Sunteți pe pagina 1din 8

Tehnici speciale de microscopie

Aceast lucrare urmrete studierea metodelor de observare a preparatelor ce


nu pot fi vizualizate cu ajutorul microscopului n transmisie sau n reflexie.

I. Noiuni teoretice
Metodele clasice de microscopie nu pot pune n eviden detaliile preparatelor
atunci cnd acestea au dimensiuni foarte mici (sub 1 m) sau nu prezint un contrast
bun (detaliile au aceeai culoare ca i restul preparatului). n aceast situaie, la
dispoziia observatorului stau metodele de colorare a preparatului sau tehnicile speciale
de microscopie.
Tehnicile de colorare (ce se vor studia n cadrul disciplinei de Histologie) prezint
n anumite situaii cteva dezavantaje: necesit o cantitate mare de timp, manopera i
substane chimice; nu pot fi observate celule sau organisme vii; imaginea obinut difer
mai mult sau mai puin de structura real.
Pentru nlturarea acestor deficiene pot fi utilizate tehnicile speciale de
microscopie. Dintre acestea amintim:
- Microscopia de imersie
- Microscopia n ultraviolet (UV)
- Microscopia de cmp ntunecat
- Microscopia de polarizare
- Microscopia de fluorescen
- Microscopia de contrast de faz
- Microscopia electronic

1. Microscopia de imersie
Cele dou tehnici de microscopie prezentate (transmisie i reflexie) nu permit o
mrire mai mare de 1000 de ori deoarece apare fenomenul de difracie a luminii pe
detaliile preparatului.
Pentru a permite observarea unor detalii mai fine una din soluii este
introducerea ntre obiect i obiectiv a unui lichid omogen, transparent i izotrop cu
indice de refracie ct mai mare, numit lichid de imersie. De obicei, se utilizeaz ulei de
cedru (n=1.3-1.5) sau compui sintetici (n=1.3-1.6). n acest mod se poate crete
mrirea pn la cca. 2000 de ori fr s apar fenomenul de difracie. Un alt avantaj al
folosirii imersiei este mrirea luminozitatii imaginii:
2h
(1 )
E d h
E0 n2 1
unde:
E - iluminarea imaginii cu lichid de imersie
E0 - iluminarea imaginii n absena lichidului
h - distana obiectiv-obiect
d - diametrul obiectivului
n - indicele de refracie al lichidului de imersie
E=(1.2-4)E0
n cazul utilizrii tehnicii de imersie este necesar ca preparatul s fie acoperit cu
o lamel pentru ca lichidul de imersie s nu modifice structura acestuia. De asemenea,
se utilizeaz obiective speciale (de imersie) ce sunt inscripionate Apo caracterizate
prin distan focal mic, avnd totodat posibilitatea de a culisa, n scopul evitrii
contactului brutal dintre obiectiv i lamel.
Au fost studiate aproape toate tipurile de bacterii. Performanele microscoapelor
cu lumin vizibil merg pana la mrimi de ordinul 2000-3000 de ori ( =0.25 m).

2. Microscopia de ultraviolet
O alt modalitate de a crete puterea separatoare este micorarea lungimii de
und a radiaiei folosite pn n domeniul ultraviolet UV (610 -10, 3.810-7)m. n acest
mod s-au putut distinge obiecte de dimensiuni de 0,15 m, atingndu-se o mrire de
6000-7000 de ori.
n cazul folosirii radiaiei UV este necesar ca toate componentele optice ale
microscopului s fie realizate din cuartz deoarece sticla comun este opac la acest tip
de radiaii.
Imaginea final va fi obinut pe un ecran de proiecie acoperit cu o substana
fluorescent. n cazul folosirii radiaiei UV este obligatorie folosirea ochelarilor i a
ecranelor de protecie deoarece retina este foarte sensibil n acest domeniu de lungimi
de und.

3. Microscopia de cmp ntunecat


Tehnica de cmp ntunecat este utilizat pentru observarea preparatelor
transparente i se bazeaz pe mprtierea luminii pe detaliile preparatului. Orice
neomogenitate din preparat va determina o modificare a direciei razelor de lumin. Din
punct de vedere constructiv se utilizeaz un condensor special alctuit dintr-o oglind
concav i una convex (figura 3.1) astfel nct doar razele de lumina mprtiate pe
neomogenitile preparatului s ajung n obiectiv.

Figura 3.1. Microscopia de cmp ntunecat.

Condensoarele de cmp ntunecat ofer nclinri diferite razelor de lumina


trimise spre preparat. Cnd se dorete observarea detaliilor foarte fine, se folosesc
condensoare ce produc nclinri mari fascicolului incident, fiind necesar n acelai timp
mrirea intensitii luminoase, deoarece fluxul de lumin ce ptrunde n obiectiv este
foarte mic. Ataate la microscop, condensoarele de cmp ntunecat trebuiesc centrate
foarte bine pe axul optic al microscopului, n caz contrar obinndu-se imagini cu
umbre.

4. Microscopia de polarizare
Microscopia de polarizare se utilizeaz n evidenierea i observarea
substanelor optic active ce se gsesc n preparat. Substanele optic active au
proprietatea de a roti planul luminii polarizate.
Figura 3.2. Microscopia de polarizare.

Pentru utilizarea acestei tehnici este necesar s se ataeze la microscop un


polarizor i un analizor, ambele confecionate din Spat de Islanda, ce au proprietatea de
a lsa s treac doar razele de lumin ce au un anumit unghi de polarizare.
Aceasta tehnic se utilizeaz att n microscopia de transmisie ct i n
microscopia de reflexie. n cazul montrii corecte a polarizorului i a analizorului doar
razele de lumina ce strbat zonele din preparat ce conin substane optic active vor
ajunge la observator.

5. Microscopia de fluorescen
Fluorescena este proprietatea anumitor substane de a emite lumin (radiaie
vizibil) atunci cnd sunt excitate cu radiaie UV. Deoarece multe substane de interes
medical prezint fluorescen (acizi nucleici, proteine) aceast tehnic este foarte
utilizat n practica de laborator i de cercetare medical.
Fiecare substan ce prezint fluorescen este caracterizat de o lungime de
und de excitaie (n UV) i de o lungime de und de emisie (n vizibil), astfel nct
tehnica poate nu doar pune n evident dar i identifica substanele respective. n acest
scop, se utilizeaz filtre optice i de UV pentru selectarea radiaiei de excitaie i de
emisie a substanei ce urmeaz a fi observat. Filtrele se dispun ca n figura 3.3.
Figura 3.3. Microscopia de fluorescen.

n cadrul acestei tehnici, pentru observarea substanelor ce nu prezint


fluorescen n mod direct, se utilizeaz markeri de fluore-scen, substane ce au
urmtoarele proprieti:
- fluorescen intrinsec
- aditivitate foarte mare
- deterioreaz minim structura (substana) de care se fixeaz
Cele mai utilizate sunt substanele din clasa flavinelor.

6. Microscopia de contrast de faz


Este o tehnic ce se utilizeaz n special pentru observarea celulelor i
organismelor vii atunci cnd tehnicile de colorare nu pot fi folosite. Metoda pune n
eviden diferena de drum optic pe care o face lumina trecnd prin diferite zone ale
preparatului (reamintim c drumul optic este produsul dintre drumul geometric i
indicele de refracie al mediului pe care l parcurge raza de lumin).
Deci aceast tehnic pune n eviden att diferene de grosime ntre diferitele
zone ale preparatului ct i diferene de indice de refracie ntre acestea. Sunt utilizate
obiective speciale (inscripionate Cf) care au dispuse n planul focal o placa de faz, ce
defazeaz lumina cu o semilungime de unda (n + se numete contrast de faz pozitiv
sau n contrast de faz negativ), i un inel parial absorbant.
De asemenea, condensorul prezint o fanta inelar ce este specific fiecrui
obiectiv folosit. Pentru punerea la punct a micros-copului este necesar un ocular special
cu ajutorul cruia se pot observa simultan att inelul parial absorbant ct i fanta
inelar n scopul suprapunerii acestor dou imagini.

II. Parte experimental


Materiale necesare:
1. Microscop de cercetare MC9
2. Microscop Biorom
3. Condensoare de cmp ntunecat
4. Polarizor, analizor
5. Obiective de imersie
6. Obiective de contrast de faz
7. Lame cu diferite preparate

Modul de lucru:
A. Observarea nucleilor celulelor
-se aeaz lama cu preparat pe masua microscopului i se fixeaz cu ajutorul
clreilor;
-se aduce pe axul optic obiectivul x40 (sau x25) i se localizeaz zona cu
preparat;
-se coboar msua microscopului fr a deplasa preparatul;
-se aduce pe axul optic obiectivul Apo xl00;
-se aplic o pictur de lichid de imersie pe preparat (n dreptul obiectivului);
-cu foarte mare atenie se coboar obiectivul pna ce se imer-seaz n lichid;
-privind prin ocular se pune la punct imaginea.

B. Determinarea depozitelor glucidice


-se monteaz la microscopul MC9 polarizorul i analizorul;
-se fixeaz preparatul pe msu;
-se pune la punct imaginea;
-se deplaseaz n plan orizontal preparatul pe msu pn cnd se gsete o
zona liber;
-se rotete ncet polarizorul pn n momentul n care imaginea este maxim de
ntunecat;
-se aduce din nou preparatul n cmpul vizual; zonele luminoase reprezint
zonele n care se gsesc substane optic active.
C. Determinarea ncrcturii biologice a apei
-se monteaz la microscopul Biorom condensorul i obiectivele de contrast de
faz;
-se nlocuiete un ocular cu ocularul de punere la punct;
-din uruburile de punere la punct se centreaz sistemul astfel nct inelul parial
absorbant din obiectiv s corespund cu fanta inelar a condensorului;
-se monteaz din nou ocularul microscopului;
-pe o lam curat se pune o pictur de ap sttut (24h);
-se fixeaz lama la microscop i se caut observarea germenilor existeni n ap
att prin tehnica de microscopie clasic ct i prin cea de contrast de faz.