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INSTITUTO DE QUMICA
BIOQUMICA QBQ230N
Biologia Noturno
Professores :
Alexander Henning Ulrich, Bloco 8 sup., sala 853,
e-mail: henning@iq.usp.br.
Mario Jose Politi, Bloco 12 sup., sala 1258,
e-mail: mjpoliti@usp.br
Monitores:
Ariane Ferreira Nunes Alves email:anunesalves@usp.br
Arquimedes Cheffer email: arquiqbq@iq.usp.br
Erika de S. Molina email: molina.kk@gmail.com
Talita Glaser email:talita.glaser@usp.br
2013
NDICE
2
INTRODUO E NORMAS GERAIS
3
AVALIAO
O clculo da mdia final consistir na soma das seguintes parcelas: [(mdia das
PROVAS LAB) X 2 ] + [(mdia dos GDs) X 0,5] + [ Av1 X 2] + [Av2 X 2,5] + [Av3 X 3,0]
dividida por 10.
Haver uma nica prova substitutiva para substituir uma das avaliaes individuais.
Reposies das PROVAS LAB E PG no sero possveis. A presena em todas as
atividades obrigatria e ser registrada em lista diria de presena. importante
destacar que faltas a laboratrio incorrero em reduo de nota na PROVA LAB
correspondente. Alunos que alcanarem a mdia final 5,0 e mostrarem freqncia
70% estaro aprovados. Aqueles cuja mdia for no mnimo igual a 3,0 e
apresentarem freqncia 70% podero fazer a prova de recuperao.
BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
4
CALENDRIO DE MDULOS E ATIVIDADES 2010
5
MDULO 1: GUA; REAO CIDO-BASE, pH E SISTEMA TAMPO
4. cidos so classificados de acordo com sua fora relativa, ou seja, de acordo com
sua capacidade de transferir um prton para a gua. cidos com constantes de
dissociao menores do que aquela de H3O+ (que, por definio, igual a 1 em
solues aquosas (v se consegue confirmar por que!)) so s parcialmente ionizados
em solues aquosas e so conhecidos como cidos fracos (K 1). J os cidos
fortes tm constantes de dissociao maiores que a de H3O+, sendo quase
completamente ionizados em solues aquosas (K1).
5. Tampes so sistemas aquosos que tendem a resistir a variaes no seu pH
quando pequenas quantidades de cido (H+) ou base (OH-) so adicionadas. Um
sistema tampo consiste de um cido fraco (o doador de prtons) e sua base
6
conjugada (o aceptor de prtons). comum encontrar os seguintes smbolos para
-
representar um cido (AH ou BH+) e sua base conjugada (A ou B:)
6. A adio de cido forte (H+) ou base forte (OH-) a uma soluo aquosa de um
cido fraco, por exemplo, cido actico (pKa = 4,76), causa pequenas variaes de pH,
se a soluo estiver a um pH prximo do pK do cido. Este comportamento define um
tampo cido-base.
7
do grupo correspondente. Essa relao numrica entre pH e pKa facilmente
compreensvel da anlise da equao de Henderson-Hasselbalch.
8
9
MICROPIPETADORES
10
Fonte: http://www.analiticaweb.com.br/
11
LABORATRIO 1: COLORIMETRIA E ESPECTROMETRIA
I. FUNDAMENTOS
A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento
analtico atravs do qual se determina a concentrao de espcies qumicas mediante
a absoro de energia radiante (luz).
Fotometria uma tcnica de anlise quantitativa que envolve a medida de
intensidade de absoro de luz monocromtica de um composto qumico em soluo.
Serve para identificar o comprimento de onda caracterstico para cada composto e
para quantificao do composto atravs de 1) absoro direta e 2) atravs de mtodo
colorimtrico. Essa intensidade de absoro depende:
1) do comprimento de onda escolhido (normalmente usa o mx - onde o
composto absorve mais luz),
2) do percurso que o feixe de luz percorrer na soluo e
3) da concentrao do composto nessa soluo.
A lei de Lambert-Beer estabelece que a absorbncia diretamente proporcional
concentrao da espcie absorvente. A frao de luz que passa por uma amostra (a
transmitncia = It/I0) est relacionada logaritmicamente, e no linearmente, com a
concentrao da amostra (figura 1).
A lei de Lambert-Beer relaciona esses trs fatores e estabelece que:
A = .l.c
Onde:
A = absorbncia definida pela reao seguinte: A = - log It/I0, que por ser
uma razo, no possui unidade (Io intensidade de luz incidente; It
intensidade de luz transmitida);
= absortividade molar (caracterstico de cada substncia), em L.(mol.cm)-1;
l = caminho ptico (percurso da luz monocromtica na soluo), em cm;
c = concentrao da substncia em mol/L.
12
l
I0 It
*
Absorbncia *
*
*
*
Concentrao (mol/L)
13
desenvolvida numa reao de ons de Cu2+ em meio alcalino com estas protenas
deve-se exclusivamente s ligaes peptdicas e a sua intensidade proporcional a
quantidade de tais ligaes. A absorbncia detectada no espectrofotmetro (figura
2).
Um outro mtodo para determinar a quantidade de protena baseado no fato
que certos aminocidos possuem anis aromticos o que os leva a absorver em
comprimentos de onda especficos na regio de UV. Bases purnicas e pirimidnicas
tambm possuem estas propriedades.
Adicionar no tubo 1:
- 1,0 mL de padro de albumina (8 mg/mL),
- 0,5 mL de gua,
- 2,5 mL de reagente de biureto.
Adicionar no tubo 2:
- 1,5 mL de gua,
- 2,5 mL de reagente de biureto.
Aps adio dos reagentes, agitar e incubar os tubos por 15 min a 37oC.
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Transferir contedo dos tubos para cubetas do espectrofotmetro e ler as
absorbncias nos comprimentos de onda 400, 420, 450, 470, 500, 520, 550, 580, 600,
630, 650, 680 e 700 nm. Usar a soluo de biureto como branco (tubo 2).
Com isso, voc estar construindo a curva de absorbncia em funo do
comprimento de onda. Estabelecer qual o mx do produto da reao de biureto.
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a) mx,
b) absorbncia obtida em mx,
c) calcular de cada substncia.
I. FUNDAMENTOS
Cromatografia - Separao de aminocidos
Um dos problemas que continuamente desafiam os bioqumicos a separao e a
purificao de um ou mais compostos de uma mistura complexa. Uma grande
variedade de tcnicas modernas, tanto analticas quanto preparativas, denominada
de cromatografia. O que elas possuem em comum a propriedade de fracionar uma
mistura complexa de substncias usando diferentes caractersticas qumicas entre os
componentes da mistura, o que faz com que eles interajam diferencialmente com a
fase estacionria e com uma fase mvel.
Existem quatro tipos principais de cromatografia: cromatografia lquida,
cromatografia gasosa, cromatografia de camada fina e cromatografia em papel. A
seleo do tipo de cromatografia para realizar uma determinada etapa de separao
dependente do material a ser isolado. Freqentemente, diversos mtodos
cromatogrficos podem ser usados seqencialmente para que seja obtido um
composto na forma pura.
Um leito cromatogrfico pode ser construdo de vrias formas, mas ele sempre
consistir, basicamente, de duas fases: a fase estacionria e a fase mvel. A fase
estacionria pode ser slida, lquida ou pode consistir de uma mistura de um slido
com um lquido. A fase mvel, que pode ser lquida ou gasosa, preenche os
interstcios da fase estacionria e deve ser capaz de fluir atravs desta. As fases
mvel e estacionria devem ser escolhidas de forma que os compostos que sero
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separados durante o processo cromatogrfico possuam um coeficiente de partio
definido entre as duas fases. Neste processo, vrios mecanismos de distribuio
podem ser empregados: a distribuio pode ser uma simples partio entre dois
lquidos imiscveis; um equilbrio de adsoro entre uma fase estacionria adsorvente
e uma fase lquida mvel; ou um equilbrio de troca inica entre uma fase estacionria
trocadora de on e uma fase mvel constituda por uma soluo de um eletrlito.
Quanto mais apolar for o grupo R, maior a mobilidade do aminocido com a fase
mvel. Conseqentemente a relao (RF) entre a distncia percorrida pelo aminocido
no papel e a distncia percorrida pela fase mvel ser tambm maior. A Tabela I
apresenta valores de RF de alguns aminocidos nas condies descritas.
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RF = distncia percorrida pelo aminocido no papel
distncia percorrida pela fase mvel
II. OBJETIVOS
1) Identificao de um aminocido atravs de seu RF, determinado pela tcnica de
cromatografia em papel.
2) a) Identificao de um aminocido atravs de seus pKas, determinados pela
tcnica de titulao.
b) Comparao da curva de titulao de um aminocido com a de um cido fraco
monoprtico.
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III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1) Cromatografia em papel
Tomar uma folha (23 x 16 cm) de papel Whatman n 1 e fazer um trao a lpis ao
longo do comprimento maior a 2 cm da borda. Evitar tocar no papel durante toda a
operao. Deixar uma margem de 1,5cm de cada lado. Marcar seis pontos sobre essa
linha que distem 4 cm um do outro e numer-los a lpis de 1 a 6. As amostras devem
ser aplicadas nos pontos numerados (3 uL) de tal modo que a mancha formada sobre
o papel seja a menor possvel.
Nos nmeros de 1 a 4 aplicar os padres e no nmero 6, a mistura de padres. A
amostra desconhecida aplicada no nmero 5.
Enrolar o papel de modo a transform-lo em um cilindro e prender as extremidades
superiores com clips.
Colocar 25 mL de solvente de Partridge (n-butanol/cido actico glacial/gua 4:1:1),
em uma placa de Petri e mergulhar o cilindro de papel em seu interior de modo que
este fique perfeitamente na vertical. Evitar que o papel toque na parede da placa.
Cobrir o sistema com um bquer de 2 L e deixar o solvente migrar 10 cm.
Retirar o papel e marcar imediatamente a linha de frente do solvente.
Secar o papel na estufa.
Mergulhar em soluo 0,1% de ninhidrina em acetona e levar estufa (80C-100C) por
alguns minutos.
Delimitar com lpis as manchas que aparecem no papel.
Determinar o RF dos padres e do aminocido desconhecido e comparar com os
dados fornecidos na tabela 1, para sua identificao.
Aminocido RF Aminocido RF
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2) Titulao
Colocar 50 mL da soluo do aminocido (0,10 M) em pH 1,0 em um bquer e titular
com soluo 0,5 M de KOH medindo o pH aps cada adio de 1 mL at atingir pH
11,0.
Colocar 50 mL de cido actico 0,15 M em outro bquer e titular com soluo 0,5 M de
KOH medindo o pH aps cada adio de 0,5 mL at pH 12,0.
Tabela 2 - pK de aminocidos
Aminocido pKa Aminocido pKa
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Esta reao, como est escrita, jamais ocorre nos seres vivos. A unio dos
aminocidos por ligao peptdica no feita por reao direta entre eles, mas atravs
de um complexo aparato de sntese protica, que inclui ribossomos, cidos
ribonuclicos, vrias protenas e enzimas num processo chamado traduo. A
equao mostra apenas o resultado liquido do processo.
21
Marzzocco & Torres, Bioqumica Bsica.
O polmero formado pode, portanto, ser visualizado como uma cadeia constituda por
unidades planares (unidades peptdicas), unidas entre si com uma articulao flexvel:
o carbono . Esta cadeia chama-se cadeia polipeptdica. As protenas podem ser
formadas por uma ou mais cadeias polipeptdicas.
4. Todavia, existem pontos de dobramento entre as unidades peptdicas rgidas,
graas a possibilidade de rotao em torno das ligaes com o carbono alfa (N-C e
C-C), que so ligaes efetivamente simples (vide figura acima). Estas ligaes so
chamadas phi () e psi () respectivamente.
5. A cadeia polipeptdica pode ser dividida entre a cadeia principal e as cadeias
laterais (grupos R) ligados aos carbonos alfa.
I. FUNDAMENTOS
Mtodos de Purificao de Protenas
possvel purificar e isolar protenas utilizando-se princpios fsico-qumicos, que
levam em conta as propriedades caractersticas dessas biomolculas. Uma dessas
caractersticas est baseada na solubilidade das diferentes cadeias laterais dos
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aminocidos, que dependem da concentrao de sais dissolvidos no solvente (fora
inica da soluo), da polaridade do solvente (constante dieltrica desse solvente), do
pH do meio (ponto isoeltrico da protena) e da temperatura.
Em uma soluo aquosa de baixa fora inica, a solubilidade de uma protena, em
geral, aumenta com a concentrao salina. Esse fenmeno conhecido como
salting in. Em solues com alta fora inica, entretanto, a solubilidade de uma
protena em geral decresce, fenmeno que resulta da competio entre os ons salinos
adicionados e o soluto (protena), diminuindo a capacidade de solvatao do solvente
aquoso. Esse fenmeno conhecido como salting out, constituindo uma das
tcnicas mais utilizadas para a purificao de protenas. Sulfato de Amnio
[(NH4)2SO4] o sal mais utilizado para salting out, uma vez que sua solubilidade
alta (3,9 M a 0C), permitindo gerar solues aquosas de alta fora inica.
Protenas em geral possuem uma grande variedade de aminocidos com
grupamentos ionizveis com diferentes pKs. A um pH caracterstico para cada
protena, as cargas positivas da molcula so balanceadas pelas cargas negativas,
conferindo protena carga total zero. Neste pH, denominado ponto isoeltrico (pI),
a molcula torna-se imvel em presena de um campo eltrico. Como pode ser visto
na Figura 1, a solubilidade da lactoglobulina pode variar com a concentrao salina
(NaCl). No entanto, em qualquer caso, ao se ajustar o pH para valores prximos ao pI
da protena, ocorre uma solubilizao mnima e a maior frao de protenas ficar
insolvel.
Em muitas situaes, pode-se utilizar os conceitos de salting out e de
precipitao no pI para purificar uma protena especfica.
Solubilidade
mg/mL
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Eletroforese e Separao de Protenas Totais (SDS-PAGE)
A separao de macromolculas (protenas, DNA e RNA) pode ser feita
aplicando-se um campo eltrico numa matriz slida, como um gel ou papel, que
contem a mistura de interesse. Esse mtodo, amplamente utilizado, denomina-se
eletroforese e baseia-se na migrao das molculas em relao a um campo eltrico,
devido sua carga.
Normalmente se utiliza um gel, devido a supresso das correntes de
conveno produzidas por pequenos gradientes de temperatura e tambm porque o
gel funciona como uma peneira molecular, permitindo a separao das
macromolculas por peso molecular.
O gel de eletroforese constitudo de um polmero de acrilamida cuja estrutura
est demonstrada na Figura 2. Esta polimerizao ocorre na presena de radicais
livres, os quais so gerados por persulfato de amnio e estabilizados por TEMED
(N,N,N,N-tetrametilenenodiamino). A polimerizao tambm depende da presena de
um agente, o NNmetileno-bis-acrilamida, que facilita a ligao das cadeiras entre si,
formando um gel cuja porosidade determinada pelo comprimento das cadeias e pelo
grau de interligao entre estas.
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A separao de protenas ocorre em condies desnaturantes. A mistura de
protenas e dissolvida em tampo de amostra. Este tampo de amostra contm SDS
(dodecil sulfato de sdio), que um detergente aninico que acaba rompendo as
ligaes no covalentes existentes na protena nativa resultando na sua desnaturao.
Neste tampo tambm temos -mercaptoetanol que reduz as pontes de dissulfeto
existentes na protena.
II. OBJETIVOS
1) Precipitar as protenas totais de uma soluo de leite em p, utilizando os
conceitos de precipitao no pI.
2) Utilizar eletroforese em gel de poliacrilamida/SDS (SDS-PAGE) para separar as
protenas de diferentes amostras e estimar sua concentrao.
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Albumina bovina a 4,0 mg/mL (5,0 L) (padro de peso molecular: 66,0 KDa)
Montar o aparato para eletroforese conforme figura 3 (o gel de eletroforese ser
preparado previamente de acordo com o apndice 1), adicionar na cuba o tampo de
corrida at cobrir os poos do gel para eletroforese.
Adicionar tampo de amostra (10 L) a cada uma das amostras, e aquecer (2
minutos, 100C) para desnaturar as protenas. Resfriar (gelo) e aplicar 15 L nos
poos do gel para eletroforese seguindo a ordem da tabela 2.
poo n 1 2 3 4 5 6 7 8
Amostra padro amostra 1 amostra 2 amostra 3 amostra 4 amostra 5 amostra 6 amostra 7
V. APNDICE
Preparao do gel de acrilamida / SDS
OBS: Adicionar o TEMED por ltimo, pois ele o agente polimerizante deste gel.
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soluo. Aguardar a polimerizao do gel (5 minutos). Ser necessrio deixar
aproximadamente 1,0 cm de espao para aplicar o gel de empilhamento
OBS: A soluo comea a polimerizar muito rapidamente, necessrio ateno e
rapidez para aplicar a soluo no aparato de eletroforese.
OBS: Adicionar o TEMED por ltimo, pois ele o agente polimerizante deste gel.
Solues utilizadas
Tampo de corrida:
3,0 g de Tris, 14,4 g de Glicina e 10, 0mL de SDS (10%)
Ajustar o volume de gua destilada para 1000 mL
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Tampo de amostra:
SDS 10% (5,0 mL), 2-mercaptoetanol (0,5 mL), Glicerol (2,0 mL), EDTA 0,1M
(0,1 mL), Azul de Bromofenol 1% (1,0 mL), Soluo C (2,5 mL) e gua
destilada (at 20,0 mL).
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Figura 3 Esquema do aparato para eletroforese.
29
MDULO 4: INTRODUO CINTICA E TERMODINMICA QUIMICA
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7. Na reao genrica A B a velocidade (v) proporcional a [A], isto , v1=k1[A]. A
velocidade da reao inversa ser, consequentemente, v-1=k-1[B]. k1 e k-1 so
constantes de velocidade e reaes como AB e BA so ditas de primeira ordem,
porque as suas respectivas velocidades dependem de concentrao molar de um
nico reagente elevado potncia 1. As constantes de velocidade k 1 e k-1 so
diferentes da constante de equilbrio da reao, K=[B]/[A]. No estado de equilbrio, por
definio, v1=v-1 e, portanto, formalmente, K=k1/k-1. As reaes representadas pelas
equaes seguintes: 2AB e A+BC so de segunda ordem, cujas velocidades so,
respectivamente, v=kA[A]2 e v=kAB[A][B]. Notar que a ordem da reao no coincide
necessariamente com a estequiometria da equao qumica.
8. Estado de Transio
Energia (T)
Livre
(G)
G*
G'
Coordenada de Reao
Variao de energia livre (G) no decorrer de uma reao genrica.
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reaes ocorre na clula a velocidade significante se no houver catlise por uma
enzima especfica, da classe das fosfatases.
Como esta reao no ocorre sem catlise, seu controle pela clula feito atravs
de uma enzima quinase especfica.
NH2
N C
C N Ad e n i n a
H C
C C H
N
N
O- O- O-
- O- P - O- P - O- P - O- CH
2 O
O O O
H H H
H Ri b o s e
HO OH
A MP
ADP
AT P
FIGURA 2
12. Alm das quinases que catalisam a transferncia de grupo fosfato do ATP para
metablitos, existem as quinases que tem como substratos protenas, genericamente
referidas como quinases de protena ou, simplesmente, protena-quinases.
32
H alguns milhares de protena-quinases diferentes em um organismo, que catalisam
a transferncia de fosfato de ATP para o grupo OH da cadeia lateral de resduos
especficos de serina e treonina formando um ster de fosfato. As reaes deste tipo
so genericamente chamadas de fosforilaes e so modificaes covalentes que
causam mudana de conformao das protenas, alterando sua atividade biolgica.
Por exemplo, um grande nmero de enzimas so fosforiladas para sofrer uma
transio do estado inativo ao ativo ou vice-versa. Mais raramente as protenas so
fosforiladas no grupo enlico de resduos de tirosina.
33
Compostos fosforilados.
R R
C O P + H2O C O + Pi Go' = - 13.000 cal/mol
CH2 CH3
R R
C O P + H2O C OH + Pi Go' = - 8.000 cal/mol
O O
Anidrido fosfrico cido cido
34
explicitamente expressa atravs dos ngulos phi () e psi () (vide Mdulo 3). Em
geral, certas combinaes de ngulos phi () e psi () so permitidas enquanto outras
no so permitidas devido a impedimentos estricos entre tomos de grupos vizinhos.
Este princpio pode ser resumido numa diagrama de Ramachandran (Figura 1).
35
-hlice. Folha pregueada.
36
d. Protenas possuem muitos grupos ionizveis atravs de reao cido-base,
cujos pKs variam enormemente. O pI de uma protena definido como pH da soluo
na qual a carga lquida da molcula de protena nula.
Topografia
de superfcie
37
MDULO 6: CINTICA ENZIMTICA
Estado de transio da
Energia G10# G0#-1 reao no catalisada
Livre (G) *
* Estado de transio da
reao catalisada
G0#1cat
G0#-1cat
Estado Inicial
(S)
(Reagentes) G0
Estado Final
(P)
(Produtos)
Coordenada de Reao
38
Trata-se de reao de primeira ordem, onde v=k1[uria], apesar de a equao
estequiomtrica indicar a existncia de 2 reagentes. Esta reao pode ser
acompanhada em tubo de ensaio no laboratrio.
As Tabelas 3 e 4 mostram resultados obtidos na prtica.
k1 kcat
E + S ES E + P
k-1
39
A derivao da equao Michaelis Menten: v = Vmax[S] / (Km + [S]) = kcat[Et][S]
/ (Km + [S]) apresentada a seguir.
Concentrao
Velocidade mxima
Velocidade do substrato
naquela [S]
Kdiss aparente do
Complexo enzima-substrato Frao de Etot na forma de ES =
[S]/(Kdiss + [S])
40
5. Substncias que reduzem a atividade de uma enzima so chamadas inibidores.
Em termos gerais, inibidores podem atuar em vrias maneiras. Aqui vamos focalizar
em inibidores que ligam reversivelmente com a enzima com constantes de
dissociao KI. Estes tipos de inibidores podem atuar em duas maneiras diferentes:
a) Eles podem competir com o substrato para o mesmo stio de ligao na superfcie
da enzima livre. Neste caso so chamados inibidores competitivos ou b) Eles
podem ligar em outro stio na enzima livre (E) e/ou no complexo enzima-substrato
(ES). Estes inibidores so chamados inibidores mistos/no-competitivos se podem
ligar a E e ES e so chamados acompetitivos se ligam somente ao complexo ES.
I. FUNDAMENTOS
A Cintica Enzimtica estuda os mecanismos de reaes qumicas catalisadas por
enzimas. H na estrutura da enzima, uma determinada regio diretamente
responsvel pela ao cataltica. Essa regio denominada stio ativo e a sua
conformao correta fundamental para a atividade enzimtica. Ali se localizam
diversos resduos de aminocidos que podem desempenhar funes de orientao do
substrato e de direta interao com este, permitindo que a reao ocorra.
Em 1913, L. Michaelis e M. L. Menten, desenvolveram estudos considerando as
principais propriedades das enzimas e aplicando as teorias conhecidas de Cintica
Qumica para um modelo simplificado, o qual envolvia a enzima livre (E), o substrato
(S), o complexo enzima-substrato (ES) e o produto (P). Esse modelo pode ser
expresso pela equao qumica:
k1 k2
E + S ES E + P
k-1
41
Michaelis e Menten, com essas consideraes, desenvolveram a expresso de
velocidade para uma reao catalisada enzimaticamente, onde V funo de [S] e
Vmax e Km so constantes:
Vmx . [S]
v =
Km + [S]
Na figura 1 est apresentada a curva de velocidade inicial de reao em funo da
concentrao de substrato para uma enzima que siga o modelo proposto por Michaelis
e Menten. Essa enzima dita de caractersticas michaelianas e obedece expresso
de velocidade apresentada acima.
Vmx
( / min.l)
Vel. Inicial Reaomol
Vmx / 2
Km
Concentrao de Substrato (M)
42
Estes monossacardeos reduzem o DNS fornecendo um produto de cor caracterstica,
cuja formao pode ser acompanhada a 540 nm.
Conhecendo-se por colorimetria a quantidade (mols) de acares redutores
formada, por um clculo estequiomtrico simples, pode-se determinar a quantidade
correspondente (mols) de sacarose hidrolisada. Nestas experincias as velocidades
da reao sero expressas em mols de sacarose hidrolisada por minuto.
Para estudos de velocidade, o tempo de reao deve ser medido com a maior
exatido possvel. Para isso, o grupo dever organizar-se de maneira a no permitir
que a reao se inicie em tempos diferentes nos vrios tubos. Para tal, importante
manter os tubos em gelo durante a adio dos reagentes. Esses devem ser
adicionados na ordem em que aparecem nos protocolos, com a enzima sendo
adicionada por ltimo. Levam-se ento os tubos, todos juntos, ao banho a 37C para
reagir. Transcorrido o tempo determinado, os tubos devem voltar, todos juntos e
simultaneamente, para o gelo. Neste ponto a reao pra.
A atividade enzimtica medida em unidade (U), sendo que 1 U a quantidade de
enzima necessria para a formao de 1 mol de produto por minuto.
II. OBJETIVOS
Estudar as influncias das concentraes de enzima e substrato nas velocidades de
uma reao enzimtica, examinar as curvas obtidas experimentalmente, calcular os
parmetros cinticos e discutir seus valores e importncia.
43
2 0,4 1,6 2,0
3 0,6 1,4 2,0
4 0,8 1,2 2,0
5 1,0 1,0 2,0
44
3. Efeito da concentrao de substrato
Numerar sete tubos de ensaio (180 X 20 mm) e adicionar os reagentes segundo a
tabela 3.
Manter todos os tubos no gelo.
I. FUNDAMENTOS
45
cetocido. Foram identificadas mais de 50 tipos de transaminases, presentes em todos
os tipos de clulas e sendo encontradas tanto no citossol como em mitocndrias de
clulas eucariticas. O grupo NH3+ de todos os aminocidos (com exceo de Lys,
Arg e Thr) podem ser removidos por transaminases em diferentes organismos. As
transaminases possuem especificidade diferenciada: relativamente especfica para o
cetocido aceptor do grupo NH3+ e, numa menor intensidade, para o aminocido
doador. A coenzima PLP (piridoxal-fosfato) essencial para as transaminaes e
vrias outras enzimas envolvidas no catabolismo de aminocidos (figura 1). PLP
derivada da vitamina B6, hidrossolvel, o piridoxal. A figura 2 mostra como os
processos catablicos dos diversos aminocidos colaboram com o eficiente
funcionamento do ciclo de Krebs pelo fornecimento de intermedirios desse ciclo.
O cido glutmico (Glu), produzido em diversas transaminaes, pode tanto sofrer
desaminao oxidativa, produzindo o - cetoglutarato e o on NH4+, que ser utilizado
no ciclo da uria, como doar o grupo NH3+ para a biossntese de outros aminocidos.
O Glu o principal doador de grupos NH3+ nesta funo. A figura 3 ilustra esses
processos metablicos.
NH3+ O
R C COO- R C
COO-
H
-CETOCIDO
AMINOCIDO
O NH3
H
C
CH2
HO CH2 O P
HO CH2 O P
+
H 3C N +
H H 3C N
H
Piridoxal-fosfato Piridoxamino-fosfato
O
NH3+
-OOC CH2 CH2 C
-OOC CH2 CH2 C COO- COO-
H -CETOGLUTARATO
GLUTAMATO
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Figura 2 - Os processos catablicos dos diversos aminocidos colaboram com o
eficiente funcionamento do ciclo de Krebs pelo fornecimento de intermedirios desse
ciclo.
II. OBJETIVOS
Estudar as reaes de transaminases e identificar os produtos e reagentes atravs da
cromatografia em papel.
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2) Preparao da mistura reacional
O sistema completo da reao composto por um aminocido, um cetocido, o
preparado enzimtico, arsenito de sdio e o tampo. O arsenito de sdio empregado
com a finalidade de evitar a oxidao dos cetocidos pelo sistema enzimtico.
Montar a seguinte reao:
- 0,3 mL de soluo de cetoglutarato 0,2M pH 7,4
- 0,3 mL de soluo de Alanina a 0,2M pH 7,4
- 0,3 mL de preparao enzimtica
- 0,5 mL de tampo fosfato 0,05M pH7,4
- 0,4 mL de soluo de arsenito de sdio 0,2M
E tambm um controle negativo (branco) contendo todos os componentes exceto a
preparao enzimtica, que substituda por tampo:
- 0,3 mL de soluo de cetoglutarato 0,2M pH 7,4
- 0,3 mL de soluo de Alanina a 0,2M pH 7,4
- 0,8 mL de tampo fosfato 0,05M pH7,4
- 0,4 mL de soluo de arsenito de sdio 0,2M
Incubar os dois tubos (reao e controle negativo) a 37C por 30 minutos. Em
seguida, inativar a reao em banho-maria fervente por 3 minutos. Centrifugar a 5000
rpm, 10 minutos (centrfuga Eppendorf). Decantar o sobrenadante transferindo para
um segundo tubo Eppendorf e fazer a cromatografia com os padres adequados.
3. Cromatografia
Em um papel de filtro Whatman nmero 1 (10 cm X 20 cm) traar com um lpis uma
linha horizontal de 2,5 cm de altura a partir da origem (ponto de contato do papel com
a soluo na cuba de cromatografia). Marcar 7 pontos com 2,5 cm de distncia entre
si.
Aplicar, com um capilar de vidro fino, sobre os pontos marcados, uma pequena
alquota dos padres de alanina, glutamato, piruvato, e -cetoglutarato, a mistura de
reao, o branco (controle negativo) e 2,4-dinitrofenil-hidrazina. Sobre os pontos onde
foram aplicados os padres e as amostras, adicionar 3 uL de 2,4-dinitrofenil-hidrazina.
O solvente utilizado para a cromatografia ser uma mistura de butanol/etanol/NH4OH
0,5 M na proporo 70:20:30 (v/v).
Aps o solvente alcanar 1 cm do final do papel, secar o papel a 80C em estufa e
marcar os produtos coloridos formados. Revelar os aminocidos do cromatograma
com a soluo de ninhidrina, secando em seguida o papel. Marcar a posio das
manchas que aparecerem.
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respectivamente, aldedo ou cetona. H duas trioses: o gliceraldedo, uma aldotriose, e
a diidroxiacetona, uma cetotriose (Figura 8). O gliceraldedo apresenta um carbono
(C2) assimtrico, dando origem a dois ismeros opticos, as formas D e L (Figura 9). J
a diidroxiacetona no possui C assimtrico e, por isso, no mostra esse tipo de
isomeria. Os outros monossacardeos podem ser derivados pelo crescimento da
cadeia destas duas trioses. A Figura 10 mostra a famlia D derivada do D-
gliceraldeido, cujas frmulas estruturais planares obedecem as regras de Fisher.
49
Famlia D derivada do D-gliceraldedo
Ciclizao da D-glicose
50
O aumento da cadeia do monossacardeo leva ao aparecimento de novos Cs
assimtricos e, portanto mais ismeros estruturais, tambm chamados
estereoismeros. O nmero de ismeros dado pela expresso 2n onde n o nmero
de carbonos assimtricos. Por exemplo, em aldoexoses h 4 Cs assimtricos, logo o
nmero de ismeros 24 =16, sendo 8 da forma D e 8 da forma L. Mas, as estruturas
lineares como representadas na Figura 10 tanto para pentoses como para hexoses
so poucos estveis em soluo, formando estruturas cclicas segundo a reao
mostrada na Figura 11. Esta uma reao bem conhecida da qumica orgnica, pela
qual um lcool (OH) faz uma adio nucleoflica a carbonila de um aldedo, formando
um composto de condensao da conhecido como semiacetal. No caso do exemplo
da Figura 11 a hexose a D-glicose e, como a figura mostra, a ciclizao leva ao
aparecimento de uma outra isomeria estrutural devido s duas posies possveis do
OH do C1 em relao ao plano do anel, gerando os ismeros e . importante
enfatizar que o OH do C1 no quimicamente equivalente aos demais OHs que so
alcolicos, sendo por isso chamado de OH glicosdico. A existncia do OH glicosdico
permite que todos os monossardeos sejam oxidados em condies brandas pelo
reagente de Fehling, uma reao de oxido-reao na qual os OHs alcolicos no
participam.
51
2. Conforme exemplificado na Figura 12 h uma nomenclatura especificamente
designada para distinguir pares de estereoismeros. Enantimeros possuem
estruturas isomricas que so uma imagem especular da outra, por exemplo, cada
membro da famlia D de hexoses mostrada na Figura 10 tem um, e, somente um,
enantimero na famlia L. So epmeros pares de estereoismeros que diferem
apenas pela configurao de um C assimtrico. So anmeros os dois ismeros
resultantes da posio do OH glicosdico do C1 na estrutura cclica da hexose. E,
finalmente, so denominados diastereoismeros pares de ismeros que no caem em
nenhuma das categorias anteriores.
Caso a ligao glicosdica envolva a condensao dos dois OHs glicosdicos como
o caso da trealose, uma 1-1-diglicose, o dissacardeo no pode ser oxidado pelo
reagente de Fehling (dissacardeo no redutor). J a maltose, que possue um OH
glicosdico livre um dissacardeo redutor, sendo oxidado pelo reagente de Fehling.
52
Glicognio Poli (1-4) (1-6) glicose.
MDULO 8: GLICLISE
53
5. Na gliclise, h 3 reaes de fosforilao irreversveis catalisadas, respectivamente,
pela hexoquinase, fosfofrutoquinase e piruvato-quinase, que funcionam como marca-
passos da via, cuja regulao se d por um elaborado sistema de controle alostrico
das enzimas.
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HOCH2
O
HO
OH
OH
GLICLISE Glicose
OH
ATP ATP
ADP ADP
P -OCH2
O
OH Glicose 6-fosfato
HO OH
OH
P -O-CH2 O CH2OH
HO Frutose 6-fosfato
OH
HO
ATP
ATP
ADP
ADP
P -O-CH2 O CH2O- P
HO OH
Frutose 1,6 bisfosfato
HO
H2C-O- P HC=O
ADP ADP
ATP ATP
O=C-O-
HC-OH 3-Fosfoglicerato
H2C-O- P
COO-
HC-O- P
2-Fosfoglicerato
H2C-OH
H2O
COO-
C-O- P
Fosfoenolpiruvato
CH2
ADP
ADP
ATP
ATP
COO- COO-
HC-OH C=O
Lactato Piruvato
CH3 NAD+ NADH CH3
NAD+ NADH
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MDULO 9: ACETIL-COA E CICLO DE KREBS
56
6. As enzimas citrato sintase, isocitrato desidrogenase e -cetoglutarato
desidrogenase so as reguladoras do fluxo metablico atravs do ciclo de Krebs e
esto sujeitas a controle alostrico, envolvendo NADH como inibidor e Ca+ e ADP
como ativadores.
Piruvato
CoASH + NAD +
CO2 + NADH
Acetil-CoA
H 2O
CoASH
Oxaloacetato Citrato
NADH + H+
NAD+ H 2O
L-Malato cis-Aconitato
H2O
H 2O
Fumarato
Ciclo de Krebs Isocitrato
FADH2
NAD+
FAD
NADH + H+
Succinato
GTP Oxalosuccinato
CO2 CoASH CO2
GDP + Pi
Succinil-CoA a-Cetoglutarato
NADH NAD+
+ H+
2. A cadeia respiratria contem 4 complexos, I,II, III e IV, ordenados por ordem
crescente de potencial redox, indo do potencial padro de NAD+/NADH (E0= -0,315V)
ao do O2/H2O (E0= +0,815V). Os eltrons so transferidos do complexo I ou II para o
complexo III pela coenzima Q (ou ubiquinona), e do complexo III para o complexo
IV pelo citocromo C para chegar ao O2. NADH e FADH2 , cedem eltrons,
respectivamente, aos complexo I e II. A transferncia exergnica de eltrons do nvel
redox de NADH para o de O2 (E0= 1,130V) envolve uma diferena de energia livre
57
liberada (G0= -218kJ/mol) que em parte retida pelo transporte de H+ do lado
interno para o externo da membrana, criando o gradiente eletroqumico de prtons que
permitir empurrar o processo endergnico de fosforilao de ADP por Pi para gerar
ATP, atravs da bomba de prtons que constitui a ATP sintase (tambm conhecida
com F1F0- ATPase).
2 H+
Espao 4 H+ 2 H+
Intermembranar
Cit C
Matrix
Mitocondrial
NAD+
NADH + H+ 1/2 O2 + 2H+
H2O
Complexo II
FADH2
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DNP desacoplador, pois promove o vazamento de H+ ,levando dissipao do
gradiente de prtons e contnuo transporte de eltrons, desacoplado da sntese de
ATP.
6. A sntese de ATP a partir de ADP e Pi na mitocndria, que catalisada pela ATP
sintase, dirigida pelo processo de transporte de eltrons. Mas como a ATP sintase
fisicamente separada das protenas do transporte de eltrons, a energia livre liberada
no transporte de eltrons deve ser conservada em uma forma que possa ser utilizada
pela ATP sintase. A energia livre do transporte de eltrons conservada pelo
bombeamento de H+ da matriz mitocondrial para o espao intermembranar, criando
um gradiente de H+. A volta dos prtons ao interior da mitocndria
termodinamicamente favorvel. A membrana interna da mitocndria impermevel a
prtons em toda sua extenso, exceto na ATP sintase; e ento por este canal que os
prtons atravessam a membrana, de volta matriz mitocondrial. A variao de energia
livre associada ao transporte de um prton atravs da membrana interna da
mitocndria pode ser determinada atravs de medidas da diferena de pH e do
potencial de membrana estabelecidos em mitocndrias consumindo oxignio.
+
+2H
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termodinamicamente favorvel a sntese de glicose a partir de piruvato. Destas
reaes, as duas primeiras correspondentes s enzimas hexoquinase e
fosfofrutoquinase, so substitudas por reaes simples de hidrlise de ligao fosfo-
ester, catalisadas, respectivamente, pelas enzimas glicose-6-P-fosfatase e frutose-1,6-
bis-fosfatase. J a terceira reao, que permite a volta de piruvato para P-enolpiruvato
mais complexa e se d em duas etapas catalisadas, respectivamente, por piruvato-
carboxilase e P-enolpiruvato-carboxiquinase.
60
so carregados pela corrente sangunea na forma de complexos com albumina, que
representa 50% da protena do plasma. cidos graxos livres so muito insolveis, a
~1microM formam micelas, que so altamente txicas.
8. Os cidos graxos so sintetizados no citosol por via anablica prpria que adiciona
seqencialmente unidades de 2 C cadeia em crescimento. Esta via alimentada por
acetilCoA, mas s a primeira unidade de 2 C entra como acetilCoA, as subseqentes
so na forma de malonilCoA. Portanto, o acetilCoA precisa ser previamente ativado a
malonilCoA, por carboxilao e consumo de 1 ATP, para permitir a reao de
condensao, levando ao crescimento da cadeia do cido graxo de uma unidade de 2
C, por ciclo de sntese. A ativao de acetilCoA catalisada pela acetilCoA-
carboxilase, uma enzima sujeita a controle complexo, envolvendo regulao alostrica
e ativao / desativao por modificao covalente (fosforilao / desfosforilao).
61
Reaes de um ciclo de beta-oxidao:
O
R CH2 CH2 CH2 C S-CoA (acil-CoA)
oxidao FAD
FADH2
H O
R CH2 C = C C S-CoA (enoil-CoA)
H
hidratao H2O
HO H O
R CH2 C C C S-CoA (L-hidroxiacil-CoA)
H H
oxidao NAD+
NADH
O O
R CH2 C CH2 C S-CoA (ceto acil-CoA)
tilise CoA
O O
R CH2 C S-CoA + H3C C S-CoA (acetil-CoA)
1. Molculas anfiflicas, como lipdeos com uma nica cauda hidrofbica, cidos
graxos livres e detergentes, quando em soluo aquosa e acima de um limiar de
concentrao (concentrao micelar crtica ou cmc) formam agregados globulares
chamados micelas.
62
2. Por outro lado, lipdeos com duas caudas hidrofbicas, como glicerofosfolipdeos e
esfingolipdeos, tendem a formar bicamadas lipdicas, que so a base estrutural das
membranas biolgicas.
Micela Bicamada
63
4. As membranas so barreiras hidrofbicas que oferecem grande resistncia
passagem de solutos hidroflicos, cuja permeao exige protenas transportadoras
especficas, conforme esquematizado na figura abaixo. Desta maneira a membrana,
atravs de transportadores especficos, regula o transporte de metabolitos entre
compartimentos celulares.
64
glicose e obedece a uma curva hiperblica de saturao j bem conhecida da cintica
enzimtica, sendo Kt anlogo a Km: Esta forma de transporte conhecida como
transporte passivamente mediado ou difuso facilitada. Trata-se de um processo
exergnico, pelo qual o soluto, no caso a glicose, atravessa espontaneamente a
membrana indo do compartimento de maior para o de menor concentrao.
65
Nestas reaes, 2 NADPH + H+ e uma ribose-5-fosfato so gerados para cada glicose-
6-fosfato oxidada.
ribose-5-fosfato convertida a gliceraldedo-3-fosfato e frutose-6-fosfato pela
transcetolase e transaldolase. A transcetolase catalisa a transferncia de unidades de
C2 de uma cetose para uma aldose. A transaldolase transfere unidades de C3 de uma
aldose para uma cetose.
As reaes de transcetolase e transaldolase criam uma ligao reversvel entre a via
das pentoses e a via glicoltica. O resultado dessas reaes a formao de 2
hexoses e 1 triose a partir de 3 pentoses:
C5 + C5 C3 + C7 Transcetolase
C7 + C3 C4 + C6 Transaldolase
C5 + C4 C3 + C6 Transcetolase
66
A equao geral da fotossntese :
67
10. Os cloroplastos geram ATP de maneira muito semelhante da mitocndria, ou
seja, atravs do acoplamento da dissipao de um gradiente de prtons sntese de
ATP.
13. O ciclo de Calvin engloba duas fases: (1) a fase de produo, na qual 3 molculas
de ribulose-5-fosfato reagem com 3 molculas de CO2, gerando 6 molculas de
gliceraldedo-3-fosfato, com o gasto de 9 ATPs e 6 NADPH + H+; (2) a fase de
recuperao, na qual os tomos de carbono de 5 gliceraldedo-3-fosfato entram em
uma srie de reaes para dar origem a 3 ribulose-5-fosfato, com as quais o ciclo
recomea.
68
6. Glicose-1-fosfato convertida a glicose-6-fosfato pela fosfoglicomutase, esta pode
ser liberada pela circulao no fgado pela ao da glicose-6-fosfatase ou degradada
pelo msculo.
UTP + H2O 2 Pi
Glicose-1P UDPG
Glicognion
Fosforilase SintaseI
Pi Glicognion+1 UDP
69
10. A fosforilase a e a sintase I (formas ativas), por um lado, e a fosforilase b e a
sintase D (formas no ativas), por outro, so, respectivamente interconversveis. Para
tanto necessrio que fosforilase a e a sintase I sejam desfosforiladas, atravs de
uma reao que requer catlise. A principal enzima, catalisadora comum destas
desfosforilaes, a fosfoprotena fosfatase 1.
11. A integrao metablica requerida pelo bom funcionamento do organismo faz com
que as interconverses coordenadas da fosforilase e sintase do glicognio no fgado,
por fosforilao, sejam controladas extracelularmente por hormnios especficos,
principalmente: adrenalina, glucagon e insulina.
70
extremidade C-terminal. A poro extracelular do receptor contm o stio de ligao da
adrenalina, enquanto a poro intracelular se associa a um trmero de protenas
conhecidas como protena-G, por ter um stio especfico para ligao do nucleotdeo
GTP. So hoje conhecidos mais de 1000 receptores, de mltiplos hormnios, com esta
estrutura bsica formando a superfamlia chamada dos receptores associados a
protena-G. A funo deste receptor transduzir o sinal adrenalina de fora para
dentro da clula, processo que mediado pelas protenas-G. H tambm receptores
presentes no citoplasma nuclear e citoplasmtico e neste caso, o hormnio precisa ter
alta solubilidade a lipdeos, atravessando a membrana plasmtica como os hormnios
esterides para encontrar o seu receptor dentro da clula.
71
a ativao de 2 leva a inibio da via de adenilato ciclase. H casos aonde a protena
G do tipo Gs sendo ativadora de adenilato ciclase e do tipo GR inibindo a adenilato
ciclase. Algumas toxinas podem ativar ou bloquear a via de transduo de sinal: toxina
da clera e a toxina da coqueluche.
23. A insulina tem efeito oposto, promove a absoro de glicose pelo fgado e
msculos e usa deposio nas reservas de glicognio. Mas importante notar que a
insulina tem mecanismos de ao totalmente diferentes da adrenalina e do glucagon.
Os receptores de insulina no pertencem famlia dos receptores acoplados a
protena-G e no tm ao sobre a adenilato ciclase. Seus receptores so do grupo de
receptores cujo domnio intracelular apresenta atividade intrnseca de protena-quinase
de tirosina. A insulina estimula fosfoprotenas fosfatases. Para reverter a ao do
glucagon, a insulina promove a ativao da fosfoprotena fosfatase que catalisa a
desfosforilao da glicognio fosforilase e da glicognio sintase, levando a inativao
da primeira (fosforilase a b) e ativao da segunda (sntase D sintase I). Desta
forma o fluxo glicoseglicognio favorecido. O transporte da glicose no interior das
clulas com a atuao da insulina um processo passivo mediado por uma famlia de
permeases denominadas GLUT (glucose transporter).
24. Respostas celulares rpidas desencadeadas por hormnios s podem ser obtidas
atravs da ativao, ou da inibio, de enzimas pr-existentes. Hormnios esterides
(por exemplo cortisol) quando secretados difundem-se pela membrana citoplasmtica
e ligam-se ao seus receptores intracelulares os quais, quando ativados, promovem no
ncleo a regulao do metabolismo pela induo da transcrio de genes que
codificam enzimas especficas, levando sntese de novo das protenas
correspondentes, fenmeno conhecido como induo enzimtica. Mas o mecanismo
de induo enzimtica desencadeado por hormnios resulta necessariamente numa
resposta celular lenta, uma vez que os RNAs mensageiros (mRNAs) precisam ser
transcritos, processados, transportados para o citoplasma e finalmente traduzidos
para produzir as protenas enzimticas exigidas.
72
25. A adrenalina estimula uma resposta local no msculo. A liberao de adrenalina
induzida por estmulo nervoso autnomo em situaes de perigo, exerccio fsico, e
hipoglicemia e induz a degradao do glicognio com os fins de fornecer glicose-1-
fosfato como fonte de energia para atividades musculares que permitem ao animal
reagir a estas situaes.
73
4. Triglicerdeos e glicognio so compostos de reserva, mobilizados quando h
necessidade de energia. Em animais, no existem espcies de protena com funes
de reserva energtica, mas no jejum prolongado protenas so hidrolisadas para
liberar aminocidos que sero catabolisados para produo de energia. O fgado o
centro de catabolisao de aminocidos.
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leguminosas, reduzem eficientemente N2 a NH4+, uma espcie qumica totalmente
compatvel com o metabolismo de todos os organismos. Portanto, o N2 fixado por essa
simbiose entre planta e bactria garante a disponibilidade do elemento N para todas
as formas de vida terrestre. As bactrias fixadoras de N2 possuem um complexo
enzimtico singular, a nitrogenase. A reao de reduo do N2 a NH4+ (fixao de
nitrognio), qual envolve um redutor poderoso a grande investimento de energia na
forma de ATP, catalisado pela nitrogenase, qual usa NADPH + H+ como doador de
eltrons:
3.A volatilidade do NH4+ (NH3 + H+) no favorece sua permanncia no solo, mas
existem bactrias autotrficas de vida livre, muito abundantes e largamente
disseminadas, que so especializadas na oxidao do ction amnio a nitrito e nitrato
para fins de obteno de energia metablica. Desta maneira o elemento N
estavelmente depositado no solo na forma de espcies qumicas, sais de nitrito e
nitrato, que so eficientemente absorvidas pelas razes das plantas e prontamente
reduzidas a NH4+ no interior da clula vegetal.
As etapas sumariamente mencionadas compreendem o ciclo do nitrognio na
natureza: a) reduo do N2 a NH4+; b) oxidao de NH4+ a nitrito e nitrato; c) reduo
de nitrito e nitrato a NH4+ e d) transformao do elemento N de inorgnico para
orgnico com a sntese de aminocidos a partir de NH4+, reao possvel em todas a
formas de organismos biolgicos.
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