemann (Centbl. Bakt., II, z3^ 385: 1909)

- 47 -
 Bastoncillos, de o,7g a i X 3 a zo , presentndose aislados,
en parejas y en cadenas largas. Pueden producir formas delgadas,
de o,s de ancho. En los cultivos jvenes se mueven activamente
con flagelos pertricos. Fsporas ovales centrales de i X 2 a 5 . Acu-
mula glicgeno en sus clulas y es Gram positiva.
Picadura profunda en gelatina: No muestra licuacin.
Colonias en agar-suero (anaerobias): Pequeas, aplastadas, irregu-
lares, gris.ceas, semitransparentes.
Colonias en agar simple y glucosado, en bisel (anaerobias): Gri-
sosas, aplastadas, hmedas, eatendidas, con bordes irregulares,
laciniados.
Colonias profundas, en cultivos de agar en masa, compactas, de
2 a 3 mm. de dimetro, con porcin central densa y periferia lanosa
poco definida.
I,a picadura profunda en agar muestra un desarrollo filiforme gra-
nuloso.
^nturbia el caldo glucosado.
Coagulacin cida de 1a leche tornasolada, con formacin abun-
dante de gas y reduccin precoz del tornasol.
Sobre patata (con carbonato de cal), formacin de una pelcula del-
gada, estensa, difcilmente perceptible, en la que posteriormente apa-
recen puntos elevados amarillentos. El medio se hace blando y friable,
con formacin de burbujas gaseosas.
No forma indol.
No lica el suero sanguneo.
Reduce los nitratos a nitritos y amonfaco.
Fermenta la glucosa, maltosa, lactosa, sacarosa y el almidn, con
formacin de cidos, gases y alcoholes, en cantidades dependientes
de la temperatura, de la cantidad de hidrato de carbono fermentable
y de las substancias nitrogenadas de que disponga. Forma principal-
mente cido butrico, con cantidades menores de cidos propinico,
actico y frmico. I,os gases formados son CO, y H=. I,os alcoholes
formados son los butlico, proplico, etlico y trazas de amlico, de-
pendiendo de la composicin de las substancias fermentadas. De ordi-
nario se forman dos partes de alcohol por una de acetona.
Fija el nitrgeno atmosfrico.
Anaerobia, aun cuando soporte pequeas cantidades de oxgeno;
con 3o mmgs. de oxgeno por litro las esporas llegan a germinar.
Temperatura ptima: 30o a 400,
Reaccin mnima: pH = 5. fdem bptima: pH = 6,g a ^,3.

-4$-
 I,a presencia del Clostridium en casi todos los suelos del Globo ha
sido comprobada por diversos investigadores, principalmente por
Winogradsky (iog), Omeliansky (^6), Preudenreich (qI) Haselhoff
y Bredeman (48).

a) II. - BACT^RIAS I.IBR^s ArROBIAS. - En el anterioi mtodo

para el aislamiento de bacterias anaerobias, fijadoras de nitrgeno,
la pasteurizacin o calentamiento del suelo hasta 80^ practicada por
Winogradsky tena por finalidad simplificar la flora bacteriana del
suelo eliminando los microorganismos que no eran susceptibles de espo-
rular. Beijerinck (6), empleando una tierra de jardn sin pasteurizar,
inoculada en un medio sin nitrgeno que contena manita como fuen-
te de carbono, e incubando a 25^ 30^, encontr una bacteria en
forma de bastoncillos bastante anchos y a veces semejantes a levaduras,
inmviles o mviles con ayuda de un solo flagelo polar, aerobia obli-
gada, que de ordinario se desarrollaba formando sobre la superficie del
medio de cultivo una pelcula griscea que ms tarde torna color pardo.
Beijerinck denomin a esta bacteria Azotobacter chroococcum, compro-
bando su presencia en casi todos los suelos ensayados y en el estircol.
Una porcin de la pelcula formada puede trasplantarse a otro
matraz con el mismo medio de cultivo:
Manita .................................... 20,o gramos.
Irosfato bipotsico (g^HPO^) ........ . . . . . . . . . o,z
Agua correttte .............................. iooo c.c.

Y despus de varios trasplantes, se tiene un cultivo suficientemente

enriquecido que permite el aislamiento del Azotobacter. Para ello, de
un cultivo reciente en que la pelicula formada sea todava muy del-
gada, se toma con e1 asa de platino una gota, que se diluye en agua
esterilizada, agitando para separar las clulas bacterianas; a partir
de sta, se hace una segttnda dilucin, y luego, una tercera, que se
utilizan para inocular, en estras, placas del rnedio de cultivo, solidi-
ficado por la adicin de un 2 por ioo de agar. Se incuban las placas
a 25^, y a los pocos das aparecen las colonias de Axotobacter, redon-
deadas, elevadas, convexas, lisa.s, plidas, semiopacas, hmedas y
viscosas, a menudo de 4 a 8 mm. de dimetro, que se seleccionan cui-
dadosamente con ayuda del microscopio para diferenciarlas de las
colonias transparentes y elevadas del Bacterium radioacter, que, con
frecuencia, acompaa al Axotobacter, y al que a veces cuesta trabajo
eliminar en la obtencin de cultivos puros.

- 49 _.
 Fn lugar del medio de Beijerinck, puede emplearse cualquiera de
los siguientes:
Solucin de Li^man (60):
Manita ................................... i5 gramos.
SHPO^ .................................. 0,2
MgSO^ ^H=O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.2
CaCI^ .................................... 0,02
Agna deatilada ......... ... . . . . ... . . . . .. .. .. iooo c, c.
FeCI,: Una gota de soludn al ra por ioo.

Una vez disueltas las substancias, se aade la cantidad de solucin

de NaOH, al io por ioo, necesaria para que la fenolftalena tome colo-
racin ligeramente rosa.
Solucin de Ashby (i):
Manita .................................... io gramos.
SHPO^ ................................... 0,2
MgSOj ^H^O ............................. 0,2
NaCI ..................................... 0,2
CaSO^ 2H^0 ............................. o,i r
CaCO .................................... g,o
Agua destilada ............................. iooo c. c.
Neutralizar con NaOH como la anterlor.

I,os cultivos puros de Azotobacter se obtienen fcilmente utilizando

el gel silceo de Winogradsky, que se prepara partiendo de una solu-
cin a125 por xoo, hecha con partes iguales, de silicatos sdico y pot-
sico, cuyo peso especfico se lleva a i,o6. En una placa de Petri se
colocan g c. c. de esta solucin, agregando una cota de fenolftalena.
Se prepara una solucin de cido clorhdrico a15 por ioo, y se va agre-
gando al silicato con una pipeta graduada, hasta que desaparezca
el color rojo, y se ajusta la solucin de HCl de tal modo que 5 c. c. neu-
tralicen 5 c. c. de 1a de silicatos.
Para preparar 1as placas de ge1 silfceo se mezclan en un frasco vo-
lfimenes iguales de soluciones de silicatos y de HCI, agitando vigoro-
samente y vertiendo con rapidez en placas de Petri, que se colocan
horizontalmente hasta que coagule el gel, lo que tarda de cinco a diez
minutos. I,uego se llevan a recipientes de poco fondo, donde se dializan
en agua corriente hasta la desaparicin de los cloruros, lo que requiere
unas veinticuatro horas, trasladndolas despus a un vaso estril que
contenga agua destilada hervida, que se renueva varias veces. Des-
pus de bien lavadas, se escurren, y se tratan con la solucin nutri-
tiva que convenga emplear.

-5^-
 l^n el caso del Azotobacter, se echa sobre la superficie del gel solu-
cin de manita, y se llevan las placas, descubiertas, a una estufa de 60^,
para que se evapore el egceso de lquido, cuidando de que el medio no
se deseque demasiado (*).
Las placas se inoculan con pequeas porciones de suelo y se incu-
ban a 28^, formndose las colonias de Azotobacter alrededor de las
partculas de suelo, de donde pueden llevarse al medio lquido de
cultivo.
Las bacterias del gnero Azotobacter tienen, como hemos indicado,
forma de bastoncillos anchos, y a veces redondeada, obteniendo la
energa que necesitan para su desarrollo mediante la ozidacin de
glcidos. Son mviles o inmviles; en el primer caso pueden poseer
un solo flagelo polar o un manojo de flagelos tambin polares.
Varios autores, Beijerinck entre ellos, niegan la formacin de espo-
ras en este gnero, mientras que Ashby, Fischer y Krzemieniewski
creen en ella, toda vez que puede resistir la desecacin durante pro-
longados perodos. Prazmowski (78) demostr que la formacin de
esporas tiene lugar en condiciones normales, con suficiente aireacin,
en presencia de humatos. I,as principales especies del gnero Azoto-
bacter son las siguientes (9):

Azotobacter chroococcum Beijerinck.

(Centbl. Bakt., II, 9: 3-43: i9o2)

Bastoncillo, de 2 a 3 X 3 a 6 K, presentndose en parejas y paque-

tes y rara vez en cadenas. I,as clulas presentan tres o cuatro grnulos
refringentes y estn rodeadas de una membrana mucilaginosa de espe-
sor variable, que toma color pardusco en los cultivos viejos. I,a ma-
teria colorante es soluble en agua, alcohol, ter y cloroformo. Mvil
por medio de un flagelo polar.
Colonias en gelatina: Pequeas, circulares, amarillas, granulosas.
Con el tiempo toman color pardo amarillento.
Picadura profunda en gelatina: Crecimiento dbil. No lca Ia
gelatina.
Picadura profunda en agar-manita: Gris tendiendo a pardusco.

(^) 7,os medios silfceos no necesitan esterilizatse, toda vez que los lavados con
agua esterilizada, seguidos del empleo de medios muy selectivos, son suficientes para
asegurar la esterilidad en lo que se refiere a contaminaciones de la atmsfera.

- 51 -
 Caldo: No se desarrolla.
Leche tornasolada: Se aclara de diez a catorce das.
Patata: Brillante, escasamente perceptible, viscosa y rugosa, pardo
achocolatado.
Pste organismo fija nitrgeno atmosfrico y desprende CO=, utili-
zando las siguientes substancias como fuente de energa: glucosa, levu-
losa, maltosa, manita, inulina, dextrina, galactosa, arabinosa, lactosa,
almidn, glicerol, alcohol etlico, acetatos, butiratos, citratos, lactatos,
malatos, propionatos y succinatos.
Aerobia.
Temperatura ptima: 250.
Habitat: Se ha comprobado su presencia en casi todos los suelos
con pH supenior a 6,0.

Axotobacier agilis Beijerinck.

(Cex^bl. Bakt., II, ^: g61-g8z; 190I.^

Bastoncillos, de 4 a 6 de longitud, casi esfricos.

Muy movible con ayuda de una manojo polar de cuatro a diez
flagelos.
Se desarrolla en medios carentes de compuestos orgnicos de ni-
trgeno.
Colonias sobre agar-manita: Circulares, blancoagrisadas, transl-
cidas, con centro blanquecino.
Colonias sobre agar lavado: Muestran ligera fluorescencia verde
azulada.
Cultivo sobre agar-manita en bisel: Grisceo, translcido, fluores-
cente.
Cultivo sobre agar lavado, en bisel: Blanco amarillento, liso, bri
llante, translcido, con centro opaco.
Caldo: Se enturbia, con formacin de anillo.
I,eche tornasolada: Se aclara de diez a catorce das.
Cultivo sobre patata: Blanco amarillento, mucilaginoso, tomando
ms tarde color pardo amarillento.
^n presencia de cidos orgnicos, se forma un pigmento verdoso
o rojizo.
Aerobia.
Temperatura ptima: 280.
Habitat: 1^ncontrada en las aguas de los canales de Delft.

-$Z^
 Aaotobacter vinelandii 7,ipman.
(New Jersey Agr. Exp. Sta. Rapt., z4: ziy-z8g; igo3.)

Bastoncillos, de 2 a 3 X 3 a 6 . Se presentan aislados, en parejas

y en cadenas cortas. Mvles por medio de un flagelo polar.
Colonias sobre agar-manita: Grandes, circulares, blancas, ligera-
mente transparentes, con fluorescencia verdosa.
Caldo glucosado: Enturbiamiento eon ligero sedimento algodonoso.
I,eche tornasolada: Se aclara de diez a catorce das.
Cultivo sobre patata: Aplastado, amarillento, pasando a pardo
claro.
Aerobia.
Temperatura ptima: 2go.
Habitat: ^ncontrada en suelos de Nueva Jersey.

Azotobacter Beijerinckii I,ipman.

(New Jersey Agr. Ezp. Sta. Rep., z4^ ^i7-z$5. 1903: 25^ 237-289. 19o4 ^

Clulas, de 3 a 4 X 5 a 6 , que se presentan aisladas, en pares o,

ms raramente, en cadenas. Mviles por medio de un flagelo polar.
Colonias sobre agar-manita: Circulares, blancas o amarillo de
azufxe.
Sobre agar-manita, en bisel: Blanco, pasando a amarillo de azufre.
Caldo glucosado: No se enturbia. Sobre la superficie flotan peque-
as masas circulares blancas.
I,eche tornasolada: Se aclara de diez a catorce das.
Sobre patata: Aplastado, amarillento, brillante, pasando a amarillo
pardusco.
Aerobia.
Temperatura ptima: 250.
Habitat: 5uelo.

Axotobacter vitreus I,hnis y Westerman.

(Centbl. Bakt., II, ^z: z34-z54 1908.)

Clulas esfricas, de unos 2 de dimetro, inmviles, que se pre-

sentan aisladas o en grupos.
Colonias en agar-manita: Pequeas, circulares, blancas,ligeramente
translcidas, brillantes.
Caldo glucosado: Sedimento mucilaginoso.

-53-
 I,eche tornasolada: Se adara de diez a catorce das.
Patata: Desanollo ligero, escasamente vsible.
Aerobia.
Temperatura ptima: 2g^.
Habitat: Suelo.
* * s

Adems de 1as bacterias de los gneros Clostrdium y Axotobacter,

se ha observado en cultivos de otras bacterias existentes en el suelo
la propiedad de fijar el nitrgeno atmosfrico. ntre otras, mencio-
naremos el Bacillus asteros^orus (Meyer) Migula, que puede fijar
de i a 3 mgs. de nitrgeno por gramo de glucosa consumido (14);
el Bacterium radioacter (63}, y una forma afn al Proteus vulgaris, ca-
paz de fijar de r,& a 4,^ mgs. de nitrgeno por gramo de azcar con-
sumido (94)
Sin embargo, para Winogradsky, las bacterias fijadoras de nitr-
geno, cuya presencia se ha sealado en el suelo, deben agruparse en
dos categorlas:
I.s Agentes fijadores neutrales, que comprenden a Ios dos grupos
clsicos del Clostrdium ^iastorianum y Axotoacter, cuya funcin nor-
mal consiste en la fijacin del nitrgeno; y
2.s Agentes fijadores artificiales, que comprenden aquellos orga-
nismos que pueden fijar pequeas cantidades de nitrgeno en las
condiciones artificiales del laboratorio, y que no parece tomen parte
en el proceso de fijacin de ntrgeno del suelo.

b) BACTERIAS ^x sl^slosls. -(Vase primera parte, pgi-

nas I14-I16.) - Poco tiempo despus de los trabajos de Hellriegel y
Wilfarth sobre el origen de las nudosidades de las races de las legu-
minosas y su intervencin en la fijacin del nitrgeno atmosfrico,
consigui Bejerinck (4) aislar en cultivo puro al microorganismo cau-
sante del proceso, que denomin Bacillus radicicola, y que, segn l,
se encontraba en el suelo en forma de pequeos bastoncillos, capaces
cie penetrar en los pelos absorbentes de las races de las leguminosas,
pasando luego al interior de la raz, evoluconando en bacilos mviles,
y posteriormente en bacterioides inmviles, ahorquillados o ramifica-
dos, que funcionan como organsmos simbitcos.
A raz de este descubrimiento se llevaron a cabo numerosas inves-
tigaciones, especialmente las de Bewley y Hutchinson (io), y posterior-

-54-
mente las de Thorton y Gangulee {q2), que confirmaron la opinin de
Winogradsky sobre el ciclo evolutivo que e$perimentaban las clulas
del Bac. radicicola, tanto en el labotario, en medios de cultivo arti-
ficiales, como en su medio habitual de vida, parecendo exstir una
relacin entre la alimentacin y este ciclo.
A partir de un cultivo joven de Bac. radicicola, se observan las si-
guientes fases: Micrococos inmviles, que al cabo de un cierto tiempo
crecen hasta duplicar su dimetro primitivo; clulas elipsoidales, pro-
vistas de un flagelo, que poseen una movilidad extraordinaria, cons-
tituyendo lo que algunos denominaron afase de enjambres, ^; bacilos
mvfles provistos de flagelos peritricos, que van perdienda paulati-
namente hasta quedar inmviles, y, finalmente, bacterioides, muchos
de ellos ramificados en T o en Y, vacuolados, y presentando el conte-
nido protoplsmico concentrado en fajas o bandas transversales.
I,a multiplicacin celular se verifica en dos fases: por biparti-
cin de los bacilos mviles o por divisn mltiple de Ios bacte-
rioides, en la que cada banda protoplasmtica da lugar a un nuevo
individuo.
I,a formacin de bacterioides en los medios de cultivo es estimu-
lada por la adicin de azcares o pequeas cantidades de cidos org-
nicos de los contenidos en la savia de la planta hospitalaria (8g). I,a
formacin de micrococos, que se transforman rpdamente en uenjam-
bres, se estimula fuertemente por la adicin de fosfatos o de leche.
^n el suelo, el Bac. radicicola experimenta las mismas transforma-
ciones que en los medios de cultivo, y tambin aquf viene estimulada
la movilidad por la adicin de fosfatos. En condiciones favorables de
humedad, temperatura y compacidad del suelo, la forma mvil puede
desplazarse con una velocidad de un mlmetro por hora.
1;1 modo de penetracin del organismo en las rafces ha sido estu-
diado por diversos investigadores, y recientemente por Thornton,
quien ha podido comprobar que los ndulos no suelen aparecer en
la planta recin germinada hasta que se empiezan a formar las hojas
verdaderas (qi), poca en que la planta segrega por sus races una
substancia que estimula la multiplicacin de las bacterias a su alrededor.
Cerca de la egtremidad de los pelos absorbentes se desarrollan pe-
queas colonias de bacterias que segregan una substancia termoesta-
ble susceptible de separarse de las bacterias por filtracin (93), que
provoca un cxecimiento asimtrico del pelo, a consecuencia del cual
ste se riza o encorva, penetrando 1as bacterias por la regin encorva-
da mediante un proceso que se ignoxa. Una vez dentro de Ia rafz las

- ss -
bacterias, se multiplican, formando un filamento o cordn mucilaginoso
que se extiende por el parnquima cortical de la ratz, y al llegar
junto a las clulas de la endodermis excita 1a multiplicacin de las
clulas prximas, inicindose de este modo la formacin de la nudo-
sidad, que progresa de modo distinto segn la especie de la planta
hospitalaria. )^n los Lupinus y Phaseolus, la infeccin produce una
rpida multiplicacin de las clulas infestadas, dando lugar a la for-
macin de la nudosidad, que en estas plantas suele tener su origen en
la zona del cambium. En otras muchas plantas, las clulas infestadas
dejan de dividirse, y la nudosidad se origina a expensas de clulas
ms externas que no han sido alcanzadas por las bacterias (bg). A
medida que la nudosidad crece, se forman en ella elementos vascu-
lares, unidos a los de la rafz, por los cuales reciben hidratos de carbono
Ias bacterias.
$n todos los tipos de nudosidad, las bacterias se multiplican den-
tro del citoplasma de la clulas hospitalarias, llenndolas por com-
pleto y tomando, en su mayor parte, forma de bacterioides, lo que
hace suponer que sean stos los agentes que llevan a cabo la fijacin
del nitrgeno.
El Sac. rqdicicola puede aislarse de1 suelo o mejor an de Ias nuda
sidades, que se esterilizan ezteriormente con sublimado corrosivo
al 2 por I.ooo durante dos o tres minutos, lavndolas luego varias
veces con agua destilada esterilizada, y, finalmente, mediante una
varilla de vidrio esterilizada se machacan en un tubo que contenga
un poco de agua esterilizada, utilizando esta agua, que lleva en sus-
pensi8n las bacterias, para hacer las siembras en medio de cultivo,
que puede ser el de Ashby (pg, go) o alguno de los siguientes:

i) Madio a ase da glucosa (3g):

Glucosa ..................................... 20,0o gramos.

F'osfato monopotsirn {KFI^P04) . . . . . . . . . . . .. . i,oo r
Sulfato magttsco (MgSO^ qHrO) ........ ... .. o,io r
Cloruro sdico (NaCI) .... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Indicfos.
Sulfato ferroso (PeSO^) ........ . . . . . . . . . . . . . . . fdem.
Sultato mangattoso (MnSO4) .. .. . . . .. . . . . . .... fdem.
Cloruro clcico (CaCI,) .......... .. ...... .. .. .. fdem.
Agua deatilada .. .. .. . ..... .. . ... .... . .. ..... iooo c. c.

2) M edio a b ase de ma^nita (iis):

Manita ..................................... io,o gramos.
Goruro sdico (NaG) .... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2
Fosfato bipotsico (K^HPO^) ........ . . . . . . . . . . o,g ,r

-56-
 Sulfato magaEsico (MSSO^ ' 7Hr0) . ...... . . . . . . o,s gramos.
Sulfato cldoo (CaSO^ aH^O) ...... . ........ . o,c ^
Carbonato clcIco (CaCO^) ..... . . ... . . . . . . . . . . i,o
Agus dtlevadura ............................ ioo c. c.
Agua destilada .............................. goo c. c.
Agarlavado ................................. i5,o gramos.

Para preparar el agua de levadura se diluye levadura, libre de al-

midn, en diez veces su peso de agua corriente; se calienta en bao de
vapor durante dos o tres horas, agitando de vez en cuando; se esteri-
liza durante veinte minutos a iio^, y despus de dejarla en reposo
durante cuarenta y ocho horas, se decanta el lqudo con ayuda de
un sifn.

3) M^dias a ase de txtractos de legurwixosas.

Para su preparacin se maceran dos o tres horas ioo gramos de

semillas en tooo c. c. de agua; luego se hierven durante dos horas y se
filtran, aadiendo agua hasta completar los iooo c. c. y un i por ioo de
sacarosa, 0,5 por ioo de carbonato de caI y i5 gramos de agar.
1~n lugar del extracto de semillas puede emplearse el de partes
verdes y races de leguminosas hervidas en agua.
I,as bacterias productoras de nudosidades en las leguminosas han
recibido diversos nombres, segn el criterio de clasificacin seguido.
Beijerinek Ie di la denominacin de Bacillus radicicola, que Praz-
mowski cambi por la de Bacterium radicicola, teniendo en euenta que
no esporulaba, y por tanto, mora a temperaturas entre 60^ y 70^.
Algunos investigadores las incluyeron en el gnero Pseudomonas, por
el hecho de que varias razas poseen un solo flagelo polar. Finalmente,
Smith (88) y Bergey, as como el Comit de la Sociedad de Bacter-
logos Americanos, han concedido prioridad al nombre de Rhizobium
leguminosarum que le di h'rank (38), y que en la actualidad es el ms
usado.
I,as bacterias de las nudosidades presentan particularidades inte-
resantes. I,a primera es que, a diferencia de lo que ocurre con la ma-
yora de las bacterias del suelo, su presencia en ste es discontnua,
encontrndoselas solamente all donde es, o ha sido, cultivada la
planta hospitalaria; de aqu 1a necesidad o conveniencia de las inocu-
laciones bacterianas en el caso de cultivar por primera vez en un
terreno especies leguminosas o en el de cambiar la especie que se
vena cultivando; ya que la segunda particularidad es que no se trata

- 57 --
de una sola especie bacteriana que pueda producir nudosidades en
cualquer espece de planta Ieguminosa, sino que esisten razas o
variedades (especies para algunos) cada una de las cuales slo pro-
duce nudosidades en determinados gneros y especies de leguminosas.
Ya en i888 reconoci Beijerinck que no todas las estirpes de bac-
terias de nudosidades eran idnticas, y lleg a distinguir siete varie-
dades. Hiltner y StSrmer (49), basndose en estudios culturales y
morfolbgcos, distinguieron dos grupos de baeierias: Bac. radicicola
que se desarrollaba bien en medios gelatinados y produca nudosida-
des en los gneros Pisum, Vica, Lathyrus, Phaseolus, Tri flium., etc-
tera, y Bac. Beijerinckii, que se desarrollaba mal en medios gelatina-
dos y formaba nudosidades en los gneros Lu^inus, Ornithopus y
Glycine; grupos que tuvieron que subdividir posteriormente.
Utlizando la reaccin de aglutinacin Zipfel (iI), lleg a la con-
clusin de que 1as bacterias productoras de nudosidades en distintos
grupos de plantas leguminosas no eran razas ni variedades de una sola
especie bacteriana, sino especies diferentes; hiptesis que parece con-
firmada por divexsos investigadores que han utilizado los mtodos
serolgicos para el estudio de Ias bacterias simbiticas.
Waksman (io2) establece Ios siguientes doce grupos de plantas
leguminosas, cada uno de los cuales posee su raza propia de bac-
terias incapaz de formar nudosidades en las plantas de los res-
tanies grupos:

GRUro I. - TrJolium pratense, Trif. hybrdum, Trif. alexandrtinum, Trij. incarna-

tum, Trif. repens, Trif. medium
GRLTPO II. - Melilotus alba, Mel. officina/is, Medicago sativa, Med. hispida, Medtica-
go lupulina, Trigonella fa*num-gr^cum.
GxuPO III. - Vigna sinensis, Cassia chamracrista, Arachtis htipogea, Lespedeza
striata, Mucuna utilis, Bapttisia tinctoria, Desmodium canescens, Acacia armata,
Genista tinctoria, Phaseolus lunatus.
GRVPO IV. - Pisum satiuum arvense, Vicia villosa, Vic. sativa, Vic, faba, Lens
sculenta, I_athyrus lati/olus.
GRUro V. -Glycine hispida (Soja mxima).
GRUro VI. - Paseolus vulgaris y Pbas. multi/lorus.
GRUro VII. - Lupinus perennis y Ornithopus sativa.
GRUPO VIII. - Amphicarpa monoica.
GRUPO IX. - Amorpha canescens. ^
GRVro X. - Strophostyles helvola.
GRUro XI. - Robinia pseudoacacia.
GRUPO XII. - Dalea alopecuroides.

* * *

-58-
 Bergey, en su Manual, que venimos siguiendo para la descripcin
de las especies bacterianas del suelo, incluye las bacterias de las nudo-
sidades en el gnero Rhizobium Frank, con seis especies.

Gnero Rhixobium ^rank, i88g.

Pequeos bastoncillos, mviles cuando jvenes, que presentan

abundantes formas ramificadas caractersticas cuando se desarrollan
en condiciones adecuadas. Sou bacterias aerobias estrictas, capaces
de fijar e1 nitrgeno atmosfrico cuando se desarrollan en medios
con hidratos de carbono y carentes de compuestos nitrogenados org-
nicos. Ocasionan la formacin de nudosidades en las races de las plan-
tas leguminosas. La especie tipo es Rhizobium leguminosarum prank.

i. - Rhixobium leguminosarum lirank.

(Laxdw. Jal^rb., ig: 5z3: 1890)

Bastoncillos aislados, de i,2 a 3 de longitud, y ejemplares en

forma de Y. Dentro de los bastoncillos se desarrollan formas secunda-
rias, bacterioides, que se tien de amarillo con el yodo. ^n las nudos-
dades sobre las rafces de las Ieguminosas se observan filamentos, de los
que proceden 1os bacterioides. Mvil con flagelos peritricos.
Sobre caldo de guisantes gelatinado que contenga asparagina se
desarrolla en forma de colonias blanquecinas de superficie brillante
y mucilaginosa. I,a substancia mucilaginosa se tie de amarillo con el
yodo y no presenta las reacciones de la celulosa. I,a gelatna se lca
a veces.
1^1 desarrollo sobre agar-manita es rpido, con tendencia a exten-
derse. I,os cultivos en estra se presentan elevados, brillantes, semi-
translcidos, blancos, mucilaginosos y a veces viscosos, forrnndose
abundante goma.
En caldo: Sedimento mucilaginoso.
I,igera produccin de cidos en medios con glucosa, galactosa,
manosa, lactosa y maltosa.
Aerobia.
Temperatura ptima: 250.
' Habitat: En las nudosidades de Lathyrus, Pisurn, Vicia y Lens.

-59-
 2. - Rhixobium trifoiii Dangeard.
(Ls Botanists, Ser. 16: I-z70; Iqs6.)

Bastoncillos mviles con flagelos pertricos. I,os bacterioides de

los ndulos son en forma de pera, hinchados y vacuolados.
El desanollo sobre agar-manita es rpido.
I,as colonias son blancas, enturbindose con la edad. Mucilaginosas.
Produce grandes cantdades de goma.
I,igera produccin cida en medios eon glucosa, galactosa, manosa,
lactosa y maltosa.
Aerobia.
Temperatura ptima: 250.
Habitat: ^n las nudosidades de las rafces de plantas del gnero
Tri f olium.

3. - Rhizoium ^haseoli Dangeard.

(Le Botaniste, Ser. 16: I-z7o; 19z6.)
SlNOrrlaass. - Rkiaobium Frankii var. rnajor Schneider; Rkisobum Frankii variedad
mixor Schnelder (Bull. Torr. Bot. Club, 19: zo3; 18gs).

Bastoncillos mviles con flagelos perftricos. I,os bacterioides tie-

nen ordinariamente forma de bastoncillos, a menudo vacuolados.
El crecimiento sobre agar-manita es rpido, con tendencia a exten-
derse. I,os cultivos en estra se presentan elevados, brillantes, semi-
translcidos, blancos, mucilaginosos.
Formacin cida muy ligera en medios con glucosa, galactosa,
manosa, sacarosa y lactosa.
Aerobia.
Temperatura ptima: 250.
Habitat: En las nudosidades de las races de Phaseolus vulgaris,
Phaseolus angusti f olia y Phaseolus multi f lorus.

4. - Rhixobium melilote Dangeard.

(Le Botaniste, Ser. 16: I-2^o; Igz6.)
SINOxIaue. - Rhiaobium mutabile Schneider (Bull. Torr. Bot. Club, 19: zo3; 189z).

Bastoncillos mviles con flagelos pertricos. Bacterioides mazudos

y ramificados.
lwl crecimiento sobre agar-manita es claramente rpido. Cultivs

-60-
en estras, elevados, brillantes, opacos, blanco perlino, mantecosos.
Forma mucha goma.
Formacin cida en medios con glucosa, galactosa, manosa y
sacarosa.
Aerobia.
Temperatura ptima: 25.
Habitat: ^n las nudosidades de las races de plantas de los gneros
Melilotus, Medicago y Trigonella.

^. - Rhizobium radicicola (Beijerinck} Bergey y col.

fBacillus radicicola Beijerinck, Bot. Zeit., q6: 7z6; i888).
SrNOrnMtAS. - Bacterium radicicola Prazmowski (Laxdw. Vers-stat., 37; i8qo). Phyto-
mixa leguminosarum J. Schr$ter (Krytogamen Flora, v. Schlesien de Cohn, 3; r889).
Pseudomoxas radicicola G. T. Moore ($ull., ^i, U. S. Dept. Agric. Bur. Plant
Industry, i9o5).

Bastoncillos aislados o en parejas, frecuentemente hinchados en un

estremo o en la parte central, que se tien desigualmente. Muy mov-
bles con ayuda de un solo flagelo polar. Segregan una substancia muci-
laginosa.
Sobre agar-glucosa, cenizas: Colonias circulares elevadas, hmedas,
blancas, brillantes y enteras.
Sobre agar-maltosa, cenizas: Colonias hmedas, brillantes, trans-
parentes, pasando con el tiempo a translcidas, blancas, muclaginosas,
con tendencia a extenderse.
l^n agua con maltosa y cenizas produce enturbiamiento con sedi-
mento mucilaginoso.
Aerobia.
Temperatura ptima: 250.
Habitat: Forma nudosidades en las races de especie de Lu^us, Soya
y Ornitho^us.

6. - Rhixobium japonicum (Kirchner) Baldwin y Bred.

(Krchner, Beitrage sur Biol. d. P/lanzen de Cohn, y: zr3^ i895
Baldwin y Fred., Jour. Bact., i7: iqi; i929.)

Bastoncillos mviles con flagelos montricos.

^1 desarrollo sobre agar-manita es lento y escaso. ^1 cultivo en

-6i -
estrfa es ligeramente elevado, brillante, opaco, blanco, mantecoso,
con ligera formacin de goma.
l^l crecimiento es mayor sobre pentosas que sobre heaosas.
Hay lenta produccin cida en medios con xilosa y arabinosa.
Aerobia.
Temperatura ptima: 250.
Habitat: Produce nudosidades en las races de Soja maxima.