Sunteți pe pagina 1din 29

CROMATOGRAFIA

Cromatografia este o metod de realizare a


separrilor analitice.
Toate metodele cromatografice implic:
 faz staionar;
 o faz mobil.
Componentele unui amestec sunt trecute peste faza
staionar cu ajutorul fluxului fazei mobile.
Separrile se bazeaz pe diferenele dintre vitezele
de migrare ale componentelor probei.
Componentele ce urmeaz a fi separate trebuie s
fie solubile n faza mobil, astfel incat n timpul separrii
ele sunt distribuite ntre cele dou faze.

Cromatografia pe coloan
Faza staionar este depus ntr-un tub ngust
de sticl sau metal.
Faza mobil care poate fi lichid sau gaz, este
forat s treac prin solid cu ajutorul presiunii
sau este lsat s treac (s se infiltreze)
datorit forei gravitaionale.
Cromatografia plan
Faza staionar este depus pe o plac de
sticl sau plastic.
Faza mobil se deplaseaz prin solid, fie prin
aciune capilar, fie sub aciunea gravitaiei.

Clasificarea separrilor cromatografice


Denumire Tipul Tipul Metoda de fixare a fazei
fazei fazei staionare
mobile staio
nare
Gaz-lichid Gaz Lichid Adsorbit ntr-un solid poros
fixat ntr-un tub, sau adsorbit
pe suprafaa intern a unui tub
capilar.
Gaz-solid Gaz Solid Fixat ntr-o coloan tubular
Lichid Lichid Lichid Adsorbit ntr-un solid poros
sau de fixat ntr-o coloan tubular
repartiie
Adsorbie Lichid Solid Fixat ntr-o coloan tubular
Hrtie Lichid Lichid Fixat n porii unei hrtii
groase
Start Lichid Lichid Solid fin divizat depus pe o
subire sau plac de sticl; lichidul poate fi
solid adsorbit pe particule
Gel Lichid Lichid Fixat n interstiiile unui solid
polimeric
Schimb Lichid Solid Rin schimbtoare de ioni
ionic fin divizat fixat ntr-o
coloan tubular
Toate separrile cromatografice se bazeaz pe
diferenele de repartiie ale soluilor ntre faza mobil i
faza staionar.
Echilibrul implicat poate fi descris cantitativ cu
ajutorul coeficientului de repartiie K, care pentru
cromatografie este definit astfel:

C S
K =
C M
Unde:
CS este concentraia analitic a solutului n faza
staionar;
CM este concentraia sa n faza mobil.
La concentraiile sczute folosite n cromatografie,
K va fi aproximativ constant astfel nct va exista o
relaie liniar ntre CS i CM.
Cromatografia realizat n aceste condiii se
numete cromatografie liniara.
n cromatografia de eluie, se introduce o singur
poriune a probei dizolvate n faza mobil pe la captul
coloanei n care componentele probei se vor distribui
ntre cele dou faze.
Intoducerea unei faze mobile adionale (eluentul)
foreaz solventul coninnd o parte a probei n josul
coloanei, unde apare o repartiie suplimentar ntre faza
mobil i zonele "proaspete" ale fazei staionare.
Prin adugarea unor noi poriuni de solvent se va
realiza trecerea moleculelor solutului n josul coloanei
printr-o serie continu de tranziii ntre faza mobil i
faza staionar. Deoarece deplasarea solutului poate
avea loc doar n faza mobil, viteza medie de migrare a
solutului depinde de fracia de timp pe care o petrece n
acea faz.
Viteza de deplasare a unui component, reprezint o
fraciune din viteza de migrare a solventului.
Viteza frontal de migrare, caracterizat de factorul
Rf, se definete prin raportul:

viteza frontului adsorbit


Rf = <1
viteza fazei mobile
S o lv e n t
P ro b

Reprezentare
A + B

schematic a eluiei
B

C o lo a n c u
u m p lu tu r
A
separrii
B
cromatografice a
A
componentelor A i
D e te c to r B A

B ale unui amestec.


S e m n a l
B A

T im p s a u V o lu m

Separarea a doi componeni A i B ai unei probe,


este cu att mai bun cu ct raportul valorilor RfA/RfB
este mai diferit de unitate.
n cazul n care ambele valori RfA i RfB sunt
apropiate de unitate, nu se pot realiza separri eficace,
deoarece compuii vor migra ntr-un interval de timp
doar cu puin mai lung dect cel necesar deplasrii fazei
mobile de-a lungul coloanei.
Procesul descris anterior n decursul cruia solutul
este "splat" prin coloan prin adugarea de solvent
proaspt se numete eluie.
Izotermele de repartiie sunt curbele ce redau
concentraia componentului cromatografic n faza
staionar (CSA) n funcie de concentraia aceluiai
component n faza mobil (CMA). Ele sunt dependente de
temperatur.
Deoarece n cromatografia uzual, afinitatea
componenilor fa de faza staionar este determinat
de adsorbie, aceste tipuri de curbe se numesc izoterme
de adsorbie.

t1 < t2
CSA
A
CS CSA
t1 t1

t2
t1
t2
t2

A A
a
CM
b CMA c
CM

Izoterme de repartiie

Deoarece procesul de adsorbie este exoterm,


creterea temperaturii defavorizeaz fixarea
componentului, i n consecin izotermele vor avea
pante mai accentuate la temperaturi mai joase.
Fixarea componentului cromatografic este
reversibil; prin urmare, la o valoare CMA =0 va
corespunde CSA =0, adic toate izotermele trec prin
origine.
O cromatogram furnizeaz doar o singur
informaie calitativ despre fiecare specie din prob, i
anume timpul su de retenie sau poziia sa n faza
staionar dup o anumit perioad de eluie.
Numrul datelor obinute pentru o specie chimic
prin cromatografie este mic n comparaie cu cele
furnizate dintr-o singur analiz de IR, RMN sau
spectroscopie de mas.

CROMATOGRAFIA PLAN

Exist dou tipuri de cromatografie plan:


cromatografia pe hrtie
cromatografia pe strat subire

n cromatografia pe hrtie, se folosete drept mediu


o foaie sau o bucat de hrtie de filtru groas.
n cromatografia pe strat subire, separarea are loc
ntr-un strat de solid fin divizat care a fost fixat pe o
suprafa suport plan.
Att cromatografia pe hrtie ct i cea n strat
subire ofer mijloace deosebit de simple i ieftine
pentru separarea i identificarea componentelor unor
mici probe complexe de substane anorganice, organice
sau biochimice.

CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBIRE

Prezint unele avantaje fa de cromatografia pe


hrtie, deoarece se pot realiza separri mai nete i mai
rapide, are o sensibilitate mai ridicat i se poate adapta
i la separarea unor amestecuri avnd concentraii mai
mari. Separrile pe strat subtire sunt influenate de
procesele de adsorbie, repartiie, excludere (difuzie) i
schimb ionic.
Stratul este o faz staionar subire depus pe o
plac de sticl, de plastic sau de metal.

Faza staionar
Solidele adsorbante (i uneori absorbante) utilizate
pentru cromatografia pe strat subire sunt similare din
punct de vedere al compoziiei chimice i a dimensiunii
particulelor cu cele folosite la realizarea diferitelor faze
staionare n cromatografia pe coloan.
Stratul subire este realizat dintr-un suport activ i
un liant, ce confer printre altele rezisten stratului.
Substana cel mai des utilizat drept suport este
silicagelul. Acesta este frecvent folosit ca suport pentru
ap sau ali solveni polari n separrile lichid-lichid.
Un alt suport des utilizat este alumina.
Drept supori, mai pot fi folosii celuloza, diatomita
i diveri polimeri organici.
Dou tipuri de dispozitive pentru cromatografia pe
strat subire:

B a. flux ascendent;
S b. flux descendent;
C

C S: poziia iniial
D Flux
a probei (start);
Flux
D: developator;
S C: suprafaa
cromatografic;
B: mpletitur de
a. b.
bumbac.
ALEGEREA SOLVENTILOR

Condiia general impus solvenilor cromatografici


este anhidritatea perfect.
Aezarea solvenilor uzuali n ordinea puterii de
eluare se numete serie eluotropic.

Seria eluotropic, dup Trappe


1. eter de petrol 8. cloroform

2. hexan 9. eter etilic

3. ciclohexan 10. acetat de etil

4. tetraclorur de 11. aceton


carbon

5. toluen 12. alcool etilic

6. benzen 13. alcool metilic

7. clorur de 14. ap
metilen

Valorile Rf depind de polaritatea fazei mobile,


crescnd odat cu aceasta.
Solveni utilizai frecvent n cromatografia pe strat
subire
Solveni Tipuri de amestecuri
hexan hidrocarburi,
compui carbonilici
hexan + eter etilic Alcooli
cloroform (85%) + metanol (14%) solvent universal
+ amoniac (1%)
cloroform (70%) + metanol (25%) compui cu caracter
+ amoniac (5%) acid
cloroform (50%) + benzen (50%) compui cu caracter
- saturat n NH3 bazic

Se depune o pictur de prob pe o plac


cromatografic, dup care, peste spotul format se
pipeteaz puin eluent.

Test preliminar pentru


alegerea solventului optim
n cromatografia pe strat
a. b. c. subire
Eluentul cel mai indicat va forma mai multe zone
inelare, separate i suficient de apropiate de centru (a),
n timp ce un solvent ce conduce la o zon punctiform
nu are o putere de eluie suficient (b), iar unul ce
formeaz un inel mare cu componenii plasai spre
periferie arat o putere de eluare prea mare (c).

ANALIZA CANTITATIVA

Cantitatea unui component este caracterizat de


suprafaa i intensitatea spoturilor.
O estimare semicantitativ a cantitii unui
component prezent, poate fi obinut prin compararea
ariei spotului cu cea a unui standard.
Dup vizualizarea spotului, se calculeaz imediat
valorile Rf, datorit posibilitii de apariie a fenomenului
de atenuare, mai ales n cazul relevrii (vizualizrii)
chimice. Zona este ncercuit cu un creion (sau se
zgrie stratul subire), se msoar distanele parcurse
de zone i frontul de solvent, iar valoarea Rf se
calculeaz astfel:
Rf = hs hf

hf Frontul de
solvent
hS

Linia de start

hS - Distana parcurs de solut.


hf - Distana parcurs de solvent.

Evaluarea valorilor Rf poate fi utilizat i n scopuri


calitative prin compararea cu valorile Rf ale unor
compui cunoscui.

CROMATOGRAFIA PE HRTIE

Cromatografia pe hrtie este, n mod deosebit, o


cromatografie de repartiie. Aceast metod poate fi
descris ntr-o manier simplificat ca fiind trecerea
unei faze mobile lichide prin structura poroas a hrtiei,
care conine faza staionar. Developarea se termin
nainte ca faza mobil s ating marginea superioar a
hrtiei, astfel nct zonele sunt distribuite de-a
curmeziul hrtiei.
Fa de cromatografia pe strat subire, aceast
metod are o serie de dezavantaje, cum ar fi: timpii de
developare mai lungi, delimitarea destul de slab a
zonelor, exactitatea destul de slab n analizele
cantitative, iar uneori dificultatea de reproducere a
condiiilor de developare.

FAZA STAIONAR

n general, hrtia este compus din fibre de


celuloz direcionate n mod dezordonat.
Se folosesc de obicei hrtii speciale de nalt
puritate i reproductibile din punct de vedere al
porozitii i grosimii. Astfel de hrtii conin suficient de
mult ap, astfel nct s putem considera
cromatografia pe hrtie ca fiind de tip lichid-lichid.
Tipuri de faze staionare folosite n cromatografia
pe hrtie
Faza Solveni utilizai

staionar

Apoas apa; soluii tamponate +


atmosfer saturat cu ap

Hidrofil alcool metilic; formamida;


glicolii; glicerolul

Hidrofob dimetilformamida; hidrocarburi


aromatice i alifatice; kerosen;
solveni oxigenai

FAZA MOBIL

Exist o larg varietate de combinaii de faze


staionare i mobile, nefiind neaprat necesar ca cele
dou sisteme s fie nemiscibile. Faza mobil utilizat
este format de obicei din diferite combinaii de solveni,
soluii de sruri i soluii tampon
Alegerea optim a condiiilor de eluie se face n
urma unor testri preliminare.
Tipuri de faze mobile utilizate n cromatografia pe
hrtie
Faza mobil Tipuri de amestecuri
separate
Ap - fenol Substane hidrofile

Izopropanol - amoniac - Substane hidrofile


ap (9:1:2)

n-Butanol - acid acetic - Substane hidrofile


ap (4:1:5)

Formamid - benzen Substane intermediar


hidrofile

Formamid - benzen - Substane intermediar


ciclohexan hidrofile

Formamid - cloroform Substane intermediar


hidrofile

Formamid - cloroform Substane intermediar


- benzen hidrofile
Dimetilformamid Substane hidrofobe
ciclohexan

Kerosen - izopropanol Substane hidrofobe


PROCEDEE CARACTERISTICE
CROMATOGRAFIEI PLANE

Dup obinerea hrtiei sau a stratului dorit,


procedeele experimentale pot fi mprite n cinci etape
de baz, i anume:
tratamentul pregtitor;
aplicarea probei;
developarea;
vizualizarea;
interpretarea datelor.

TRATAMENTUL PREGATITOR

Se realizeaz n funcie de tipul cromatografiei (de


repartiie sau de adsorbie) i aplicarea final.
Adsorbanii au poziii adsorbante cu activiti
diferite i rein, mai puternic, apa. Pentru ca adsorbia s
fie folosit la capacitatea sa maxim, adsorbantul
trebuie s fie ntr-un anumit grad de uscare (s fie
activat).
Adsorbanii nu trebuie s fie supui la o temperatur
de uscare prea nalt sau un timp de uscare prea
ndelungat, deoarece pot avea loc transformri chimice,
care vor conduce la un comportament adsorbant
modificat.

APLICAREA PROBEI

nainte de aplicarea probei, pe hrtie sau pe plac se


traseaz linia de start, care reprezint locul unde va fi
aplicat proba, i care trebuie s fie suficient de departe
de marginea hrtiei sau plcii, astfel nct s nu fie
scufundat n sistemul de solvent utilizat pentru
developare.
Instrumentele cele mai utilizate la aplicarea probelor
sunt pipetele (micropipete), capilarele de precizie i
microseringile.

DEVELOPAREA

n vederea realizrii unei separri corespunztoare,


este necesar ca procesul cromatografic s aib loc ntr-
o camer de developare saturat n faz mobil.
De remarcat c asigurarea unei developri
corespunztoare presupune o bun etanare la aer a
camerelor de developare.
Developarea ascendent presupune urcarea fazei
mobile din rezervor pe hrtie sau pe stratul subire, n
timp ce developarea descendent are loc atunci cnd
faza mobil coboar din rezervor. Datorit rezistenei
mecanice convenabile este preferat developarea
ascendent n cazul cromatografiei pe strat subire, spre
deosebire de cromatografia pe hrtie cnd se prefer
developrarea descendent ca urmare a unei rezistene
mecanice slabe.
S up ort
Camere de
Sup ort
developare folosite n
cromatografia pe hrtie.
H
a. Developare
H
ascendent.
Flu x S b. Developare
P
Flux descendent.
H - hrtie de filtru;
S
P - prob;
a. b.
S - solvent de
developare;
Flux - curgerea solventului.
RELEVAREA

Dup terminarea developrii, se procedeaz la


relevarea (vizualizarea) spoturilor.
Detectarea se poate face direct dac compuii sunt
colorai sau fluoresceni.
O alt metod des utilizat este aceea a pulverizrii
unei soluii care s conduc la formarea unor compui
colorai cu speciile prezente pe hrtie sau plac.
Dup vizualizarea spotului se calculeaz valoarea Rf.
Aceste valori Rf se pot utiliza n scopuri calitative, prin
compararea cu valorile Rf ale unor compui cunoscui.
Cromatografia plan are numeroase aplicaii n
monitorizarea calitii mediului,biochimie, farmacie,
biologie.
CROMATOGRAFIA DE GAZE

Cromatografia de gaze este o variant


cromatografic folosit pentru separarea amestecurilor
de gaze sau lichide volatile, bazat pe repartiia diferit a
componenilor amestecului de analizat ntre dou faze: o
faz staionar solid (cromatografia de adsorbie) sau
lichid depus pe un suport solid inert (cromatografia
de repartiie) i o faz mobil gazoas (gazul purttor).
Ca urmare a repartiiei diferite a componenilor din
amestec ntre cele dou faze i a fenomenelor de
transfer de mas prin difuzie ce au loc n coloana
cromatografic, se realizeaz o deplasare cu viteze
diferite a acestora prin coloan, componenii prsind
coloana ealonat n timp.
Acetia ajung apoi ntr-un sistem de detecie, dnd
natere unui semnal electric proporional cu
concentraia (masa) lor, care, ulterior este amplificat i
nregistrat sub forma unei cromatograme.
Pentru un component "i" prezent n amestec,
constanta de distribuie ntre cele dou faze este dat de
relaia:
concentratie component in faza satationara
Ki =
concentratie component in faza mobila
Cu ct componenii amestecului de analizat au
constante de distribuie mai diferite, cu att separarea
cromatografic realizat este mai bun. Valorile acestor
constante de distribuie depind de natura componenilor
de separat, de ansamblul faza staionar - faz mobil
ales i de temperatura din coloan.
5 7 8

3 D <<
2

1 6

Schema bloc a unei instalaii gaz cromatografice


rezervorul cu gaz purtator care joac rol de faza
mobil (1);
dispozitivul de msurare i reglare a presiunii
gazului purttor (2);
dispozitiv de injectare a probei n coloan (3);
coloana cromatografic (4);
detector (5);
termostat (6);
amplificator (7);
nregistrator (8).
Faza mobil, care este de obicei un gaz inert (heliu
sau azot) trece continuu prin sistemul cromatografic
transportnd proba aflat n stare de vapori. n coloan,
separarea are loc datorit adsorbiei sau respectiv,
repartiiei componenilor probei pe faza stationar solid
sau lichid.
Dup separare, fiecare component este detectat pe
masur ce prsete coloana cromatografic i este
nregistrat sub forma unui pic cromatografic.
Gazul purtator utilizat drept faz mobil trebuie s
fie un gaz inert, care s nu interacioneze cu proba, i
care s permit o funcionare adecvata a detectorului
utilizat.
Presiunea i debitul acestuia n coloan sunt
controlate cu ajutorul unui reductor de presiune i a
unui debitmetru.
CROMATOGRAFIA DE LICHIDE PE COLOAN

Cromatografia de lichide pe coloan este o variant


cromatografic n care componenii amestecului de
analizat se separ datorit migrrii lor difereniale de-a
lungul unei coloane umplut cu o faz staionar solid
sau lichid pe suport inert sub influena unei faze mobile
lichide.
Separarea are loc pe baza unui proces de adsorbie
(cromatografia solid - lichid, CLS) sau repartiie
(cromatografia lichid - lichid, CLL) al componenilor ntre
cele dou faze, proces ce se produce n mod repetat
pn la prsirea coloanei cromatografice.
n funcie de modul de lucru exist mai multe
tehnici de lucru care se deosebesc ntre ele prin modul
de realizare a separrii cromatografice, i anume:
(1) Cromatografia prin eluie
(2) Cromatografia frontal
(3) Cromatografia prin deplasare
Dintre aceste procedee, cel mai utilizat este primul.
n cromatografia prin eluie, proba se introduce cu
ajutorul unei micropipete sau al unei microseringi n
cantitate mic la captul coloanei, dup care se adaug
lichidul ce funcioneaza drept faz mobil, numit eluent.
Componenii probei sunt antrenai de faza mobil de-a
lungul coloanei, realizndu-se astfel separarea lor,
datorit constantelor de repartiie/adsorbie K =
[Ci]S/[Ci]M diferite.
La baza coloanei, componenii sunt colectai sub
forma unor fraciuni i analizai, metoda permind att
determinarea calitativ ct i cantitativ a componenilor
dintr-un amestec.

R1 R2
3
P
1
2
4

a
b

7
5

D I C

8
CF

Schema bloc a unui cromatograf de lichide sub presiune


1 - rezervoare de solveni (faze mobile);
2 - dispozitiv de pompare i producere a gradientului de
faza mobil;
3 - injector;
4 - coloana analitic (a) i coloana de referin (b);
5 - detector;
6 - nregistrator;
7 - calculator;
8 - colector de fraciuni.

n cromatografia de lichide sub presiune, coloanele


trebuie s reziste la presiuni ridicate, ceea ce impune
etaneizari la capete.
Aceste coloane cromatografice sunt umplute cu
faze staionare solide sau lichide depuse pe suport solid
inert.
n cromatografia de adsorbie, ca faza staionar
solid se folosesc diferite materiale pulverulente, dintre
care cele mai utilizate sunt alumina i silicagelul.
ntr-o msur mai mic se folosesc, de asemenea,
silicatul de magneziu, pmntul diatomitic, pulberea de
zahr, precum i o serie de adsorbeni modificai.
n cromatografia de repartiie, ca suport se
folosete frecvent celuloza, silicagelul, pmntul
diatomitic.

CROMATOGRAFIA PRIN SCHIMB IONIC

Cromatografia de schimb ionic este o metod de


separare bazat pe echilibre de schimb ionic ntre o faz
staionar schimbtoare de ioni i o faz mobil lichid
ce conine substane ionizabile supuse procesului de
analiz.
Reacia de schimb ionic ce are loc n cazul unei
astfel de separri este o reacie reversibil i pe aceast
proprietate de reversibilitate se bazeaz posibilitatea de
regenerare a fazei staionare schimbtoare de ioni.
O astfel de reacie poate fi reprezentat prin
ecuaia:

+ s c him b ionic +
RX Y regenerare
RY X

unde X i Y sunt specii ionice cu aceeai sarcin


electric.
Schimbtorii de ioni utilizai drept faze staionare
sunt materiale insolubile n cei mai muli solveni avnd
grefate grupe funcionale ionizabile a cror sarcin
electrostatic este neutralizat de ioni mobili
(contraioni) ce pot fi nlocuii cu ioni de aceeai sarcin,
prezeni n soluia de analizat.
Dintre acestea, cel mai des utilizate sunt rinile
sintetice schimbtoare de ioni, datorit proprietilor lor
mecanice bune, a stabilitii lor chimice i a uniformitii
lor granulometrice. Ele sunt constituite dintr-o reea
polimeric tridimensional (obinut printr-o reacie de
copolimerizare sau policondensare) pe care sunt grefate
gruprile ionizabile ce le confer proprieti de
schimbtori de ioni.
Dup semnul sarcinii purtat de gruparea
funcional ionizabil fixat pe reeaua
macromolecular, se disting dou categorii de rini
schimbtoare de ioni:
rini schimbtoare de cationi (cationii) avnd
grefate grupri sulfonice - SO3-, carboxilice - COO-,

aminodiacetice - N(CH2COO-)2, fosforice - PO32-,


etc.
rini schimbtoare de anioni (anionii) avnd
grupri de amoniu cuaternar - NR3+, amoniu teriar

- NHR2+, fosfoniu - PR3+, etc.