Sunteți pe pagina 1din 27

SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr.

: 1/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

DETERMINAREA CONTINUTULUI
DE AZOT(proteina)

PSL-F.CH.-01

Intocmit Verificat Aprobat


Nume Gianina Barbuta Tatiana Arabagiu Gianina Barbuta
Functie RMC Sef laborator Administrator
Semnatura/
Data

Aceast copie este difuzat controlat DA X NU

Not: Procedurile SMC sunt proprietatea SC UNILAB SA i sunt protejate prin drepturile de
copyright. Orice copiere a acestei proceduri sau reproducere parial este permis numai cu
acordul scris al Sefului de laborator.
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 2/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

INDICATORUL REVIZIILOR SI APROBARILOR

Nr. Editia Data Capitolul, subcapitol Nume, Prenume, Semnatura


Crt. Revizia aplicarii Pagina Elaborat Verificat Aprobat
(modificat,adaugat)
1. 02/0 02/06/14 Elaborarea Editiei 2 RMC Sef lab. Admin.
Gianina Tatiana Gianina
Barbuta Arabagiu Barbuta
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 3/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

LISTA DE DIFUZARE

Exemplarul Persoanele care utilizeaza documentul


nr. Locul difuzrii Nume prenume/Funcie Data Semnatura
RMC
1. Gianina Barbuta 02/06/14

2. Sef laborator Tatiana Arabagiu 02/06/14

Organism de certificare
3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 4/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

1. OBIECTIV

1.1. Aceast procedur se refera la determinarea continutului de azot / protein din din carne si
produse din carne, lapte si produse lactate, produse dulci, amidon si derivate, ceai, cereale si
leguminoase, concentrate alimentare, condimente, produse cerealiere,sucuri de legume si fructe.
1.2. Procedura este aplicat de ctre personalul ce opereaza in activitatea de determinari fizico-
chimice din cadrul Laboratorului Unilab.

2. SCOP

2.1. Procedura are drept scop descrierea modului in care se realizeaza operatiile impuse de
aceasta metoda de analiza..

3. RESPONSABILITATI

3.1. Personalul care execut operatiile specifice, in procesul de analiza , cunoaste operaiile care
sunt prezentate n procedura, si aplica de fiecare dat i la fel etapele descrise.
3.2. Personalul care execut operaiile respective rspunde de rezultatele obinute pe care le
inregistreaza in Fisele de lucru. Acestea sunt verificate periodic de catre seful de laborator.

4. DOCUMENTE DE REFERINTA

- SR ISO 2213-17: Produse dulci. Determinarea continutului total de substante proteice


si a continutului de substante proteice din lapte.
- SR 13013-3-1994 : Produse cerealiere, de morarit, de panificatie, biscuiti si paste
fainoase
- SR ISO 937: Carne si produse din carne. Determinarea continutului de azot.
- SR ISO/TS 17837-2009 : Lapte si produse din lapte. Determinarea continutului de
azot si calculul proteinei brute. Metoda keljdal.
- SR EN ISO 3188:2009: Amidon si produse derivate. Determinarea continutului de
azot prin metoda Kjedahl. Metoda titrimetrica
- SR 13348-1:1996: Ceai. Metoda de analiza. Determinarea azotului proteic dupa
metoda Kjeldahl. Metoda spectrofotometrica
- SR EN ISO 20483:2013 :Cereale si leguminoase. Determinarea contiutului de azot si
calculul continutului de proteina bruta. Metoda Kjeldahl
- STAS 8613/6-80: Concentrate alimentare. Determinarea azotului.
- SR 9763-13:1996 :Condimente. Determinarea azotului dupa metoda Kjeldahl. Metoda
spectrofotometrica
- sr 13013-3:1994 :Produse cerealiere, de morarit, de panificatie, biscuiti si paste
fainoase. Determinarea continutului de proteina bruta
- SR EN 12135:2003: Sucuri de fructe si de legume. Dozarea azotului. Metoda
Kjeldahl .

- proceduri de lucru si generale care fac parte din Manualul Sistemului de management
al laboratorului.
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 5/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

5. CARNE SI PRODUSE DIN CARNE

5.1. TEHNICA DE LUCRU

5.1.1 MATERIALE SI REACTIVI

- sulfat de cupru (II) pentahidratat


- sulfat de poatsiu anhidru
- acid sulfuric conc.
- hidroxid de sodiu sol. decarbonatata: se dizolva 33g NaOH pentru 100ml solutie
- acid boric sol. : se dizolva 40 g H3BO3 in apa distilata si se completeaza la 1000ml cu apa .
- acid clorhidric 0.1n
- indicator Tashiro : 2 g rou de metil, 1 g albastru de metilen n 1000 ml etanol de 95%

5.1.2 APARATURA SI STICLARIE

- cutit rotativ de mare viteza ( sau masina de tocat)


- balanta analitica , cu exactitate de 0.001g
- hartie de filtru
- baloane Kjeldahl
- dispozitiv de incalzire al balonului Kjeldahl (unitate de dezagregare DK6)
- dispozitiv de aspirare pentru vaporii degajati in timpul digestiei(pompa si scruber)
- aparat de antrenare cu vapori(unitate de distilare semiautomata UDK 130)
- biurete de 50 ml
- pahar Erlenmeyer de 500 ml

5.1.3. MODUL DE LUCRU

- se omogenizeaz proba prin trecerea de 2 ori prin maina de tocat sau aparat ce include un
cuit rotativ de vitez mare, (dndu-se n prealabil membrana jos)
pasta rezultata se introduce ntr-un recipient bine nchis, se pstreaz la rece i se
analizeaz n maxim 24 ore.
in balonul Kjeldahl se adaug 15 g sulfat de potasiu anhidru i 0.5 g sulfat de cupru (II).
se cntresc cu precizie de 0.0001g circa 2 g prob , pe o bucat de hrtie de filtru. Se
introduce hrtia cu proba n balonul Kjeldahl. Se adaug n balon i 25 ml acid sulfuric.
Se instaleaz balonul la instalaia Kjeldahl i se nclzete pn ce lichidul este complet
limpede i are tent clar bleu-verde. Se face digestia timp de 2h, la temperatura de 420
C;
se scoate balonul din instalaie i se las s se rceasc la temperatura camerii.
se instaleaz fiola la aparatul de distilare , se adaug n fiola 50 ml ap distilat i 100 ml
hidroxid de sodiu 33% .
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 6/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

intr-un pahar Erlenmeyer se pun 50 ml acid boric 40% i 4 picturi de souie indicator i
se aeaz paharul la aparatul de distilare.
se titreaz distilatul cu soluie acid clorhidric 0.1 n i se noteaz volumul ce se folosete
la calcule.
se realizeaza mereu proba martor (in dublura) : in balonul Kjeldahl se adaug 15 g
sulfat de potasiu anhidru i 0.5 g sulfat de cupru (II), se adaug 25 ml acid sulfuric, se
instaleaz balonul la instalaia Kjeldahl i se face digestia timp de 2h, la temperatura de
420 C, pn ce lichidul este complet limpede i are tent clar bleu-verde, se scoate
balonul din instalaie i se las s se rceasc la temperatura camerii, se instaleaz fiola
la aparatul de distilare, se adaug n fiola 50 ml ap distilat i 100 ml hidroxid de sodiu
33%, intr-un pahar Erlenmeyer se pun 50 ml acid boric 40% i 4 picturi de souie
indicator i se aeaz paharul la aparatul de distilare, se titreaz distilatul cu soluie
acid clorhidric 0.1 n i se noteaz volumul, ce se folosete la calcule.
proba se analizeaza la dublu . In cazul in care in laborator se primesc multe probe intr-o
singura zi, validarea metodei se realizeaza prin analiza unei singure probe la dublu si a
celorlalte la simplu (analizele efectuate in aceeasi zi) pentru a nu lasa clientii sa astepte
mult timp rezultatele analizei.

5.1.4. CALCUL

Continutul de proteina exprimat in procente de masa :

Proteina=0.0014 x (V1-V0) x f x100 x 6.25 in care:


m
V0= volumul in ml de sol. de HCl 0.1n utilizat la titrare pentru proba martor
V1= volumul in ml de sol. de HCl 0.1n utilizat la titrare pentru determinare
m= masa in grame a probei de analizat
f =factorul sol. de HCl 0.1n utilizata la titrare

5.1.5. REPETABILITATE

Diferenta dintre rezultatele celor doua determinari facute simultan sau in succesiune
rapida, de catre acelasi analist, trebuie sa nu depaseasca 0,01 g de azot pentru 100 g
proba de incercat.

6. LAPTE SI PRODUSE DIN LAPTE

6.1. TEHNICA DE LUCRU

6.1.1. MATERIALE SI REACTIVI

- sulfat de potasiu (K2SO4), liber de azot .


- sulfat de cupru(II) pentahidrat solutie , (CuSO4 .5H2O)= 5,0 g/100ml
Se dizolva 5,0g de sulfat de cupru(II) pentahidrat in 100ml apa in balon cotat. Se dilueaza cu
apa pana la semn si se amesteca.
- acid sulfuric (H2SO4) concentrat [20(H2SO4)= 1,84 g/ml].
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 7/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

- hidroxid de sodiu sol.50 % :50g de hidroxid de sodiu (NaOH) la 100 ml apa distilata.
- solutie indicator, se amesteca un volum de rosu de meti solutie 0.1% cu 5 volume de vrede
de bromcresol solutie 0.2% :
rosu de metil sol. 0.1 % : se dizolva 0,1g de rosu de metil in etanol 95% in balon cotat
de 100 ml. Se dilueaz pn la semn cu etanol similar i se amestec.
Verde de brom crezol sol. 0.2 % : se dizolva 0,5g de verde de bromcresol n etanol 95%
ntr-un balon cotat de 250ml. Se dilueaz pn la semn cu etanol similar i se amestec.
-acid boric solutie, (H3BO3)=40.0g/l : se dizolva 40 g acid boric in 1L apa fierbinte in balon
cotat de 1000ml. Se raceste si se completeaz pn la semn cu ap, se adaug 3 ml de
soluie de indicator i se amestec.
Soluia, care este de culoare portocaliu deschis, se pstreaz ntr-o sticl borosilicat.
Protejai soluia de lumin i de surse de amoniac n timpul stocrii.
-acid clorhidric solutie standard, c(HCl)= (0,10,0005)mol/l.
-sulfat de amoniu [(NH4)2SO4], nainte de utilizare, se usuc sulfat de amoniu, la 102oC2oC
pentru 2h. Se rcete la temperatura camerei n exsicator.
-triptofan (C11H12N2O2) sau clorhidrat de lizin(C6H14N2O2.HCl).
-zaharoz (C12H22O11).

APARATURA SI STICLARIE

-baloane kjeldahl
-balanta analitica, capabila sa cantareasca cu o precizie de 0,1mg.
-biurete sau pipete automate.
-cilindri gradati.
-pahare Erlenmyer.
-biurete, de capacitate 50ml, gradate la fiecare 0,1ml sau biurete automate care
ndeplinesc aceleai cerine.
-dispozitiv de macinare (masina de tocat).
-baloane cotate , de capacitate 50ml, 100ml, 250ml, si 1000ml.
-bile de sticla.
- dispozitiv de incalzire al balonului Kjeldahl (unitate de dezagregare DK6)
- dispozitiv de aspirare pentru vaporii degajati in timpul digestiei(pompa si scruber)
- aparat de antrenare cu vapori(unitate de distilare semiautomata UDK 130)
-spatula.
-hartie de filtru.
-baie de apa, capabila sa mentina o temperatura intre 38oC si 40oC.

PREPARAREA PROBEI PENTRU ANALIZA

6.1.3.1. BRANZA
Se indeparteaza stratul de suprafata al brnzei, n aa fel nct s ofere un eantion de
testare reprezentativ al probei. Se macin eantionul. Se amestec rapid ntreaga mas i
s macina din nou, rapid. Se analizeaza proba de testare ct mai curnd posibil dup
mcinare.

6.1.3.2. LAPTE
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 8/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

Se incalzeste proba la o temperatura cuprinsa ntre 38oC i 40oC pe baia de ap. Se


rcete proba la temperatura camerei.

MOD DE LUCRU

- BRANZA : dupa pregatirea probei se cntrete 1 g de brnz pe o hrtie de filtru. Se


introduce hrtia cu proba n balonul Kjeldahl, se adauga 5-10 bile de sticla, 15 g sulfat
de potasiu anhidru i 1 ml sol.sulfat de cupru (II) si 25 ml acid sulfuric conc.
-LAPTE : se adaug 5 ml0,1 ml din proba de testare pregtit, cntrit cu aproximatie
de 0,1mg, ntr-un balon Kjelahl, se adauga 5-10 bile de sticla, 15 g sulfat de potasiu
anhidru i 1 ml sol. sulfat de cupru (II) si 25 ml acid sulfuric conc.
-se instaleaz balonul la instalaia Kjeldahl, se face digestia timp de 2h, la temperatura
de 420 C i se nclzete pn ce lichidul este complet limpede i are tent clar
albastru-verde.
-se scoate balonul din instalaie i se las s se rceasc la temperatura camerii.
-se instaleaz fiola la aparatul de distilare , se adaug n fiola 85 ml ap distilat i 75
ml hidroxid de sodiu 50% .
-intr-un pahar Erlenmeyer se pun 50 ml acid boric 40% i 4 picturi de souie indicator
i se aeaz paharul la aparatul de distilare.
-se titreaz distilatul cu soluie acid clorhidric 0.1 n, punctul final este atins la prima
urma de culoare roz , se noteaz volumul ce se folosete la calcule.
- proba martor se realizeaza astfel :
in cazul martorului de branza : se adauga 5-10 bile de sticla, 15 g sulfat de potasiu
anhidru i 1 ml sol.sulfat de cupru (II) si 25 ml acid sulfuric conc.,
martorul de la lapte : se adaug 5 ml de ap i aproximativ 0,85 g de zaharoz, cntrit
cu aproximatie de 0,1mg, ntr-un balon Kjelahl, se adauga 5-10 bile de sticla, 15 g
sulfat de potasiu anhidru i 1 ml sol. sulfat de cupru (II) si 25 ml acid sulfuric conc.
se instaleaz balonul la instalaia Kjeldahl, se face digestia timp de 2h, la temperatura
de 420 C i se nclzete pn ce lichidul este complet limpede i are tent clar
albastru-verde.
se scoate balonul din instalaie i se las s se rceasc la temperatura camerii.
se instaleaz fiola la aparatul de distilare , se adaug n fiola 85 ml ap distilat i 75 ml
hidroxid de sodiu 50% .
intr-un pahar Erlenmeyer se pun 50 ml acid boric 40% i 4 picturi de souie indicator i
se aeaz paharul la aparatul de distilare.
se titreaz distilatul cu soluie acid clorhidric 0.1 n, punctul final este atins la prima
urma de culoare roz , se noteaz volumul ce se folosete la calcule.
- proba se analizeaza la dublu . In cazul in care in laborator se primesc multe probe intr-o
singura zi, validarea metodei se realizeaza prin analiza unei singure probe la dublu si a
celorlalte la simplu (analizele efectuate in aceeasi zi) pentru a nu lasa clientii sa astepte
mult timp rezultatele analizei.

CALCULUL SI EXPRIMAREA REZULTATELOR


SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 9/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

Continutul de azot w N se calculeaza, exprimandu-se n procente de mas cu patru zecimale,


din proba de testare folosind ecuaia :

1,4007 (VS - Vb)ct


wN = -----------------------
m
in care :
ct = este cantitatea de concentraia substanei, n moli pe litru, exprimat cu patru zecimale
din soluie de acid clorhidric 0.1n
Vb = este volumul, in mililitri, cu cel puin precizie de 0,05 ml, de soluie de acid
clorhidric 0.1n utilizat n testul-martor
m = este masa, in grame, exprimat la cel mai apropiat miligram, a cantitii de proba
VS = este volumul, in mililitri, cu cel puin precizie de 0,05 ml, de soluie de acid
clorhidric 0.1n utilizat n determinare.
Exprimarea rezultatului continutului de azot se face cu 4 zecimale, dac este necesar pentru
calculele ulterioare, in caz contrar, se exprim rezultatele finale de testare pentru trei zecimale.

Coninutul de proteine brute se calculeaz coninutul de proteina bruta, w p, exprimat n


procente de mas folosind ecuaia :
w p = 6,38 wN

unde:
w N = continutul de azot
in care 6,38 este factor general acceptat de conversie a continutului de azot in continutul
de proteine crude .
- Exprimarea rezultatului continutului de proteine brut se face cu 3 zecimale, dac este
necesar pentru calculele ulterioare, in caz contrar, se exprim rezultatele finale de testare pentru 2
zecimale.

7. AMIDON SI DERIVATE

7.1. TEHNICA DE LUCRU

7.1.1. MATERIALE SI REACTIVI

-acid sulfuric concentrat, = 1.84 g/ml


-hidroxid de sodiu, solutie 30 %
-acid boric, solutie 20 g/l
-catalizator compus, format din:
sulfat de potasiu, 97 g
sulfat de cupru (ii) anhidru, 3 g
-acid sulfuric, solutie titrata, de aproximativ 0.02 n sau 0.1 n
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 10/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

-indicator de culoare, preparat prin amestecarea a doua parti, in volume, dintr-o solutie saturata,
rece, de rosu de metil neutru in etanol 50 % (v/v) cu o parte, in volume, dintr-o solutie 0.25 g/l
albastru de metilen in etanol 50 % (v/v).
indicatorul trebuie pastrat intr-un flacon de sticla bruna.

7.1.2. APARATURA SI STICLARIE

- balon Kjeldahl de capacitate cuprinsa intre 500 800 ml.


- dispozitiv de incalzire al balonului Kjeldahl (unitate de dezagregare DK6)
- dispozitiv de aspirare pentru vaporii degajati in timpul digestiei(pompa si scruber)
- aparat de antrenare cu vapori(unitate de distilare semiautomata UDK 130)
- cilindru gradat de 100 ml
- aparat de mineralizare.
-aparat de distilare sau antrenare cu vapori.
-biureta de 25 ml, cu diviziuni de 0.05 ml.
-masina de tocat sau mojar.
-sita, cu dimensiunea nominala a ochiurilor de 0.6 mm.
-balanta analitica.

7.1.3. PREGATIREA PROBEI PENTRU ANALIZA

Pregatirea esantionului de analizat se face prin amestecarea cu grija si rapid a esantionului,


scuturandu-l sau agitand cu o spatula in recipientul care-l contine; daca recipientul este prea mic
pentru aceasta operatie, se transfera intreaga cantitate de esantion intr-un alt recipient uscat si de
marime convenabila, pentru a se efectua usor amestecarea. Poate fi necesara macinarea
esantionului si cernerea sa prin sita.

7.1.4. MOD DE LUCRU

- se cantareste, cu precizie de 0.001 g, pana la 10 g (m) din esantionul de analizat, in


functie de continutul presupus de azot si se trece proba in balonul Kjeldahl, in prealabil
uscat, astfel incat sa nu se lase nici o urma de produs pe peretele interior al gatului
balonului.
-in cazul unui lichid vascos sau al unei paste, proba poate fi cantarita intr-o capsula mica
de sticla sau, pe o folie de aluminiu, de hartie sau de material plastic, care sa nu aduca nici
un aport in azot sau al carei continut de azot este cunoscut si care se introduce in balon. In
cazul unui suport cu aport de azot, trebuie sa se tina seama de el la proba martor.
- in balonul Kjeldahl, care contine proba de analizat, se adauga 10 g catalizator compus si, cu
ajutorul unui cilindru gradat, volumul, in mililitri, de acid sulfuric concentrat necesar, calculat
dupa formula 20+4 m, astfel incat acidul sa se spele peretele interior al gatului balonului.
- se agita usor continutul balonului, pana cand amestecul nu mai contine aglomerari si este complet
umectat. Se adauga bile de sticla pentru uniformizarea fierberii, apoi se pune palnia in forma de
para in gatul balonului si se pune balonul Kjeldahl, pe suportul aparatului de mineralizare timp de
2h, la temperatura de 420 C.
-se lasa proba sa se raceasca si se adauga, cu grija, 50 ml pana la 200 ml apa, agitand continutul
balonului. Se monteaza balonul la aparatul de distilare.
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 11/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

- intr-un vas conic de 500 ml care contine un volum cunoscut (intre 25ml si 50 ml) de solutie de
acid boric si trei pana la cinci picaturi indicator de culoare. Se adaugand 150 ml pana la 200 ml
solutie de hidroxid de sodiu.
- distilarea este completa atunci cand se colecteaza 200 ml lichid, lichidul din vas trebuie sa fie de
culoare verde.
-distilatul se titreaza cu solutie de acid sulfuric 0.1 N, utilizand o biureta potrivita, de 10 ml sau 25
ml pana cand culoarea solutiei vireaza spre rosu-violet.
-se efectueaza doua determinari din acelasi esantion de analizat.
-proba martor se efectueaza o determinare martor in celeasi conditii ca mai sus.. Daca proba
de analizat a fost cantarita pe un suport care contine azot, proba martor se efectueaza folosind un
suport identic.

7.1.5. CALCULUL SI EXPRIMARE REZULTATE

Continutul de azot al esantionului este dat, in procente de masa de relatia:

100 1.401 T (V1 V0 )


0.01401 T (V V )
1 0 m m
in care:

T - normalitatea solutiei de acid sulfuric utilizata pentru cele doua titrari


V0 volumul solutiei de acid sulfuric, utilizat pentru proba martor, ml
V1 volumul solutiei de acid sulfuric, utilizat pentru determinare, ml
m masa probei de analizat, g

Ca rezultat se ia media aritmetica a doua determinari, daca volumele de solutie de acid


sulfuric utilizate nu difera cu mai mult de 0.1 ml. In caz contrar, se reincep determinarile pe
acelasi esantion de analizat.

8. CEAI

8.1. TEHNICA DE LUCRU

8.1.1. MATERILE SI REACTIVI

-acid sulfuric concentrat, = 1.84 g/ml


-hidroxid de sodiu, solutie 30 %
-catalizator compus, format din:
sulfat de potasiu, 97 g
sulfat de cupru (II) anhidru, 3 g
-acid sulfuric, solutie titrata, 0.1 N
-sulfat de amoniu sau clorura de amoniu sau oxalat de amoniu.
-Reactiv Nessler
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 12/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

8.1.2. APARATURA SI STICLARIE

Materiale curente de laborator si:

-balon Kjeldahl, de 250 ml.


-bile de sticla.
- dispozitiv de incalzire al balonului Kjeldahl (unitate de dezagregare DK6)
- dispozitiv de aspirare pentru vaporii degajati in timpul digestiei(pompa si scruber)
- aparat de antrenare cu vapori(unitate de distilare semiautomata UDK 130)
-aparat de mineralizare.
- hartie pergaminata sau de filtru sau folie de aluminiu ce nu contine azot
-aparat de distilare sau antrenare cu vapori.
-pahar conic de 100 ml.
-balon cotat de 50 ml si 250 ml.
-pipete de diferite capacitati.
-spectrofotometru reglabil la lungimea de unda de 430 nm prevazut cu cuve de sticla de 10 mm.
-rasnita electrica.
-sita, cu dimensiunea nominala a ochiurilor de 1 mm.
-balanta analitica.

8.1.3 PREGATIREA PROBEI PENTRU ANALIZA

Pregatirea esantionului de analizat


Se macina esantioul cu ajutorul rasnitei astfel incat sa poata trece cu usurinta prin ochiurile sitei.
Proba se pastreaza in flacoane curate si uscate, inchise ermetic.

8.1.4. MOD DE LUCRU

- proba de analizat se cantareste, cu precizie de 0.001 g, pana la 0.1 g (m 0) din esantionul de


analizat, intr-o hartie pergaminata sau de filtru sau folie de aluminiu ce nu contine azot sau al
caror continut de azot este cunoscut.
In cazul unui suport cu aport de azot, trebuie sa se tina seama de el la proba martor.
- se adauga 3 g de catalizator compus si volumul, in ml, de acid sulfuric concentrat necesar,
calculat dupa formula 20 + 4m0, in asa fel incat acidul sa spele peretele interior al balonului
Kjeldahl. Se agita usor continutul balonului astfel incat proba de analizat sa fie complet umezita.
Pentru a evita supraincalzirea, se adauga cateva bile de sticla.
- balonul Kjeldahl se pune in aparatul de mineralizat, se incalzeste progresiv pana la fierberea
usoara a lichidului din balon. Se mentine incalzirea inca 1 h dupa ce lichidul a devenit limpede.
- se lasa proba sa se raceasca si apoi se clateste palnia in forma de para si gatul balonului cu
cativa mililitri de apa. Apoi se aduce la semn intr-un balon cotat de 250 ml cu apa.
- cu ajutorul unei pipete se iau 20 ml din mineralizatul astfel obtinut si se trec in balonul de
distilare. Vasul colector contine 20 ml acid sulfuric 0.1 n. In balonul de distilare se adauga 30 ml
hidroxid de sodiu 30 % si se da drumul la distilare. Distilarea se considera completa cand in
vasul de colectare s-au obtinut 40 ml.
- distilatul se transvazeaza intr-un balon cotat de 50 ml, se aduce la semn cu apa si se
omogenizeaza.
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 13/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

- trasare curba de etalonare se pregateste o serie de solutii etalon, cu cel putin cinci concentratii
diferite si cunoscute dintr-o sare de amoniu. Intr-o serie de pahare conice de 100 ml, se introduce
cu ajutorul unei pipete 50 ml din fiecare din aceste solutii etalon. Intr-un alt pahar conic de 100
ml, se introduc 50 ml apa. Aceasta ultima solutie corespunde concentratiei zero in sarea de
amoniu a curbei de etalonare. Se adauga cu ajutorul unei pipete 1 ml reactiv Nessler fiecarui
pahar conic si se amesteca. Se lasa in repaus 10 min si se masoara absorbana fiecarei solutii cu
ajutorul spectrofotometrului reglat la lungimea de unde de 430 nm. Se traseaza curba de
etalonare inscriind pe ordonata absorbanta, iar pe abscisa concentratia in azot.
- masurare spectrofotometrica -se ia distilatul obtinut mai sus si se introduce intr-un pahar conic
de 100 ml. Se adauga 1 ml reactiv Nessler si se amesteca. Se lasa pentru 10 min in repaus si se
masoara absorbanta solutie cu ajutorul spectrofotometrului, la lungimea de unda de 430 nm.
- proba martor se efectueaza o proba martor, numai cu reactivi, utilizand 50 ml distilat. Daca
proba de analizat a fost cantarita pe un suport care contine azot, proba martor se efectueaza
folosind un suport identic.
se efectueaza doua determinari din acelasi esantion de analizat.

8.1.5. CALCULUL SI EXPRIMARE REZULTATE

Continutul de azot proteic al esantionului, in procente de masa, este dat de relatia:

C V V C V C V V C V
1 1 2 100 2 2 100 1 100 1 1 2 2 2
m V 6 m 50 6 m 6
V 50
0 3 10 0 10 0 10 3
in care:

C1 concentratia de azot citita pe curba de etalonare, in g/ml


C2 concentratia de azot a probei martor citita pe curba de etalonare, in g/ml
V1 volumul la care s-a adus mineralizatul, ml
V2 volumul la care s-a adus distilatul, ml
V3 volumul de mineralizat luat pentru distilare, ml
m masa probei de analizat, g
Ca rezultat se ia media aritmetica a doua determinari.

Repetabilitatea -diferenta dintre doua determinari efectuate simultan sau rapid una dupa alta pe
aceeasi esantion, in acelasi laborator, de catre acelasi operator, un trebuie sa depaseasca valoarea
de 5% din media aritmetica.

9. CEREALE SI LEGUMINOASE

9.1. PRINCIPIU METODEI

Proba de lucru este mineralizata cu acid sulfuric in prezenta unui catalizator. Produsii de reactie
sunt alcalinizati si apoi distilati. Amoniacul eliberat este colectat intr-o solutie de azid boric, care
se titreaza cu o solutie de acid sulfuric, pentru a determina continutul de azot si a se calcula
continutul de proteina bruta.
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 14/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

9.2. MATERIALE SI REACTIVI

-Sulfat de potasiu
-Sulfat de cupru (II) pentahidrat
-Oxid de titan
-Acid sulfuric concentrat, = 1.84 g/ml
-Acid sulfuric 0.05mol/l
-Ulei de parafina
-Acetanilida, cu un punct de topire de 114C si un continut de azot de 10.36/100g
-Triptofan, cu un punct de topire de 282C si un continut de azot de 13.72/100g
-Pentaoxid de fosfor
-Acid boric, solutie apoasa de 40 g/l, sau orice alta concentratie recomandata pentru aparatura
care se utilizeaza.
-Indicator de culoare: se amesteca volumele de solutie A si solutie B in proportia recomandata
pentru aparatura care se utilizeaza (de exemplu: 5 volume de solutie A si 1 volum de solutie B).
De asemenea, titrarea se poate realiza potentiometric prin utilizarea unui electrod de pH, care
trebuie sa fie verificat zilnic.
Solutia A: verde de bromcrezol 200 mg, etanol cu o concentratie in volume de 95%, o
cantitate suficienta pentru o solutie de 100 ml.
Solutie B: rosu de metil 200 mg, etanol cu o concentratie in volume de 95%, o cantitate
suficienta pentru o solutie de 100 ml.
-Hidroxid de sodiu, solutie 33 sau 40 %, cu un continut de azot mai mic sau egal cu 0.001%.
-Solutie etalon de acid sulfuric, 0.05 mol/l
-Sulfat de amoniu, solutie etalon 0.05 mol/l
-Zaharoza, libera de azot.

9.3. APARATURA SI STICLARIE

-Moara mecanica
-Sita, cu dimensiunea ochiurilor de 0.8 mm.
-Balanta analitica, cu o exactitate de 0.001 g.
- dispozitiv de incalzire al balonului Kjeldahl (unitate de dezagregare DK6)
- dispozitiv de aspirare pentru vaporii degajati in timpul digestiei(pompa si scruber)
-aparat de antrenare cu vapori(unitate de distilare semiautomata UDK 130)

9.4.ESANTIONARE

Laboratorul trebuie sa primeasca un esantion reprezentativ. Acesta nu trebuie sa fie deteriorat sal
modificat in timpul transportului sal depozitarii.
Esantionarea nu face parte din metoda specifica in acest standard international. In ISO 24333
sunt prezentate metode recomandate de esantionare.

9.5. PREGATIRE PROBEI PENTRU ANALIZA


SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 15/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

Daca este necesar esantionul se macina astfel incat sa treaca in intregime printr-o sita cu
dimensiunile orificiilor de 0.8 mm. In cazul cerealelor trebuie macinata o cantitate de cel putin
200 g. Esantionul macinat se amesteca cu atentie.

9.6. MOD DE LUCRU

Daca este necesar sa se verifice ca cerintele date privind limita de repetabilitate sunt indeplinite,
se realizeaza doua determinari separate.
-se cantareste, cu o exactitate de 0.001 g, o cantitate din esantionul de incercare pregatit ca mai
sus, aleasa pe baza continutului estimat de azot, astfel incat proba de lucru sa continua intre
0.005 g si 2 g de azot, de preferinta, mai mult de 0.02 g.
-se transfera proba de lucru in balonul de mineralizare si apoi se aduga 10 g de sulfat de potasiu,
0.30 g de sulfat de cupru pentahidrat, 0.30 g oxid de titan si 20 ml acid sulfuric concentrat.
Cantitatea de acid poate fi ajustata in functie de aparatura, dar numai dupa ce se stie cu
certitudine ca aceasta masura conduce la o rata de recuperare de 99.5 % pentru acetanilida si de
99.0 % pentru triptofan.
-se agita cu atentie astfel inact sa se asigure o umezire in profunzime a probei de lucru.
-se aseaza balonul in unitatea de mineralizare, la temperatura 420C, timp de 2 ore de
mineralizare, se lasa sa se raceasca.
-in balonul racit se adauga 50 ml de apa
-se transfera in balonul de colectare 50 ml de acid boric si pentru colorimetrie vizuala sau
folosind o sonda optica, cel putin 10 picaturi de indicator de culoare.
-se adauga un exces de 5 ml de solutie de hidroxid de sodiu necesare pentru neutralizarea
cantitatii de acid sulfuric folosit. Apoi se realizeaza distilarea.
- intregului volum de distilat se titreaza folosind solutie de acid sulfuric 0.05 mol/l, determinarea
sfarsitului titrarii se face prin colorimetrie vizuala, sau cu ajutorul unei sonde optice, sau pri
analiza potentiometrica cu un sistem de masurare a pH-ului.
-proba martor se realizeaza o proba martor cu reactivii utilizati ca mai sus , dar fara proba de
lucru. Este posibila inlocuirea probei de lucru cu 1 g de zaharoza.

9.7. EXPRIMARE REZULTATE

Continutul in azot total, exprimat ca fractiune de masa din substanta uscata, in procente, se
calculeaza cu formula:

V1 V0 T 0.014 100 100


140T V V

w 1 0
N m 100 W m 100 W
H H

in care:

V1 volumul solutiei de acid sulfuric necesara pentru proba de lucru, ml


Vs volumul solutiei de acid sulfuric necesara pentru proba martor, ml
0.014 este cantitatea de azot echivalenta la utilizarea a 1 ml de solutie de acid sulfuric 0.5
mol/l, g
T este concentratia normala a solutiei de acid sulfuric folosita la titrare
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 16/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

m este masa probei luate in lucru, g


WH este umiditatea

Rezultatul se exprima cu doua zecimale.

Continutul de proteina bruta


Se calculeaza continutul de proteina bruta din substanta uscata prin multiplicarea valorii obtinute
in momentul determinarii continutului de azot cu un factor de conversie, in functie de specia de
cereale sau leguminoase si de utilizarea lor.
Rezultatul se exprima cu doua zecimale.

Repetabilitatea -diferenta dintre doua determinari efectuate simultan sau rapid una dupa alta pe
aceeasi esantion, in acelasi laborator, de catre acelasi operator, un trebuie sa depaseasca valoarea
de 5% din cazuri , mai mare dect limita de repetabilitate.
r=(0.0063xWp)x2.8
Pentru produsele pentru care continutul de proteina cruda este intre 7% si 80%.
Wp-este proteina cruda a probei

Repetabilitatea -diferenta dintre doua determinari efectuate simultan sau rapid una dupa alta pe
aceeasi esantion, in laboratore diferite, de catre operatori diferiti, un trebuie sa depaseasca
valoarea de 5% din cazuri , mai mare dect limita de reproductibilitate R, se calculeaza:
R=(0.014xWp)x2.8
Pentru produsele pentru care continutul de proteina cruda este intre 7% si 80%.

Factori pentru conversia continutului de azot in continut de proteina

Produs Factor de conversie din azot in proteina


Grau 5.7
Grau durum 5.7
Produse rezultate din macinarea graului 5.7 sau 6.25
Grau pentru hrana animalelor 6.25
Orz 6.25
Ovaz 5.7 sau 6.25
Secara 5.7
Triticale 6.25
Porumb 6.25
Leguminoase 6.25

Pentru toate celelalte se utilizeaza in general 6.25.


SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 17/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

10. CONCENTRATE ALIMENTARE

10.1. PRINCIPIU METODEI

Dupa mineralizare cu acid sulfuric, in prezenta de catalizatori, amoniacul din sulfatul de amoniu
rezultat se elibereaza prin alcalinizare si se prinde intr-o solutie titrata de acid sulfuric. Excesul
de acid sulfuric se titreaza cu hidroxid de sodiu.

10.2. MATERIALE SI REACTIVI

-acid sulfuric concentrat, = 1.84 g/ml si 0.1 n


-hidroxid de sodiu, solutie 33 % si 0.1 n
-sulfat de amoniu, solutie 0.1 n
-sulfat de cupru, pulbere.
-sulfat de potasiu, pulbere.
-zaharoza
-solutie indicator Tashiro preparata astfel:
Solutia A: 0.1 g rosu de metil se dizolva la cald pe baie de apa in 100 ml alcool etilic 96%
vol.
Solutie B: 4 ml solutie apoasa de albastru de metilen 1 % se aduce la 100 ml cu alcool
etilic 96% vol.
Indicatorul se prepara amestecand volume egale din solutia A si B; punctul de viraj este la pH
5,5.

Obs. - culoarea solutiei indicator la punctul de viraj trebuie sa fie cenusie. Aceasta se verifica
astfel: in 30 ml apa in care s-au adaugat in prealabil 6-8 picaturi solutie indicator Tashiro se
adauga, picatura cu picatura, acid clorhidric 0.01 n (preparat inainte de utilizare). Virajul de la
verde la cenusiu trebuie sa fie brusc, la adaosul unei sau a doua picaturi de acid clorhidric; o
picatura in plus coloreaza solutia din cenusiu in violet liliachiu. In caz contrar se ajusteaza prin
marire, fie a cantitatii de albastru de metilen, fie a celei de rosu de metil.
In lipsa indicatorului Tashiro, se poate folosi:
rosu de metil, solutie 0.2 % in alcool etilic 60 % vol.
hartie de filtru

10.3. APARATURA SI STICLARIE

- balon Kjeldahl de capacitate cuprinsa intre 250-500 ml.


-aparat de mineralizare.
-aparat de distilare sau antrenare cu vapori.
-balanta
-bile de sticla

10.4. MOD DE LUCRU


SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 18/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

-se cantaresc cu precizie de 0.0002 g, 1 sau 2 g din proba de analizat, intr-un cornet de hartie de
filtru asezat pe o sticla de ceas. Cornetul cu proba cantarita se introduce in balonul Kjeldahl. Se
adauga 0.5-1 g sulfat de cupru, 10 g sulfat de potasiu si 25 ml acid sulfuric concentrat, balon bile
de sticla.
-balonele Kjeldahl se pun aparatul de mineralizat. Incalzirea se face treptat pentru a evita
spumarea. Mineralizarea se continua pana cand lichidul devine complet limpede (fara particule
negre) si de culoare verde albastruie. Din acest moment se continua fierberea 90 min, fara a
depasi acest timp. Dupa mineralizare, se lasa la racit la temperatura camerei, dupa care se adauga
apa pana la 250 ml.
-din solutia obtinuta se masoara cu pipeta 100 ml si se pun la distilat. In vasul colector se
introduc 25 ml acid sulfuric 0.1 n si 3-4 picaturi de indicator Tashiro sau de solutie de rosu de
metil.
-in balonul Kjeldahl se introduc 40-50 ml hidroxid de sodiu 33 %. Reactia lichidului din balonul
de distilare dupa adaugarea solutiei de hidroxid de sodiu trebuie sa fie puternic alcalina (culoarea
lichidului trebuie sa fie albastru inchis spre negru).
-se lasa la distilat pana se colecteaza 40 ml. Sfarsitul distilarii se verifica cu hartie de turnesol, a
carei culoare nu trebuie sa se modifice in contact cu o picatura de distilat. In caz contrar, se
repeta distilarea cu o noua cantitate de solutie, colectionandu-se o cantitate mai mare de distilat si
respectandu-se conditiile de mai sus.
-distilatul se titreaza cu solutie de hidroxid de sodiu 0.1 n pana la virajul culorii indicatorului de
la violet la verde, in cazul folosirii indicatorului Tashiro sau de la rosu la galben deschis, in cazul
folosirii rosului de metil ca indicator.
-se efectueaza in paralel doua determinari din aceeasi proba pentru analiza.
-in paralel, se efectueaza o proba martor, inlocuind proba de analizat cu o cantitate echivalenta de
zaharoza. Continutul de azot al determinarii martor trebuie sa fie nul.
In caz contrar, se aplica corectia scazand din cantitatea de azot total al probei de analizat,
cantitatea obtinuta la determinarea martor.
Determinarea martorului este necesara in special cand se schimba reactivii folositi.

10.5. EXPRIMARE REZULTATE

Continutul de azot de azot total si de substante proteice, exprimat in procente, se calculeaza cu


formulele:

Azot total
1 2

0.0014 V V V V
3

100
V m
0

Substante proteice

1 2

3

0.0014 V V V V 6.25
100
V m
0
in care:

0.0014 cantitatea de azot, in g, corespunzatoare la 1 ml acid sulfuric 0.1 n


V1 volumul de acid sulfuric 0,1 n introdus in vasul de colectare, ml
V2 volumul solutiei de hidroxid de sodiu 0.1 n folosit la titrarea distilatului, ml
V3 volumul solutiei de hidroxid de sodiu 0.1 n folosit la titrarea martorului, ml
V volumul total al solutiei obtinute dupa mineralizare (250 ml), ml
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 19/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

V0 volumul solutiei luat pentru distilare


m masa probei de analizat, g
6.25 cantitatea de substante proteice, in g, corespunzatoare la 1 g azot.

Ca rezultat se ia media aritmetica a doua determinari in paralel, daca nu se depaseste 0.1 g azot
pentru 100 g proba.

11. CONDIMENTE

11.1. PRINCIPIU

Mineralizarea unei probe de analizat cu acid sulfuric, in prezenta unui catalizator compus,
alcalinizarea produsilor de reactie, distilarea amoniacului rezultat, captarea acestuia intr-o solutie
de acid sulfuric si masurarea spectrofotometrica a sarii de amoniu formate dupa adaugarea
reactivului Nessler.

11.2. MATERIALE SI REACTIVI

-acid sulfuric concentrat, = 1.84 g/ml


-hidroxid de sodiu, solutie 30 %
-catalizator compus, format din:
sulfat de potasiu, 97 g
sulfat de cupru (II) anhidru, 3 g
-acid sulfuric, solutie titrata, 0.1 N
-sulfat de amoniu sau clorura de amoniu sau oxalat de amoniu.
-reactiv Nessler

11.3. APARATURA SI STICLARIE

-balon kjeldahl, de 250 ml.


-aparat de mineralizare.
-aparat de distilare sau antrenare cu vapori.
-pahar conic de 100 ml.
-balon cotat de 50 ml si 250 ml.
-pipete de diferite capacitati.
-spectrofotometru reglabil la lungimea de unda de 430 nm, prevazut cu cuve de sticla de 10 mm.
-balanta analitica.

11.4. MOD DE LUCRU


.
- proba de analizat se cantareste, cu precizie de 0.001 g, pana la 1 g din esantionul de analizat,
intr-o hartie pergaminata sau folie de aluminiu ce nu contine azot sau al caror continut de azot
este cunoscut.
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 20/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

- in cadrul mineralizare se adauga 3 g de catalizator compus si volumul, in ml, de acid sulfuric


concentrat necesar, calculat dupa formula 20 + 4m0, in asa fel incat acidul sa spele peretele
interior al balonului Kjeldahl. Se agita usor continutul balonului astfel incat proba de analizat sa
fie complet umezita. Pentru a evita supraincalzirea, se adauga cateva bile de sticla.Balonul
Kjeldahl se pune in aparatul de mineralizat, se incalzeste progresiv pana la fierberea usoara a
lichidului din balon. Se mentine incalzirea inca 1 h dupa ce lichidul a devenit limpede.
- se lasa proba sa se raceasca si apoi se clateste palnia in forma de para si gatul balonului cu
cativa mililitri de apa. Apoi se aduce la 250 ml cu apa.
- cu ajutorul unei pipete se iau 2 ml din mineralizatul obtinut si se trec in balonul de distilare ce
contine 50 ml apa. Vasul colector contine 20 ml acid sulfuric 0.1 n. In balonul de distilare se
adauga 30 ml hidroxid de sodiu 30 % si se da drumul la distilare. Distilarea se considera
completa cand in vasul de colectare s-au obtinut 40 ml.
-distilatul se transvazeaza intr-un balon cotat de 50 ml, se aduce la semn cu apa si se
omogenizeaza.
-trasarea curbei de etalonare : se pregateste o serie de solutii etalon, cu cel putin cinci
concentratii diferite si cunoscute dintr-o sare de amoniu. Intr-o serie de pahare conice de 100 ml,
se introduce cu ajutorul unei pipete 50 ml din fiecare din aceste solutii etalon. Intr-un alt pahar
conic de 100 ml, se introduc 50 ml apa. Aceasta ultima solutie corespunde concentratiei zero in
sarea de amoniu a curbei de etalonare. Se adauga cu ajutorul unei pipete 1 ml reactiv Nessler
fiecarui pahar conic si se amesteca. Se lasa in repaus 10 min si se masoara absorbana fiecarei
solutii cu ajutorul spectrofotometrului reglat la lungimea de unde de 430 nm. Se traseaza curba
de etalonare inscriind pe ordonata absorbanta, iar pe abscisa concentratia in azot.
-masurare spectrofotometrica : se ia distilatul obtinut mai sus si se introduce intr-un pahar conic
de 100 ml. Se adauga 1 ml reactiv Nessler si se amesteca. Se lasa pentru 10 min in repaus si se
masoara absorbanta solutie cu ajutorul spectrofotometrului, la lungimea de unda de 430 nm.
-se efectueaza doua determinari din acelasi esantion de analizat.
proba martor se efectueaza numai cu reactivi. Daca proba de analizat a fost cantarita pe un suport
care contine azot, proba martor se efectueaza folosind un suport identic.

In cazul unui suport cu aport de azot, trebuie sa se tina seama de el la proba martor.

11.5. EXPRIMARE REZULTATE

Continutul de azot proteic al esantionului, in procente de masa, este dat de relatia:

C V V C V C V V C V
1 1 2 100 2 2 100 1 100 1 1 2 2 2
m V 106 m 50 10 6 m 10
6
V 50
0 3 0 0 3
in care:

C1 concentratia de azot citita pe curba de etalonare, in g/ml


C2 concentratia de azot a probei martor citita pe curba de etalonare, in g/ml
V1 volumul la care s-a adus mineralizatul, ml
V2 volumul la care s-a adus distilatul, ml
V3 volumul de mineralizat luat pentru distilare, ml
m0 masa probei de analizat, g
Ca rezultat se ia media aritmetica a doua determinari.
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 21/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

12. PRODUSE CEREALIERE

12.1. PRINCIPIU METODEI

Dupa mineralizare cu acid sulfuric, in prezenta unui catalizator mixt, alcalinizarea produsilor de
reactie, distilarea amoniacului rezultat si titrarea acestuia, dupa captarea intr-o solutie cu acid
boric, cu o solutie de acid sulfuric.

12.2. MATERILE SI REACTIVI

-acid sulfuric concentrat, = 1.84 g/ml si 0.1 n


-hidroxid de sodiu, solutie 33 %
-acid boric, solutie 4 % (m/m).
-catalizator mixt:
sulfat de potasiu: 10 g
sulfat de cupru (II) anhidru: 4 g
-solutie indicator Tashiro: 0.2 g rosu de metil si 0.1 g albastru de metilen, fin mojarate, se dizolva
in 100 ml alcool etilic 95 % (v/v). Solutia se pastreaza in sticla de culoare bruna, in loc intunecos
si rece.
-hartie de turnesol.
-pipeta cu bula, de 50 ml
-balanta analitica

12.3. APARATURA SI STICLARIE

-balon Kjeldahl de capacitate 300 ml.


-aparat de mineralizare.
-aparat de distilare sau antrenare cu vapori.
-balon cotat de 250 ml.
-biureta de 25 ml sau 50 ml, cu valoarea diviziunii de 0.1 ml.
-balanta analitica.
-pipeta cu bula de 50 ml.
-hartie de filtru

12.4. MOD DE LUCRU

Luarea si pregatirea probelor


Pentru orez conform STAS 1068.
Pentru gris conform STAS 1225.
Pentru malai si faina - conform STAS 877.
Pentru paine si produse de panificatie - conform STAS 91.
Pentru biscuiti conform STAS 1227/3.
Pentru paste fainoase conform STAS 753/3.
Probel se pastreaza in recipiente d sticla, cu dop rodat.
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 22/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

-din proba pregatita se cantaresc 1.5-2.5 g, cu precizie de 0.001 g, pe o bucata de hartie de filtru.
Se impacheteaza hartia cu proba si se introduce in balonul Kjeldahl. Se adauga catalizatorul
mixt. Apoi se adauga 25 ml acid sulfuric concentrat, pentru a antrena eventualele urme de proba
sau de catalizator. Balonul se incalzeste treptat pana la terminarea spumarii si dezintegrarii
masei, apoi se intensifica incalzirea si se fierbe pana cand lichidul devine complet limpede (fara
particule negre), in acest moment se metine lichidul la fierbere inca 45 min. La sfarsitul
mineralizarii, continutul balonului este limpede si incolor sau slab verzui.Timpul total de
mineralizare trebuie sa fie minim 2h.
-trebuie evitate pierderile de acid din cauza supraincalzirii, avand grija ca vaporii de condensare
sa nu depaseasca jumatate din gatul balonului.
-se lasa balonul la racit, peste care se adauga 50 ml apa. Continutul balonului se agita prin rotatie
pana la completa lui omogenizare.
-distilare prin antrenare cu vapori, in balon se adauga apa pana la un volum de 250 ml si se lasa
la racit. Din solutia obtinuta se masoara 50 ml care se pun in balonul de distilare. Peste se adauga
25 ml hidroxid de sodiu 33% si se monteaza la aparat. In vasul colector se adauga 25 ml solutie
acid boric si 20 ml apa, in care se mai adauga cateva picaturi de indicator Tashiro.
-se efectueaza distilarea pana cand in vasul colector se aduna 200 ml distilat.
-sfarsitul distilarii se verifica cu hartie de turnesol umezita cu apa, a carei culoare nu trebuie sa se
modifice in contact cu o picatura de distilat. In caz contrar, se repeta distilarea cu o noua cantitate
de solutie, colectandu-se o cantitate mai mare de distilat.
-distilatul se titraza cu acid sulfuric 0.1 n, pana la virarea culorii indicatorului de la verde deschis
la cenusiu cu nuanta albastruie.
-se efectueaza, in paralel, doua determinari din aceeasi proba de analizat.
-se efectueaza o proa martor, in aceleasi conditii ca mai sus, cu toti reactivii folositi, inclusiv
hartia de filtru.

12.5. CALCUL SI EXPRIMARE REZULTATE

Continutul de proteina bruta, exprimat in procente, se calculeaza cu formula:

Proteina bruta
1 2

0.001401 V V F V f
100
V m
0

in care:

0.001401 cantitatea de azot, in g, corespunzatoare la 1 ml acid sulfuric 0.1 n


V1 volumul de acid sulfuric 0,1 n folosit la titrarea probei, ml
V2 volumul de acid sulfuric 0,1 n folosit la titrarea probei martor, ml
V volumul total al solutiei obtinute dupa mineralizare (250 ml), ml
V0 volumul solutiei luat pentru distilare
m masa probei de analizat, g
F factorul de corectie al acidului sulfuric 0,1 n
f factorul de transformare a azotului total in substante proteice (5.70).

Ca rezultat se ia media aritmetica a doua determinari in paralel.


Rezultatul se exprima cu doua zecimale.
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 23/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

13. SUCURI DE FRUCTE SI DE LEGUME

13.1. PRINCIPIU METODEI

Dupa mineralizare cu acid sulfuric, in prezenta de catalizatori, pentru transformarea azotului


organic in sulfat de amoniu; solutia alcalina se aduce la un pH alcalin si se distila amoniacul
elibera intr-o solutie de acid boric in exes. Se titreaza cu acid sulfuric sau acid clorhidric pentru
determinarea amoniacului legat de acidul boric si se calculeaza continutul in azot al esantionului
plecand de la cantitatea de amoniac produsa.

13.2. MATERIELE SI REACTIVI

-acid sulfuric concentrat, = 1.84 g/ml


-solutie etalon de acid sulfuric, 0.05 mol/l
-solutie etalon de acid clorhidric, 0.1 mol/l
-sulfat de potasiu
-sulfat de cupru (II) anhidru
-sulfat de cupru (II) pentahidrat
-amestec de catalizatori: se amesteca cu grija, macinand, 100 g sulfat de potasiu si 10 g sulfat de
cupru (II) anhidru sau 15.64 g sulfat de cupru (II) pentahidrat.
-dioxid de seleniu
-hidroxid de sodiu, solutie 40 %
-acid boric, solutie 2 % (m/m).
-solutie indicator: 100 mg rosu de metil si 50 mg albastru de metilen in 100 ml alcool etilic 95 %
(v/v).

13.3. APARATURA SI STICLARIE

-balon Kjeldahl de capacitate 300 ml.


-aparat de mineralizare.
-aparat de distilare sau antrenare cu vapori.
-cilindru gradat, de 25 ml.
-biureta gradata, din 0.1 in 0.1 ml.
-masina de tocat
-bile de sticla
-pipeta de 10 ml.

13.4. MOD DE LUCRU

13.4.1. PREGATIRE ESANTION PENTRU ANALIZA

In mod normal, produsele nu trebuie sa fie pretratate, dar daca este necesara o diluare a lor,
analiza prin aceasta metoda trebuie sa se faca volumetric, rezultatele fiind exprimate la litru
esantion. Analiza produselor concentrate se poate efectua de asemenea, pe baza volumetrica,
dupa diluare la o densitate relativa cunoscuta. In acest caz, densitatea relativa trebuie sa fie
indicata.
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 24/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

In cazul in care proba a fost cantarita se ia in calcul factorul de dilutie, rezultatele putand fi
exprimate la kg produs.
In cazul produselor foarte vascoase si/sau cu un numai mare de particule (de exemplu pulpa),
determinarea se efectueaza in mo curent, pe o proba cantarita.

13.4.2. DOZARE

-cu ajutorul unei pipete se introduc 10 ml esantion pentru analiza intr-un balon Kjeldahl si cateva
bile de sticla pentru omognizarea fierberii. Se incalzeste usor pana cand esantionul devine inchis
la culoare, nu se evapora pana la sec. Se lasa sa se raceasca.
-se calculeaza continutul in substante uscate solubile al esantionului plecand de la densitatea
relativa determinata conform SR EN 1131.Se utilizeaza 4 ml de acid sulfuric concentrat la
gramul de substante uscate solubil, fiind recomandat ca acestea sa fie in general zaharuri.
-dupa racire, in balonul Kjeldahl se adauga cantitatea calculata de acid sulfuric concentrat plus 1
ml in exces. Se adauga 0.9 g amestec de catalizatori si o granula de dioxid de seleniu.
-se reincalzeste usor si se continua fierberea pana ce continutul solutiei devine limpede, timp de
60 de minute.
-se lasa sa se raceasca la temperatura ambianta. Se adauga cu grija 35 ml de apa. Se
omogenizeaza si se lasa din nou sa se raceasca.
-intr-un vas de colectare se adauga 30 ml solutie de acid boric si una sau doua picaturi de solutie
indicator si se omogenizeaza.
In balonul Kjeldahl se adauga 20 ml solutie hidroxid de sodiu si se pune la distilat. Se distla
astfel incat sa se obtina circa 100 ml distilat in 4-5 min.
-distilatul se titraza cu solutie etalon de acid sulfuric sau acid clorhidric, pana la virarea culorii
indicatorului in roz. Se noteaza volumul (V) al solutiei de acid clorhidric sau sulfuric necesar
titrarii.

13.5. EXPRIMARE REZULTATE

Continutul in azot total, exprimat in mg/l, se calculeaza cu formula:

1000
V 1.4
N V
s

in care:

V volumul in ml, al solutiei etalon de acid sulfuric sau de acid clorhidric necesar titrarii
Vs volumul in ml, al probei de analizat
Se va tine cont de factorul de dilutie si de modul de exprimare al rezultatelor, functie de masa sau
de volum.
Daca un produs concentrat a fost diluat de la concentratia sa initiala, se ia ca valoare densitatea
relativa a esantionului cu concetratia initiala.
Rezultatul se exprima fara zecimale.

14.CAFEA
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 25/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

14.1. PRINCIPIU
Mineralizarea probei de lucru cu acid sulfuricin prezenta unui catalizator compus, alcalinizarea
produsilor de reactie, distilarea amoniacului pus in libertate, care este captat intr-o solutie de
acid sulfuricsi masurarea spectrofotometrica a sarii de amoniu formate dupa adaugarea
reactivului Nessler.

14.2. MATERIALE SI REACTIVI

-acid sulfuric, concentrat


-hidroxid de sodiu, solutie 30%
-catalizator format din:
sulfat de potasiu, 97g
sulfat de cupru (II) anhidru, 3g
-sulfat de amoniu sau clorura de amoniu sau oxalat de amoniu
-acid sulfuric, solutie 0.1n
reactivul Nessler

14.3. APARATURA SI MATERIALE

-balonul Kjeldahl
-dispozitiv de incalzire al balonului Kjeldahl (unitate de dezagregare DK6)
- dispozitiv de aspirare pentru vaporii degajati in timpul digestiei(pompa si scruber)
- aparat de antrenare cu vapori(unitate de distilare semiautomata UDK 130)
-pahar conic de capacitate de 100 ml
-balon cotat de capacitate 250 ml
-balon cotat de capacitate 50 ml
-pipete de diferite capacitati
-spectrofotometru reglabil la lungimea de unda de 430 nm prevazut cu cuve de sticla ale caror
parcurs optic este de 10 nm
-rasnita electrica
-sita cu dimensiunea ochiurilor de 1mm
-balanta analitica
-hartie de filtru
-bile de sticla

14.4. MOD DE LUCRU

14.4.1. PREGATIREA PROBEI

Se macitana esantionul cu ajutorul rasnitei astfel incat sa poata trece cu usurinta prin ochiurile
sitei. Proba se pastreaza in flacoane curate si uscate, inchise ermetic.

14.4.2. DETERMINAREA SUBSTANTEI USCATE


SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 26/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

Se calculeaza continutul in substanta uscata plecand de la continutul determinat pe o portiune


de esantion conform cu metoda specifica.

14.4.3. DOZARE

-se cantareste cu o exactitate de 0.001g in jur de 1g ( m0 ) din esantionul pentru analiza intr-o
hartie de filtru sau folie de aluminiu ce nu contine azot sau al caror continut de azot este
cunoscut. In cazul in care acest support este responsabil de introducerea unei anumite cantitati
de azot, trebuie sa se tina seama de aceasta in determinarea probei martor.
- se adauga 3 g catalizator si volumul, in mililitri, de acid sulfuric concentrat, necesar, calculat
dupa formula 20+4 m0 si cateva bile de sticla.
-balonul se introduce in instalatia de mineralizare.
-se incalzeste progresiv pana la fierbere usoara, se mentine incalzirea inca 1h, pana ce lichidul a
devenit limpede.
-se lasa sa se raceasca, la temperatura camerei
- se trece cantitativ intr-un balon cotat de 250 ml, dupa racire pana la temperatura ambientala,
se aduce la semn.
-cu ajutor unei pipete se iau 20 ml din mineralizat si se intruduc intr-un balon Kjeldahl si 30 ml
de hidroxid de sodiu 30 % , dupa adaugarea hidroxidului, balonul se fixeaza in aparatul de
distilat
-in vasul de colectare se introduce 20 ml acid sulfuric 0.1n
-distilarea se considera completa cand in vasul de colectare s-au obtinut in jur de 40 ml
diastilat.
-distilatul obtinut se transvazeaza intr-un balon cotat de 50 ml si se aduce la semn cu apa si se
omogenizeaza.
-se iau 50 ml din distilatul obtinut si se introduc intr-un pahar conic de 100 ml
- se adauga 1 ml reactiv Nessler si se amesteca, se la 10 minute in repaus si se masoara
absorbanta solutiei cu ajutorul spectrofotometrului reglat la lungimea de unda de 430 nm.
- se efectueaza doua detrminari pentru acelasi esantion
-proba martor se efectueaza in aceleasi conditii ca mai sus si cu toti reactivii folositi, utilizand
50 ml distilat.

14.4.4. TRASAREA CURBEI DE ETALONARE

- se pregateste o serie de solutiie etalon, cu cel putin cinci concentratii diferite si cunoscute
dintr-o sare de amoniu.
- intr-o serie de pahare conice de 100 ml, se introduc cu ajutorul unei pipete 50 ml din fiecare
din aceste solutii etalon.
- intr-un pahar conic de 100 ml se introduc 50 ml apa, aceasta solutie corespunde concentratiei
zero in sarea de amoniu a curbei etalon
- se adauga 1 ml reactiv Nessler, fiecarui pahar conic si se amesteca
-se lasa in repaus 10 minute si se masoara absorbanta fiecarei solutii cu ajutorul
spectrofotometruluireglat la lungimea de unda de 430nm
-se traseaza curba de etalonare inscriind pe ordonata absorbanta, iar pe abscisa concentratia de
azot.
SC UNILAB SA DETERMINAREA CONTINUTULUI Pag. Nr. : 27/27
DE AZOT(proteina)
Editia 2/ Revizia 0
PSL-F.CH.-01 Data : 02.06.2014

15.5. CALCULUL SI EXPRIMAREA REZULTATELOR

Continutul de azot al esantionului in procente de masa este dat de formula :

C V V C V C V V C V
1 1 2 100 2 2 100 1 100 1 1 2 2 2
m V 106 m 50 10 6 m 10
6
V 50
0 3 0 0 3

in care:

C1 concentratia de azot citita pe curba de etalonare, in g/ml


C2 concentratia de azot a probei martor citita pe curba de etalonare, in g/ml
V1 volumul la care s-a adus mineralizatul, ml
V2 volumul la care s-a adus distilatul, ml
V3 volumul de mineralizat luat pentru distilare, ml
m0 masa probei de analizat, g

Se ia ce rezultat media aritmetica intre doua determinari.

15.5. |Repetabilitatea : difenta dintre doua determinari efectuate simultan sau rapid una dupa
alta pe acelasi asantion, in acelasi laborator, de catre acelasi analist, nu trebuie sa depaseasca
valoarea de 5% din media aritmetica.