Sunteți pe pagina 1din 27

ALGORITMUL DIAGNOSTICULUI IN VIROZE

Etapele diagnosticului virusologic

Recoltarea produsului patologic


Transportul produselor patologice
Direciile diagnosticului virusologic

RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE STERIL!!!


Fluidele orale reduc riscul contaminarii, simplifica procedura de recoltare

PRODUSE PATOLOGICE

Snge - 3-5 ml prin punctia venoasa aseptica, pe anticoagulant.


Virusuri frecvent izolate: virusuri care disemineaza viremic si agentii etiologici ai febrelor hemoragice.
Materiile fecale - 4-8 g in solutie de Mg SO4 (stabilizeaza infectivitatea enterovirusurilor).
Virusuri frecvent izolate: enterovirusuri, rotavirusuri, calicivirusuri, mai rar adenovirusuri enterice.
Secretii nazo faringiene
a) spalatura nazo faringiana se obtine cu ajutorul unor tampoane cu
coada (sterile) introduse in cornetul nazal inferior.
b) aspiratul nazofaringian se obtine folosind un speculum nazal prin administrarea a 3 ml ser fiziologic in
nari cu o seringa atasata la un tub de plastic.
c) lavaj traheobronsic se obtine prin bronhoscopie in conditii speciale de catre personal calificat
Virusuri frecvent izolate: virusurile gripale A si B, virusurile paragripale, adenovirusuri, rhinovirusuri,
coronavirusuri, virusul respirator sincitial, v.rujeolos, v. rubeolos, v. urlian.
Lichid cefalorahidian (LCR) - 5-6 ml prin punctie rahidiana, inainte de
inceperea tratamentului.
Virusuri frecvent izolate: virusul rabic, unele arbovirusuri.

Saliva. Se recolteaza saliva de langa ductul Stenon cu tampon steril.


Frecvent este limitata la diagnosticul infectiei rabice.
Lichid vezicular - Colectarea lichidului din vezicule, bule, pustule se face dupa dezinfectia prealabila a
regiunii cutanate sau mucoase. Se perforeaza vezicula cu un ac atasat la o seringa de tuberculina sau cu
ajutorul unei pipete.
Virusuri frecvent izolate: HSV I, HSV II si VZV.
Urina -100 ml - orice specimen urinar obtinut prin abstinenta de la mictiune timp de 2 ore este adecvat
pentru diagnosticul virusologic.
Virusuri frecvent izolate. V. citomegalic, v. rujeolos.
Tampoane vaginale, lavaj cervico-vaginal, tampon uretral de la nivelul colului uterin si uretrei (atat
la femeie cat si la barbat); cu tampoane sterile, respectiv periuta citologica (pentru uretra masculina),
fara toaleta prealabila a regiunii.
Virusuri frecvent izolate: virusuri herpetice si papilomavirusuri; diagnostic BTS, uretritelor, leziunilor
veziculare si hiperplazice genitale.
Biopsia tisulara. Fragmente de organ recoltate n ctiva ml de solutie salina + ser de vitel 10% +
antibiotice n concentratiile folosite n culturile de celule.

Transportul probelor recoltate

Rapid
La rece
Sigur
ambalare riguros corecta
etichetarea cu semn biorisc
documentatie in legatura cu agentul biologic transportat

Formular de trimitere pentru diagnostic virusologic


Adresa spitalului/policlinicii/ cabinetului ce trimite Medicul caruia i se va comunica rezultatul (tel, fax, e-
produsul patologic mail)
Nume, prenume pacient Sex, Varsta
Date clinice, suspiciune diagnostic Data debutului simptomatolgiei
Tipul produs patologic Data, ora recoltarii
Tipul tratamentului administrat Date epidemiologice (contact cu boli infectioase
in prealabil transmisibile, vectori, calatorii in zone endemice pt o
anumita boala, vaccinari)
Analiza solicitata
Semnatura, parafa medicului

Direciile diagnosticului virusologic

1. Izolare virala in: Antigene virale ELISA, IF


Culturi de celule Genom viral PCR; Rt-PCR
Ou de gaina embrionat 3. Teste Serologice:
Animal de laborator a. Ac virus- specifici tip IgM
Detectia directa a : b. seroconversia in ac virus- specifici
Particulelor virale EM , IEM tip IgG

Izolarea virala prin inoculare pe OGE : Pocks-uri pe MCA a OGE - v. variolic


Detectia directa a particulei virale prin Microscopie Electronica

Coloratia negativa Metode de concentrare:


acetat de uranil ultracentrifugare
acid fosfotungstic difuzia in agar
Metode care cresc sensibilitatea (106-108 centrifugare directa pe grila de ME
particule/ml): SPIEM, SIA

Diagnosticul serologic

pe pro b uni c de se r - anticorpi antivirali de tip


IgM (rspunsul imun primar) - ELISA de captur
pe probe pereche de ser
- proba I - la debut
- proba II - la 2-3 sptmni

ELISA tehnica indirect sau de competiie

seroconversia (proba I - nu exist anticorpi/ proba II -


apar anticorpi specifici virusului de detectat),
creterea semnifi cativ a titrului de anticorpi ntre
cele 2 probe (de minim 4 ori)

Etapele diagnosticului virusologic


IZOLAREA VIRUSURILOR IN CULTURI CELULARE.EFECTE CITOPATICE

AVANTAJE / DEZAVANTAJE ALE SISTEMELOR DE IZOLARE VIRALA

AVANTAJE DEZAVANTAJE
ANIMAL DE LAB Infectie naturala Cost / etica
O.G.E. Cost Susceptibilitate limitata
CULTURI DE CELULE Sensibilitate buna Susceptibilitate variabila
/ disponibilitate

Componentele culturilor de celule: Celule dispersate+ mediu nutritiv

Mediu nutritiv
solutie salina tamponata - Earle, Hanks
substane nutritive (SFV, lizate proteice)- Serul fetal de vitel (SFV) contineo serie de factori ce
actioneaza pentru a stimula cresterea si diviziunea celular (hormoni nonpeptidici, factori de adeziune ce
intervin n atasarea celulelor pe un substrat celular solid, factori de crestere) SFV este adugat n
proportie de 10% n mediul de cretere si 2-5% n mediul de ntretinere
vitamine si aminoacizi eseniali
antibiotice i antifungice
Condiii necesare
Asespsie riguroasa
pH adecvat
Temperatur constant
atmosfer cu 5-10% CO2

CLASIFICAREA CULTURILOR DE CELULE

Culturi de organ
Culturi de celule dispersate
Culturi primare- pot fi mentinute n vitro timp limitat (3-5 pasaje).
Tulpini celulare pot fi mentinute n vitro timp de 50-60 de pasaje. - Cariotipul cromozomial este cel al
tipului de origine - diploid - ceea ce certific netumorigenitatea culturii
Linii celulare - CELULE TRANSFORMATE

CELULE TRANSFORMATE

1. conin gene implicate n imortalizarea n vitro (cultivare nr. infinit pasaje) modificari cromozomiale =>
cariotip heteroploid
2. se multiplic haotic, cerine nutritive foarte sczute (se multiplic la concentraii foarte sczute de
SFV), glicoliza anaerob = sursa principala de energie)
3. membran celular modificat n compoziie (absena fibronectinei => independente de aderarea la un
suport solid
4. nu au inhibitie de contact, se dispun dezordonat diferit de esutul din care deriv
5. telomeraza activa
6. inoculate la animale, pot reproduce tumora de provenienta
7. modificarea morfologiei
8. au antigene de suprafa diferite codificate de virus sau de celulele gazda=> neoantigene
9. aglutineaz uor cu lectinele (antigene vegetale)
10. modificarea mesagerilor secunzi (AMPc)
Echipament de laborator

Hote cu flux laminar pentru obtinerea, si propagarea culturilor de celule si izolarea virala

TIPURI DE EFECTE CITOPATICE

SINCITIAL: HIV, v rujeolos, VRS, herpes


PICNOTIC LITIC- enterovirusuri (v. poliomielitice; v. Coxsackie; ECHO)
INCLUZIONAR- intranuclear, intracitomplasmatic, mixt

EFECT CITOPATIC SINCITIAL


EFECT CITOPATIC INCLUZIONAR
Intracitoplasmatic acidofil: v rabic, v vaccinal
Intranuclear
-acidofil: papovavirusuri
- bazofil: adenovirusuri
Mixt: v herpetice, v rujeolos

INCLUZII CITOPLASMATICE (RABIE)


patognomonic in SNC - CORPII BABES NEGRI in cornul lui Ammon si neuronii piramidali din cerebel

INCLUZII INTRANUCLEARE (BOALA CU INCLUZII CMV)

INCLUZII INTRANUCLEARE
Diagnostic in infectia cu virusuri gripale

Orientare clinica
febra (3-5 zile), mialgie, cefalee, astenie (>2 saptamani), tuse neproductiva, faringita, rinoree.
Gripa nu se diagnosticheaza clinic!!!
Simptomatologie asemanatoare cu infectii determinate de:
Mycoplasma pneumoniae, adenovirusuri, virusul respirator sincitial, rhinovirusuri, virusuri paragripale, si
Legionella spp.

Forma clinic Etiologie viral comun Etiologie viral rar


Guturai, Rhinofaringite Rhino, coronavirusuri v. gripale, Enterovirusuri
(Cox)
Laringo- traheobronsite VRS, V. Adeno-, v. rujeolic
paragripale
Bronsite V. gripale V. paragripale
Pneumonii V. gripale, V. gripei aviare,
SARS Micoplasme

DIAGNOSTICUL DE GRIPA

ETIOLOGIE POSIBILA Produs IZOLARE Dg. DIRECT Dg. INDIRECT


Patologic =detectie directa =serologie
V GRIPALE SNF (ENF) ANF OGE DA PCR DA studii
(A, B, C) ATB Culturi si IF epidemiolog ice
celulare

Produse patologice :

a)Spalatura nazo faringiana (SNF) = Exsudat nazo faringian

Recoltare.

N- tampoane sterile cu coada introduse in cornetul nazal inferior,


secretii de la nivelul peretelui posterior al nazofarinxului.
F - tampon prin cavitatea bucala pentru secretii de pe peretele lateral/posterior al orofaringelui si din orice arie
adiacenta cu inflamatie, exudat sau ulceratie. se evita atingerea tamponului de limba, obraji sau buze pentru
evitarea cotaminarii.

Stocare si transport. optim imediat dupa recoltare (cand nu este posibil: -70 C, cu transport pe zapada carbonica)

Prelucrare.
tamponul sau secretiile recoltate sunt dispuse intr-un tub steril cu circa 15 ml mediu minim o ora, timp necesar
elutiei virusului. centrifugare la 2500 - 15 minute, la 4 C. Supernatantul este indepartat si sedimentul este
resuspendat in 3-4 ml TFS sau mediu. In final depozitul de celule reluat in TFS serveste pentru izolare virala
sau pentru efectuarea de frotiuri ce vor fi testate in imunofluorescenta.
Produse patologice :

a) exsudat nazo faringian


b) aspiratul nazofaringian se obtine folosind un speculum nazal prin administrarea a 3 ml ser fiziologic in
nari cu o seringa atasata la un tub de plastic.
c) lavaj traheobronsic se obtine prin bronhoscopie in conditii speciale de catre personal calificat.

Directii de diagnostic
IZOLARE OGE/ c.c.
DETECTIE RAPIDA RIF / Rt PCR
DIAGNOSTIC SEROLOGIC

Izolare virala diagnostic de electie

1.-culturi primare de rinichi de maimuta rhesus. -linia continua epiteliala de rinichi de caine (MDCK).
2. pe OGE- 9-11 zile, inoculat
intraamniotic
intraalantoidian.

V. GRIPAL ESTE NONCITOPATOGEN!!

Tipuri v gripal: A, B, C
Subtipuri: A(H1N1) , A(H3,N2)

Dupa HA si NA:
16 tipuri de HA
9 tipuri de NA

Demonstrarea izolarii v.gripale pe culturi de celule -


HEMADSORBTIE

48 ore dupa inocularea v. gripal se incearca detectia virusului prin hemadsorbtie,


obisnuit cu eritrocite de cobai
Hematiile adsorbite specific rozeteaza la periferia celulelor infectate.

DEMONSTRAREA PREZENTEI VIRUSULUI IN OGE


REACTIA DE HEMAGLUTINARE -RHA

Etape:
Ag. viral - dilutii binare
suspensie de hematii
Se incubeaza la temperatura camerei - 30 minute
Martorul reactiei contine suspensie hematii

Rol RHA:
Demonstrarea prezentei virusului hemaglutinant
Titrarea antigenului hemaglutinant
IDENTIFICAREA V. GRIPALE R. HEMAGLUTINO-
INHIBARE (RHAI)
Etape:
Ag. viral hemaglutinant
Dilutii binare din serurile imune de referinta (Ac antivirali
cunoscuti)- 60 min la 37C.
Sistem indicator - suspensia de hematii.
Se incubeaza 60 min la temperatura camerei

DIAGNOSTIC SEROLOGIC RHAI = Tulpini de referinta


+ ser pacient

diagnostic retrospectiv,
recoltarea de probe de ser pereche
cresteri semnificative (de peste 4 ori) a titrului Ac specifici
sau determinarea rezultatului vaccinarii

OMS - Global Influenza Surveillance Network

2012-2013 Emisfera de Nord


A / California/7/2009 (H1N1) -like virus;
A / Victoria/361/2011 (H3N2)-like virus;
B / Wisconsin/1/2010-like virus.

Reactia de Imunofluorescenta directa (RIF)

test rapid, reproductibil, ieftin , detecteaza ANTIGENE VIRALE cu anticorpi marcati cu fluorocromi

Reactia de Imunofluorescenta (RIF)

Aplicatii DIAGNOSTIC IN
Infectiile herpetice
Infectiile respiratorii (Gripa)
Rabia

Teste moleculare NAT (nucleic acid tests)


RT PCR
Swine flu real-time PCR kit
Quick Diagnosis of Flu Strains Possible with New Microchip Test - FluChip,
Inexpensive Test Detects influenza Infections Quickly and Accurately MChip
FDA Approves New Laboratory Test To Detect Human Infections With Avian Influenza A/H5 Viruses

DIAGNOSTIC IN INFECTIA CU HERPESVIRUSURI


Alfa-herpesvirusuri
Beta-herpesvirusuri
Gamma-herpesvirusuri

Subfamilia Herpesvirusuri umane Sediul latentei


Alfaherpesvirinae Herpes simplex 1 Neuroni senzitivi din rdcina
(HSV1-facial) -HH1 posterioar a nervilor spinali
Herpes simplex 2 i nucleii senzitivi ai nervilor
(HSV2-genital) - HH2 cranieni
Virus varicelo- zosterian (VZV) - HH3
Betaherpesvirinae Virus citomegalic Limfocitul T,
(CMV) -HHV5 monocite, organe solide
Virus Herpetic uman 6 - HHV6 Virus (plamni, rinichi) +/- epiteliul
Herpetic uman 7- HHV7 glandelor salivare
Gamaherpesvirinae Virus Epstein Barr Limfocitul B,
(EBV) - HHV4 endoteliu capilar
HHV8 (asociat sarcomului Kaposi)

Diagnostic in infectia cu ALPHAHERPESVIRUSURI

orientare clinica : leziuni veziculare


HERPES SIMPLEX 1 (HSV1)
HERPES SIMPLEX 2 (HSV2)
VARICELO-ZOSTERIAN (VZV)

GINGIVOSTOMATITA HERPETICA
HERPES GENITAL

PRODUSE PATOLOGICE
Lichid vezicular
Tampon conjunctival
Tampoane vaginale, lavajul cervico- vaginal, tampon uretral
Recoltare recomandata in cazul leziunilor active (50% sanse de izolare virala)

Directii de diagnostic

Izolare virala dg de electie


Diagnostic direct =
PCR
Imunofluorescenta directa
Diagnostic indirect - valoarea testelor serologice

Sincitiu = celule balonizate, multinucleate Incluzii acidofile = corpii


Cowdry A

Reactia de Imunofluorescenta directa


test specific, reproductibil, ieftin
Amprenta se va usca bine: pp. amprentat direct pe lama
Imersie in acetona la 2-8C timp de 10 minute si uscare.

Reactivii trebuie sa fie la temp.camerei

Incubare cu anticorp fluorescent (30 min la 37 C)


Spalare
Citire la MO in lumina UV

Anticorpi monoclonali marcati cu ITC fluoreceina sau rhodamina anti epitopi specifici de la nivelul anvelopei
-gp C si ICP35 (HSV1) =110-120kd
-polipeptide (HSV2) =78-82kd

PCR-metoda mai sensibila de confirmare a dg. de infectie cu HSV


util mai ales in:
- detectia infectiei in excretia asimptomatica
- evaluarea riscului transmiterii HSV in cupluri discordante
- eficienta supresiei replicarii virale in terapia antivirala (encefalita herpetica)
Serologia singura nu este considerata ca dg de confirmare ci se alatura
testelor de dg. direct.

Diagnostic in infectia cu BETAHERPESVIRUSURI CMV


Directii de diagnostic

Izolare virala pe culturi de fibroblaste diploide umane / Shell vials (24h). Dupa 2 zile se poate observa
ECP / detecta antigene timpurii prin RIF(pp: lavaj bronhoalveolar; LCR, biopsii tisulare; sange pe
anticoagulant, urina
IF direct pentru detectia atigenelor pp65 din fractia limfocitara
PCR pentru ADN CMV din sange pe anticoagulant, lichid amniotic
ELISA de captur pentru anticorpi anti CMV IgM; ELISA cantitativa pentru evidentierea
seroconversiei in anticorpi anti CMV IgG pe probe pereche de ser.

Shell vials,Cell culture

ECP CMV

RIF evidentierea Ag pp65 cu Ac antipp65 marcati fluorescent


Diagnostic serologic al infectiei cu CMV la gravide
Prima testare

Diagnostic in infectia cu GAMAHERPESVIRUSURI EBV


ELISA si IF
anticorpi anti capsidari IgM (anti VCA, anti EA)
anticorpi anti nucleari (anti EBNA) (pp=ser)
PCR pentru ADN EBV
(pp=biopsie tisulara, snge integral)
Diagnostic de laborator in neuroviroze

2 aspecte clinice
Meningite virale
Encefalite virale

1. SUSPICIUNEA CLINICA
Definitie de caz meningita virala

Febra 38.5 C asociata cu minim un simptom dintre:


Cefalee severa i persistenta;
Redoare de ceafa
Durere de ceafa asociata cu minim 2 din urmatoarele:
Fotofobie
Greata
Varsaturi
Faringita exudativa
Dureri abdominale
La sugari si copiii mici semnele principale sunt febra 38.5 C asociata cu iritabilitate si pulsarea fontanelei

SINDROM ETIOLOGIE POSIBILA

MENINGITA 80%-90%
ASEPTICA Enterovirusuri
Polio
Cocsackie A si B
E.C.H.O.
10 - 20%
alte virusuri:
VZV
V. URLIAN HSV
CMV
V. PARAGRIPALE
V. Poliomielitice

Paralizie flasca
Distala
Asimetrica
Sensibilitate pastrata

Boala mana picior gura Coxsackie A

Algoritm de diagnostic virusologic meningite virale

ETIOLOGIE POSIBILA Produs IZOLARE Dg. DIRECT Dg. INDIRECT


Patolog =detectie directa =serologie
80%-90% MF SNF De electie NU DA
Enterovirusuri LCR Culturi celulare
Polio Animal de laborator
Cocsackie A si B
E.C.H.O.

Produse patologice
Materiile fecale(MF)
Recoltare. Materiile fecale pot fi recoltate ca atare in cantitate de 4-8 grame sau corespunzator
volumului extremitatii falangei distale a indexului de adult. De asemenea, se pot recolta intr-o solutie 1
M de Mg SO4 (stabilizeaza infectivitatea enterovirusurilor)
Precizari. Este important de notat ca enterovirusurile se excreta saptamani la rand, dar sansele de
izolare scad. Se recomanda recoltarea a 2 - 3 probe de la pacient la interval de 24-48 ore.
Stocare si transport. Produsele patologice sunt transportate si stocate la 2-4 C.
Prelucrare. In vederea izolarii de virus suspensia de materii fecale se prepara amestecand proba
recoltata cu 15 ml de solutie Hanks si bile de sticla sterile intr-un tub de centrifuga inchis. Se agita
puternic, se centrifugheaza , si se recolteaza supernatantul.
Lichid cefalorahidian (LCR)
Recoltare. Se realizeaza prin punctie la nivelul L4-L5, cat mai rapid posibil de la debutul
simptomatologiei, inainte de inceperea tratamentului antibiotic, respectand strict masurile de asepsie.
1 ml de LCR este suficient pentru investigatii virusologice. Cantitatea recoltata nu trebuie sa depaseasca
5-6 ml in 3 tuburi sterile. Se determina numarul de celule, proteine totale, glicorahia si presiunea LCR.
Sansa de izolare din acest produs creste cnd participarea meningiana este evidenta. Acest lucru se
traduce prin pleiocitoza (cresterea numarului de celule limfo-monocitare in LCR).
Stocarea. Se pastreaza la 2-4 C, fara adaos de mediu de transport viral.
Transportul. Se realizeaza cat mai rapid posibil. Daca se depaseste 1 ora de la recoltare transportul se
face obligatoriu pe gheata sau la -70 C.
Exsudat faringian/SNF
IZOLAREA ENTEROVIRUSURILOR IN CULTURI DE CELULE
ECP PICNOTIC LITIC

Identificarea enterovirusurilor:

REACTIA DE SERONEUTRALIZARE IDENTIFICAREA VIRUSURILOR = VIRUS


NEUTRALIZARE

TITRAREA ANTICORPILOR = REACTIA DE SERONEUTRALIZARE


VIRUSNEUTRALIZARE
VIRUS NECUNOSCUT. ANTICORPI CUNOSCUTI=SER IMUN DE REFERINTA
SERONEUTRALIZARE TITRU DE ANTICORPI NECUNOSCUT VIRUS CUNOSCUT =
TULPINA DE REFERINTA

ETAPE RSN
1. TITRAREA INFECTIVITATII VIRALE
2. BLOCAREA INFECTIVITATII VIRALE
3. DEMONSTRAREA NEUTRALIZARII INFECTIVITATII VIRALE

TITRAREA INFECTIVITATII VIRALE


metoda plajelor

3. DEMONSTRAREA NEUTRALIZARII
INFECTIVITATII VIRALE
= Repetarea etapei 1 cu amestecurile antigen-
anticorp
Identificarea enterovirusurilor dupa metoda Tabla de sah

ENCEFALITE Algoritm de diagnostic virusologic

SINDROM ETIOLOGIE Prod. Patologic IZOLARE Dg. Dg. INDIRECT


POSIBILA DIRECT =serologie
=detect.
directa
ENCEFALITA HERPES Lichid vezicular
Culturi PCR NU
ACUTA VIRUSURI: LCR celulare IF
MENINGO- HSV1 HSV2 Biopsie cerebrala
Animal de
ENCEFALITA VZV,EBV,CMV laborator
ENCEFALO- V. RABIC Saliva, Culturi PCR De electie pt.
MIELITA ARBOVIRUSURI Amprente dermice, celulare IF ARBO
TOGAVIRUSURI corneene, Biopsie Animal de VIRUSURI
FLAVIVIRUSURI cerebrala laborator
BUNYAVIRUSURI LCR
SANGE
POSTINFECTIOASE SALIVA, Culturi PCR IF NU
V. RUJEOLOS BIOPSIE celulare
V. URLIAN CEREBRALA
V. GRIPALE VZV LCR
DIAGNOSTIC SEROLOGIC IN INFECTIA HIV/SIDA

1. DIAGNOSTIC SEROLOGIC

TESTE DE TRIAJ- sensibilitate inalta TESTE DE CONFIRMARE- specificitate inalta


ELISA WESTERN BLOT
TESTE RAPIDE RADIOIMUNOPRECIPITAREA (RIPA)
IMUNOFLUORESCENTA INDIRECTA

l 2. DETECTIA DIRECTA A VIRUSULUI SAU A PRODUSELOR VIRALE


IZOLARE VIRALA
DETECTIA ANTIGENEMIEI p24 ELISA de detectie a Ag virale
DETECTIA ACIDULUI NUCLEIC VIRAL (ARN HIV PLASMATIC)

TESTE DE TRIAJ

ELISA = Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay

ELISA de detectie a anticorpilor antivirali


TEHNICA INDIRECTA

ETAPE
1. Incubare ser pacient 1h la 37C
2. Spalare
3. Incubare conjugat (Ac anti IgG uman x enzima)- 1h la 37C
4. Spalare
5. Incubare substrat 20 30 min la temp camerei
6. Citire la spectrofotometru DO probe, martori, cut off, zona gri
TESTE DE CONFIRMARE
WESTERN BLOT

1. SDS-PAGE
2. BLOT (transfer)
3. DETECTIA ANTICORPILOR

WESTERN BLOT detectia Ac serici

Western blot in infectia HIV

Criteriul minim de
pozitivitate
2 env
+
1 gag
DIAGNOSTIC SEROLOGIC HIV

DIAGNOSTIC SEROLOGIC HIV

AMPLIFICAREA TINTEI
PCR
NASBA (nucleic acid sequenced based amplification)
AMPLIFICAREA SEMNALULUI
b-DNA (branched DNA)
No. of No. Amplicon
Primul ciclu PCR Etapa 1- Denaturare Cycles Copies of
Target
PCR- Etapa 2 CUPLAREA PRIMERILOR LA CAPETELE
1 2
SECVENTEI TINTA
2 4
PCR -3 Elongarea primerilor sub actiunea Taq Polimerazei 3 8
La sfarsitul primului ciclu PCR rezulta 2 copii identice ale 4 16
SECVENTEI TINTA 5 32
6 64
Amplificarea tintei 20 1,048,576
30 1,073,741,822
RT- PCR(Reverstranscriere+PCR)
Real-time PCR

sonde moleculare legate cu doua tipuri de molecule-semnal: o molecula fluorescenta (reporter) si una de
intarziere (quenching).

capacitatea de a realiza
simultan amplificarea si
detectia acidului nucleic,
permitand astfel
monitorizarea continua a
reactiei PCR
DETECTIA AMPLICONULUI

Electroforeza in gel de agar, colorare cu bromura de


ethidiu si comparare cu markeri de GM
cunoscuta
Hibridizare cu sonde moleculare marcate
complementare si apoi detectie (+/- spectrofotometrica)

Hibridizare cu sonde moleculare marcate complementare

RFLP (restriction fragment length polymorfism)

Cu enzime de restrictie (ER)

LiPA Line Probe Assay

Hibridizare cu sonde moleculare cu specificitate pentru regiuni conservate


din cadrul genotipurilor si subtipurilor evidentierea profilului specific unui
genotip prezent in ampliconi

Diagnostic in infectia HIV

DETECTIA VIRUSULUI SAU A PRODUSELOR VIRALE


IZOLARE VIRALA
DETECTIA ANTIGENEMIEI p24
DETECTIA ACIDULUI NUCLEIC VIRAL (ARN HIV PLASMATIC)

Utilizarea metodelor moleculare in infectia HIV

Fereastra serologica perioada de la contactul infectant pana la sinteza anticorpilor antiHIV; testele
serologice sunt negative
Nou-nascutii din mame seropozitive HIV toti sunt seropozitivi testele serologice sunt pozitive,
anticorpii materni trec bariera feto- placentara;
doar o parte dintre nou-nascuti fac si infectia HIV (transmiterea materno-fetala a infectiei ~25% sau <<
cu profilaxie).
Initierea si monitorizarea terapiei antiretrovirale
ORIENTAREA DIAGNOSTICA IN HEPATITE VIRALE

1. Tablou clinic
2. Teste biochimice
Markerii necrozei hepatocitare (transaminaze, LDH) Markeri colestaza (FAL, GGT, bilirubina)
Markeri ai incapacitatii de sinteza la nivel hepatic (proteine serice, colesterol, trigliceride)
3. Date epidemiologice: cale transmitere, contact infectant, per. incubatie, vaccinuri
4. Diagnostic etiologic = detectia markerilor virali:
antigene virale (Ag)
anticorpi antivirali (Ac)
acid nucleic viral

CLINICA, EPIDEMIOLOGIE

Diagnostic V.H.B. Infectia acuta cu VHB evolutie spre vindecare


Infectia cronica cu VHB

Tehnica ELISA sandwich

1. Incubare ser pacient 1h la 37C


2. Spalare
3. Incubare CONJUGAT 60min la 37C
4. Spalare
5. Incubare SUBSTRAT 20 min la t.camerei
6. Solutie de stopare
7. Citire la spectrofotometru => D.O., MN, MP,C.O.
Diagnostic molecular in infectia VHB

(1) Monitorizarea evolutiei naturale /sub tratament a hepatitei virale B


Riscul de ciroza/CHP creste cu nivelul VL, atat pt persoanele AgHBe negative, cat si pt cele AgHBe pozitive

(2) Initiere tratamentului pt hepatita cronica B


Tratamentul este initiat pe baza
PBH
VL
Transaminaze serice
La persoanele AgHBe negative, iv >10.000 copii/ml indica infectie activa (marker de infectivitate virala).

(3)Criterii de evaluare a raspunsului la terapie in hepatita cronica VHB

Virusologice
Mentinerea nedetectabila a ADN-VHB plasmatic
Seroconversie sustinuta la antiHBe la pacientii AgHBe pozitivi
Eliminarea AgHBs seroconversie anti HBs

Biochimice:
normalizarea sustinuta a nivelului transaminazelor

Histologice:
reducerea stadiului de fibroza sau absenta progresiei
reducerea activitatii necro- inflamatorii

Diagnostic V.H.D.
Coinfectia HBV - HDV
Suprainfectia HBV HDV

Diagnostic in infectia VHC


Patternul serologic al infectiei VHC acute cu vindecare / infectiei VHC care cronicizeaza
Succesul terapeutic in hepatita cronica C
Raspunsul virusologic sustinut (RVS)

Diagnostic V.H.A.

EVOLUTIA MARKERI DE INFECTIE VHA


HEPATITA A NU CRONICIZEAZA!!
ELISA de detectie anticorpi de clasa IgM
ELISA de captura

Utilizarea metodelor moleculare in infectiile virale:


HIV, hepatite, papilomavirusuri
infectia HIV
infectia VHB
Monitorizarea evolutiei naturale /sub tratament a hepatitei virale B
Initierea tratamentului pt hepatita cronica B
infectia VHC
Diagnosticul infectiei active + Aprecierea rezultatelor terapiei
GENOTIPARE - apreciaz durata tratamentului i prognosticul
infectia HPV
Detectia ADN HPV (PCR)
GENOTIPARE genotipuri high risk si low risk