Denumita de Lederberg in 1993 instrumentul pentru democratizarea biologiei
moleculara Acesta reactie da posibilitatea ca dintr-o mixtura de ADN sa fie pescuita o singura molecula de ADN si sa fie amplificata enzimatic Procedura este simpla, economica si complet automatizata
Principiul reactiei
Se foloseste drept matrita un ADN monocatenar
In conditii de laborator in vitro , pe acest lant unic de ADN se poate sintetiza un lant complementar cu ajutorul ADN-polimerazei si in prezenta unui oligonucleotid (15-20 nucleotide) primer. Pentru a porni sinteza noului lant ADN pe un lant ADN matrita , ADN-polimeraza necesita prezenta pe matrita a unui oligonucleotid primer cu capatul 3-OH liber, la acest capat urmand a se fixa nucleotide ADN care vor forma noul lant
Efectuarea Reactiei
PCR poate porni de la punctul a sau b
a. ADN genomic dublu lant (de cercetat) izolat din celule si taiat in fragmente cu ajtorul enzimelor de restrictie b. Lant unic de ADN sintetizat in prealabil prin transcriere inversa a ARN-ului
Etapele reactiei
1.Denaturarea ADN-ului genomic (izolat din celule) dublu lant sau ADN (sintetizat cu ajutorul unei molecule de ARNm) la tempetarura inalta 95 gr C ; acesta contine secvente ce urmeaza a fi multiplicate
2. Dupa scaderea temperaturii se adauga primerul in exces, in aceste conditii fixarea primerului pe ADN-ul unic lant reprezinta un proces de HIBRIDIZARE ce are loc la temperatura scazuta 36-65 gr C; perimetrul delimiteaza capatul initial al fiecarei din cele 2 secvente ADN unic lant (rezultate din denaturarea ADN-ului dublu lant) de multiplicat Adausul de primer se face in exces pentru a se obt o hibridizare primer-lant unic de AND
3.Reactia de sinteza a noului lant ADN in prezenta celor 4 tipuri de nucleotide
( adenin/guanin/timin/citidin deoxi-nucleozid trifosfat) pornind de la locul de fixare a primerului. ADN polimeraza se leaga de capatul 3 al primerului si sintetizeaza noul lant in directia 5 -> 3 , folosind drept matrita segmentul ADN lant unic de amplificat , iar primerul va fi incorporat in noul lant de ADN format , in acest fel lantul de ADN este din nou dublat si odata cu acesta => un ciclu PCR este terminat 4. Cu fiecare nou ciclu ( de denaturaresinteza a ADN-ului) va fi dublata cantitatea deADN rezultata din ciclul anterior
Polimeraza utilizata in PCR
o Inainte se folosea ADN-polimeraza Klenow dar pentru ca era termolabila a fost inlocuita cu o ADN-polimeraza termostabila, izoata de la bacteria THERMUS AQUATICUS, luand numele de Taq-polimeraza, aceasta fiind stabila pana la 95 C o Optimul de activitate este la 75-80C o Utilizarea Taq-polimerazei a facut posibila automatizarea toatala a procesului in masinile Thermal Cyclers o Cu ajutorul acesteia se pot realiza consecutiv 40 de cicluri de PCR, obtonandu-se o amplificare de AND de ordinal 106-107 o Pentru o multiplicare suficienta de secvente ADN sunt necesare 25-30 de cicluri de reactii automatizate, care se efectueaza in aproximativ 4h
Spectru de aplicabilitate
a)In diagnosticul medical:
Diagnosticul bolilor ereditare- se poate face si prenatal, la fat prin determinarea ADN-ului din celulele trofoblastice, facandu-se determinarea prenatala pt sexul copilului si se poate pune diagnosticul unei eventuale boli genetice in urma recoltarii lichidului amniotic
Diagnosticul bolilor infectioase :
HIV- se poate face in stadiul precoce ale infectiei, prin identificarea prezentei acidului nucleic viral in sange Se pot folosi ca probe pt diagnostic: spalatura bucala(cu celule epiteliale) , epitelii de fir de par, sange
Mai este folosita si in diagnosticul urmatoarelor boli innfectioase:
b) In medicina judiciara -pentru evidentierea identitatii unui fir de par sau a unei cantitati foarte mici de sange sau sperma
c) In studii de evolutie biologica
-testarea naterealuilui genetic de la organisme moarte (plante/animale) ex: in acest fel s-a reusit studierea fragmentelor de ADN din tesuturi cerebrale provenit d) In studii ecologice: s-a reusit evidentierea unui nr de microorganisme in probe de pamant/apa care nu puteau fi cultivate pe medii de cultura
e) In arheologie: -pentru analiza ADN-ului provenit din mumii egiptene
