Olivia S.

Dorneanu Teodora Vremer

Staphylococcus aureus:
clasic versus modern

Editura Gr. T. Popa Iai

2011
 ISBN 978-606-544-076-0

Material protejat de drepturile de autor. Reproducerea sau multiplicarea integral sau

parial, prin orice mijloc, a acestui material, fr acordul editorilor este ilicit i
constituie infraciune.
 Autori

(n ordine alfabetic)

Dorneanu Olivia Simona M.D., Ph.D., Confereniar universitar,

Disciplina de Microbiologie, U.M.F. Gr. T.
Popa Iai

Iancu Luminia Smaranda M.D., Ph.D., Profesor universitar, Disciplina

de Microbiologie, U.M.F. Gr. T. Popa Iai

Logigan Ctlina M.D., Ph.D., Medic specialist Medicin de

Laborator

Miftode Egidia Gabriela M.D., Ph.D., Confereniar universitar,

Disciplina de Boli Infecioase, U.M.F. Gr. T.
Popa Iai

Nastase Eduard Vasile M.D., Doctorand, Medic specialist Medicin

de familie, Medic rezident Boli Infecioase

Vremer Teodora M.D., Doctorand, Asistent universitar,

Disciplina de Microbiologie, U.M.F. Gr. T.
Popa Iai
 CUPRINS

1. Introducere 1
Teodora Vremer

2. Identificarea Staphylococcus aureus 5

Olivia S. Dorneanu, Luminia S. Iancu

3. Evoluia rezistenei la antibiotice a Staphylococcus aureus 11

Ctlina Logigan

4. Fenotipuri de rezisten ale Staphylococcus aureus 13

Eduard V. Nastase

5. Staphylococcus aureus meticilino-rezistent 23

Teodora Vremer , Olivia S. Dorneanu

6. Leucocidina Panton-Valentine 38
Olivia S. Dorneanu, Teodora Vremer

7. Sensibilitatea redus la glicopeptide a Staphylococcus aureus 42

Olivia S. Dorneanu

8. Detectarea genelor nuc, mecA, pvl la izolate clinice de

Staphylococcus aureus 50
Teodora Vremer , Olivia S. Dorneanu

9. Rezistena la antibiotice a tulpinilor de Staphylococcus aureus

izolate din infecii 96
Olivia S. Dorneanu, Teodora Vremer

10. Opiuni terapeutice 107

Olivia S. Dorneanu, Egidia G. Miftode

Bibliografie 124
ABREVIERI

AAC = aminoglicozid acetiltransferaza

ANT = aminoglicozid nucleotidiltransferaza
APH = aminoglicozid fosfotransferaza
ATCC = American Type Culture Collection
AUC = area under the curve (aria de sub curb)
AUIC = area under the inhibitory curve (aria de sub curba inhibitorie)
BORSA = fenotipul borderline de rezisten la meticilin al S. aureus (fenotipul
inactivator)
CA-MRSA = community-acquired MRSA (tulpini comunitare de MRSA)
ccr = gene cassette chromosome recombinase (gene pentru recombinazele casetei
cromosomiale)
CDC = Centers for Disease Control (Centrul de Control al mbolnvirilor)
CLSI = Clinical and Laboratory Standards Institute
CMI = concentraia minim inhibitorie
coa = gena care codific coagulaza
EARS-Net = European Antimicrobial Resistance Surveillance Network
EMRSA = epidemic MRSA (tulpini epidemice de MRSA)
ermA, ermB, ermC = gene care codific rezistena la macrolide
femA, femB, femC, femD = gene care codific factori eseniali ai rezistenei la
meticilin
FDA = Food and Drug Administration
Fwd = forward (despre primer)
HA-MRSA = hospital-acquired MRSA (tulpini nosocomiale de MRSA)
HPLC = high performance liquid chromatography (cromatografie de lichide de
nalt performan)
hVISA = heterogenous vancomycine intermediate Staphylococcus aureus (S. aureus
intermediar la vancomicin heterogen)
GISA = glycopeptide intermediate Staphylococcus aureus (S. aureus intermediar la
glicopeptide)
GRD = glicopeptide resistance detection (detectarea rezistenei la glicopeptide)
gyrA , parC = gene care codific rezistena la chinolone
linA, linA = gene care codific rezistena la lincosamide
lukF-PV, lukS-PV = gene care codific leucocidina Panton-Valentine
mecA = gena care codific rezistena la meticilin
MLSK = grupul de antibiotice macrolide, lincosamide, streptogramine i ketolide
MLST = Multi Locus Sequence Typing
MDR = multiple drug resistance (rezisten multipl la antibiotice)
MOD-SA = fenotipul modificat de rezisten la meticilin al S. aureus
MRSA = methicillin-resistant Staphylococcus aureus (S. aureus rezistent la
meticilin)
MSSA = methicillin-susceptible Staphylococcus aureus (S. aureus sensibil la
meticilin)
NTC = non template control (martor negativ fr ADN)
nuc = gena care codific nucleaza
PAP = population analysis profile (profilul de analiz al populaiei)
PCR-RFLP = Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length
Polymorphism
PCR = polymerase chain reaction (reacia de amplificare genic)
PFGE = Pulsed Field Gel Electrophoresis (electroforeza n cmp pulsator)
PLP2a = protein suplimentar de legare a penicilinei
PVL = Panton-Valentine leukocidine (leucocidina Panton-Valentine)
R = rezistent
Rev = reverse (despre primer)
RT-PCR = real-time polymerase chain reaction (reacia de amplificare genic n
timp real)
S = sensibil
SCCmec = staphylococcal cassette chromosome mec (caseta cromosomial
stafilococic mec)
SCN = stafilococi coagulazo-negativi
SLST = Single Locus Sequence Typing
spa = gena care codific proteina A a S. aureus
SSTI = skin and soft tissue infections (infecii ale pielii i esuturilor moi)
Tm = melting temperature (temperatura de denaturare)
TE = Tris EDTA
vanA, vanB, vanC1-vanC3 = gene care codific rezistena enterococilor la
vancomicin
VISA = vancomycine intermediate Staphylococcus aureus (S. aureus intermediar la
vancomicin)
VSSA = vancomycin susceptible Staphylococcus aureus (S. aureus sensibil la
vancomicin)
VRE = vancomycin resistant enterococci (enterococi vancomicino-rezisteni)
VRSA = vancomycin resistant Staphylococcus aureus (S. aureus rezistent la
vancomicin)
 1. INTRODUCERE
Teodora Vremer

Staphylococcus aureus este o bacterie condiionat patogen bine adaptat,

capabil a supravieui bine n mediul nconjurtor i de a se rspndi de la o
persoan la alta, putnd produce colonizare sau ascunzndu-se n
compartimentele intracelulare i, cel mai important, putnd produce forme
variate de mbolnviri la om.

Exist variaii enorme ntre tulpinile de S. aureus. Achiziia de elemente

genetice mobile adeseori aduce gene de virulen i rezisten. Factorii de aprare
ai gazdei umane i utilizarea antibioticelor selecteaz cea mai adaptat bacterie;
noile tulpini de S. aureus sunt mai virulente i mai rezistente la antibiotice.

O caracteristic important a acestei bacterii o reprezint capacitatea sa

de a dobndi rapid rezisten la aproape toate antibioticele utilizate n terapie,
inclusiv la cele considerate de rezerv, precum glicopeptidele. Aceste trsturi
impun o strict monitorizare a tulpinilor circulante, cu identificarea izolatelor
purttoare ale unor gene de rezisten i a unor factori de virulen.

Infeciile cu S. aureus sunt adeseori acute i piogene i, netratate, se pot

rspndi la esuturile nvecinate sau, bacteriemic, la situsuri metastatice,
implicnd alte organe. Unele infecii produse de S. aureus sunt cutanate; acestea

1
includ furuncule sau carbuncule, celulit, impetigo i infecii ale plgilor operatorii
cu variate localizri. Unele din cele mai severe infecii produse de S. aureus sunt
bacteriemia, pneumonia, osteomielita, endocardita acut, miocardita, pericardita,
meningita, corioamniotita, sindromul pielii oprite i abcese ale muchilor,
tractului urogenital, sistemului nervos central i ale diverselor organe abdominale.

Variantele de S. aureus cu colonii mici sunt subpopulaii care apar natural

i care cresc ncet, producnd colonii mici pe medii uzuale. Aceast populaie de S.
aureus este mai frecvent la pacieni cu infecii persistente neobinuite, cum ar fi
fibroza chistic sau osteomielita cronic i care sunt expui cronic la
aminoglicozide i trimetoprin-sulfametoxazol. Dei infecia cu S. aureus la aduli
sau copii cu fibroz chistic nu afecteaz semnificativ funcia respiratorie,
utilizarea continu a terapiei antistafilococice crete riscul de colonizare cu
Pseudomonas aeruginosa.

De la descoperirea sa, n 1880, de ctre Alexander Ogston care l-a izolat

pentru prima dat dintr-un abces i a descris rolul su n producerea infeciilor
localizate i a septicemiilor, istoria S. aureus s-a caracterizat prin evoluie i
schimbare, fiind marcat de dou evenimente importante: dezvoltarea rezistenei
la meticilin care face ca ntreaga clas a antibioticelor beta-lactamice s fie
ineficient (methicillin-resistant S. aureus, MRSA) i, recent, emergena tulpinilor
comunitare de MRSA care poart gene asociate cu virulena crescut. Capacitatea
S. aureus de a dobndi rapid rezistena la substane antimicrobiene a reprezentat
un subiect frecvent n literatura de specialitate n ultimii 50 de ani (Howden et al.,
2010).

MRSA au fost raportate pentru prima dat n 1961 i de atunci a devenit un

patogen nosocomial major n toat lumea. Rezervorul de MRSA sunt pacienii
infectai sau colonizai, iar modul principal de transmitere de la pacient la pacient

2
este prin intermediul minilor contaminate ale personalului medical. Este
axiomatic faptul c depistarea precoce a unei infecii MRSA i stabilirea
sensibilitii la antibiotice permite iniierea rapid a terapiei i a msurilor de
control corecte. Diagnosticul de laborator i testarea sensibilitii la substane
antimicrobiene sunt etape cruciale pentru tratarea, controlul i prevenirea
infeciilor cu MRSA (Brown et al., 2005).

Metodele convenionale de testare a sensibilitii la antibiotice, prin

obligativitatea izolrii bacteriei n cultur pur, presupun un timp ndelungat (24-
48 de ore) pentru obinerea profilului de sensibilitate la antibiotice. n plus, aceste
metode nu reuesc s evidenieze ntotdeauna meticilino-rezistena, n cazul
tulpinilor heterorezistente, iar rezultatele determinrii difuzimetrice a rezistenei
la oxacilin sunt profund afectate de condiiile n care se desfoar testarea
(Ornskov et al., 2008.).

Dezvoltarea tehnicilor de biologie molecular care vizeaz determinani

specifici de rezisten sunt mai rapide, mai specifice i mai sensibile comparativ cu
metodele clasice i reprezint o perspectiv atrgtoare (Ornskov et al., 2008).
Totui, aceste teste nu sunt accesibile oricrui laborator, astfel nct o analiz
comparativ a eficacitii metodelor clasice raportate la tehnicile de biologie
molecular, considerate de referin, este de dorit.

Vancomicina a fost introdus pentru prima dat n terapie n 1958 i a

reprezentat tratamentul de elecie pentru infeciile severe cauzate de MRSA.
Muli ani nu au existat raportri privind riscul apariiei tulpinilor rezistente la
vancomicin. Primele semnalri privind izolarea n Japonia, n 1997, a unor tulpini
cu rezisten intermediar la vancomicin (VISA Vancomycin Intermediate
Staphylococcus aureus) au reprezentat un motiv de ngrijorare n lumea medical.
Din acel moment s-a pus problema acurateei metodelor de detecie i a

3
relevanei clinice a tulpinilor cu sensibilitate redus la vancomicin. Au fost
modificate recomandrile CLSI privind punctele de ruptur pentru vancomicin i
a crescut ngrijorarea privind eficiena vancomicinei n tratamentul infeciilor
stafilococice.

Apariia tulpinilor cu sensibilitate redus la teicoplanin a fost semnalat

anterior izolrii tulpinilor cu sensibilitate redus la vancomicin. Ambii termeni,
att GISA (Glycopeptide Intermediate Staphylococcus aureus) ct i VISA au fost
utilizai n literatur i n esen sunt interschimbabili. Totui, sensibilitatea redus
la teicoplanin poate fi prezent fr a fi asociat cu o reducere demonstrabil a
sensibilitii la vancomicin, n timp ce, de obicei, tulpinile VISA prezint o scdere
demonstrabil a sensibilitii la teicoplanin.

Dup apariia tulpinilor de enterococi rezisteni la vancomicin n anii 80,

a existat o mare preocupare cu privire la posibilitatea izbucnirii unor epidemii de
infecii cu tulpini cu rezisten nalt la vancomicin (VRSA Vancomycin Resistant
Staphylococcus aureus) prin transferul genei de rezisten vanA de la enterococi.
Prima raportare a unor astfel de tulpini a fost n n SUA n 2002. Totui, pn la
aceast dat doar 9 tulpini VRSA au fost izolate n SUA, la care se adaug un caz n
India i unul n Iran . Aceste date indic faptul c, dei mecanismul de rezisten
este semnificativ, nu evolueaz i nu se rspndete cu rapiditate (Howden et al.,
2010; Chang et al., 2003).

4
 2. IDENTIFICAREA STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Olivia S. Dorneanu, Luminia S. Iancu

Identificarea speciei unui izolat clinic este esenial pentru a diferenia S.

aureus de stafilococii coagulazo-negativi (SCN). n acest scop, pot fi utilizate
diferite teste: producerea de protein A, coagulaza legat (clumping factor),
coagulaza liber (extracelular) i nucleaza termostabil. n plus, recent au fost
puse la punct i metode moleculare. Testele de identificare trebuie nsoite de
controale de calitate, tulpini de control pozitive i negative, sau conform
indicaiilor productorului.

2.1. Testul coagulazei la tub

Coagulaza liber transform plasma n absena calciului. Testul coagulazei

la tub cu plasm de iepure i examinarea tuburilor dup incubare timp de 4 i,
respectiv, 24 ore, este testul standard pentru identificarea de rutin a S. aureus.
Testele negative la 4 ore trebuie re-examinate la 24 ore deoarece o proporie
mic de tulpini necesit mai mult de 4 ore pentru formarea cheagului. Alte specii
de stafilococi, spre exemplu S. schleiferi sau S. intermedius, pot da rezultate
pozitive n testul coagulazei la tub, dar nu sunt izolate frecvente din infecii
umane. n plus, rareori tulpini de S. aureus sunt negative n testul coagulazei.

5
 Figura 1. Cultura pe agar-snge a unei tulpini de S. aureus

Figura 2. Testul coagulazei la tub pentru identificarea S. aureus.

De la stanga spre dreapta: martor negativ, martor pozitiv, tulpina de testat.

2.2. Testul coagulazei pe lam

Coagulaza legat difer de coagulaza liber prin legarea de corpul

bacterian i prin faptul c necesit doar fibrinogen (Cookson, 1997). Testul
aglutinrii pe lam pentru coagulaza legat este foarte rapid, dar pn la 15% din
tulpinile de S. aureus sunt negative. De aceea, izolatele negative prin acest test

6
trebuie confirmate prin testul coagulazei la tub. S. schleiferi i S. lugdunensis pot
da rezultate pozitive la testul coagulazei pe lam. Testul este nepotrivit pentru
izolatele care se emulsioneaz greu. Coagulaza legat poate fi mascat de cantiti
mari de capsul.

Figura 3. Testul coagulazei pe lam pentru identificarea S. aureus

2.3. Teste de latex aglutinare

Primele versiuni ale testelor de latex aglutinare pentru S. aureus au

detectat proteina A i/sau coagulaza legat. Aceste teste au dat rezultate fals-
negative cu unele tulpini MRSA care produceau cantiti mici de coagulaz legat
sau proteina A (Kuusela et al., 1994). Formulri mai recente ale acestor teste
includ proteina A i/sau clumping factor, dar detecteaz i diferite antigene de
suprafa, ceea ce a mbuntit sensibilitatea testelor, ns cu scderea
specificitii lor datorit unor reacii ncruciate cu SCN (Blake i Metcalfe, 2001).
n plus, orice test ce include clumping factor poate da rezultate fals-pozitive cu S.
lugdunensis i S. schleiferi (Wichelhaus et al., 1999).

7
 Figura 4. Test de latex aglutinare pentru identificarea S. aureus

2.4. Teste pentru DNaz i nucleaz termostabil

Plcile pentru dezoxiribonucleaz (DNaz) pot fi utilizate pentru triajul

izolatelor, dar, pentru c diferite cantiti de DNaz sunt produse de SCN,
rezultatele pozitive trebuie confirmate printr-un alt test. Nucleaza termostabil
poate fi folosit pentru identificarea S. aureus, dei rareori SCN pot da reacie
pozitiv. Metoda metacromatic difuzimetric pentru nucleaza termostabil
poate fi utilizat pentru testarea direct a hemoculturilor (Madison i Baselski,
1983), dar aceast metod este dependent de mediu (Faruk i Murray, 1984). A
fost descris i un test de latex aglutinare bazat pe nucleaza termostabil.

2.5. Teste biochimice comerciale

Sunt foarte multe kituri comerciale i sisteme automate care includ

identificarea S. aureus (Spanu et al., 2003). Performana acestor teste este bun,
dar ele sunt lente, consum mai mult timp din punct de vedere tehnic i sunt mai
scumpe dect teste precum coagulaza sau latex aglutinarea. De aceea este mai
puin probabil s fie utilizate pentru identificarea specific a S. aureus. n contrast,
Staphychrom II este un test cromogen cu durat de 2 ore, bazat pe protrombin i
inhibitori de proteaz. ntr-un studiu a fost raportat o sensibilitate de 98,6% i o

8
specificitate de 100%, mai bun dect pentru testul coagulazei (Fonsale et al.,
2004).

Figura 5. Galerie ID 32STAPH (bioMrieux, Frana)

utilizat n identificarea unei tulpini de S. aureus

2.6. Metode moleculare

Ocazional, izolate de S. aureus dau rezultate echivoce la testul coagulazei

sau la testarea biochimic i este nevoie de o confirmare a identificrii printr-o
metod alternativ. n plus, rezultatele testrii sensibilitii la meticilin/oxacilin
pot fi echivoce i, din nou, o testare molecular ulterioar este justificat. Teste
moleculare rapide pentru determinarea sensibilitii la meticilin/oxacilin pot fi
combinate cu detectarea simultan a unei inte moleculare specifice pentru S.
aureus pentru identificarea rapid a MRSA.

Majoritatea metodelor moleculare pentru identificarea S. aureus sunt

bazate pe PCR. Actualmente exist o gam de primeri pentru amplificarea unor
inte cu specificitate de specie. Aceste inte includ nucleaza (nuc), coagulaza (coa),
proteina A (spa), femA sau femB, Sa 442, ARNr 16S i gene ale proteinelor asociate
suprafeei, care leag fibrinogen (Grisold et al., 2002).

Cteva metode moleculare au fost puse la punct n ultimii ani pentru

identificarea i testarea sensibilitii S. aureus i utilizare n laboratoarele de

9
diagnostic, dar au fost publicate doar puine studii privind performaele lor (Levi i
Towner, 2003). Este ns clar c pentru moment, datorit costurilor adiionale
pentru aceste teste, a numrului vast i a diversitii mari de produse patologice
care sosesc ntr-un laborator clinic, este fezabil a identifica S. aureus prin metode
moleculare doar pentru confirmare, atunci cnd alte metode dau rezultate
echivoce, sau n produse patologice cu suspiciune ridicat de infecie cu MRSA.
Toate testrile trebuie nsoite de control pozitiv i, respectiv, negativ.

10
 3. EVOLUIA REZISTENEI LA ANTIBIOTICE A
STAPHYLOCCUS AUREUS
Ctlina Logigan

De la introducerea penicilinei n terapie, n 1940, S. aureus a dovedit o

mare capacitate de adaptare, la sfritul anilor 40 izolndu-se primele tulpini
rezistente, prin producerea unei penicilinaze plasmidice inductibile i care
prezentau rezisten asociat la tetraciclin, streptomicin, eritromicin. Astzi,
majoritatea tulpinilor de S. aureus sunt rezistente la penicilin (Enright et al.,
2002).

Ulterior au aprut noi peniciline semisintetice, rezistente la hidroliza -

lactamazei (oxacilina, meticilina, nafcilina). Meticilina, utilizat pentru prima dat
n 1959, a fost iniial eficient n tratarea infeciilor cu S. aureus rezistent la
penicilin (Felten et al., 2002). ns n 1961, n Marea Britanie, au fost semnalate
primele tulpini rezistente la meticilin i, implicit, la tot grupul antibioticelor
beta-lactamice, rezisten dobndit prin achiziia genei mecA (Deurenberg i
Stobberingh, 2008; Deurenberg RH, Stobberingh, 2009).

La scurt timp, au fost izolate tulpini MRSA i n alte ri ale Europei, iar mai
trziu n Japonia, Australia, SUA. n anii 1970 au fost raportate primele cazuri de
izbucniri epidemice cu MRSA n spitalele din estul Australiei, iar n urmtoarea

11
decad frecvena infeciilor cu MRSA n spitale a crescut foarte mult peste tot n
lume. Rezistena la meticilin se asociaz cu rezistena la antibiotice din alte clase
nou introduse (lincosamide, fluorochinolone, noile aminoglicozide) (Schito, 2006).

Tot n acest perioad sunt raportate primele tulpini cu sensibilitate

modificat la vancomicin, antibiotic intodus n terapie n 1958 i folosit frecvent
n tratamentul infeciilor cu MRSA (Srinivasan et al., 2002); astfel, n 1997, n
Japonia se izoleaz prima tulpin cu rezisten intermediar la vancomicin (VISA),
cu concentraie minim inhibitorie la vancomicin de 8 g/ml. Iar n anul 2002, n
SUA, se izoleaz prima tulpin cu rezisten nalt la vancomicin (VRSA) prin
transferul genelor de rezisten ale enterococilor (Chang et al., 2003). Pn n
prezent CDC a raportat 11 tulpini de VRSA.

ncepnd din anul 1998 este semnalat apariia tulpinilor comunitare

MRSA non-multirezistente, dotate cu proprieti deosebite de colonizare. S-a
observat o rspndire a tulpinilor comunitare n mediul spitalicesc, ducnd la o
cretere a morbiditii i mortalitii prin infecii cu MRSA n aceste instituii
(Seybold et al., 2006). Studiile moleculare au atestat originea lor independent de
tulpinile nosocomiale de MRSA (Klevens et al., 2007).

12
 4. FENOTIPURI DE REZISTEN ALE STAPHYLOCCUS AUREUS
Eduard V. Nastase

4.1. Rezistena la beta-lactamine

Fenotipul slbatic de S. aureus este sensibil la penicilin. Primul mecanism

de rezisten descris pentru stafilococi a fost sinteza unei penicilinaze inductibile
codificate plasmidic, care inactiveaz penicilinele de biosintez,
carboxipenicilinele i ureidopenicilinele, dar care poate fi inactivat de ctre
inhibitorii de betalactamaz (acid clavulanic, sulbactam, tazobactam).

Rezistena la meticilin a stafilococilor poate fi datorat mai multor

mecanisme:
a. modificarea intei de aciune prin producerea unei proteine
suplimentare de legare a penicilinei (PLP2a) cu o afinitate foarte slab pentru
ansamblul -lactaminelor. Sinteza acestei proteine este codificat de gena
cromozomal mecA. Reprezint cel mai frecvent mecanism i confer rezisten la
ntreaga clas a betalactaminelor (fenotipul clasic). Rezistena la meticilin poate
s fie omogen (nivel ridicat), manifest la ntreaga populaie testat, sau
heterogen (nivel sczut), manifest numai la 10-4 pn la 10-8 din organismele
populaiei testate.

13
 Genele de reglare mecR1 (co-inductor) i mecI (represor) inhib
transcrierea genei mecA. Unele tulpini pierd complet gena mecI, ceea ce
antreneaz o producere constitutiv de proteine PLP2a. Elementul mecR1-mecI
prezint omologie cu genele reglatoare blaR1-blaI ale operonului penicilinaz.
Gena blaI codific o protein care inhib transcrierea co-represorului blaZ n timp
ce gena blaR1 are o funcie antirepresoare. ntr-adevr, ultima codific o protein
membranar care n prezena unei beta-lactamine nltur represia produsului
blaI asupra blaZ. Astfel, gena mecA poate fi co-reglat de ctre sistemul de
inducie al penicilinazei.

Patru gene accesorii (femA, femB, femC, femD) necesare exprimrii la nivel
ridicat a rezistenei la meticilin sunt situate la distan de gena mecA i sunt
toate implicate ntr-una din etapele de sintez a peptidoglicanului.

Este larg acceptat c tulpinile de S. aureus mecA pozitive i sensibile la

oxacilin sunt de obicei heterorezistente i terapia cu beta-lactamaze poate eua
(Giannouli et al., 2010).

b. modificarea afinitii PLP-urilor normale fa de -lactamine,

determin rezistena la izoxazolilpeniciline, persistnd sensibilitatea la penicilin,
cefalosporine i carbapeneme (fenotipul MOD-SA - S. aureus modificat);

c. hiperproducie de betalactamaze - pentru tulpinile de S. aureus

borderline (tulpinile BORSA - fenotipul inactivator) care nu au PLP2a, dar care pot
inactiva oxacilina datorit cantitii mari de penicilinaz produs. n general, nu
exist multirezisten asociat. Cefalosporinele sunt active mpotriva acestor
tulpini. Asocierea la oxacilin a inhibitorilor de betalactamaz duce la restaurarea
sensibilitii (Jehl et al., 2003).

14
 d. producerea unei meticilinaze, capabil s hidrolizeze meticilina, n
absena mecA, determin un fenotip de rezisten rar semnalat, caracterizat prin:
sensibilitate la penicilina G, aminopeniciline, ureidopeniciline, carbapeneme,
cefalosporine i rezisten la oxacilin.

Tabelul 1. Fenotipuri de rezisten dobndit a stafilococilor la beta-lactamine

Mecanism Peniciline de Antibiotic + Peniciline M Cefalosporine

biosintez inhibitor de Carbapeneme
Carboxipeniciline -lactamaz
Ureidopeniciline
Slbatic S S S S

Penicilinaz R S S S

Modificarea R R R R
PLP, gena
mecA

BORSA (rar) R S/R R S

MODSA (rar) S S R S

BORSA = S. aureus borderline

MODSA = S. aureus modificat

Rezistena la meticilin n cazul S. aureus este adesea asociat cu alte

mecanisme de rezisten care determin inactivarea altor familii de antibiotice.
Astfel, tulpinile de S. aureus rezistente la meticilin prin modificarea PLP-urilor
sunt cel mai adesea rezistente la aminoglicozide, fluorochinolone, macrolide,
lincosamide i ketolide, la fosfomicin, uneori la rifampicin. Antibioticele care
rmn active sunt glicopeptidele, acidul fusidic, streptograminele i
oxazolidinonele. Fenotipurile inactivator prin exces de beta-lactamaz i MOD-SA

15
au rezisten intermediar la oxacilin i n general nu exprim rezisten multipl
(Buiuc i Negu, 2008).

4.2. Rezistena la aminoglicozide este legat de achiziionarea de enzime

care inactiveaz aceste antibiotice (Buiuc i Negu, 2008). Fenotipurile de
rezisten sunt:

Tabelul 2. Fenotipuri de rezisten dobndit a stafilococilor la aminoglicozide

Fenotip Enzime Kanamicin Tobramicin Gentamicin

Amikacin Netilimicin
Isepamicin
Slbatic - S S S

K APH 3-III R S S

KT ANT-4-4 R R S

KTG APH 2 - AAC 6 R R R

APH: aminoglicozid fosfotransferaza;

ANT: aminoglicozid nucleotidiltransferaza;
AAC: aminoglicozid acetiltransferaza.

Pentru depistarea fenotipurilor de rezisten la aminoglicozide este

suficient testarea fa de kanamicin, tobramicin i gentamicin. Rezistena la
kanamicin (fenotipul K) sau la kanamicin i tobramicin (fenotipul KT) sunt
predictive pentru rezistena la amikacin, dar netilmicina rmne activ.
Rezistena la kanamicin, tobramicin i gentamicin (fenotipul KTG) este
predictiv pentru rezistena la amikacin i netilmicin (Buiuc i Negu, 2008).

16
 4.3. Rezistena la tetracicline se poate produce prin dou mecanisme:

Primul este legat de concentrarea intracelular insuficient a antibioticului

datorit efluxului acestuia prin membrana citoplasmatic, sub aciunea unei
proteine membranare Tet. Acest mecanism confer rezisten la tetraciclin, dar
nu i la minociclin.

Al doilea este legat de o modificare a intei ribozomale a acestor

antibiotice. n acest caz, exist o rezisten ncruciat la toate tetraciclinele.

4.4. Rezistena la macrolide, lincosamide, streptogramine i ketolide

(MLSK) are la baz urmtoarele mecanisme:
a. Modificarea intei ribozomale (sub-unitatea 50S)

Tulpinile rezistente produc o metilaz responsabil de o dimetilare

specific a adeninei din ARNr 23S. Aceasta provoac o modificare a conformaiei
ARN-ului care reduce afinitatea MLS pentru ribozomi. Metilaza inactiveaz toate
macrolidele i licosamidele. Aceast rezisten depinde de diferii determinani
genetici. Stafilococii prezint gene ermA, ermB i ermC. Aceste gene sunt purtate
de transpozoni sau de ctre plasmide. Expresia fenotipic a rezistenei poate fi
inductibil (rezisten ncruciat pentru toate macrolidele cu 14 i 15 atomi de
carbon i sensibilitate la macrolidele cu 16 atomi de carbon i la ketolide) sau
constitutiv (rezisten ncruciat la toate macrolidele cu 14-16 atomi de carbon,
lincosamidele, ketolidele i streptograminele B = rezistena de tip MLS B).
Rezistena la compusul B nu modific aciunea sinergic a celor 2 componeni ai
streptograminelor.

17
 Tabelul 3. Fenotipuri de rezisten dobndit ale stafilococilor la MLSK

(1) (3) (4) (5)

MECANISM Genotip Feno M14 M16 LIN CLIN PRI KET

(2)
tip M15

Modificarea erm MLSB R S S S S S

intei inductibil

(6)
erm MLSB R R R R (S) R
constitutiv

Inactivare lin (A) L S S R (S) S S

vat (L) S S S(I/R) S(I/R) (S) S

vgb SB S S S S S/I S

Necunoscut Necunoscut LSA S S I/R I S/I S

Eflux vga SA S S S S (S) S

msr (A) M R S S S S S

(1) M14: eritromicina, roxitromicina, claritromicina, diritromicina

(2) M15: azitromicina
(3) M16: spiramicina, josamicina
(4) Pristinamicina
(5) Ketolide
(6) (S) = antibiotic a carui activitate bacteriostatic sau bactericid este diminuat
Vgb nu este niciodat singur, ci numai asociat cu vat sau vga.
Vga nu este ntotdeauna asociat cu fenotipul L.

b. Inactivarea antibioticului

Streptogramin A acetiltransferaza confer rezisten la factorul A, pe cnd

streptogramin B hidrolaza, codificat de gena vgb, inactiveaz factorul B. Cel puin
2 gene vat sunt responsabile pentru acetilarea streptograminelor A. Rezistena
izolat la lincosamide, excepional la S. aureus, dar detectat la stafilococi
coagulazo-negativi (S. sciuri, S. cohnii, S. xylosus), este datorat dobndirii unei
enzime care modific lincomicina i clindamicina prin adenilare. Acest fenotip LS A
poate fi confundat cu fenotipul L, ambele rare la S. aureus, cu att mai mult cu ct

18
necomercializarea discurilor separate de streptogramine face testul dificil de
efectuat. Lincosamidele sunt inactivate de ctre nucleotidiltransferazele codificate
de dou gene plasmidice foarte apropiate, linA i linA.

c. Efluxul activ al antibioticului

Expresia acestei rezistene este dependent de gena mrsA, care codific

proteina MrsA responsabil de eliminarea crescut a eritromicinei
intrabacteriene.

Au fost izolai stafilococi rezisteni numai la streptograminele A. Rezistena

dependent de gena vga este datorat unei diminuri intracelulare a antibioticului
(Gherardi et al., 2009).

d. Demonstrarea rezistenei inductibile la clindamicin n prezena unui

inductor puternic al sintezei metilazei implicate, se poate face prin metoda
difuzimetric, plasnd adiacent discul de eritromicin (15 g) i discul de
clindamicin (2 g), la o distan de 15-26 mm. Dac tulpina prezint rezisten
inductibil la clindamicin, eritromicina va difuza in mediu, inducnd rezisistena
la lincosamide, cu apariia unei turtiri a diametrului zonei de inhibiie pentru
clindamicin (zona D) (figura 36).

4.5. Rezistena la chinolone

Stafilococii sunt n mod natural rezisteni la chinolonele din prima

generaie, dar sunt, n schimb, sensibili la fluorochinolone.

19
 Au fost descrise 3 mecanisme de rezisten:
Afinitate sczut prin modificarea intei, ADN giraza. Dobndirea
rezistenei este legat de apariia mutaiilor cromozomiale la nivelul
genelor gyrA i parC care provoac o diminuare a legrii chinolonelor de
intele lor intracelulare, complexele ADN-giraza i ADN-topoizomeraza
IV. Rezistena la aceast familie de antibiotice este legat n principal de
selecia mutantelor rezistente. Rezistena este ncruciat la toate
fluorochinolonele;
Defecte de ptrundere prin peretele bacterian;
Eflux.

Ultimele 2 mecanisme sunt mai puin frecvente.

4.6. Rezistena la rifampicin apare prin modificarea ARN-polimerazei. Se

disting dou niveluri de rezisten:
- nivel nalt, cu CMI > 32g/mL;
- sensibilitate diminuat (CMI 1-4g/mL), tulpini rar izolate.

4.7. Rezistena la cotrimoxazol se realizeaz prin:

- modificarea enzimelor int: dihidrofolatreductaza i
tetrahidrofolatreductaza;
- hiperproducia acestor enzime int.

20
 4.8. Rezistena la cloramfenicol

Dobndirea unei cloramfenicol acetiltransferaze plasmidice modific

cloramfenicolul i provoac o rezisten de nivel nalt. Totui, incidena acestei
rezistene este redus.

4.9. Rezistena la fosfomicin

Rezistena la fosfomicin este, de asemenea, datorat mutaiilor aprute

cu frecven mare i care afecteaz transportul antibioticului. Aceasta explic
neutilizarea sa n monoterapie. O rezisten plasmidic la fosfomicin a fost pus
n eviden i la S. aureus. Gena fosB este purtat de plasmide la S. aureus.
Mecanismul, prin analogie cu cel descris la bacilii gram-negativi, ar putea fi o
inactivare a antibioticului prin conjugare cu glutation.

Fosfomicina blocheaz sinteza PLP2a, ceea ce permite o aciune sinergic

cu beta-lactamine asupra MRSA sensibil la fosfomicin.

4.10. Rezistena la acid fusidic

Rezistena la acid fusidic se datoreaz mutaiilor factorului de elongare EF-

6, aprute cu frecven mare, de unde utilizarea sa n asociere cu un alt antibiotic
(Jehl et al., 2003).

21
 4.11. Rezistena la glicopeptide

Au fost presupuse dou mecanisme de modificare a sensibilitii

stafilococilor la glicopeptide:
a. modificare fenotipic datorat unei mutaii aprute ca urmare a
presiunii de selecie exercitat de vancomicin (tulpinile cu rezisten
intermediar la vancomicin - VISA). Aceste tulpini prezint o rezisten
ncruciat la teicoplanin. Ele au fost izolate de la pacieni care au primit multiple
tratamente cu vancomicin (Howden et al., 2006).

b. modificare genotipic, necorelat cu o presiune de selecie exercitat

de vancomicin, datorat transferului de gene de rezisten (vanA) de la
enterococii vancomicino-rezisteni (VRE) la stafilococi (tulpinile VRSA).

Metoda difuzimetric nu difereniaz tulpinile cu sensibilitate redus (CMI

4-8 g/mL) de tulpinile sensibile (CMI 0.5-2 g/mL), chiar i dac sunt incubate 24
ore, iar tulpinile de S. aureus rezistente la vancomicin (CMI 16g/mL) pot
produce doar o cretere redus n jurul discului de vancomicin.

Pe lng tulpinile VISA, au fost descrise tulpinile hVISA (heterogeneous

VISA) care par s fie sensibile la vancomicin (CMI a populaiei majoritare
2g/mL), dar care conin o subpopulaie de celule cu sensibilitate redus la
vancomicin, capabile s se dezvolte ntr-un mediu coninnd o concentraie
crescut de vancomicin i avnd CMI 4 g/mL (Howden et al., 2006;
Appelbaum, 2007).

22
 5. STAPHYLOCCUS AUREUS METICILINO-REZISTENT
Teodora Vremer , Olivia S. Dorneanu

Criteriile utilizate pentru definirea MRSA sunt, conform standardului CLSI

2010 (Clinical and Laboratory Standards Institute): prezena genei mecA i
concentraia minim inhibitorie (CMI) a oxacilinei > 4 g/mL sau CMI pentru
cefoxitin > 8g/mL. Tulpinile MRSA rezistente la 3 sau mai multe clase de
antibiotice non-betalactamice sunt definite ca multirezistente.

Apariia tulpinilor rezistente la meticilin (MRSA), semnalat pentru prima

dat n 1960, a dus la o cretere a mortalitii (tabelul 4), a duratei de spitalizare i
a costurilor pentru ngrijiri medicale, reprezentnd o important problem de
sntate public.

5.1. Epidemiologie

n anii 1970 au fost raportate primele cazuri de izbucniri epidemice ale

infeciilor cu MRSA (methicillin-resistant S. aureus) n spitalele din estul Australiei,
iar n urmtoarea decad frecvena infeciilor cu MRSA n spitale a crescut foarte
mult peste tot n lume (Llarrull et al., 2009). Rata mortalitii prin infecii cu MRSA
n SUA (2005) a fost mai mare dect n cazul HIV-infeciei (6,3/100.000), iar
incidena infeciilor invazive (31,8/100.000) a fost mai mare comparativ cu

23
infeciile determinate de S. pneumoniae, H. influenzae, N. meningitidis (Howden
et al., 2010).

Rata infeciilor cu MRSA variaz de la o ar la alta, de la 1% pn la peste

50 %. n 2008, proporia MRSA dintre izolatele de S. aureus din hemoculturi a fost
sub 5% n Danemarca, Estonia, Finlanda, Islanda, Olanda, Norvegia i Suedia. n
Austria, Luxemburg, Slovenia proporia a fost mai mic de 10%, n timp ce n alte 8
ri proporia a fost ntre 10%-24% (Belgia, Cehia, Frana, Germania, Ungaria,
Letonia, Polonia, Elveia). n alte 13 ri a fost raportat o proporie de peste 25 %
(Bulgaria, Croaia, Cipru, Grecia, Israel, Italia, Malta, Portugalia, Irlanda, Romnia,
Spania, Turcia, Marea Britanie), iar n Malta i Portugalia s-a nregistrat o proporie
de cel puin 50% (Kck et al., 2010).

n ara noastr, conform unui studiu realizat ntre anii 2004-2005 la Spitalul
de Boli Infecioase Braov de ctre Ionescu et al. (2010), 60%-72% dintre izolatele
de S. aureus din infecii invazive au fost rezistente la meticilin, cea mai mare
frecven a acestor tulpini pentru Europa. n Iai, studii realizate de Dorneanu et
al. (2006) i Constantiniu et al. (2005) au artat o prevalen a tulpinilor MRSA de
47% la pacienii din unitile spitaliceti i respectiv de 5,4% la pacienii din
ambulator.

n Europa, MRSA este o cauz major de infecii asociate ngrijirilor

medicale, fiind responsabil de 44% dintre aceste infecii (circa 150.000 de pacieni
anual), 22% decese i 41% zile suplimentare de spitalizare asociate acestor infecii,
determinnd o cretere a costurilor de spitalizare cu aproximativ 380 milioane
EUR (Kck et al., 2010).

Un factor de risc important pentru infecia cu MRSA l reprezint portajul

de tulpini MRSA, aproximativ 29% dintre persoanele colonizate dezvoltnd
ulterior infecii cu aceste tulpini (Kck et al., 2010). Cheia strategiei de meninere

24
a prevalenei MRSA la un nivel redus n rile scandinave i n Olanda a constat n
adoptarea unui program riguros de prevenie prin screening-ul la internare al
pacienilor cu risc nalt de a fi colonizai cu astfel de tulpini (Strenburg, 2009).
Supravegherea eficient a rspndirii tulpinilor MRSA depinde de rapiditatea
depistrii portajului.

Tabelul 4. Creterea riscului de mortalitate n bacteriemiile determinate de MRSA

comparativ cu bacteriemiile determinate de tulpinile sensibile la meticilin (MSSA)
(adaptat dup Kck et al., 2010)

ara, perioada Cazuri de infecii Mortalitatea Mortalitatea

cu MRSA prin MRSA prin MSSA
(Nr / %) (%) (%)

Belgia, 1992-1998 85 (44,7) 64 24

Belgia, 2002-2004 154 (43) 42 24

Marea Britanie, 1995-2000 815 (46,9) 12 5

Marea Britanie, 1997-2004 461(50) 34 27

Frana, 1997-1998 99 (30) 43 20

Germania, 1997-2002 378 (25,1) 17 6

Germania, 2002-2007 521 (13) 42 19

25
 5.2. Mecanismul de rezisten

Rezistena la meticilin a S. aureus este cauzat cel mai frecvent de

achiziia unei gene mecA, care codific sinteza unei noi proteine de legare a
penicilinei (PLP2a), concomitent cu pierderea genei mecI (sistem inhibitor al genei
mecA). Gena mecA se gsete la nivelul elementului genetic mobil SCCmec
(staphylococcal cassette chromosome mec caseta cromosomial mec), inserat
aproape de originea replicrii, la nivelul unui situs specific, numit attBscc (SCCmec
attachment site) (Noto et al., 2008). SCCmec poart n plus variate gene de
rezisten la antibiotice non-betalactamice (Hiramatsu et al., 2001).

SCCmec cuprinde dou componente eseniale:

- complexul genelor mec, care conine gena mecA ce codific rezistena
la meticilin, gene reglatorii i secvene de inserie a mecA;
- complexul genelor ccr (cassette chromosome recombinase genes), care
codific sinteza de recombinaze, responsabile pentru mobilitatea
(integrarea i excizia) SCCmec (Hiramatsu et al., 2002).

Pn n prezent au fost descrise opt tipuri majore de SCCmec (I-VIII), care

difer ca dimensiuni, compoziie genetic, tipul genelor recombinante (ccrAB sau
ccrC) i clasa mec (A, B, C1 sau C2) (Deurenberg i Stobberingh, 2008; Higuchi et al.,
2008; IWG-SCC, 2009) (figura 6). n funcie de varianta SCCmec se poate realiza
tiparea tulpinilor de S. aureus n scop epidemiologic.

Genele de reglare, mecR1 i mecI inhib transcrierea genei mecA.

Exist de asemenea 4 gene accesorii, femA, femB, femC, femD, situate la

distan de mecA, fiecare implicat ntr-o alt etap de sintez a
peptidoglicanului. Aceste gene particip la exprimarea la nivel nalt a rezistenei la

26
meticilin, expresie ce necesit sinteza corect i eficient a precursorilor
peptidoglicanului (Berger-Bchi i Rohrer, 2002; Hrlimann-Dalel et al., 1992).

Tabelul 5. Tipurile SCCmec identificate la S. aureus (dup IWG-SCC, 2009)

Complexul genei mec

Complexul
Tipul SCCmec (include gena mec, genele reglatorii i
genelor ccr
secvenele de inserie asociate)

I 1 (A1B1) B

II 2 (A2B2) A

III 3 (A3B3) A

IV 2 (A2B2) B

V 5 (C) C2

VI 4 (A4B4) B

VII 5 (C) C1

VIII 4 (A4B4) A

27
 complexul genelor mec complexul genelor ccr

Tip I (1B)
(NCTC10442)

Tip II (2A)
(N315)

Tip III (3A)

(85/2082)

Tip IV (2B)
(CA05)

Tip IV (2B&5)
(ZH47)

Tip V (5C2)
(WIS)

Tip V (5C2&5)
(TSGH17, PM1)

Tip VI (4B)
(HDE288)

Tip VII (5C1)

(JCSC6082)

Tip VIII (4A)

(C10682)

Figura 6. Tipurile SCCmec (dup IWG-SCC, 2009)

28
 5.3. E-MRSA, CA-MRSA, HA-MRSA

Pentru infecia cu MRSA exist mai multe terminologii, pentru a sublinia

proveniena tulpinii sau a puncta o anumit caracteristic epidemiologic. Astfel,
au fost descrise: infecia epidemic (epidemic MRSA, EMRSA), comunitar
(community aquired MRSA, CA-MRSA) sau spitaliceasc (hospital aquired MRSA,
HA-MRSA).

Tulpinile izolate din izbucniri epidemice i cele endemice n mediul de

spital sunt numite tulpini epidemice (EMRSA). n conformitate cu European
HARMONY MRSA typing network, definiia EMRSA este mai cuprinztoare i
include dou sau mai multe izolate identificate din dou sau mai multe spitale.
Anumite tulpini EMRSA, n special EMRSA-15 i EMRSA-16, s-au rspndit cu
precdere la nivel mondial.

Conform CDC Guidelines (2006), tulpinile sunt ncadrate drept CA-MRSA

dac sunt izolate de la pacieni nespitalizai sau n primele 48 de ore de la
internare. n plus, aceti pacieni nu trebuie s fi prezentat n ultimul an:
- infecii cu MRSA;
- spitalizare;
- dializ sau intervenii chirurgicale;
- dispozitive medicale implantate.

Tulpinile care nu ntrunesc criteriile de includere n definiia CA-MRSA sunt

clasificate drept HA-MRSA (Valsesia et al., 2010).

Dei au fost asociate mult vreme aproape exclusiv infeciilor de spital

(HA-MRSA), tulpinile meticilino-rezistente sunt tot mai des implicate n infecii
comunitare (CA-MRSA), unele cu evoluie sever, aprute la persoane sntoase,
tinere i fr factori de risc cunoscui pentru infeciile nosocomiale (Howden et al.,

29
2001). Virulena crescut a acestor tulpini a fost asociat cu sinteza unei
exotoxine, numit leucocidina Panton-Valentine (PVL) (Carleton et al., 2004).

Rspndirea rapid a tulpinilor CA-MRSA, nu doar n comunitate, ci i n

mediul spitalicesc, face necesar depistarea lor corect i n timp scurt. De
asemenea, creterea fenomenului de rezisten la antibiotice, cu riscul epuizrii
arsenalului terapeutic n viitor, impune, pe lng gsirea unor noi soluii
terapeutice i o strict monitorizare a tulpinilor de S. aureus circulante, cu
identificarea izolatelor purttoare ale unor gene de rezisten, precum i a unor
factori de virulen.

MRSA a devenit cunoscut mai ales ca agent etiologic al infeciilor

nosocomiale (HA-MRSA), reprezentnd cea mai frecvent cauz a infeciilor
cardiovasculare, respiratorii sau chirurgicale i a doua cauz de pneumonii
asociate ngrijirilor medicale i infecii sistemice (Llarrull et al., 2009).

Pn recent, descendeni ai tulpinilor HA-MRSA au reprezentat cea mai

frecvent cauz de infecii sporadice n comunitate, afectnd n principal persoane
cu istoric de spitalizare recent sau contact apropiat cu o persoan care a fost
spitalizat. La sfritul anilor 1990 au fost descrise pentru prima dat tulpinile CA-
MRSA, implicate n apariia unor infecii severe i fatale la copii fr expunere la
factori de risc asociai ngrijirilor medicale. De atunci, epidemii ale infeciilor
determinate de CA-MRSA au fost raportate n ntreaga lume (Diep i Otto, 2008).

Apariia tulpinilor comunitare de MRSA non-multirezistente, dar dotate cu

proprieti deosebite de colonizare i virulen suplimentar, precum i
rspndirea acestor tulpini n mediul spitalicesc, a dus la creterea morbiditii i
mortalitii prin infecii cu MRSA (Seybold et al., 2006). Majoritatea infeciilor
comunitare cu tulpini MRSA sunt determinate de 5 clone adaptate la diseminarea
n comunitate: Midwest/ST1, Southwest/ST30, European/ST80, Pacific/ST59,

30
USA300/ST8 (Diep i Otto, 2008). Un studiu realizat de Memmi et al. (2008) a
demonstrat c prezena genei mecA nu este singurul determinant al meticilino-
rezistenei n cazul tulpinilor CA-MRSA. Astfel, n cazul clonelor USA300 i MW2
(USA400), pierderea PLP4 a determinat reducerea de 16 ori a concentraiei
minime inhibitorii la oxacilin i nafcilin. n plus, pierderea PLP4 afecteaz
transcripia PLP2 n celule dup expunerea la oxacilin, ducnd la o reducere
semnificativ a cross-linkrii peptidoglicanului. De asemenea, studiul a artat c
cefoxitinul se leag ireversibil la PLP4, avnd efect sinergic cu oxacilina asupra CA-
MRSA. (Memmi et al., 2008).

Contientizarea pericolului MRSA este n cretere, prevalena infeciilor cu

aceste tulpini fiind tot mai mare n multe ri. MRSA este cunoscut n principal ca
un patogen nosocomial, aproximativ 85% dintre infeciile cu MRSA fiind asociate
ngrijirilor medicale (HA-MRSA).

n ultimii ani, MRSA a fost tot mai frecvent implicat n infecii comunitare
(Vandenesch et al., 2003; Davis et al., 2007). Unele studii, precum cel realizat de
Valsesia et al. (2010), remarc o infiltrare a tulpinilor comunitare n mediul de
spital, iar modele matematice prezic nlocuirea tulpinilor clasice HA-MRSA de
ctre tulpinile CA-MRSA, dotate cu proprieti deosebite de colonizare.
Rspndirea rapid a tulpinilor CA-MRSA, nu doar n comunitate, ci i n mediul
spitalicesc, impune depistarea lor rapid i corect.

ntre tulpinile CA-MRSA i HA-MRSA exist diferene semnificative n ce

privete tipul de SCCmec. Astfel, tulpinile HA-MRSA conin n mod caracteristic n
special tipurile I, II i III de SCCmec care poart gene ce confer rezisten
suplimentar la aminoglicozide, tetracicline, eritromicin, clindamicin (Moroney
et al., 2007; Kilic et al., 2006).

31
 Tulpinile CA-MRSA poart elementele SCCmec tip IV, V sau VII
(Deurenberg i Stobberingh, 2008; Carleton et al., 2004), de dimensiuni mai mici i
fr determinani adiionali ai rezistenei, fiind sensibile la celelalte clase de
antibiotice i exprim mai frecvent heterorezistena la meticilin. Aceste diferene
sugereaz c tulpinile CA-MRSA sunt distincte de cele implicate n infeciile de
spital i c au aprut independent, probabil prin transferul SCCmec la un numr
limitat de tulpini de S. aureus meticilino-sensibile (MSSA) circulante n comunitate
(Carleton et al., 2004; Okuma et al., 2002).

Au existat raportri ale infeciilor cauzate de CA-MRSA n 1982 i la

nceputul anilor 1990. Moartea a patru copii cu pneumonie necrozant i fr
factori de risc asociai ngrijirilor medicale a adus CA-MRSA n atenia lumii
medicale la sfritul anilor 90 (Said-Salim et al., 2003).

CA-MRSA difer de HA-MRSA din punct de vedere clinic, epidemiologic i

bacteriologic (Deurenberg et al., 2007; Amador-Miranda et al., 2008).

Din punct de vedere clinic, CA-MRSA determin de obicei infecii ale pielii
i ale esuturilor moi, frecvent cu formarea de abcese i furuncule (Fridkin et al.,
2005). Totui, n aproximativ 5% din cazuri, poate determina afeciuni severe ce
pot pune n pericol viaa pacienilor, precum: pneumonie necrozant,
osteomielit, abcese renale i pulmonare, fasciit necrozant, endocardit, artrit
septic, bacteriemii, oc septic (Amador-Miranda et al., 2008; John i Schreiber,
2006; Gillet et al., 2002).

Spre deosebire de pacienii cu infecii determinate de HA-MRSA, pacienii

infectai cu CA-MRSA nu au factori de risc asociai ngrijirilor medicale (precum
spitalizare recent, intervenii chirurgicale, terapie cu antibiotice, dispozitive
implantate, etc.) i sunt mai tineri, frecvent copii. Au fost raportate izbucniri ale
unor infecii cu CA-MRSA la deinui, militari, sportivi, homosexuali, consumatorii

32
de droguri intravenoase (Eveillard et al., 2002; Kluytmans-Vandenbergh i
Kluytmans, 2006).

Din punct de vedere bacteriologic, tulpinile CA-MRSA difer de tulpinile

nosocomiale prin prezena unor profiluri de sensibilitate la antibiotice diferite,
fiind, n general, sensibile la majoritatea claselor de antibiotice, altele dect cele
beta-lactamice, ct i prin prezena unor factori de virulen i exotoxine. Un
studiu efectuat de Kim et al. (2006) a artat c diferite subtipuri SCCmec asociaz
anumite profiluri de virulen i c tulpinile MRSA poart mai frecvent, comparativ
cu tulpinile sensibile la meticilin, gene ce codific sinteza unor toxine (85,5%
versus 53,8%). Unele studii au sugerat c anumite tulpini de CA-MRSA ar putea fi
mai virulente dect HA-MRSA (Said-Salim et al., 2003; Boyle-Vavra i Daum, 2007).

O varietate de metode moleculare au fost dezvoltate pentru tiparea

tulpinilor de stafilococi n scop epidemiologic, fcnd posibil diferenierea ntre
tulpinile de provenien spitaliceasc, de cele comunitare. Aceste metode includ:
- PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis - electroforeza n cmp pulsator)
(Ostoji, 2008);

- PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length

Polymorphism), metod de caracterizare genotipic bazat pe reacia
de amplificare genic PCR, urmat de digestia cu endonucleaze de
restricie i analiza polimorfismului lungimii fragmentelor de restricie
(Buiuc i Negu, 2008);

- MLST (Multi Locus Sequence Typing) i SLST (Single Locus Sequence

Typing), metode de ultim generaie care realizeaz analiza mutaiilor
situs-specifice ale secvenelor ADN (single sau multilocus) (Deurenberg
i Stobberingh, 2009; Deurenberg et al., 2007).

33
 5.4. Metode de detectare a rezistenei la meticilin

A. Metode fenotipice

Depistarea fenotipurilor de rezisten ale S. aureus fa de penicilinele

rezistente la penicilinaz este influenat de condiiile testrii. Astfel, la 37 C
stafilococii cu fenotipul clasic de rezisten cresc mai lent dect stafilococii
sensibili, dar diferena devine nesemnificativ n culturile incubate la temperaturi
mai joase (35C sau 30C) (Buiuc i Negu, 2008).

Antibioticul de testare pentru depistarea rezistenei fa de penicilinele

rezistente la beta-lactamaze trebuie ales corect. Dintre penicilinele
penicilinazo-rezistente, oxacilina (1 g/disc) este preferat pentru stabilitatea ei i
reproductibilitatea rezultatelor. Din anul 2005 este recomandat detectarea
MRSA prin testul difuzimetric la cefoxitin (30 g/disc), care s-a dovedit mult mai
fiabil dect testarea folosind discul de 1g oxacilin (Buiuc i Negu, 2008).

Rezistena la meticilin poate s fie omogen (nivel ridicat), manifest la

ntreaga populaie testat, sau heterogen (nivel sczut), manifest numai la 10 -4
pn la 10-8 din organismele populaiei testate. Pentru izolatele clinice de MRSA,
rezistena intrinsec la beta-lactamice este frecvent heterogen. Testele uzuale
depisteaz corect tulpinile de S. aureus cu expresie omogen a rezistenei clasice,
dar pot s nu detecteze tulpinile heterorezistente. n cazul acestor tulpini,
rezistena de nivel nalt este exprimat de o minoritate de bacterii pe medii
obinuite la 37C, dar de o manier uniform pe medii hipertone i la 35 C.

Cercetarea rezistenei heterogene se poate face prin metoda difuzimetric,

folosind discul de 1 g oxacilin sau discul de 30 g cefoxitin, cu incubare 24 ore la
35C. Heterorezistena se manifest prin reducerea diametrului zonei de inhibiie
sau prin apariia unui film de cretere sau a unor colonii cu dimensiuni progresiv

34
reduse n zona de inhibiie. O alt metod, de referin, care permite testarea mai
multor tulpini pe o singur plac, este metoda plcii de triaj. Se folosesc medii
agarizate adiionate cu 4% NaCl i 6 mg/L oxacilin, nsmnate n spot i
incubate 24 ore la 35C. Sunt depistate astfel, tulpinile cu fenotipul clasic de
rezisten (mec pozitive), ns tulpinile cu rezisten intermediar nu cresc pe
placa de triaj (Buiuc i Negu, 2008).

Identificarea altor fenotipuri de rezisten la oxacilin/meticilin este

necesar atunci cnd tulpina testat nu crete pe placa de triaj, dar alte metode
de testare indic rezisten la oxacilin. Se poate face prin testarea tulpinii fa de
oxacilin asociat cu un inhibitor de beta-lactamaz: dac tulpina rmne
rezistent, atunci aparine fenotipului MOD-SA, dar dac apare sensibil prin
asocierea inhibitorului de beta-lactamaz, atunci aparine fenotipului inactivator
prin exces de beta-lactamaz (Buiuc i Negu, 2008).

Alte metode fenotipice de detecie a meticilino-rezistenei includ:

- determinarea CMI (concentraia minim inhibitorie) pentru oxacilin
folosind benzi E-test (AB Biodisk). E-test combin acurateea testelor
cantitative cu simplitatea metodei difuzimetrice (figurile 39-41). Acest
test utilizeaz un gradient continuu de concentraii ale antibioticului,
astfel nct valorile CMI obinute sunt mai precise dect n cazul folosirii
metodelor convenionale de determinare a CMI (metoda diluiilor n
bulion i metoda diluiilor n mediu solid);
- sistemul automat Vitek 2 (bioMrieux);
- test screening de latex-aglutinare pentru MRSA, care detecteaz rapid,
cu sensibilitate i specificitate mare, prezena PLP2a (produsul genei
mecA) (van Griethuysen et al, 1999).

35
 Conform normelor CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute),
testarea sensibilitii S. aureus la penicilin i oxacilin este suficient pentru a
preciza sensibilitatea sau rezistena pentru o clas larg de antibiotice beta-
lactamice i nu este indicat testarea altor peniciline, a asocierii antibiotice beta-
lactamice cu inhibitori de beta-lactamaze, cefeme, carbapeneme.

B. Metode genotipice

Metodele genotipice de detecie a genei mecA sunt folosite mpreun cu

metodele de evideniere a PLP2a drept teste standard de confirmare pentru
MRSA n cazul infeciilor stafilococice severe (Felten et al., 2002; Miller et al.,
2005; Reygaert, 2009).

Metodele moleculare, dei costisitoare, ofer un rspuns clar pentru

prezena sau absena genei mecA, iar prin rapiditatea rezultatelor, permit o
evaluare precoce a terapiei, reprezentnd o alternativ din ce n ce mai mult
utilizat pentru identificarea i caracterizarea tulpinilor de S. aureus, ct i pentru
diferenierea acestor tulpini n scop epidemiologic (Fluit et al., 2001).

Datorit importanei depistrii rezistenei la meticilin, au fost propuse

variate metode ce se concentreaz pe amplificarea genei mecA, fie singur, fie n
multiplex PCR. Utilizarea multiplex PCR a permis detectarea rapid a tulpinilor
MRSA n prelevat, uneori n combinaie cu identificarea altor markeri de rezisten
la antibiotice i a unor gene ce codific sinteza unor factori de patogenitate (e.g.,
leucocidina Panton-Valentine) (Al-Talib et al., 2009). Metodele genetice de
detecie a MRSA se bazeaz n general pe amplificarea a dou inte: o gen
ntlnit numai la aceast specie, util pentru identificarea S. aureus (e.g., gena
nuc, pentru endonucleaza termostabil) i gena mecA ce codific PLP2a (Huletsky
et al., 2004). Folosirea reaciei de amplificare genic n timp real (RT-PCR, real-

36
time polymerase chain reaction) a dus la o mbuntire semnificativ a utilizrii
PCR n detecia MRSA, iar n combinaie cu detectarea genelor pvl, furnizeaz
informaii importante din punct de vedere epidemiologic (McDonald et al., 2005;
Adams, 2005; Renwick et al., 2008; Ornskov et al., 2008).

Metodele moleculare, dei costisitoare, ofer un rspuns clar pentru

prezena sau absena genei mecA, iar prin rapiditatea rezultatelor, permit o
evaluare precoce a terapiei, reprezentnd o alternativ din ce n ce mai mult
utilizat pentru identificarea i caracterizarea tulpinilor de S. aureus, ct i pentru
diferenierea acestor tulpini n scop epidemiologic (Fluit et al., 2001).

37
 6. LEUCOCIDINA PANTON-VALENTINE
Olivia S. Dorneanu, Teodora Vremer

Patogenitatea S. aureus este legat de sinteza unei mari varieti de factori

de virulen care-i permit s colonizeze, s invadeze i s eludeze sistemul imun.
Aceti factori includ leucocidina Panton-Valentine (PVL), o citotoxin descris
pentru prima dat n 1894 de ctre Van de Velde, cnd a fost asociat cu infeciile
prilor moi.

Expresia leucocidinei Panton-Valentine (PVL), o exotoxin citolitic, a fost

puternic asociat cu CA-MRSA, fiind prezent n special la tulpinile izolate din
leziuni dermonecrotice (Deurenberg i Stobberingh, 2008; Tristan et al., 2007).
Genele care codific PVL au fost depistate mai frecvent la tulpinile MRSA izolate
din infecii comunitare i mai rar la tulpinile responsabile de infecii nosocomiale
(Vandenesch et al., 2003; Prevost et al., 1995).

Toxina PVL este compus din 2 proteine care acioneaz sinergic, LukS-PVL
i LukF-PVL, codificate de genele fagice lukF-PV i lukS-PV (Gravet, 1998; Said-
Salim, 2005), componente ale fagilor SLT, PVL, SA2MW, SA2usa, care se pot
rspndi de la o tulpin la alta prin intermediul bacteriofagilor (Diep i Otto, 2008;
David i Daum, 2010). Aceast toxin are drept int celulele polimorfonucleare,
determinnd formarea de pori la nivelul membranei citoplasmatice i lizozomale,

38
ceea ce duce la degranularea citoplasmei i liz celular n final (Boyle-Vavra,
2007).

Capilar

Interstiiu
Hematie
ALVEOLA NORMAL Strat de
Celul
surfactant
endotelial
Macrofag Membrana
Umezirea Spaiu aerian alveolar bazal
LEZIUNE PULMONAR epiteliului bronic alveolar Membran
epitelial
ACUT INDUS DE PVL bazal
endotelial
Lichid de edem
Celul de tip II
bogat n proteine
Necroza
PMN Celul de tip I
Celul de tip I
necrotic sau apoptotic Proteaze

Oxidani
Interstiiu lrgit,
edemaiat PMN
Fibrin activat

Scurgere de Formarea
PMN chemokine unei bree
migratoare n snge
Celul endotelial
necrotic sau apoptotic

Figura 7. Mecanismul lezrii acute pulmonare i al inflamaiei pulmonare induse de PVL.

Sgeile negre indic evenimente observate. (adaptat dup Diep et al., 2010)

Se crede c PVL joac un rol cheie n patogeneza pneumoniei necrozante,

dar datele pe model experimental murin sunt neconcludente. PMN-urile
roztoarelor sunt mai puin sensibile dect cele umane la citoliza indus de PVL, n
timp ce cele ale iepurilor, asemntor celor umane, sunt foarte sensibile la citoliza
indus de PVL. Aceast diferen n sensibilitatea celulelor int poate afecta
rezultatele n diverse modele experimentale. La iepure, PVL mediaz necroza
pulmonar sever, edem pulmonar, hemoragie alveolar, hemoptizie i moarte
(figura 7), trsturi clinice tipice n pneumonia necrozant uman fatal (Diep et
al., 2010).
39
 PVL induce activare rapid i moarte celular a neutrofilelor umane sau de
iepure, dar nu i a celor murine sau simiene. Din contra, modulinele fenol-solubile
(PSM), un grup de componente stafilococice citolitice recent identificat, nu au
specificitate de specie. n general, dup fagocitoza bacteriilor, diferite tulpini de
stafilococi, att PVL-pozitive, ct i PVL-negative, exprimnd o varietate de ali
factori de virulen (cum ar fi proteine de suprafa) au indus moarte celular n
neutrofile. Totui, eliberarea PVL de ctre stafilococi a cauzat moarte celular
rapid i prematur, diferit de moartea fiziologic (i programat) a PMN dup
fagocitoza i degradarea bacteriilor virulente (Leffler et al., 2010).

S-a crezut c genele care codific PVL, care se pot rspndi de la o tulpin
la alta prin bacteriofagi, sunt prezente la mai puin de 5% din izolatele de S. aureus
(Lina et al., 1999). n SUA, dup mijlocul anilor 1990, portajul de gene PVL a fost
strns corelat cu infecii produse de CA-MRSA n numeroase studii
epidemiologice. Aproximativ 60-100% din tulpinile CA-MRSA (dup diverse
definiii) poart genele PVL (Diep et al., 2004).

Au fost identificate tulpini PVL-pozitive care poart SCCmec tip IV, V sau VT
(Boyle-Vavra et al., 2005) aparinnd unor diferite genotipuri, n numeroase zone
geografice, dei locusul cromozomal de integrare a genelor PVL nu prezint nici o
legtur genetic cu locul de inserie al elementelor SCCmec. Mai mult, nici o alt
gen ce codific o toxin a S. aureus nu a fost att de puternic asociat cu CA-
MRSA ca i PVL (Vandenesch et al., 2003). Genele PVL se gsesc rareori la tulpini
MRSA ce poart SCCmec tip I, II sau III.

Genele PVL sunt mai frecvente printre izolatele de S. aureus care produc
infecii clinice manifeste dect printre izolatele care produc colonizare
asimptomatic, dei datele din literatur sunt contradictorii (Zhang et al., 2008).

40
Prevalena genelor PVL este mai redus la izolatele MSSA dect la izolatele MRSA
de colonizare sau izolate din infecii (Baggett et al., 2004).

Sinteza acestei toxine are rol n producerea infeciilor de pri moi,

pneumonia necrozant, infecii osoase i articulare. Infeciile determinate de
tulpinile productoare de PVL se caracterizeaz printr-un rspuns inflamator
sistemic mai important, un risc mai mare de complicaii la copiii cu osteomielit, o
severitate mai mare a leziunilor localizate i scderea ratei de supravieuire la
pacienii cu pneumonie comunitar, comparativ cu infeciile determinate de
tulpini neproductoare de PVL (Bocchini et al., 2006; Muttaiyah et al., 2010).
Sinteza PVL a fost asociat cu tulpinile comunitare de MRSA care afecteaz n
principal indivizi tineri, sntoi, fr expunere la factori de risc asociai infeciilor
de spital (Holmes et al., 2005). Dei PVL a fost depistat i la tulpini CA-MRSA care
determin mbolnviri sporadice, precum i la tulpini MSSA, toxina a fost asociat
epidemiologic numai cu cele 5 clone predominante, responsabile de izbucniri
epidemice. n contrast, SCCmec IV este prezent nu numai la cele 5 clone
predominante, ci i la majoritatea tulpinilor care determin mbolnviri sporadice
(Diep i Otto, 2008).

41
 7. SENSIBILITATEA REDUS LA GLICOPEPTIDE A
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Olivia S. Dorneanu

Datorit numrului mare de infecii produse de MRSA, vancomicina i

teicoplanina au devenit antibiotice de elecie pentru tratamentul infeciilor
stafilococice nosocomiale (Jarvis, 1998). Rezistena dobndit la vancomicin i
teicoplanin a fost raportat pentru prima dat la enterococi, n 1989 i, dei
enterococii rezisteni la vancomicin i MRSA mpart o ni ecologic similar, iar
transferul genei de rezisten ntre aceste specii a fost demonstrat in vitro, primul
caz de MRSA rezistent la vancomicin (vancomycin-resistant S. aureus, VRSA) a
fost raportat abia n 2002 (CDC, 2002). Totui, n 1997, un izolat clinic de MRSA cu
sensibilitate redus la vancomicin a fost raportat n Japonia (Hiramatsu et al.,
1997). Aceste izolate, denumite uzual S. aureus intermediar la vancomicin
(vancomycin-intermediate S. aureus, VISA), au cauzat nenumrate dezbateri ntre
microbiologi, att din punct de vedere al semnificaiei lor clinice, ct i al deteciei
lor n laborator (Howe i Walsh, 2004).

n prezena presiunii selective, tulpinile de S. aureus sensibile la

vancomicin (VSSA) sunt capabile s-i modifice peretele celular i s devin mai
puin sensibile la vancomicin. Aceste izolate de S. aureus intermediare la
vancomicin (VISA) sunt definite printr-o concentraie minim inhibitorie (CMI)

42
detectat prin metoda microdiluiilor n bulion de 4-8 g/mL i poate avea ca
intermediar un fenotip precursor cunoscut ca S. aureus heterorezistent
intermediar la vancomicin (hVISA). Dei definiia precis este disputat,
heterorezistena se refer la prezena unei subpopulaii rezistente (n mod tipic cu
o frecven de 10-5 pn la 10-6 UFC) ntr-un izolat n totalitate sensibil (CMI = 2
g/mL prin metoda microdiluiilor n bulion) (van Hal i Paterson, 2011).

7.1. Definiii

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) a definit punctele de

ruptur pentru S. aureus pentru vancomicin n urm cu peste 20 ani. Evoluia
acestora pn n prezent poate fi urmrit n tabelul 6. Noile puncte de ruptur
EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) (2009) nu
mai includ categoria VISA.

Tabelul 6. Terminologia pentru tulpini de S. aureus cu sensibilitate redus la vancomicin

(adaptat dup Howden et al., 2010)

Clasificare Microdiluii n bulion (g/ml)

(sensibilitate la CLSI nainte de 2006 CLSI dup 2006 EUCAST
glicopeptide)
Sensibil (VSSA) 4 2 2
Intermediar (VISA) 8-16 4-8 -
Rezistent (VRSA) 32 16 4

S. aureus cu sensibilitate redus la vancomicin este definit prin una din

urmtoarele:
- CMI (concentraia minim inhibitorie) 4 g/ml (Fridkin et al., 2003);

43
 - aria de sub curba (AUC) omorre funcie de concentraia vancomicinei
0,9 din AUC a tulpinii tip Mu3 (Howden et al., 2004).

VISA heterorezistent (heterogenous vancomycin-intermediate S. aureus,

hVISA) este definit prin una din urmtoarele:
- tulpini VSSA care prin subcultivare produc n mod constant subcolonii
cu CMI n gama VISA/VRSA cu o frecven de 1x106 dup profilul de
analiz al populaiei (PAP) (Hiramatsu et al., 1997);
- raport AUC de 0,9 din AUC a tulpinii tip Mu3, menionat ca PAP/AUC
(Horne et al., 2009);
- Etest modificat cu inoculum mare cu citire la 48 ore (Maor et al., 2009).

7.2. Modificri fenotipice i mecanisme de rezisten

Tulpinile hVISA par a fi precursori ai tulpinilor VISA i evolueaz spre

rezisten omogen (VISA) dup expunere la antibiotice cu aciune la nivelul
peretelui celular (Boyle Vavra et al., 2001).

La sfritul anilor 1990, Sieradzki i Tomasz (1997) sugerau c alterrile

aparute n structura peretelui celular inhib accesul vancomicinei ctre situsul su
activ la o tulpin indus n laborator, cu CMI la vancomicin de 100 g/ml. n
ultimii ani a aprut un model de mecanism de rezisten pentru hVISA i VISA, n
care VISA apare prin mutaii secveniale din VSSA, hVISA fiind un intermediar ntre
VSSA i VISA. Un turnover celular redus i o activitate autolitic redus, iar n unele
cazuri sinteza activat a peretelui celular, duc la ngroarea peretelui celular i
accesul redus al vancomicinei la situsul su activ care este localizat n septul de
diviziune.

44
 Difuziune
Rat mare de
difuziune a redus a
vancomicinei vancomicinei
prin septul de prin septul de
diviziune diviziune

Molecula de vancomicin Muropeptid al peptidoglicanului Precursor de

coninnd resturi libere de D-alanil-D- peptidoglican
alanin legat de lipid

Figura 8. Model prezentnd situsul activ al vancomicinei n septul de diviziune i

modificrile asociate cu fenotipul VISA. La celulele VISA, rata de difuziune a vancomicinei
ctre vrful septului de diviziune este sczut, micornd concentraia activ de antibiotic
care ajunge la precursorul lipid II la nivelul situsului de sintez a peretelui celular
(adaptat dup Howden et al., 2010)

Alte modificri comune la nivelul peretelui celular includ: producia

crescut de muropeptide anormale (Sieradzki i Tomasz, 1999), producia crescut
de PBP2 i PB2a (Hanaki et al., 1998), reducerea nivelului de PBP4 (Sieradzki i
Tomasz, 1999), creterea nivelului de reziduuri D-Ala-D-Ala i reducerea
legturilor ncruciate la nivelul peptidoglicanului (Sieradzki i Tomasz, 1997).

45
 Analiza modificrilor metabolice la VISA a demonstrat un catabolism redus
al acetatului. Acesta poate duce la modificarea caracteristicilor de cretere,
toleran la antibiotice, modificri n moartea celular i sinteza crescut de
adezin polizaharidic intercelular (Nelson et al., 2007).

Un numr de studii au demonstrat absena genelor de rezisten la

vancomicin vanA, vanB i vanC1 pn la vanC3 la tulpini hVISA i VISA (Howden
et al., 2006).

7.3. Epidemiologie

Primele raportri ale unor izolate clinice de S. aureus cu sensibilitate

redus la teicoplanin i emergena rezistenei in vivo n cursul terapiei cu
teicoplanin au fost fcute n Europa, la nceputul anilor 1990, dei aceste tulpini
au rmas sensibile la vancomicin (Mainardi et al., 1995). n 1997, tulpini de S.
aureus cu sensibilitate redus la vancomicin au fost raportate n Japonia. Acestea
includ o tulpin cu CMI la vancomicin de 8 g/ml (tulpina Mu50, VISA, ATCC
700699) izolat dintr-o infecie de plag operatorie la un sugar de 4 luni care a
suferit chirurgie cardiac, iar administrarea de vancomicin a fost nsoit de eec
terapeutic (Hiramatsu et al., 1997) i o tulpin cu CMI la vancomicin de 4 g/ml,
cu subpopulaii cu CMI mai mare la o rat mai mare de 1 la 10 6 celule (tulpina
Mu3, hVISA, ATCC 700698). Mu3 a fost izolat n 1997 din sputa unui pacient de
64 de ani cu pneumonie cu MRSA i cu eec terapeutic la vancomicin (Hiramatsu
et al., 1997).

O dificultate n aprecierea corect a frecvenei hVISA i VISA este lipsa

unor criterii standardizate n definirea hVISA i utilizarea unor metodologii diferite
pentru detectarea VISA. Spre exemplu, Hiramatsu et al. (2007) au detectat
fenotipul hVISA la pn la 20% din izolatele MRSA din spitalul lor, dar un alt

46
studiu, mai recent, din Japonia nu a detectat nici o tulpin hVISA n 6625 tulpini
testate (Arakawa et al., 2004).

Tulpini de S. aureus (predominant MRSA) cu fenotip hVISA sau VISA au fost

ulterior raportate n multe ri, inclusiv SUA, Japonia, Australia, Frana, Scoia,
Brazilia, Coreea de Sud, Hong Kong, Africa de Sud, Tailanda, Israel i alii (Howden
et al., 2010). Prevalena global a hVISA, rezultat din toate studiile dintre anii
2006-2010, rmne sczut, aproximativ 1,3% din izolatele MRSA testate (van Hal
i Paterson, 2011).

7.4. Semnificaie clinic

Comparativ cu infeciile VSSA, persistena hVISA nu a dus la mai multe

complicaii metastatice (Musta et al., 2009). O cretere semnificativ a duratei
medii de spitalizare la pacieni cu infecii hVISA a fost documentat n studiul lui
Fong et al. (2009). Mai multe studii au documentat o mortalitate mai mare
asociat cu MRSA sensibile la vancomicin, dar cu CMI mai mari (n general ntre
1,5-2 g/ml) (Soriano et al., 2008).

Cum tulpinile hVISA sunt asociate cu parametri cunoscui a influena

mortalitatea (i.e., infecii cu inoculum mare, bacteriemie persistent, CMI la
vancomicin mari), ne-am putea atepta la o mortalitate mai crescut comparativ
cu VSSA. Totui, niciun studiu nu a putut detecta o astfel de diferen. Rata
mortalitii la 30 zile a fost similar pentru cele 2 categorii de infecii (van Hal i
Paterson, 2011).

47
 7.5. Detectarea sensibilitii reduse la vancomicin

Deoarece determinanii genetici ai hVISA i VISA nu au fost nc elucidai

complet, momentan nu exist nici o metod molecular pentru detectarea
acestora. Pe de alt parte, doar valoarea CMI a vancomicinei nu poate distinge
hVISA de VSSA i utilizarea doar a acestei testri nu va detecta hVISA care sunt
relativ frecvente printre izolatele de S. aureus cu CMI de 2 g/ml.

Morfologia coloniilor de VISA i hVISA poate diferi de cea a coloniilor

standard, e.g., o reducere a pigmentrii sau a dimensiunilor coloniilor. De aceea
este important a testa pentru sensibilitatea la vancomicin fiecare morfotip dintr-
o cultur mixt (Howden et al., 2010).

Detectarea hVISA este problematic deoarece platformele comerciale de

testare a sensibilitii la antibiotice utilizeaz un inoculum mai slab dect cel
necesar. n consecin, au fost puse la punct mai multe metode de triaj i de
detecie care utilizeaz un inoculum mai mare i stimuleaz creterea
subpopulaiilor rezistente. Totui, unele din aceste metode pot selecta
subpopulaii rezistente in vitro mai degrab dect s detecteze prezena in vivo a
heterorezistenei (Walsh et al., 2001).

Metoda cea mai acurat i reproductibil este profilul de analiz

populaional (PAP) - aria de sub curb (AUC), care traseaz grafic numrul de
bacterii viabile/concentraia vancomicinei. Un raport AUC a tulpinii de testat/ AUC
a tulpinii de referin Mu3 0,9 confirm un izolat hVISA. Utilizarea PAP-AUC este
limitat deoarece este scump, laborioas i consumatoare de timp.

48
Teste de triaj pentru detectarea hVISA sunt:
- CMI vancomicin n bulion (sensibilitate 11%, specificitate 100%);
- agar infuzie cord-creier cu 6 g/ml vancomicin, inoculum de 0,5
McFarland i incubare 48 ore (sensibilitate 4,5-12%, specificitate 68-
100%);
- agar Mueller-Hinton cu 5 g/ml teicoplanin, inoculum de 2 McFarland
i incubare 48 ore (sensibilitate 65-98%, specificitate 35-95%);
- agar Mueller-Hinton cu 5 g/ml vancomicin, inoculum de 0,5
McFarland i incubare 48 ore (sensibilitate 1-20%, specificitate 59-99%);
- PAP simplificat (agar infuzie cord-creier cu 4 g/ml vancomicin,
inoculum de 0,5 McFarland i citire la 48 ore) (sensibilitate 71%,
specificitate 88%);
- macrometoda Etest (agar infuzie cord-creier, inoculum 2 McFarland,
incubare 48 ore) (sensibilitate 69-98,5%, specificitate 89-94%);
- Etest GRD (glicopeptide resistance detection) agar Mueller-Hinton cu
5% snge de berbec sau de cal, inoculum 0,5 McFarland:
citire la 24 ore: sensibilitate 70-77%, specificitate 98-100%;
citire la 48 ore: sensibilitate 93-94%, specificitate 82-95%
(Howden et al., 2010).

49
 8. DETECTAREA GENELOR nuc, mecA, pvl LA IZOLATE CLINICE
DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Teodora Vremer , Olivia S. Dorneanu

8.1. PCR, multiplex PCR, real time PCR

Reacia de amplificare genic PCR (polymerase chain reaction), descoperit

n 1983 de Kary Mullis (Premiul Nobel n 1993) este o tehnic prin care se
genereaz multiple copii identice ale unei secvene nucleotidice int dintr-o gen
de interes, fiecare secven nucleotidic nou sintetizat constituind o matri
pentru o noua copie (Kubista et al., 2006).

Metodele PCR convenionale realizeaz detecia ampliconilor la sfritul

amplificrii (detecie end-point). n ultimii ani, tehnologia PCR a fost mbuntit
prin apariia metodelor de detecie n timp real (real-time PCR). Metoda RT-PCR
este capabil s detecteze produii de amplificare odat cu formarea i
acumularea acestora (Kubista et al., 2006).

Pentru ca amplificarea s aib loc, sunt necesare urmtoarele elemente:

- ADN matri;
- enzima termostabil care realizeaz sinteza unei noi catene de acid
nucleic (ADN polimeraza Taq, izolat din Thermophilus aquaticus);

50
 - primeri forward i reverse: sunt secvene oligonucleotidice
complementare cu capetele fragmentului de amplificat; ei servesc drept punct de
plecare pentru sinteza ADN de ctre enzim, marcnd inceputul i sfritul regiunii
care trebuie s fie amplificat;
- cationi divaleni (Mg2+ i/sau Mn2+) cu rol n catalizarea reaciei
enzimatice;
- cationi monovaleni (K+), importani pentru randamentul reaciei;
- deoxinucleotidele (dATP, dGTP, dCTP i dUTP): folosite pentru sinteza
lanului complementar de acid nucleic;
- soluie tampon cu rol de mediu de reacie, necesar pentru meninerea
unui pH de 8,3-8,8, la temperatura ambiant (Buiuc i Negu, 2008).

Un ciclu PCR cuprinde urmtoarele etape:

- predenaturare: etap iniial, necesar pentru activarea ADN-polimerazei
atunci cnd se utilizeaz tehnologia Hot-start; const n nczirea la 94-96C timp
de 1-9 minute;
- denaturarea: const n nclzirea amestecului de reacie la 92-96C, cu
desfacerea legturilor de H i separarea ADN-ului int n 2 catene;
- hibridizarea sau alinierea primerilor la molecula de ADN matri: const n
scderea temperaturii la 55-70C, cu ataarea primerilor la matria ADN
monocatenar; n general, temperatura de aliniere este cu 3-5C mai mic dect
temperatura de denaturare (Tm) a primerilor folosii.
- elongarea sau extensia primerilor: const n sinteza unui nou lan de ADN
pe baza complementaritii cu ADN matri. Temperatura folosit n aceast etap
depinde de tipul polimerazei utilizate; pentru Taq polimeraza, temperatura
optim la care enzima recunoate captul 3 al primerilor i ncepe elongarea lor
este de 72C (Lawyer et al., 1993, Buiuc i Negu, 2008).

Procesul global de amplificare cuprinde 3 faze:

51
 - faza exponenial: are loc dublarea cantitii de ADN;
- faza linear: are loc o ncetinire a reaciei pe msur ce reactivii din
amestecul de reacie sunt consumai;
- faza de platou (end-point): reacia este oprit, fr formarea unor noi
produi de amplificare; oprirea reaciei este cauzat de epuizarea componentelor
reaciei i de inhibiia prin cantitatea mare de ADN.

n cadrul unei reacii multiplex PCR sunt amplificate simultan dou sau mai
multe inte ADN ntr-un singur tub de reacie (Persson et al., 2005). Metoda
genereaz mult mai mult informaie, ntr-un timp mai scurt i la un cost mai
redus dect amplificrile PCR unice (singleplex).

Avantajele utilizrii multiplex PCR:

- multiplex PCR ofer informaii despre mai multe gene pornind de la
aceeai cantitate de prob;
- reacia se desfoar cu economie de timp, reactivi i efort;
- detecia mai multor inte se realizeaz n condiii identice de reacie, cu
avantajul eliminrii diferenelor de pipetare ntre inte.

Dezavantajele multiplex PCR:

- prezena mai multor perechi de primeri n acelai mediu de reacie crete
riscul amplificrilor nespecifice i apariia dimerilor de primeri;
- optimizarea este dificil de realizat i costisitoare.

Pentru desfurarea reaciei sunt necesare:

- dou sau mai multe perechi de primeri;
- n cazul RT-PCR pot fi necesare sonde marcate diferit pentru fiecare in;
- instrument capabil s detecteze toate intele.

Particularitile folosirii tehnicii multiplex RT-PCR:

52
 - se pot folosi pn la 8 perechi de primeri simultan n aceeai reacie
(Buiuc i Negu, 2008);
- este posibil cuantificarea acizilor nucleici prezeni n prob;
- nu este necesar procesarea post-PCR, ca n cazul PCR convenional care
presupune migrarea produilor de amplificare n gel de agaroz i vizulalizarea n
UV;
- detecia se realizeaz rapid.

Metoda Real-Time PCR (RT-PCR) prezint urmtoarele avantaje fa de

metoda convenional:
- detecia se realizeaz n faza exponenial a amplificrii, cnd se produce
o dublare a cantitii de ampliconi la fiecare ciclu iar rezultatele se coreleaz mai
bine cu nivelul iniial al intei;
- se pot detecta cantiti mai mici ale ADN-ului int.

Monitorizarea acumulrii produilor de reacie odat cu desfurarea

amplificrii se face prin nregistrarea emisiei fluorescente a unor substane
speciale aflate n mediul de reacie. ntre semnalul fluorescent i cantitatea de
ampliconi formai exist o relaie de proporionalitate direct, ambele crescnd
odat cu numrul de cicluri de amplificare (Kubista et al., 2006).

Exist mai multe tipuri de sisteme care pot fi utilizate pentru monitorizarea
amplificrii:
- sisteme care utilizeaz substane de intercalare: SYBR Green, un colorant
care se leag doar la ADN-ul dublu catenar i al crui semnal fluorescent se
intensific doar dup legarea la ADNdc. n cursul PCR, pe msur ce noi produi de
amplificare se formeaz, intensitatea emisiei fluorescente crete;
- sisteme care utilizeaz sonde sau primeri marcai cu fluorocromi (e.g.
sonde TaqMan);

53
 - sistemele mai puin utilizate includ: Molecular Beacons, utilizarea
sondelor Scorpion i utilizarea primerilor LUX .

Sondele oligonucleotidice sunt marcate cu doi fluorocromi care formeaz o

pereche donor-acceptor: primul fluorocrom (reporter), n stare excitat, transfer
energia sa celui de-al doilea, care suprim astfel activitatea fluorescent a
donorului, fiind denumit represor (quencher). Molecula represoare poate fi
fluorescent (fluorescent quencer), disipnd energia primit sub form de lumin,
sau nefluorescent (dark quencher) (Sisea i Pamfil, 2009).

Utilizarea sondelor de hidroliz, numite i TaqMan se bazeaz pe

capacitatea ADN polimerazei Taq de a dezintegra, n timpul extensiei, orice
segment oligonucleotidic alipit moleculei matri. Sondele de hidroliz au lungimi
de 20-30 baze i temperaturi de alipire cu aproximativ 10C mai mari dect
primerii. Fluorocromul reporter este ataat captului 5, iar cel represor la captul
3. Ct timp sonda este intact, apropierea reporterului fa de represor
determin trasferul de energie ntre cele dou molecule i suprimarea emisiei
fluorescente a reporterului (Sisea i Pamfil, 2009).

n cursul reaciei de amplificare, sonda este fixat ntre siturile

complementare primerilor. n cursul extensiei primerilor, ADN polimeraza Taq se
deplaseaz de-a lungul moleculei matri, sintetiznd noua caten i hidrolizeaz
sonda TaqMan (figura 9). Degradarea sondei TaqMan ntrerupe transferul energiei
de la reporter la represor, iar semnalul fluorescent poate fi nregistrat. Degradarea
unor noi sonde n ciclurile succesive ale reaciei PCR determin creterea
intensitii semnalului fluorescent, indicnd acumularea produilor PCR (Sisea i
Pamfil, 2009).

54
 Figura 9. Reprezentarea schematic a RT-PCR utiliznd sonde TaqMan
(adaptat dup Mocellin et al., 2003)

Deoarece semnalul reporterului apare doar dac primerii PCR i sonda

TaqMan se alipesc secvenei int, specificitatea acestui sistem este semnificativ
mai mare dect a sistemelor PCR clasice sau a sistemelor real-time PCR care
utilizeaz SYBR Green.

55
 8.2. Extracia ADN folosind coloane de legare a ADN (column based)

8.2.1. Principiu

Aceast tehnic folosete procedura liz-legare-splare-eluare (figura 10).

- liza bacteriilor n soluii cu sruri

chaotropice;

- legarea ADN-ului la membrana de

silica n prezena unor concentraii
crescute de sruri chaotropice, pH
sczut i alcool, dup centrifugare;

- splare, pentru ndeprtarea

contaminanilor;

- eluarea ADN n soluie de Tris-EDTA, n

prezena unor concentraii reduse de
sruri.

Figura 10. Etapele extraciei ADN

(modificat dup: http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/dna-and-
rna-purification/bacterial-genomic-miniprep-kit.html)

56
 Avantajele utilizrii acestei metode:
- nu se folosesc reactivi toxici precum fenol sau cloroform;
- nu este necesar folosirea rinilor;
- nu este necesar precipitarea cu alcool;
- raportul cristografic A260/280 este ntre 1,6-1,9;
- permite obinerea a minimum 200 l eluat; 15 g - 20 g ADN cu
lungimea fragmentului de pn la 50 kb;
- timp necesar < 120 minute.

8.2.2. Materiale necesare

Pentru realizarea extraciei ADN stafilococic prin metoda bazat pe

principiul separrii pe membrane de silica am folosit:

A. Kitul de extracie GenEluteTM Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma

Aldrich).

Kitul conine:
- Soluie de liz pentru bacterii gram-pozitive, diluent pentru prepararea
soluiei de lizozim;
- Proteinaz K;
- Soluii de splare;
- Soluii pentru eluare (10 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, pH 9,0);
- Soluii pentru pregtirea coloanelor;
- Coloane de legare a ADN, cu membrane de silica.

57
 B. Lizostafin, pulbere liofilizat (Sigma Aldrich) (sinonim Glycyl-glycine
endopeptidase)
- obinut din cultura de Staphylococcus staphylolyticus;
- enzim cu activitate litic asupra speciilor de Staphylococcus;
- are aciune hexozaminidazic, amidazic si endopeptidazic;
- cliveaz legaturile ncruciate glicinice din peretele celular al
stafilococilor;
- puritate peptidic 50-70%;
- activitate specific 500 uniti/mg protein (o unitate reduce
turbiditatea unei suspensii celulare de S. aureus de la 0,250 la 0,125 in
10 minute la pH 7,5 la 37C ntr-un volum de reacie de 6 ml);
- masa molecular ~25kDa;
- pH optim 7,5;
- sub form de pulbere liofilizat i menine activitatea cel puin 3 ani la
-20C;
- soluiile se utilizeaz proaspete i nu se congeleaz.

C. Lizozim, pulbere liofilizat (Sigma Aldrich)

- hidrolizeaz legturile (14) intre acidul N-acetil-muramic i N-acetil-
D-glucozamin;
- obinut din albu de ou;
- puritate proteic 90%;
- pH optim 6,0-9,0;
- activitate 40.000 unitti/mg protein;
- sub form de pulbere liofilizat i menine activitatea cel puin 4 ani la
-20C;
- n soluii apoase (10mg/ml) i menine activitatea cel puin 1 lun la
2-8C.
58
D. Tulpini de referin:
- Staphylococcus aureus ATCC 25923 (nuc i pvl prezente, mecA absent);
- Staphylococcus aureus ATCC 33592 (nuc prezent, mecA prezent);
- Staphylococcus aureus ATCC 49775 (nuc i pvl prezente, mecA absent).

F. Alte materiale (aparatur, consumabile, reactivi):

- hot cu flux laminar de aer;
- bloc de nclzire;
- microcentrifug;
- balan analitic;
- vortex;
- stative pentru tuburi de 1,5-2 ml;
- pipete micrometrice monocanal 20l, 200l, 1000l;
- tuburi tip Falcon volum 15/50 ml;
- microtuburi cu volum de 2 ml;
- vrfuri cu filtru 20l, 200l, 1000l;
- etanol 95-100%;
- soluie de decontaminare a suprafeelor pentru biologie molecular;
- mnui fr pudr;
- spatule i tvi pentru cntrire.

8.2.3. Protocol de lucru:

1. Se prenclzete blocul de nclzire la 55C.

2. Se prenclzete baia de ap la 37C.

59
 3. Se amestec bine reactivii trusei i se examineaz pentru prezena
precipitatelor. Dac vreun reactiv formeaz precipitate, se nclzete la 55-65C
pn se dizolv precipitatul i se rcete la temperatura camerei nainte de
utilizare.

4. Se dilueaz concentratul soluiei de splare cu 80 ml etanol 95-100% i

se nchide bine flaconul pentru a evita evaporarea alcoolului.

5. Reconstituirea proteinazei K:
- se dizolv pulberea dintr-un flacon de proteinaz K cu 0,5 ml ap pentru
a se obine o soluie stoc 20 mg/ml;
- soluia stoc se poate pstra la 2-8C timp de mai multe sptmni sau la
-20C, n poriuni mici, pentru perioade mai lungi;
- nu se combin soluia de proteinaz K cu soluia de liz pentru stocare.

6. Prepararea soluiei stoc de lizozim 2.115x106 uniti/ml (~45 mg/ml):

- se folosete soluia de liz pentru bacterii Gram-pozitive;
- se amestec prin pipetare sus-jos;
- lizozimul nedizolvat se va dizolva n cursul incubrii la 37 C.
- se suplimenteaz soluia de lizozim cu 200 uniti/ml lizostafin (~0,4
mg/ml);
- sunt necesari 200 l pentru fiecare extracie;
- se prepar soluia de lizozim n exces, innd cont de erorile de
pipetare;
- soluia de lizozim astfel realizat trebuie utilizat n ziua preparrii.

7. Colectarea celulelor:
- se centrifugheaz 1,5 ml cultur peste noapte de Staphylococcus aureus
n bulion, la 12000-16000g, 2 minute;
- se ndeprteaz complet mediul de cultur.

60
 8. Resuspendarea celulelor. Se resuspend sedimentul n 200 l soluie
lizozim i se incubeaz la 37C, 30 minute.

9. Liza celulelor:
- se adaug 20 l soluie proteinaz K;
- apoi se adaug 200 l soluie de liz C;
- se vortexeaz 15 secunde sau se inverseaz;
- se incubeaz la 55C, 10 minute;
- un amestec omogen este esenial pentru o liz eficient.

10. Pregtirea coloanelor. Se adaug 500 l soluie de pregtire a

coloanelor (Column Preparation Solution) la fiecare coloan preasamblat
GenElute Miniprep Binding aezat ntr-un tub de colectare 2 ml. Se
centrifugheaz la 12.000g, 1 minut i se arunc eluatul.

11. Legarea ADN la coloan. Se adaug 200 l etanol 95-100% la lizat, se

votexeaz 5-10 secunde sau se inverseaz. Un amestec omogen este esenial. Se
transfer tot coninutul ntr-o coloan de legare i se centrifugheaz la 6500g, 1
minut, apoi se plaseaz coloana ntr-un nou tub de colecie.

12. Prima splare. Se adaug 500 l soluie de splare 1 la coloan, se

centrifugheaz la 6.500g, 1 minut. Se plaseaz coloana ntr-un nou tub de colecie.

13. A doua splare. Se adaug 500 l soluie de splare la coloan, se

centrifugheaz la vitez maxim (12.000-16.000g) pentru a usca coloana. Dac se
observ etanol rezidual se centrifugheaz nc 1 minut (acelai tub de colecie). Se
plaseaz coloana ntr-un nou tub de colecie.

14. Eluarea ADN. Se pipeteaz 200 l soluie de eluare (Elution Solution)

direct n centrul coloanei i se incubeaz 5 minute la temperatura camerei;
ulterior, se centrifugheaz la 6.500g, 1 minut.

61
 Se mparte eluatul n mai multe tuburi. ADN-ul extras poate fi stocat pe
termen scurt la 4C (cteva zile pn la o sptmn) sau pe termen mai lung la
-20C. Cnd sunt necesare fragmente mai lungi se evit vortexarea, se pipeteaz
cu atenie i se evit ciclurile nghe-dezghe repetate.

8.3. Detectarea genelor mecA, pvl i nuc n culturi de referin ale S.

aureus utiliznd singleplex/triplex RT-PCR

8.3.1. Materiale necesare

Pentru detecia cu sonde TaqMan a genelor mecA, pvl i nuc am folosit:

1. Instrumentul RT-PCR Stratagene Mx3005P (figura 11):
- sursa de lumin: lamp de halogen- quartz tungsten;
- detector: tub fotomultiplicator, un tub cu vid care funcioneaz pe baza
efectului fotoelectric extern care convertete lumina n semnal electric;
are amplificare intern a semnalului de 106 108 ori, obinndu-se la
ieire semnale vizibile pentru fascicule de lumin foarte slabe;
- seturi de filtre pentru detectarea a pn la 5 inte/culori simultan.

2. Master mix HotStarTaq Master Mix kit (Qiagen)

- Conine 250 U HotStarTaq ADN polimeraz, o form modificat de Taq
polimeraz, inactiv la temperatura camerei, activat la 95C , ceea ce
reduce riscul amplificrilor nespecifice, formarea dimerilor de primeri i
zgomotul de fond;

62
 Figura 11. Aparatul Stratagene Mx3005P

- PCR Buffer;
- Amestec dNTP (concentraie 200 M pentru fiecare dNTP);
- Concentraia final a MgCl2 n soluie este de 1,5 mM;
- Ap Rnase-free.

Alternativ, am utilizat Brilliant II QPCR Master Mix (Stratagene, Agilent

Technologies)
- Conine SureStart Taq ADN polimeraza;
- PCR Buffer;
- Amestec dNTP;
- Concentraia final a MgCl2 n soluie 1 este de 5,5 mM.

Pentru realizarea multiplex RT-PCR am utilizat Brilliant Multiplex QPCR

Master Mix (Stratagene, Agilent Technologies).

63
 3. Primeri mecA, nuc (TIB-MOLBIOL) i pvl (Biosearch Technologies, Inc.)
(tabelul 7):

Tabelul 7. Secvenele primerilor utilizai (adaptat dup McDonald et al., 2005)

Primeri Secven (5-3) GC (%) Tm

mecA Fwd GGCAATATTACCGCACCTCA 50 58C
mecA Rev GTCTGCCACTTTCTCCTTGT 50 58C
pvl Fwd ACACACTATGGCAATAGTTATTT 30,4 50C
pvl Rev AAAGCAATGCAATTGATGTA 30 56C
nuc Fwd CAAAGCATCAAAAAGGTGTAGAGA 38 52C
nuc Rev TTCAATTTTCTTTGCATTTTCTACCA 27 50C
Legend: Tm = temperatura de denaturare (melting temperature)
Fwd = forward
Rev = reverse

Primerii au avut urmtoarele proprieti:

- livrai sub form liofilizat;
- grad purificare HPLC (high performance liquid chromatography
cromatografie de lichide de nalt performan).

Recomandri generale pentru reconstituirea primerilor i a sondelor

- primerii i sondele liofilizate nu se congeleaz, ci sunt meninute la
+4C, la ntuneric, pn n momentul reconstituirii;
- primerii i sondele pot fi reconstituii prin dizolvare n ap nuclease-
free;
- pentru reconstiture se urmeaz etapele: spin nainte de deschiderea
tubului - adaug solvent - amestec uor - ateapt 10 secunde -
amestec din nou;

64
 - dup reconstituire, sondele u primerii se mpart n mai multe tuburi i
se pstreaz la -20C pe termen mai lung sau la +4C pentru utilizare
zilnic;
- se evit ciclurile nghe/dezghe;
- se evit expunerea la lumin a sondelor.

Variante de lucru pentru reconstituirea primerilor:

a. Realizarea unor concentraii stoc de 30 M, prin dizolvare n ap
ultrapur, dup cum urmeaz:

Pentru o concentraie a primerilor de 3 M se dizolv 300 pmol n 100 l

ap (specificaiile productorului).

Pentru o concentraie a primerilor de 30 M se dizolv 300 pmol n 10 l

ap.

Spre exemplu, pentru reconstituirea primerilor mecA, cunoscndu-se

cantitatea n nmol:
se dizolv 28.400 pmol primer mecA Rev n 946,66 l ap.
se dizolv 23.800 pmol primer mecA Fwd n 793,33 l ap.

b. Realizarea unor concentraii stoc de 100 M, prin dizolvare n ap

nuclease-free, dup cum urmeaz:

Cunoscnd c 1M= 1 mol/L, rezult c, pentru a se obine o concentraie a

primerilor de 100 M, 100 pmol primeri se dizolv n 1 l ap.

Spre exemplu, pentru reconstituirea primerilor pvl, cunoscndu-se

cantitatea n nmol:
92.920 pmol primer pvl Rev se dizolv n 929,2 l ap.

65
 90.000 pmol primer pvl Fwd se dizolv n 900,1 l ap.

Din soluiile stoc de 100 M primeri am preparat un primer mix, astfel:

80 l ap + 10 l primer Fwd + 10 l primer Rev = 100 l primer mix, n

care concentraia fiecrui primer a fost de 10 M.

Tabelul 8. Secvenele sondelor de hidroliz (adaptat dup McDonald et al., 2005)

Tipul Secven (5-3) Colorant Colorant Tm GC

sondei reporter 5 represor 3 (%)

mecA AGATCTTATGCAAACTT FAM TAMRA 65C 33,3

AATTGGCAAATCC
pvl ATTTGTAAACAGAAATT Quasar BHQ3 63C 21,2
ACACAGTTAAATATGA 670

nuc TTTTCGTAAATGCACTTG CAL Fluor TAMRA 59C 41

CTTCAGGACCA Orange
560

4. Sonde de hidroliz TaqMan mecA, pvl i nuc (Biosearch Technologies,

Inc., tabelul 8):
- livrate sub form liofilizat, n tuburi nchise la culoare;
- grad purificare HPLC.

66
 Reconstituirea sondelor de hidroliz

Pentru reconstituirea sondelor TaqMan am aplicat formula recomandat

de ctre productor:
pentru obinerea unei soluii stoc de 100 M, se dizolv sonda ntr-o
cantitate de ap egal cu cantitatea acesteia n nmol x 10.
spre exemplificare: 50,49 nmoli de sond TaqMan mecA au fost
dizolvai n 504,9 l ap.

5. Tulpini de referin:
- Staphylococcus aureus ATCC 25923 (nuc i pvl prezente, mecA absent);
- Staphylococcus aureus ATCC 33592 (nuc prezent, mecA prezent);
- Staphylococcus aureus ATCC 49775 (nuc i pvl prezente, mecA absent).

6. Alte materiale necesare (aparatur, consumabile, reactivi):

- hot cu flux laminar de aer;
- vortex;
- minicentrifug;
- benchtop cooler (sistem de rcire);
- tuburi PCR 0,2 ml, optic clare i cu capac plat sau plci PCR;
- tuburi de reacie de 0,5 ml;
- tuburi 1,5ml;
- stative pentru tuburi PCR;
- pipete micrometrice monocanal de 10, respectiv 20, 100, 200 i 1000
l;
- vrfuri cu filtru volume de 10l, 20l, 200l, 1000l;
- ap nuclease-free (fr nucleaze);

67
 - soluie de decontaminare a suprafeelor pentru biologie molecular;
- mnui fr pudr.

8.3.2. Protocolul de lucru

Realizarea amestecului de reacie

- se adaug reactivii ntr-un tub de 0,5 ml sau de 1,5 ml, n funcie de
numrul de probe testate;
- se adaug un surplus de aproximativ 10% din fiecare reactiv, n vederea
compensrii erorilor de pipetare la constituirea amestecului;
- dup constituirea mix-ului, tubul este vortexat i centrifugat scurt;
- se pegtesc tuburi de reacie de 0,2 ml (cu capac plat, optic clare)
pentru fiecare prob sau alternativ stripuri a cte 8 tuburi sau plci PCR
cu 96 de godeuri;
- cu ajutorul pipetei micrometrice se repartizeaz cte 18 l de amestec
de reacie n fiecare tub PCR de 0,2 ml;
- se adaug 2 l din soluia de ADN n tubul corespunztor fiecrei probe;
- n cazul probelor NTC (non template control), soluia de ADN este
nlocuit cu ap ultrapur.

Pentru calcularea cantitii de primeri i sonde care trebuie incluse n mixul

de reacie am aplicat urmtoarea formul:

Ci x Vi = Cf x Vf
Ci = Concentraia iniial
Vi = Volumul iniial
Cf = Concentraia final
Vf = Volumul final

Am realizat fiecare reacie n triplicat, pentru verificarea reproductibilitii

rezultatelor.

68
 Tabelul 9. Canalele de fluorescen utilizate pentru detectarea amplificrii

Sond Colorant reporter 5 Excitaie Emisie Canalul de fluorescen

TaqMan utilizat
pentru detectarea
fluoroforului
mecA FAM 495 nm 520 nm FAM
pvl Quasar 670 647 nm 670 nm Cy5
nuc CAL Fluor Orange 538 nm 559 nm HEX/JOE/VIC

Prezena genelor a fost indicat prin creterea fluorescenei fluoroforului

cu care a fost marcat sonda de detectare (tabelul 9).

8.3.3. Detectarea genei mecA la tulpini de referin S.aureus ATCC

utiliznd singleplex RT-PCR

Pentru amplificarea genei mecA am utilizat:

primeri mecA Fwd i Rev, soluie stoc 30M
sonde TaqMan marcate cu FAM, soluie stoc de 100M

Volumele utilizate pentru fiecare reactiv ntr-o reacie, sunt prezentate n

tabelul 10.

Profilul termic utilizat este reprezentat n tabelul 11 i figura 12.

69
 Tabelul 10. Amestecul de reacie realizat pentru detectarea genei mecA

Reactivi Pentru o reacie Concentraia

Concentraia Volumul n reacie (M)
iniial (M) utilizat
Master Mix 2x 10 l 1x
Primer Fwd 30 0,2 l 0,30

Primer Rev 30 0,2 l 0,30

Sond de hidroliz 100 0,02 l 0,1
TaqMan
Ap nuclease-free 7,58 l

ADN int 2 l
Volumul final de 20l
reacie

Tabelul 11. Profilul termic utilizat pentru detecia genei mecA

Nr. cicluri Etap Temperatur Timp

1 ciclu predenaturare (activarea Taq 95C 7 minute
polimerazei Hot start)
40 cicluri denaturare 95C 15 secunde
hibridizarea primerilor i 60C 60 secunde
elongare

Rezultate. Gena mecA a fost detectat la tulpina de referin

Staphylococcus aureus ATCC 33592 i a fost absent la S. aureus ATCC 25923 i la
S. aureus ATCC 49775 (figura 13).

70
 Figura 12. Profilul termic utilizat pentru detecia genei mecA

S. aureus ATCC 33592 mecA (+)

S. aureus ATCC 25923 mecA (-)

S. aureus ATCC 49775 mecA (-)

Figura 13. Curba de amplificare a genei mecA pentru tulpinile de referin

S. aureus ATCC 49775, S. aureus ATCC 25923 i S. aureus ATCC 33592

71
 8.3.4. Detectarea genelor pvl la tulpini de referin S. aureus ATCC
utiliznd singleplex RT-PCR.

Pentru amplificarea genelor pvl am preparat:

un mix de primeri n care concentraia fiecrui primer a fost de 10 M;
o soluie stoc de 100 M din sonda TaqMan marcat cu Quasar 670.

Volumele utilizate pentru fiecare reactiv ntr-o reacie, sunt prezentate n

tabelul 12.

Tabelul 12. Amestecul de reacie realizat pentru detectarea genelor pvl

Reactivi Concentraia
Pentru o reacie n reacie (M)
Concentraia Volumul
iniial utilizat
Master Mix 2x 10 l 1x
primer mix 10 M 0,8 l 0,40
(Fwd i Rev)
sond de hidroliz 100 M 0,02 l 0,1
TaqMan
ap nuclease-free 7,18 l
ADN int 2 l
Volumul final 20l

Tabelul 13. Profilul termic utilizat pentru detecia genelor pvl

Nr cicluri Etap Temperatur Timp

1 ciclu predenaturare 95C 10 minute
40 cicluri denaturare 95C 15 secunde
hibridizarea primerilor 55C 60 secunde
i elongare

72
 Figura 14. Profilul termic utilizat pentru detectarea genelor pvl

Figura 15. Detectarea genelor pvl la tulpini de referin S. aureus ATCC 49775,
S. aureus ATCC 25923 i S. aureus ATCC 33592

73
 Profilul termic utilizat este reprezentat n tabelul 13 i figura 14.

Rezultate. Am detectat genele pvl la S. aureus ATCC 49775 i la S. aureus

ATCC 25923. Gena a fost absent la tulpina S. aureus ATCC 33592 (figura 15).

Ulterior am modificat protocolul de amplificare. Schimbarea concentraiei

primerilor i a profilului termic a dus la obinerea unor curbe de amplificare
similare.

8.3.5. Detectarea genei nuc la tulpini de referin S. aureus

Pentru amplificarea genei nuc am preparat:

un mix de primeri n care concentraia fiecrui primer a fost de 10 M;
soluie stoc de 100 M din sonda TaqMan marcat cu fluorocromul CAL
Fluor Orange.

Tabelul 14. Amestecul de reacie realizat pentru detectarea genei nuc

Reactivi Concentraia
Pentru o reacie n reacie (M)
Concentraia Volumul utilizat
iniial
Master Mix 2x 10 l 1x
primer mix 10 M 0,6 l 0,30
(Fwd i Rev)
sond de hidroliz 100 M 0,02 l 0,1
TaqMan
ap nuclease-free 7,38 l
ADN int 2 l
Volumul final 20l

74
 Profilul termic utilizat este reprezentat n tabelul 15.

Rezultate. Am detectat genele nuc la S. aureus ATCC 49775, S. aureus ATCC

25923 i S. aureus ATCC 33592 (figura 16).

Tabelul 15. Profilul termic utilizat pentru detecia genei nuc

Nr cicluri Etap Temperatur Timp

1 ciclu predenaturare 95C 10 minute
40 cicluri denaturare 95C 15 secunde
hibridizarea primerilor 60C 60 secunde
i elongare

Figura 16. Amplificarea genei nuc la tulpinile de referin S. aureus ATCC 49775,
S. aureus ATCC 25923 i S. aureus ATCC 33592

75
 Ulterior am modificat protocolul de amplificare, crescnd timpul primului
ciclu, de predenaturare, la 10 minute i am obinut urmtoarea curb de
amplificare:

Figura 17. Amplificarea genei nuc la tulpinile de referin S.aureus ATCC 49775,
S. aureus ATCC 25923 i S. aureus ATCC 33592 dup un protocol modificat

8.3.6. Detectarea prin triplex RT-PCR a genelor mecA, nuc i pvl la tulpini
de referin de S. aureus

Detectarea prezenei genelor mecA, nuc i pvl prin triplex RT-PCR a fost
posibil prin aplicarea a dou protocoale de lucru.

I. Primul protocol de lucru:

- pentru nceput am utilizat cantiti echimolare de primeri (tabelul 16)
- profilul termic folosit este reprezentat n tabelul 17.

76
 Tabelul 16. Triplex RT-PCR pentru detecia genelor mecA, pvl i nuc:
Concentraiile primerilor i sondelor de hidroliz n amestecul de reacie

Primeri/sond Concentraia n reacie (M)

Primeri mecA 0,30
Primeri pvl 0,30
Primeri nuc 0,30
Sondele TaqMan mecA, pvl i nuc 0,1

Tabelul 17. Profilul termic utilizat pentru triplex RT-PCR

Nr cicluri Etap Temperatur Timp

1 ciclu predenaturare 95C 7 minute
40 cicluri denaturare 95C 15 secunde
hibridizarea primerilor i 60C 60 secunde
elongare

Rezultatele amplificrii sunt prezentate n figurile 18-20:

Figura 18. S. aureus ATCC 49775 (pvl pozitiv, nuc pozitiv, mecA negativ)

77
Figura 19. S. aureus ATCC 25923 (pvl pozitiv, nuc pozitiv, mecA negativ)

Figura 20. S. aureus ATCC 33592 (mecA pozitiv, nuc pozitiv i pvl negativ)

78
 II. Al doilea protocol de lucru utilizat este reprezentat n tabelele 18 i 19.
Rezultatele amplificrii sunt prezentate n figurile 22-26.

Tabelul 18. Concentraia primerilor i a sondelor n amestecul de reacie

Gena amplificat Concentraia final n reacie (M)

Primeri Sonde de hidroliz
mecA 0,30 0,1
pvl 0,40 0,1
nuc 0,05 0,05

Tabelul 19. Triplex RT-PCR pentru detecia genelor mecA, pvl i nuc: profilul termic utilizat

Nr. cicluri Etapa Temperatura Durata

predenaturare (activarea Taq
1 95C 10 minute
polimerazei Hot start)
denaturare 95C 15 secunde
40
hibridizare primeri i elongare 55C 60 secunde

Figura 21. Triplex RT-PCR. Profilul termic utilizat

79
 Figura 22. S. aureus ATCC 25923 (mecA negativ, pvl i nuc pozitive)

Figura 23. S. aureus ATCC 49775 (pvl i nuc pozitive). Comparaie ntre curbele de
amplificare a pvl prin singleplex i prin multiplex RT-PCR

80
 Figura 24. S. aureus ATCC 49775 (genele pvl i nuc pozitive, mecA negativ)

Figura 25. S. aureus ATCC 49775 (genele pvl i nuc pozitive). Comparaie ntre curbele de
amplificare a pvl prin singleplex i prin multiplex RT-PCR

81
 Figura 26. S. aureus ATCC 33592 (mecA pozitiv, nuc pozitiv i pvl negativ)

8.4. Detectarea genelor pvl, mecA i nuc la izolatele clinice de S. aureus n

Spitalul Clinic de Boli Infecioase Sf. Parascheva Iai

Material i metode
Am testat 188 de tulpini non-duplicat izolate n Spitalul Clinic de Boli
Infecioase Sf. Parascheva Iai n perioada 1 ianuarie 2008-31 decembrie 2010.
Tulpinile au fost izolate din secreii purulente (102), hemocultur (46), lichid
cefalo-rahidian (LCR) (16), sput (18), iar 16 tulpini au fost izolate concomitent din
mai multe produse patologice.

Detecia genelor mecA, nuc i pvl s-a fcut folosind tehnica triplex RT-PCR
(Vremer et al., 2011). Extracia ADN din cultura de 24 ore n bulion cord - creier
s-a fcut folosind kitul GenElute Bacterial Genomic DNA (Sigma Aldrich,
Germania). Pentru amplificarea genelor int au fost utilizai primeri i sonde de
hidroliz ale cror secvene nucleotidice au fost descrise anterior de ctre

82
McDonald et al. (2005) (tabelele 7, 8). Concentraiile primerilor i sondelor sunt
prezentate n tabelul 18, iar profilul termic ales pentru desfurarea reaciei de
amplificare genic este descris n tabelul 19.

Amplificarea simultan a celor 3 gene (nuc, mecA i pvl) a fost detectat cu

ajutorul aparatului Stratagene MX3005P (Agilent Technologies, USA). Prezena
genelor a fost indicat prin creterea fluorescenei fluoroforului cu care a fost
marcat sonda de detectare (tabelul 9) i generarea unei curbe sigmoidale de
amplificare. Rezultatele amplificrii prin multiplex RT-PCR au fost confirmate prin
singleplex RT-PCR (tabelele 10-15). Drept controale pozitive i negative au fost
utilizate tulpinile de referin S. aureus ATCC 25923 i 49775 (pvl prezent, mecA
absent) i S. aureus ATCC 33592 (mecA prezent, pvl absent) (figurile 18-20).

Testarea fenotipic s-a realizat prin metoda difuzimetric, conform

recomandrilor CLSI 2008-2010 (Clinical Laboratory Standards Institute) i folosind
galerii ATB STAPH 5 (bioMrieux, Frana). Depistarea tulpinilor cu rezisten
inductibil la clindamicin s-a fcut prin testul D. Concentraiile minime inhibitorii
(CMI) ale oxacilinei i vancomicinei au fost determinate prin metoda E-test
(bioMrieux, Frana), folosind tulpina S. aureus ATCC 29213 drept control.

Rezultate

Gena mecA a fost pus n eviden la 86 de izolate (45,74 %), n timp ce

prin testele fenotipice sensibilitatea testrii a fost 95,34% folosind discul de 1 g
oxacilin i 97,67% folosind discul de 30 g cefoxitin sau galeriile ATB STAPH 5.
CMI ale oxacilinei au fost cuprinse ntre 0,094-256 g/ml, cu un procent al
tulpinilor heterorezistente de 21,27% din total, iar CMI la vancomicin au fost
cuprinse ntre 0,5-2 g/ml.

83
 Figura 27. Curbe de amplificare pentru o tulpin izolat de la bolnav:
nuc pozitiv, mecA negativ i pvl negativ (testat i prin singleplex RT PCR)

Figura 28. Triplex RT PCR - amplificarea genelor mecA, nuc i pvl

pentru o tulpin izolat de la bolnav (testat i prin singleplex RT PCR)

84
Figura 29. Amplificarea genei mecA la izolatele clinice de S. aureus

Figura 30. Amplificarea genelor pvl la izolatele clinice de S. aureus

85
Figura 31. Amplificarea genei nuc la izolatele clinice de S. aureus

Figura 32. Compararea curbelor de amplificare a pvl

obinute prin singleplex i prin triplex RT-PCR

86
 Din totalul tulpinilor testate, 45 au fost pvl-pozitive (23,93%), reprezentnd
33,72% dintre izolatele MRSA (tabelul 20). Prevalena infeciilor cu tulpini MRSA i
cu tulpini PVL-pozitive pe parcursul celor 3 ani este prezentat n figura 33.

Tabelul 20. Rezultatele determinrii genelor mecA i pvl la izolate clinice

An MRSA MSSA
Nr total tulpini Nr tulpini pvl + Nr total tulpini Nr tulpini pvl +

2008 21 7 29 8

2009 30 7 30 3

2010 35 15 43 5

Figura 33. Prevalena tulpinilor MRSA i a tulpinilor PVL-pozitive

Majoritatea tulpinilor pvl-pozitive au fost izolate din secreii purulente

(82.22%), 6 tulpini au fost izolate din hemoculturi, o tulpin a fost izolat din LCR
i din hemocultur, iar o tulpin a fost izolat din LCR, hemocultur i sput.
Evoluia clinic a acestor pacieni a fost urmtoarea: deces (dou cazuri), agravare

87
(un caz), evoluie staionar (6 cazuri), ameliorare (26 cazuri) i vindecare (10
cazuri). Tulpinile izolate de la pacieni cu infecii sistemice care au evoluat spre
deces sau agravare au fost sensibile la meticilin (MSSA), cu rezisten doar la
penicilin sau penicilin i gentamicin. Decesul a survenit n cazul unei paciente
de 7 ani cu infecie dobndit n comunitate, care a prezentat localizri secundare
pulmonare i meningeale (Nastase et al., 2011); al doilea caz de deces a fost un
pacient n vrst de 79 de ani cu infecie asociat ngrijirilor medicale, care
prezenta bypass femuro-popliteal i insuficien renal.

Tabelul 21. Profilurile de rezisten la antibiotice pentru tulpinile MSSA pvl-pozitive

Nr tulpini MSSA P G CM E TE
rezistente
8 +
3 + +
1 + +
1 + +
1 + +
1 + + + +
Legend: P = penicilin G = gentamicin
CM = clindamicin E = eritromicin
TE = tetraciclin

Din totalul tulpinilor pvl-pozitive, 16 au fost MSSA; s-au distins 6 profiluri

diferite de rezisten la antibiotice, cel mai frecvent fiind rezistena la penicilin (8
tulpini), iar o tulpin a fost sensibil la toate antibioticele testate (tabelul 21).

Tulpinile MRSA productoare de PVL (29 tulpini) au prezentat 7 profiluri de

rezisten la antibiotice, cel mai frecvent fiind rezistena la eritromicin (22
tulpini); dintre aceste tulpini, dou au fost MDR (tabelul 22).

88
 Tabelul 22. Profilurile de rezisten la antibiotice non-betalactamice
pentru tulpinile MRSA pvl-pozitive

Nr tulpini MRSA G CM E TE FQ SXT RIF

rezistente

22 +

2 + +

1 +

1 + +

1 + +

1 + + +

1 + + + +

Legend:
SxT = cotrimoxazol
RIF = rifampicin

Toate tulpinile pvl-pozitive au fost sensibile la cloramfenicol (C), linezolid

(LZD), teicoplanin (TEC), vancomicin (VA) i acid fusidic (FUS) i nici o tulpin pvl-
pozitiv nu a prezentat rezisten inductibil la clindamicin.

Analiza profilurilor de rezisten a izolatelor pvl-negative a evideniat 44 de

pattern-uri diferite, cele mai frecvente fiind MSSA rezistente la penicilin (27,97%)
i MRSA multi-rezistent la eritromicin, clindamicin i tetraciclin (11,18%).

Din totalul tulpinilor MRSA, 72,09% au fost ncadrate ca infecii

comunitare, pe baza urmtoarelor criterii: culturi pozitive n primele 48 de ore de
la internare, n absena factorilor de risc asociai ngrijirilor medicale (istoric de

89
spitalizare n ultimul an, operaii chirurgicale, dializ renal, dispozitive medicale
percutane, absena culturilor pozitive pentru MRSA n ultimul an). Dintre tulpinile
CA-MRSA 37,09% au fost productoare de PVL.

Figura 34. Compararea rezistenei la antibiotice pentru tulpinile CA-MRSA i HA-MRSA

Compararea rezistenei la antibiotice pentru tulpinile CA-MRSA i HA-

MRSA relev o rat crescut de rezisten la TE, G, RIF i FQ n cazul izolatelor HA-
MRSA, n timp ce rata rezistenei la SXT, C i FUS a fost similar pentru cele dou
categorii (figura 34).

Dintre cele 86 tulpini MRSA, 54 au fost MDR, majoritatea fiind clasificate

drept CA-MRSA (34/54), profilul de rezisten predominant fiind: rezistena la E,
CM i TE (n cazul a 10 tulpini). Majoritatea tulpinilor MDR ncadrate ca HA-MRSA
au prezentat rezisten suplimentar la: G, RIF i FQ (pentru 9 tulpini). Doar 3
dintre tulpinile pvl-pozitive au fost MDR, reprezentnd 5,55% dintre izolatele
MDR.

90
 Discuii

Prevalena MRSA remarcat n cursul studiului (45,74 %) este n acord cu

date publicate anterior de Dorneanu et al. n 2006 (47%) i cu raportrile
European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net) (2009), care
plaseaz Romnia pe unul dintre primele locuri privind incidena MRSA izolat din
infecii invazive (35,6%). Meninerea prevalenei MRSA la un nivel redus
presupune un program riguros de prevenie, prin screening-ul la internare al
pacienilor cu risc nalt de a fi colonizai. Pentru o monitorizare eficient a
circulaiei tulpinilor MRSA este necesar identificarea corect a tulpinilor MRSA.
Metodele convenionale nu reuesc ntotdeauna s detecteze tulpinile
heterorezistente i necesit validarea prin metode moleculare, considerate
standardul de aur, dar inaccesibile pentru testarea de rutin. Folosirea RT-PCR
ofer, n perspectiv, posibilitatea depistrii MRSA direct n prob i instituirea
rapid a msurilor de prevenie a rspndirii MRSA n spital (McDonald et al.,
2005; Ornskov et al., 2008).

Rezultatele noastre privind detecia MRSA prin metode fenotipice sunt

similare cu cele publicate de Anand et al. (2009), Pottumarthya et al. (2005) i
Salimnia et al. (2005) care raporteaz o sensibilitate a testrii cu discul de 30 g
cefoxitin de 100%, 99% i respectiv 99,7%, n timp ce, n cazul testrii cu discul de
1 g oxacilin, aceeai autori semnaleaz o concordan mai redus cu tehnicile
moleculare (sensibilitate de 87,5%, 94,7% i respectiv 93,3%).

Mult vreme, tulpinile MRSA au fost asociate infeciilor nosocomiale;

emergena i diseminarea n comunitate a unor tulpini cu virulen crescut,
purttoare ale leucocidinei Panton-Valentine, constituie o problem de sntate
public (Vandenesch et al., 2003; Davis et al., 2007). Unii autori anticipeaz
nlocuirea tulpinilor clasice HA-MRSA cu tulpini comunitare, care infiltreaz mediul

91
de spital, graie unei capaciti crescute de colonizare (Valsesia et al., 2010). Dei
majoritatea tulpinilor CA-MRSA determin infecii ale pielii i esuturilor moi,
unele cazuri pot evolua ctre infecii invazive, bacteriemie, pneumonie necrozant
i fasciit necrozant (Boyle-Vavra i Daum, 2007).

De obicei, tulpinile CA-MRSA sunt sensibile la majoritatea antibioticelor

non-betalactamice, au o rat mai mare de cretere i un nivel mai redus al
meticilino-rezistenei, care se exprim cel mai frecvent heterogen. Studiul de fa
a evideniat a rat a heterorezistenei la oxacilin 45,16%. Prevalena rezistenei
multiple la tulpinile CA-MRSA a fost 54,83%, cu rezisten la: TE (94,11% dintre
tulpinile MDR), E (91,17%), CM (79,41%), G (44,11%), FQ (41,17%), RIF (38,23%),
SXT (5,88%), C (5,88%), FUS (5,88%). Aceste date sunt n concordan cu observaii
recente care indic o pierdere a limitelor clare ntre tulpinile comunitare i cele de
spital, cu o cretere a fenomenului rezistenei la antibiotice printre tulpinile CA-
MRSA, care devin astfel, mult mai asemntoare cu HA-MRSA din punct de vedere
fenotipic (Otter i French, 2006; Tavares et al., 2011).

Expresia toxinei PVL a fost asociat cu CA-MRSA, fiind izolat predominant

din leziuni dermonecrotice (Deurenberg i Stobberingh, 2008; Tristan et al., 2007).
Rata tulpinilor pvl-pozitive raportate n literatur difer mult de la un autor la
altul. Studiul nostru a artat o rat relativ crescut a izolatelor pvl-pozitive
(23,93%), comparativ cu raportrile Holmes et al. (2005) care a semnalat o
frecven redus a tulpinilor de S. aureus productoare de PVL (1,6%) (38). Peste
250 de articole asupra S. aureus productoare de PVL publicate ntre 2002-2007
au identificat o asociere ntre producerea PVL i epidemiile determinate de CA-
MRSA. Un studiu realizat de Vandenesch et al. (2003) asupra markerilor genetici
comuni la 117 izolate de CA-MRSA, de pe diferite continente, a concluzionat ca
tulpinile CA-MRSA au avut n comun elementul mobil SCCmec tip IV i locusul PVL,
n timp ce alte gene care codificau variate toxine au fost specifice tulpinilor izolate

92
predominant ntr-un anumit continent. De asemenea, studiul a artat c tulpinile
CA-MRSA difer de tulpinile HA-MRSA din punct de vedere genetic i c au evoluat
independent.

Hedin et al. (2007) a demonstrat c PVL este un marker genetic stabil

pentru infeciile CA-MRSA, 96% dintre tulpinile pvl-pozitive fiind CA-MRSA, n timp
ce 81% dintre tulpinile pvl-negative au fost HA-MRSA. Fang et al. (2008) a raportat
un procent al tulpinilor CA-MRSA purttoare ale genelor pvl de 56% din 104 tulpini
testate; un procent similar a fost detectat de Berglund et al. (2008) (respectiv
66%). Majoritatea tulpinilor pvl-pozitive testate n cadrul acestui studiu au fost CA-
MRSA (23/45, respectiv 51,11%), n timp ce doar 2 tulpini pvl-pozitive (4,44%) au
fost clasificate ca HA-MRSA iar n cazul a 4 tulpini (8,88%) nu au existat suficiente
date clinice care s permit clasificarea.

Implicarea leucocidinei Panton Valentine n virulena S. aureus a fost mult

disputat datorit rezultatelor neconcludente ale studiilor in vivo care utilizau
oarecele ca model animal, specie la care neutrofilele, principalele inte celulare
ale PVL, sunt lipsite de sensibilitate la aciunea acestei toxinei. Totui, datele
epidemiologice i experimente in vivo pe iepure, un model animal mai potrivit, ale
crui neutrofile prezint aceeai sensibilitate la aciunea PVL ca i celulele umane,
au demonstrat asocierea ntre producerea leucocidinei i infeciile cutanate
necrotizante. Astfel, un studiul realizat de Lipinska et al. a artat c iepurii care au
fost injectai intradermic cu suspensii ale unor tulpini comunitare pvl-pozitive de
S.aureus au dezvoltat leziuni cutanate mai severe i un grad mai mare de necroz
tisular comparativ cu tulpinile pvl-negative i au prezentat o cretere a titrului
anticorpilor anti-LukS-PV.

n cadrul acestui studiu, 36 din cele 45 de tulpini productoare de PVL

(80%) au fost izolate din infecii comunitare, iar dintre acestea, 23 de tulpini au

93
fost CA-MRSA (63,88%). Doar dou tulpini CA-MRSA productoare de PVL au fost
MDR i au prezentat rezisten la E, G, TE i SXT. Majoritatea izolatelor CA-MRSA
pvl-pozitive (21/23) au fost rezistente la E, dar niciuna nu a prezentat rezisten la
CM, FQ, RIF, C sau FUS.

Sensibilitatea pstrat la acidul fusidic a acestor tulpini este discordant cu

datele din literatur care sugereaz c rezistena la acidul fusidic ar putea fi
utilizat drept marker pentru identificarea tulpinilor CA-MRSA productoare de
PVL (Witte et al., 2005). Studiul de fa a evideniat doar dou tulpini CA-MRSA i
2 tulpini HA-MRSA au fost rezistente la acid fusidic, niciuna dintre ele nefiind
productoare de PVL.

Concluzii

Multiplex RT-PCR este util pentru detecia rapid a tulpinilor MRSA i

identificarea genelor care codific sinteza factorilor de virulen, precum PVL.
Introducerea acestei tehnici n cadrul Laboratorului de Biologie Molecular a
permis validarea rezultatelor testrii fenotipice, demonstrnd o bun sensibilitate
a deteciei tulpinilor MRSA prin metode clasice (95,34 97,67%).

Studiul a evideniat o rat crescut a tulpinilor productoare de PVL,

asociate majoritar cu tulpinile CA-MRSA i avnd un profil de rezisten particular,
la eritromicin, cu sensibilitate pstrat la clindamicin, rifampicin,
fluorochinolone, cloramfenicol i acid fusidic. Dei rezistena la acid fusidic a fost
propus drept marker al tulpinilor CA-MRSA productoare de PVL, rezultatele
acestui studiu sugereaz c nu putem utiliza rezistena la acid fusidic pentru
screening-ul acestor tulpini n zona noastr.

94
 Depistarea tulpinilor productoare de PVL poate fi utilizat, n asociere cu
tehnicile de tipare pentru identificarea tulpinilor CA-MRSA i supravegherea
epidemiologic a circulaiei acestor tulpini.

Punerea la punct a tehnicii multiplex RT-PCR va permite, n viitor,

detectarea prezenei tulpinilor MRSA, eventual productoare de PVL, direct n
produsul patologic i aplicarea precoce a msurilor de prevenie a rspndirii
acestor tulpini n spital.

Testarea sensibilitii la antibiotice a relevat un procent surprinztor de

mare de tulpini MDR printre izolatele clasificate drept CA-MRSA (54,83%), dar nu
i printre tulpinile productoare de PVL. Aceste date subliniaz tendina
ngrijortoare a tulpinilor comunitare de a dobndi rezisten la antibiotice,
precum i necesitatea utilizrii unor tehnici moleculare suplimentare pentru
caracterizarea complet acestor tulpini.

95
 9. REZISTENA LA ANTIBIOTICE A TULPINILOR DE
STAPHYLOCCUS AUREUS IZOLATE DIN INFECII
Olivia S. Dorneanu, Teodora Vremer

n ultimele decade, MRSA s-a remarcat ca pathogen periculos att n

spitale, ct i n comunitate. MRSA este endemic n majoritatea spitalelor n multe
ri i este considerat cel mai serios patogen de spital deoarece poate cauza
frecvent epidemii dificil de tratat (Rachel et al., 2008; Boyce et al., 2005). Tulpini
endemice de MRSA purttoare de determinani multipli de rezisten au devenit o
problem nosocomial mondial la nceputul anilor 1980, fiind responsabile
pentru triplarea costurilor i a duratei de spitalizare n comparaie cu bacteriemia
cu MSSA. n plus, infeciile cu MRSA cresc morbiditatea i riscul de mortalitate
(Ippolito et al., 2010).

9.1. Material i metode

Tulpini bacteriene. Am investigat 188 tulpini non-duplicat de S. aureus

izolate din infecii. Acestea au fost izolate din hemocultur, lichid cefalo-rahidian
(LCR), puroi sau sput, de la pacieni internai n perioada 1 ianuarie 2008 i 31
decembrie 2010 n Spitalul Clinic de Boli Infecioase Sf. Parascheva Iai. Acesta
este un spital universitar cu 300 de paturi care interneaz pacieni din toat

96
regiunea de Nord-Est a Romniei, inclusiv pacieni cu infecii nosocomiale
dobndite n alte uniti spitaliceti. Spitalul are o secie de Terapie Intensiv (TI)
i o secie pentru pacieni HIV-infectai.

Tulpinile de S. aureus au fost considerate infectante pe baza criteriilor

microbiologice: izolarea din situsuri normal sterile, asocierea cu reacia
inflamatorie la examenul microscopic i izolarea predominant, n cantitate mare.

Testarea sensibilitii la antibiotice. Toate tulpinile au fost testate la

antibiotice prin metoda difuzimetric, dup recomandrile CLSI (2008-2010). S.
aureus ATCC 25923 a fost utilizat ca i tulpin de control.

Sensibilitatea la oxacilin a fost testat folosind discuri de cefoxitin (30 g).

Alte antibiotice testate au inclus: penicilin, trimetoprim/sulfametoxazol,
eritromicin, clindamicin, gentamicin, tetraciclin, doxiciclin, ciprofloxacin,
levofloxacin, rifampicin, cloramfenicol, linezolid, teicoplanin, vancomicin
(discuri Oxoid, Marea Britanie). Rezistena inductibil la clindamicin a fost
detectat prin metoda dublului disc (test D), cu 15 mm ntre discuri.

E-test. Concentraia minima inhibitorie (CMI) la oxacilin i vancomicin a

fost determinat folosind benzi E-test (bioMrieux, Frana). S. aureus ATCC 29213
a fost utilizat ca tulpin martor.

Detectarea genei mecA. Am studiat prezena genei mecA la tulpinile

testate prin RT-PCR conform protocolului descries la capitolul 8.3.

Analiza statistic. Analiza statistic a fost realizat folosind EPIINFO 2005.

Pentru compararea datelor a fost utilizat testul chi ptrat; p 0,05 a fost
considerat statistic semnificativ.

97
 9.2. Rezultate

Tulpinile au fost izolate din secreii purulente (102), hemocultur (46), LCR
(16), sput (18), iar 16 tulpini au fost izolate concomitent din mai multe produse
patologice. Au fost 142 (75,5%) infecii comunitare cu S. aureus i 46 (24,5%)
infecii nosocomiale. Unele infecii nosocomiale au fost asociate cu actul
chirurgcal (7 cazuri), majoritatea cu chirurgia pe nevrax (6 cazuri) sau dispozitive
implantabile (6 cazuri). 28 (14,9%) dintre pacieni au fost spitalizai n secia de TI;
doar 3 (1,6%) pacieni au fost HIV-pozitivi.

Gena mecA a fost pus n eviden la 86 de izolate (45,74 %), n timp ce

prin testele fenotipice sensibilitatea testrii a fost 95,34% folosind discul de 1 g
oxacilin i 97,67% folosind discul de 30 g cefoxitin sau galeriile ATB STAPH 5.

Figura 35. Antibiograma unei tulpini de S. aureus izolat dintr-o prob de puroi.
Tulpina este rezistent la penicilin (se observ marginea net a zonei de inhibiie),
eritromicin i clindamicin (rezisten inductibil).

98
 Figura 36. Rezisten inductibil la clindamicin (detaliu)

Figura 37. Antibiograma unei tulpini de S. aureus izolat dintr-o prob de sput.
Tulpin MRSA MDR (eritomicin, clindamicin, fluorochinolone,
aminoglicozide (fenotip KTG), rifampicin)

99
Figura 38. Antibiograma unei tulpini de S. aureus pe galerie ATB Staph 5 (bioMrieux,
Frana). Tulpin rezistent doar la penicilin.

Figura 39. Etest pentru vancomicin, VA (CMI = 1,5 g/ml) i pentru oxacilin,
OX (CMI = 8 g/ml, heterorezisten) pentru o tulpin de S. aureus izolat din
hemocultur

100
 Figura 40. Etest pentru vancomicin, VA (CMI = 2 g/ml) i pentru oxacilin,
OX (CMI 256 g/ml) pentru o tulpin de S. aureus izolat dintr-o prob de sput

Figura 41. Etest pentru vancomicin, VA (CMI = 1,0 g/ml) i pentru oxacilin, OX (CMI =
0,19 g/ml) pentru o tulpin de S. aureus izolat din hemocultur

101
 A existat concordan de 100% ntre prezena genei mecA i detectarea
rezistenei la oxacilin prin determinarea CMI prin metoda E-test.

Cea mai mare prevalen a tulpinilor MRSA a fost printre probele de sput
(81,8%), iar cea mai redus a fost pentru tulpinile izolate din infecii sistemice
(34,1%), diferen statistic semnificativ, p = 0,037.

Din totalul tulpinilor MRSA, 72,09% au fost ncadrate ca infecii

comunitare.

CMI ale oxacilinei au fost cuprinse ntre 0,094-256 g/ml, cu un procent al

tulpinilor heterorezistente de 21,27% din total, CMI 50 a fost 1 g/ml i CMI 90 256
g/ml. Subliniem faptul c 29,8% dintre tulpinile testate au avut CMI oxacilin
256 g/ml.

CMI la vancomicin au fost cuprinse ntre 0,5-2 g/ml. CMI50 a fost 1 g/ml
i CMI90 2 g/ml. Nu am detectat nici o tulpin VRSA.

Am detectat diferene statistic semnificative (p < 0,05) ntre sensibilitatea

tulpinilor MRSA versus MSSA la gentamicin, eritromicin, clindamicin,
tetraciclin, doxiciclin, ciprofloxacin, levofloxacin, rifampicin.

Dei rezistena la clindamicin este mai frecvent printre MRSA dect

printre MSSA (35,3% versus 14,7%, p < 0,05), rezistena inductibil la clindamicin
este mai frecvent la tulpini MSSA rezistente la eritromicin (59,0%) dect la
tulpini MRSA rezistente la eritromicin (50,0%).

102
SXT = trimetoprim/sulfametoxazol, G = gentamicin, E = eritromicin, CM = clindamicin, TE =
tetraciclin, DO = doxiciclin, CIP = ciprofloxacin, LEV = levofloxacin, RIF = rifampicin, C =
cloramfenicol, VA = vancomicin, LZD = linezolid

Figura 42. Rezistena la antibiotice a tulpinilor MRSA versus MSSA

9.3. Discuii

Infeciile produse de S. aureus, mai ales prin tulpinile rezistente la

antibiotic, au atins proporii epidemice la nivel mondial. Incidena infeciilor cu S.
aureus rezistent la antibiotice, mai ales tulpini MRSA, este n cretere n Romnia,
att n spitale, ct i n comunitate.

ntre 2004-2005, 60%-72% din izolatele invazive de S. aureus din spitalele

romneti au fost MRSA, cea mai mare frecven n Europa (Ionescu et al., 2010).
n studiul nostru am gsit o prevalen semnificativ mai sczut (34,1%) a MRSA
printre tulpinile izolate din infecii sistemice.

103
 A fost detectat o rat a MRSA de 38,4% (56/146) ntre tulpinile de S.
aureus izolate ntre 2004-2005 n Spitalul Judeean Braov. Toate tulpinile MRSA
au fost rezistente la tetraciclin, dar sensibile la vancomicin. Rezistena
inductibil la clindamicin a fost detectat la 23/28 izolate rezistente la
eritromicin. Tiparea molecular a identificat 15 clone, dintre care doar 4 asociate
cu MRSA (CC 1, 8/239, 30 i 80). Tulpinile au fost i HA-MRSA (SCCmec tip III) i CA-
MRSA (SCCmec tip IV), iar PVL a fost detectat la 10 tulpini MRSA i 12 MSSA
(Ionescu et al., 2010).

ntre 2004-2005, 49,9% tulpini MRSA au fost depistate, prin prezena genei
mecA, ntre 423 de tulpini de la pacieni infectai sau colonizai, spitalizai n secia
de TI sau n secii chirurgicale ntr-un spital universitar din Tg. Mure. Majoritatea
au fost multirezistente. Unul din genotipurile MRSA identificat prin PFGE a fost
frecvent la pacienii tratai n secia de TI (Szkely et al., 2008). Rata MRSA n
seciile de TI din Timioara a fost de 50-60% ntre 2005-2007. n acelai studiu,
date din ambulatoriu din Sud-Estul Romniei au artat 26% MRSA ntre 2006-2007
(Licker et al., 2009).

Prevalena MRSA la pacieni internai n spitalul de Boli Infecioase Iai n

2006 a fost de 47,1%, cu CMI la oxacilin variind ntre 0,064 i >256 g/ml. Rate de
rezisten mari au fost detectate pentru eritromicin (81%), gentamicin (91%),
tetraciclin (91%) (Dorneanu et al., 2006).

Utilizarea pe scar larg a antibioticelor a accelerat evoluia S. aureus,

care, prin dobndirea unor multiple gene de rezisten, a devenit capabil s
supravieuiasc la aproape toate familiile de antibiotice. O proporie n cretere de
infecii cu S. aureus sunt produse de MRSA. Prevalena acestuia n studiul nostru,
45,74%, este similar cu valorile gsite n alte zone ale Romniei.

104
 Am detectat o rat MRSA n infecii sistemice de 34,1%, mai mare dect n
majoritatea rilor europene. Cea mai mic prevalen MRSA n Europa este n
rile nordice, sub 5%. rile europene centrale prezint rate de rezisten la
meticilin de pn la 25%, n timp ce n rile mediteraneene, aceasta ajunge
peste 25% (EARS-Net, 2009). MRSA reprezint 27% din toate izolatele de S. aureus
n spitalele canadiene; genotipic, 68,8% dintre acestea sunt HA-MRSA i 27,6%
sunt CA-MRSA (Zhanel et al., 2010). Reiter et al. (2010) au detectat 35%
meticilino-rezisten la tulpini de S. aureus, dar 44,5% la pacieni cu fibroz
chistic.

Tratamentul infeciilor produse de MRSA este o provocare deoarece

aceste tulpini sunt frecvent asociate cu prevalen nalt a rezistenei la alte
antibiotice. n studiul nostru am gsit rate mari de rezisten la eritromicin,
tetraciclin, clindamicin, ciprofloxacin i gentamicin (figura 42). Niveluri similare
de rezisten au fost detectate i de ali autori (Ionescu et al., 2010; Szkely et al.,
2008; Shrestha et al., 2009; Bukharie, 2010). Tulpinile MRSA au fost mai frecvent
asociate cu rezistena multipl la antibiotice (MDR).

Vancomicina a devenit agentul terapeutic standard mpotriva tulpinilor

MRSA, pentru care opiunile terapeutice sunt limitate prin acumularea i a unor
ali markeri de rezisten la antibiotice achiziionai n cursul evoluiei recente a
genomului S. aureus. n multe ri, rspndirea tulpinilor hVISA i VISA ridic noi
probleme terapeutice (Kinney, 2010; Stefani i Goglio, 2010). n studiul nostru nu
am detectat nici o tulpin hVISA sau VISA, dar E-testul standard pentru
vancomicin folosit de noi are sensibilitate joas n detectarea acestor tulpini, 57-
75% (Satola et al., 2011; van Hal et al., 2011; Riederer et al., 2011). Vancomicina
rmne o opiune foarte bun pentru tratamentul infeciilor MRSA. Noi
antibiotice utile n tratmentul infeciilor cu S. aureus rezistent la antibiotice includ
linezolidul, daptomicina, tigeciclina i televancinul (Kinney, 2010).

105
 9.4. Concluzii

Prevalena ridicat a tulpinilor MRSA i abilitatea S. aureus de a dobndi

rezisten la orice antibiotic folosit n terapie impun monitorizarea sensibilitii la
antibiotice, mai ales pentru tulpini izolate din infecii severe. Dei scump, RT-PCR
ofer rezultate mai precise cu privire la sensibilitatea la oxacilin dect metoda
difuzimetric, ceea ce permite o mai bun optimizare a terapiei cu antibiotice n
spitale. Aceast metod poate fi utilizat i pentru screeningul pacienilor la
internare pentru depistarea colonizrii cu MRSA, n vederea prevenirii transmiterii
intraspitaliceti a acestuia i scderea ratei infeciilor cu HA-MRSA.

Totui, metoda difuzimetric cu disc de cefoxitin are sensibilitate i

specificitate mare, ceea ce o recomand pentru utilizare n laboratoarele clinice
care nu au la dispoziie tehnici moleculare.

Glicopeptidele rmn terapia de elecie n tratamentul infeciilor cu MRSA.

Pentru a le pstra valoarea, utilizare alor trebuie limitat la acele cazuri la care
necesitatea lor este bine documentat. Alte obiuni terapeutice valoroase includ
linezolidul i trimetoprim/sulfametoxazol.

106
 10. OPIUNI TERAPEUTICE
Olivia S. Dorneanu, Egidia G. Miftode

n ciuda posibilei rezistene a MRSA i la alte antibiotice, exist o serie de

ageni antimicrobieni care sunt eficieni mpotriva acestuia. MRSA dobndit n
comunitate (CA-MRSA) este adesea sensibil la foarte multe antibiotice uzuale
incluznd minociclina, doxiciclina, trimetoprim/sulfametoxazol, rifampicin i
clindamicin. MRSA asociat infeciilor intraspitaliceti (HA-MRSA) ar putea fi
ocazional sensibil la aceti ageni, ns adeseori se impune utilizarea altor
antibiotice pentru o terapie eficient. Creterea incidenei infeciilor cu MRSA a
deschis oportunitatea introducerii pe pia a unor noi antibiotice anti-MRSA. n
acest moment sunt autorizate pe pia de ctre FDA (Food and Drug
Administration) 4 antibiotice pentru tratamentul infeciilor cu MRSA: vancomicin,
linezolid, daptomicin i tigeciclin.

10.1. Vancomicina

Vancomicina a fost descoperit n 1956 n cteva probe de sol din sud-estul

Asiei unde era produs de un actinomicet, Streptomyces orientalis. Datorit
incidenei i prevalenei crescute a S. aureus penicilino-rezistent, aprobarea sa a
fost fcut imediat de FDA. A fost utilizat n clinic in 1958, la 2 ani dup

107
descoperirea sa. nc de la nceput, utilizarea vancomicinei a fost dificil datorit
toxicitii semnificative. Imediat dup introducerea vancomicinei au fost
descoperite i cefalosporinele. Acestea erau eficiente mpotriva S. aureus
penicilino-rezistent. Datorit acestora precum i din cauza toxicitii vancomicinei
aceasta din urm a fost folosit cu pruden n timpul primelor 2 decenii de uz
clinic. n anii 1970 incidena crescnd a MRSA a cauzat o cretere alarmant n
utilizarea vancomicinei.

Vancomicina este un glicopeptid. Se leag de poriunea terminal a

lanului pentapetidic (D-alanin-D-alanin), blocnd eficient formarea peretelui
celular bacterian. Efectul bactericid are loc la suprafaa extern a peretelui
bacterian, ntruct antibioticul nu poate ptrunde n citoplasm. Cu toate acestea,
efectul vancomicinei depinde de translocarea bacterian a precursorilor peretelui
bacterian, ctre suprafaa extern a acestuia. Deoarece vancomicina este eficient
mpotriva sintezei peretelui bacterian, este activ doar mpotriva bacteriilor gram-
pozitive, ntruct acestea prezint un procent ridicat de peptidoglican la nivelul
peretelui celular. Bacteriile gram-negative sunt neafectate de ctre vancomicin.

Vancomicina este indicat pentru multiple infecii cu bacterii gram-

pozitive. CLSI a fixat concentraia minima inhibitorie (CMI) pentru S. aureus
sensibil la vancomicin ca fiind 2 g/ml. S. aureus se consider a fi cu
sensibilitate intermediar la un CMI ntre 4-8 g/ml. S. aureus vancomicino-
rezistent este reprezentat de acele tulpini cu un CMI 16 g/ml. Dei marea
majoritate a stafilococilor nc prezint sensibilitate crescut conform nivelului
CMI, abilitatea vancomicinei de a realiza in esuturi concentraii mai mari dect
CMI este n discuie. Datele clinice arat c muli pacieni infectai cu tulpini de S.
aureus vancomicino-sensibile nu au avut o evoluie bun n ciuda utilizrii
vancomicinei.

108
 Eficiena dozelor standard de vancomicin n tratamentul infeciilor cu S.
aureus a fost asociat nivelurilor sale serice. Pacienii cu infecii severe au nevoie
de o activitate bactericid a antibioticului. La pacieni, cel mai bun parametru de
corelaie cu succesul/insuccesul terapeutic este raportul unei AUC (area under the
curve) pentru 24 ore fa de CMI (AUIC, Area Under the Inhibitory Curve). O
aciune antimicrobian minim eficient se realizeaz cnd aria de sub concentraia
inhibitorie (AUIC) este de minim 125, unde AUIC este calculat ca AUC seric de 24
ore mprit la CMI-ul patogenului. Schemele terapeutice care nu realizeaz AUIC
de minim 125 nu pot preveni presiunea selectiv care duce la multiplicarea
excesiv a subpopulaiilor bacteriene rezistente (Schentag, 1999).

Schentag et al. (1998) au demonstrat c pacienii cu concentraii serice ale

vancomicinei sub curba inhibitorie (AUIC) >125 au avut 97% rat de succes
terapeutic spre deosebire de 50% pentru cei cu AUIC <125. n mod asemntor,
Moise et al. (2007) au demonstrat c pacienii cu un AIUC > 345 au avut o rat de
succes terapeutic de 78%, i doar de 24% pentru un AUIC < 346. Sakoulas et al.
(2004) au raportat la 30 de pacieni cu bacteriemie cu MRSA, o rat de succes
clinic n condiiile unui CMI sczut (p=0,020). Pacienii cu o CMI 0,5 g/ml au
avut 55,6% rat de succes terapeutic dup tratament cu vancomicin, n timp ce
aceia cu un CMI ntre 1-2 g/ml doar 9,5% rat de succes terapeutic.

Vancomicina este utilizat n infeciile produse de MRSA, dar este mai

puin activ dect oxacilina mpotriva MSSA. Eficacitatea vancomicinei mpotriva
stafilococilor este invers corelat cu CMI. Valoarea CMI trebuie determinat n
infecii severe i trebuie realizat o concentraie seric de 8 ori mai mare dect
valoarea CMI (Daurel i Leclercq, 2010). Heterorezistena instabil este frecvent
printre izolatele clinice de MRSA i poate reprezenta o cauz de eec terapeutic
(Plipat et al., 2005).

109
 Vancomicina este administrat intravenos n cele mai multe infecii, cu
excepia cazurilor de enterocolit produs de Clostridium difficile cnd calea de
administrare este oral. Vancomicina nu se absoarbe din tractul digestiv, dei au
fost raportate cazuri de niveluri toxice la pacieni care aveau leziuni severe ale
tractului intestinal. Penetrabilitatea sa n esuturi este destul de sczut. Cruciani
et al. (1996) au artat c vancomicina administrat n doz de 1g, n perfuzie de 1
or, la interval de 12 ore adesea eueaz n meninerea unei concentraii n
esutul pulmonar peste CMI-ul stafilococilor sensibili. Studii clinice similar n
esutul cardiac i valvular au demonstrat niveluri sczute terapeutic.

Administrarea rapid a vancomicinei produce o reacie acut histamin-

like cunoscut precum sindromul omului rou. Administrarea agentului
terapeutic n perfuzie timp de o or reduce semnificativ incidena acestei
probleme. Alt reacie care poate aprea este eritemul. Dei preparatele de
vancomicin erau destul de toxice la nceput astzi sunt mult mai sigure. Cu toate
acestea, datele arat c administrarea combinaiei de vancomicin i un
aminoglicozid este mult mai nefrotoxic (35%) dect fiecare agent luat separat
(7%).

Rezistena la vancomicin a fost rar iniial n principal datorit folosirii

rare a antibioticului. Cu creterea incidenei MRSA, vancomicina a devenit mult
mai larg utilizat. Utilizarea ndelungat a vancomicinei a condus la apariia
rezistenei bacteriilor la acest antibiotic. Enterococul vancomicino-rezistent a
nceput s apar la sfritul anilor 1980, S. aureus cu rezisten intermediar la
vancomicin la sfritul anilor 1990, iar S. aureus vancomicino-rezistent la
nceputul anilor 2000. Pn acum se pare c rezistena stafilococilor la
vancomicin s-ar produce mai degrab prin transfer al genei vanA de la o tulpin
de enterococ vancomicino-rezistent dect printr-o mutaie de novo ntre tulpinile
de S. aureus.

110
 Datorit longevitii sale, vancomicina a fost introdus iniial ca tratament
standard n infeciile cu MRSA. Ratele de insucces terapeutic de peste 40% n
tratamentul pneumoniei au fost demonstrate utiliznd doze standard; exist
dovezi n cretere privind ineficiena sa. Bacteriemia cu MRSA la pacienii tratai
cu vancomicin ar putea persista dup perioada de defervescen conducnd la
complicaii tardive.

Un studiu care clarific ineficiena vancomicinei este cel condus de

Gonzalez-Ruiz i Richardson (2008) prin evaluarea a 32 de cazuri de pneumonii
bacteriane cu MRSA i 54 de cazuri cu MSSA. Zece din 20 pacieni cu pneumonie
cu MRSA tratai cu vancomicin au murit. n ceea ce privete cazurile cu MSSA,
47% (8/17) tratai cu vancomicin au murit n timp ce nici unul din cei tratai cu
cloxacilin nu au murit. Cu toate acestea, vancomicina s-a administrat n aceleai
doze n ambele cazuri cu MRSA i MSSA. S-a concluzionat c singurul uz raional al
vancomicinei este n cazurile de meticilino-rezisten. Cu toate acestea, studiul
dorea s ilustreze c vancomicina dovedete grave ineficiene n ciuda folosirii ca
tratament de elecie. Nevoia de a atinge o concentraie tisular adecvat, urmat
de o penetrabilitate tisular sczut, par s contribuie la rezultate care sunt mult
mai slabe dect s-ar fi ateptat cineva lund n considerare doar sensibilitatea
antibacterian in vitro.

Au fost fcute eforturi de a mbunti eficiena vancomicinei prin

asigurarea unui nivel seric ridicat al antibioticului (>15 g/ml) n cazurile critice,
dei nu exist studii clinice prospective randomizate care s demonstreze c
eficiena agentului este mbuntit n acest mod i nici care pot asigura c
toxicitatea antibioticului poate fi evitat. Au fost ncercri de mbuntire a
eficacitii vancomicinei prin combinarea sa cu rifampicina sau aminoglicozide.
Terapia de combinaie vancomicin-rifampicin, dei asociat cu rate de vindecare

111
mai mari, a dus la creterea frecvenei rezistenei la vancomicin (van Hal i
Paterson, 2011).

Perfuziile continui cu vancomicin ar avea avantaje n locul administrrii

dozelor de 2 ori pe zi, dei aceste protocoale nu sunt considerate standard n acest
moment. Cu toate acestea, ntr-un studiu prospective, randomizat, Wysocki et al.
(2001) a artat c perfuzia continu cu vancomicin a fost asociat cu costuri mai
reduse n administrare, atingerea mai rapid a unei concentraii terapeutice
eficiente, i reducerea variabilitii dozelor n comparaie cu schemele standard de
administrare.

10.2. Linezolid

Linezolidul este primul reprezentant dintr-o nou clas de antibiotice,

oxazolidinonele. A aprut n anii 1990 ca o soluie la incidena n cretere a MRSA
i respectiv la consumul ridicat de vancomicin. A fost aprobat pentru uzul clinic
de ctre FDA (Food and Drug Administration) n aprilie 2000.

Linezolidul acioneaz prin legarea selectiv la subunitatea 50S ribozomal

i prin aceasta inhib sinteza proteic. Linezolidul este eficient mpotriva
bacteriilor gram-pozitive, precum Enterococcus faecium, S. aureus, Streptococcus
agalactiae, S. pneumoniae i S. pyogenes. Nu are efecte pe bacteriile gram-
negative. Are o biodisponibilitate de 100%, fiind singurul cu aceast caracteristic
printre antibioticele anti-MRSA. O doz oral de 600mg de linezolid atinge aceeai
concentraie seric ca la administrarea intravenoas. Prin acesta, penetrabilitatea
n esuturi este n general mult mai bun dect a multor altor antibiotice, n
special vancomicin; concentraiile linezolidului din plasm i din sebumul de la
suprafaa epidermului la voluntarii sntoi depesc concentraia minim

112
necesar inhibrii creterii a 90% din bacterii (enterococi, stafilococi, streptococi)
de-a lungul ntregului interval dintre 2 doze. Concentraia linezolidului n sebum
depete concentraia plasmatic cu 206% ( 26%). Concentraia linezolidului n
lichidul sudoral atinge 104% din concentraia plasmatic.

Linezolidul este indicat n tratamentul pneumoniilor nosocomiale cu S.

aureus (MRSA i MSSA) sau cu S. pneumoniae (incluznd tulpinile multirezistente).
Este de asemenea indicat n tratamentul infeciilor complicate ale pielii i a unor
afeciuni precum infeciile piciorului diabetic fr osteomielit concomitent,
cauzat de S. aureus (MSSA sau MRSA), S. pyogenes sau S. agalactiae.

Linezolidul este n general bine tolerat. Cu toate acestea exist cteva

efecte adverse ce merit luate n considerare. O mielosupresie reversibil
(incluznd anemie, leucopenie, panciopenie i trombocitopenie) a fost raportat
la pacieni ce au primit linezolid pe perioade mai ndelungate. Datorit acestui
efect advers se recomand sptmnal o hemoleucogram, n special la pacienii
ce primesc acest medicament pentru mai mult de 2 sptmni. Linezolid are
potenial de interaciune cu ageni adrenergici sau serotoninergici fiind un
inhibitor reversibil al monoaminoxidazei. Nu ar trebui administrat mpreun cu
alimente coninnd tiramin sau cu pseudoefedrinele. Alte efecte secundare sunt
eritem, inapeten, grea, diaree, constipaie i febr. Un numr redus de
pacieni au acuzat reacii alergice severe, tinitus sau colit pseudomembranoas.
Linezolid poate fi toxic mitocondrial producnd acidoz lactic i neuropatie
periferic la unii pacieni. Neuropatia periferic i neuropatia optic sunt
complicaii foarte rare.

Profilul de toxicitate al linezolidului este comparabil cu al vancomicinei n

curele de terapie cu durat scurt (van Hal i Paterson, 2011).

113
 ngrijortoare este apariia rezistenei la linezolid, consecutiv utilizrii
intense. Deoarece cele mai multe bacterii au multiple copii de ARNr 23S a
subunitii 50S la care se leag linezolid, dobndirea rezistenei implic apariia
mai multor mutaii ale acestor copii. Rezistena la linezolid a fost iniial raportat
pentru izolate de enterococi vancomicino-rezisteni, apoi observat pentru S.
aureus (Tsiodras et al., 2001).

Linezolidul s-a dovedit eficient n tratamentul infeciilor pielii i ale

esuturilor moi (inclusiv infeciile piciorului diabetic) i pentru tratamentul
pneumoniei cu bacterii gram-pozitive (inclusiv MRSA).

n tratamentul pneumoniei nosocomiale cu MRSA, linezolid a demonstrat

rate de vindecare clinic semnificativ mai mari comparativ cu vancomicina. n
ciuda acestui fapt, nu a fost observat nici o diferen n mortalitatea legat de
infecie (van Hal i Paterson, 2011).

Dovezi similare ale superioritii linezolidului au fost artate n tratamentul

infeciilor pielii i esuturilor moi cu MRSA, incluznd infecii ale plgilor
chirurgicale. Alte studii clinice cu linezolid au artat o reducere substanial a
duratei de spitalizare n infeciile pielii i ale esuturilor moi, ca i n reducerea
duratei tratamentului. Aceste studii arat o economie semnificativ n costurile de
tratament, n ciuda unui cost ridicat de achiziie a medicamentului.

10.3. Daptomicina

Daptomicina este un antibiotic lipopeptidic ciclic activ doar pe bacterii

gram-pozitive. Este un produs de fermentaie al Streptomyces roseosporus.
Daptomicina se leag de membrana citoplasmic bacterian printr-un proces
dependent de calciu, cauznd o depolarizare rapid i un eflux al ionilor de

114
potasiu (Steenbergen et al., 2005). Rezultatul const ntr-o moarte celular rapid
fr liza celulei.

Daptomicina a dovedit eficacitate in vitro mpotriva stafilococilor (inclusiv

MRSA i VISA), enterococilor (inclusiv enterococi rezisteni la glicopeptide),
streptococilor i corinebacteriilor (Richter et al., 2003). A fost aprobat de ctre
FDA n septembrie 2003 pentru tratamentul infeciilor complicate ale pielii i ale
esuturilor tegumentare cauzate de bacterii gram-pozitive, iar n mai 2006 pentru
tratamentul bacteriemiei i a endocarditelor cu S. aureus.

ntr-un studiu clinic despre pneumonii, eficacitatea clinic a fost de 79%

pentru daptomicin i de 87% pentru ceftriaxon. Explicaia principal a
ineficienei daptomicinei n tratamentul pneumoniei este acela c antibioticul
interacioneaz cu surfactantul pulmonar, rezultnd o inhibiie a activitii
antibacteriene.

Daptomicina este disponibil doar pentru administrarea intravenoas.

Farmacocinetica sa indic o rat de eliminare aproape liniar. Medicamentul este
legat de proteine n proporie de 92%, timpul su de njumtire fiind de 8 ore. Se
administreaz n doz zilnic unic de 4mg/kg pentru infecii ale pielii i esuturilor
moi, n timp ce pentru bacteriemia cu S. aureus sau endocardit pe cord drept
doza crete la 6mg/kg.

Dei greaa i vrsturile sunt cele mai frecvente efecte adverse notabile
ale antibioticului, incidena acestora nu este deloc diferit fa de a altor
medicamente. Efectul advers specific i ctre care trebuie concentrat atenia
este mialgia i creterea nivelului enzimelor musculare (creatinfosfokinaza) dei s-
a semnalat la mai puin de 3% din pacienii tratai. Cu toate acestea medicii sunt
avertizai de un posibil episod de miopatie i rabdomioliz n timpul
tratamentului. Utilizarea simultan a daptomicinei cu statinele ar putea crete

115
riscul de miopatie ceea ce impune o administrare discontinu a statinelor n
timpul antibioterapiei.

Din cauza mecanismului unic de aciune, s-a sugerat c ar fi mai puin

probabil ca daptomicina s induc rezisten, comparativ cu ali ageni. Cu toate
acestea rezistena a fost raportat pentru VRE i S. aureus. n anumite cazuri, se
pare c rezistena coincide cu o ngroare a peretelui bacterian stafilococic, similar
cu cea din VISA. Evaluarea microbiologic a rezistenei la daptomicin sugereaz
c bacteriile rezistente i pierd mult din virulen n mod frecvent (Silverman et
al., 2001).

Primele raportri de pneumonie acut cu eozinofile indus de daptomicin

au aprut n 2010 (van Hal i Paterson, 2011).

10.4. Tigeciclina

Tigeciclina este primul medicament de uz clinic disponibil dintr-o nou

clas de antibiotice numit glicicline, care se aseamn structural cu tetraciclinele,
coninnd 4 inele de benzen aezate central. Tigeciclina prezint o substituie n
poziia D-9 i se crede c prin aceast modificare conformaional s-ar conferi un
spectru mai larg de aciune. Tigeciclina are ca int de aciune ribozomii bacterieni
fiind un agent bacteriostatic.

Acest antibiotic are un spectru larg de aciune incluznd bacterii aerobe,

anaerobe, bacterii gram-pozitive (printre care i MRSA) i bacterii gram-negative.
Cu toate acestea, sunt lipsite de efecte fa de Pseudomonas sau Proteus.
Tigeciclina este aprobat pentru tratamentul infeciilor complicate ale pielii,
esuturilor moi precum i al infeciilor intraabdominale complicate (Peterson,
2008). Medicamentul este disponibil doar n administrare intravenoas, cu o doz

116
iniial de ncrcare de 100 mg, urmat apoi de 50 mg la 12 ore. Ajustarea dozelor
este necesar la pacienii cu afeciuni hepatice, ns nu se aplic celor cu afecini
renale.

10.5. Alte antibiotice cu aciune mpotriva MRSA

Cteva antibiotice au o aciune variabil mpotriva MRSA, ns nu sunt

aprobate de FDA pentru tratamentul infeciilor cu MRSA. Multe dintre acestea se
pot administra oral i sunt adesea eficiente n tratamentul CA-MRSA.
Trimetoprim&sulfametoxazol este adesea foarte eficient mpotriva MRSA, dei n
studii clinice nu are aceeai eficacitate ca vancomicina mpotriva MRSA.

Tetraciclinele cu durat lung de aciune precum minociclina sau

doxiciclina i-au dovedit eficiena mpotriva MRSA.

Clindamicina este disponibil oral i adesea este eficient mpotriva MRSA,

dei ocazional dezvolta o rezisten eritromicin-indus, identificat n laborator
prin testul D.

Ali ageni care sunt ocazional utili n managementul infeciilor cu MRSA

includ rifampicina, macrolidele (claritromicina), fluroquinolonele (moxifloxacina i
levofloxacina), gentamicina i cloramfenicolul.

Dintre noile antibiotice mpotriva MRSA, ceftopibrol, ortivancin i

dalbavancin necesit studii suplimentare nainte de evaluarea FDA. Ceftopibrol,
ortivancin i dalbavancin au fost asociate cu rate de vindecare clinic comparabile
cu ale vancomicinei n tratamentul infeciilor complicate ale pielii i esuturilor
moi (van Hal i Paterson, 2011).

117
 Dalbavancina, o lipoglicopeptid de a 2-a generaie din aceeai clas cu
vancomicina se remarc printr-un timp de njumtire extrem de lung ce permite
administrarea unei doze unice intravenos pentru o sptmn. Un studiu clinic n
infeciile pielii i esuturilor moi, comparnd dalbavancina i linezolidul au artat
rezultate asemntoare n 90% din pacieni din ambele grupuri avnd o evoluie
bun.

Ceftobiprol este prima cefalosporin cu aciune mpotriva MRSA. testrile

in vitro au artat c antibioticul este la fel de eficient mpotriva MRSA ca i
linezolidul.

Oritavancina este un antibiotic glicopeptidic de semisintez, precum

vancomicina, care are activitate bactericid n infeciilor severe cu bacterii gram-
pozitive, incluznd stafilococii vancomicino-rezisteni i enterococii.

118
 Tabelul 23. Recomandri pentru tratamentul infeciilor cu MRSA (adaptat dup Liu et al., 2011)

Manifestare Tratament Doz adult Doz copil Comentarii

Infecii ale pielii i esuturilor moi (SSTI)
Abcese, furuncule, Incizie i drenaj Pentru abcese i furuncule, incizia i drenajul sunt
carbuncule suficiente n majoritatea cazurilor.
Celulit purulent Clindamicin 300450 mg 1013 Diareea asociat cu Clostridium difficile poate
(= celulit asociat cu x3/zi, oral mg/kg/doz oral apare mai frecvent n comparaie cu ali ageni
scurgere purulent sau la 68 h, < 40 orali
exsudat n absena unui mg/kg/zi
abces drenabil)

Trimetoprim/ 12 cp cu doz Trimetoprim 46 SXT nu este recomandat n al treilea trimestru de

sulfametoxazol dubl, x2/zi, oral mg/kg/doz, sarcin i la copii <2 luni.
sulfametoxazol
2030
mg/kg/doz oral
la 12 h
Doxiciclin 100 mg x2/zi, 45kg: 2 Tetraciclinele nu sunt recomandate la copii sub
oral mg/kg/doz oral vrsta de 8 ani i n sarcin.
la 12 h
>45kg: doz de
adult
Minociclin 200 mg 1, apoi 4 mg/kg 1 oral,
100 mg x2/zi, apoi 2
oral mg/kg/doz oral
la 12 h
Linezolid 600 mg x2/zi, 10 mg/kg/doz Scump
oral oral la 8 h, <600
mg/doz
Celulit non-purulent (= -lactam (eg, cefalexin 500 mg oral Este recomandat terapie empiric pentru
celulit fr scurgere i dicloxacilin) zilnic streptocci de grup A. Este recomandat terapia
Manifestare Tratament Doz adult Doz copil Comentarii
purulent sau exsudat i empiric pentru CA-MRSA la pacieni care nu
fr abces asociat) rspund la -lactam.
Clindamicin 300450 mg 1013 Asigur terapie pentru stretococi -hemolitici i
x3/zi, oral mg/kg/doz oral CA-MRSA
la 68 h, < 40
mg/kg/zi
-lactam (eg, Amoxicilin: 500 Asigur terapie pentru stretococi -hemolitici i
amoxicilin) i/sau mg x3/zi, oral CA-MRSA
trimetoprim/ Vezi mai sus Vezi mai sus
sulfametoxazol sau o pentru celelalte pentru SXT i
tetraciclin antibiotce tetraciclin
Linezolid 600 mg x2/zi, 10 mg/kg/doz Asigur terapie pentru stretococi -hemolitici i
oral oral la 8 h, <600 CA-MRSA
mg/doz
SSTI complicate Vancomicin 1520 15 mg/kg/doz IV
mg/kg/doz IV la 6 h
la 812 h
Linezolid 600 mg x2/zi, 10 mg/kg/doz Pentru copii 12 ani, 600 mg x2/zi, oral/IV. Nu se
oral sau IV oral/IV la 8 h, recomand n sarcin.
<600 mg/doz
Daptomicin 4 mg/kg/doz n studiu Dozele n studiu pentru copii sunt: 5 mg/kg (1217
IV, zilnic ani), 7 mg/kg (711 ani), 9 mg/kg (26 ani). Nu se
recomand n sarcin.
Telavancin 10 mg/kg/doz Nedeterminat Nu se recomand n sarcin.
IV, zilnic
Clindamicin 600 mg x3/zi 1013 Administrare cu precauie n sarcin.
oral/IV mg/kg/doz oral
la 68 h, < 40
mg/kg/zi
Bacteriemie i endocardit infecioas
Bacteriemie Vancomicin 1520 15 mg/kg/doz IV Asocierea de gentamicin sau rifampicin la
Manifestare Tratament Doz adult Doz copil Comentarii
mg/kg/doz IV la 6 h vancomicin nu este recomandat de rutin
la 812 h
Daptomicin 6 mg/kg/doz 6-10 mg/kg/doz Pentru aduli, unii experi recomand doze mai
IV, zilnic IV, zilnic mari, de 810 mg/kg/doz IV, zilnic. Administrare
cu precauie n sarcin.
Endocardit infecioas pe La fel ca pentru
valv nativ bacteriemie
Endocardit infecioas pe Vancomicin i 1520 15 mg/kg/doz IV
valv protezat mg/kg/doz IV la 6 h
la 812 h
gentamicin i 1 mg/kg/doz 1 mg/kg/doz IV
IV la 8 h la 8 h
rifampicin 300 mg PO/IV 5 mg/kg/doz
la 8 h oral/IV la 8 h
Pneumonie
Vancomicin 1520 15 mg/kg/doz IV
mg/kg/doz IV la 6 h
la 812 h
Linezolid 600 mg x2/zi, 10 mg/kg/doz Pentru copii 12 ani, 600 mg x2/zi oral/IV.
oral/IV oral/IV la 8 h, Nu se recomand n sarcin.
<600 mg/doz
Clindamicin 600 mg x3/zi 1013 Administrare cu precauie n sarcin.
oral/IV mg/kg/doz oral
la 68 h, < 40
mg/kg/zi
Infecii osoase i articulare
Osteomielit Vancomicin 1520 15 mg/kg/doz IV Tratamentul se bazeaz pe debridarea chirurgical
mg/kg/doz IV la 6 h i drenajul abceselor de pri moi asociate. Unii
la 812 h experi recomand asocierea de rifampicin
600 mg zilnic sau 300450 mg x2/zi.
Daptomicin 6 mg/kg/doz 6-10 mg/kg/doz
Manifestare Tratament Doz adult Doz copil Comentarii
IV, zilnic IV, zilnic
Linezolid 600 mg x2/zi, 10 mg/kg/doz Pentru copii 12 ani, se recomand linezolid 600
oral/IV oral/IV la 8 h, mg x2/zi oral/IV.
<600 mg/doz
Clindamicin 600 mg x3/zi 1013
oral/IV mg/kg/doz oral
la 68 h, < 40
mg/kg/zi
Trimetoprim/ 3,54,0 Nedeterminat Un comprimat cu doz dubl de SXT conine 160
sulfametoxazol i mg/kg/doz mg trimetoprim. Pentru un adult de 80 kg, 2 astfel
rifampicin oral/IV, la 8-12 de comprimate produc o doz de 4 mg/kg.
h
Artrit septic Vancomicin 1520 15 mg/kg/doz IV ntotdeauna trebuie realizate drenajul i debrifarea
mg/kg/doz IV la 6 h speiului articular.
la 812 h
Daptomicin 6 mg/kg/doz 6-10 mg/kg/doz
IV, zilnic IV, zilnic
Linezolid 600 mg x2/zi, 10 mg/kg/doz
oral/IV oral/IV la 8 h,
<600 mg/doz
Clindamicin 600 mg PO/IV 1013
TID mg/kg/doz oral
la 68 h, < 40
mg/kg/zi
Trimetoprim/ 3,54,0 Nedeterminat
sulfametoxazol mg/kg/doz
oral/IV, la 8-12
h
Infecii ale sistemului nervos central
Meningit Vancomicin 1520 15 mg/kg/doz IV Unii experi recomand asocierea de rifampicin
mg/kg/doz IV la 6 h 600 mg zilnic sau 300450 mg x2/zi.
 Manifestare Tratament Doz adult Doz copil Comentarii
la 812 h
Linezolid 600 mg x2/zi, 10 mg/kg/doz Pentru copii 12 ani, se recomand linezolid 600
oral/IV oral/IV la 8 h, mg x2/zi.
<600 mg/doz
Trimetoprim/ 5 mg/kg/doz Nedeterminat
sulfametoxazol oral/IV, la 8-12
h
Abces cerebral, empiem Vancomicin 1520 15 mg/kg/doz IV Unii experi recomand asocierea de rifampicin
subdural, abces epidural mg/kg/doz IV la 6 h 600 mg zilnic sau 300450 mg x2/zi.
la 812 h
Linezolid 600 mg x2/zi, 10 mg/kg/doz Pentru copii 12 ani, se recomand linezolid 600
oral/IV oral/IV la 8 h, mg x2/zi.
<600 mg/doz
Trimetoprim/ 5 mg/kg/doz Nedeterminat
sulfametoxazol oral/IV, la 8-12
h
Tromboz septic a Vancomicin 1520 15 mg/kg/doz IV Unii experi recomand asocierea de rifampicin
sinusului cavernos sau a mg/kg/doz IV la 6 h 600 mg zilnic sau 300450 mg x2/zi.
sinusului venos dural la 812 h
Linezolid 600 mg x2/zi, 10 mg/kg/doz Pentru copii 12 ani, se recomand linezolid 600
oral/IV oral/IV la 8 h, mg x2/zi.
<600 mg/doz
Trimetoprim/ 5 mg/kg/doz Nedeterminat
sulfametoxazol oral/IV, la 8-12
h
IV= intravenos; SXT = Trimetoprim/sulfametoxazol
 BIBLIOGRAFIE

1. Adams DN. Shortcut Method for Extraction of Staphylococcus aureus DNA from Blood
Cultures and Conventional Cultures for Use in Real-Time PCR Assays. J Clin Microbiol 2005;
43: 2932-33.
2. Al-Talib H, Yean CY, Al-Khateeb A, et al. A pentaplex PCR assay for the rapid detection of
methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Panton-Valentine Leucocidin. BMC
Microbiol 2009; 9: 113-5.
3. Amador-Miranda R, Bertrn-Pasarell J, Gonzlez M, Conde A. Methicillin-resistant
Staphyloccocus aureus in the community. Bol Asoc Med P R 2008; 100: 21-3.
4. Anand KB, Agrawal P, Kumar S, Kapila K. Comparison of cefoxitin disc diffusion test,
oxacillin screen agar, and PCR for mecA gene for detection of MRSA. Indian J Med
Microbiol 2009; 27: 27-9.
5. Appelbaum PC. Reduced glycopeptide susceptibility in methicillin-resistant Staphylococcus
aureus (MRSA). Int J Antimicrob Agents 2007; 30: 398-408.
6. Arakawa Y, Ike Y, Nagasawa M. Where has vancomycin heterogenously resistant
Staphylococcus aureus gone? Lancet 2004; 363: 1401.
7. Baggett HC, Hennessy TW, Rudolph K et al. Community-onset methicillin-resistant
Staphylococcus aureus associated with antibiotic use and the cytotoxin Panton-Valentine
leukocidin during a furunculosis outbreak in rural Alaska. J Infect Dis 2004; 189: 1565-73.
8. Berger-Bchi B, Rohrer S. Factors influencing methicillin resistance in staphylococci. Arch
Microbiol 2002; 178: 165-71.
9. Berglund C, Prevost G, Laventie B, Keller D, Soderquist B. The genes for Panton Valentine
leukocidin (PVL) are conserved in diverse lines of methicillin resistant and methicillin
susceptible Staphylococcus aureus. Microbes Infect 2008; 10: 878-84.
10. Berglund C, Mlling R, Sjberg L, Sderquist B. Predominance of staphylococcal cassette
chromosome mec (SCCmec) type IV among methicillin-resistant Staphylococcus aureus
(MRSA) in a Swedish county and presence of unknown SCCmec Types with Panton-
Valentine leukocidin genes. Clin Microbiol Infect 2005; 11: 447-56.
11. Blake JE, Metcalfe MA. A shared noncapsular antigen is responsible for false-positive
reactions by Staphylococcus epidermidis in commercial agglutination tests for
Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 2001; 39: 544-50.
12. Bocchini CE, Hulten KG, Mason EO Jr, Gonzalez BE, Hammerman WA, Kaplan SL. Panton-
Valentine leukocidin genes are associated with enhanced inflammatory response and
local disease in acute hematogenous Staphylococcus aureus osteomyelitis in children.
Pediatrics 2006; 117: 433-40.
13. Boyce JM, Cookson B, Christiansen K, Hori S, Vuopio-Varkila J, Kocagoz S, et al. Meticillin-
resistant Staphylococcus aureus. Lancet Infect Dis 2005; 5:653 63.
14. Boyle Vavra S, Carez RB, Daum RS. Development of vancomycin and lysostaphin resistance
in a methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother 2001; 48: 617-
25.

124
15. Boyle-Vavra S, Ereshefsky B, Wang CC et al. Successful multiresistant community-
associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineage from Taipei, Taiwan, that
carries either the novel staphylococcal chromosome cassette mec (SCCmec) type VT or
SCCmec type IV. J Clin Microbiol 2005; 43: 4719-30.
16. Boyle-Vavra S, Daum RS. Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus
aureus: the role of Panton-Valentine leukocidin. Lab. Investig 2007; 87: 3-9.
17. Brown DFJ, Edwards DI, Hawkey PM et al. Guidelines for the laboratory diagnosis and
susceptibility testing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). J. Antimicrob.
Chemother 2005; 56: 1000-18.
18. Buiuc D, Negu M (ed.). Tratat de microbiologie clinic, Ed a II-a, Editura Medical,
Bucureti, 2008, p. 472-74, 564-82.
19. Bukharie HA. Increasing threat of community-acquired methicillin-resistant
Staphylococcus aureus. Am J Med Sci 2010; 340(5):378-81.
20. Carleton HA, Diep BA, Charlebois ED, et al. Community-adapted methicillin-resistant
Staphylococcus aureus (MRSA): population dynamics of an expanding community
reservoir of MRSA. J Infect Dis 2004; 190: 1730-8.
21. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Staphylococcus aureus resistant to
vancomycin USA 2002. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2002; 51: 565-7.
22. Chambers HF, Deleo FR. Waves of resistance: Staphylococcus aureus in the antibiotic era.
Nat Rev Microbiol 2009; 7: 629-41.
23. Chang S, Sievert DM, Hageman JC, et al. Infection with vancomycin-resistant
Staphylococcus aureus containing the vanA resistance gene. N Engl J Med 2003; 348:
1342-7.
24. Cookson B. Staphylococcus aureus. In Emmerson M, Kibbler C, Hawkey P eds. Principles of
Clinical Bacteriology. Oxford: John Wiley, 1997: 109-30.
25. Cruciani M, Gatti G, Lazzarini L et al. Penetration of vancomycin into human lung tissue. J
Antimicrob Chemother. 1996; 38: 865-9.
26. Daurel C, Leclercq R. Vancomycin, what else? Arch Pediatr 2010. 17, Suppl 4: S121-8.
27. David MZ, Daum RS. Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus:
Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic. Clin Microb Rev 2010;
23 (3): 61687.
28. Davis SL, Perri MB, Donabedian SM, et al. Epidemiology and outcomes of community-
associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. J Clin Microbiol 2007; 45:
1705-11.
29. Deurenberg RH, Vink C, Kalenic S, et al. The molecular evolution of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Infect 2007; 13: 222-35.
30. Deurenberg RH, Stobberingh EE. The evolution of Staphylococcus aureus. Infect Genet
Evol 2008; 8: 747-63.
31. Deurenberg RH, Stobberingh EE. The Molecular Evolution of Hospital- and Community-
Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus. Curr Mol Med 2009; 9: 100-15.
32. Diep BA, Sensabaugh GF, Somboona NA et al. Widespread skin and soft-tissue infections
due to two methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains harboring the genes for
Panton-Valentine leucocidin. J Clin Microbiol 2004; 42: 2080-4.
33. Diep BA, Otto M. The role of virulence determinants in community-associated MRSA
pathogenesis. Trends Microbiol 2008; 16(8): 3619.
34. Diep BA, Chan L, Tattevin P et al. Polymorphonuclear leukocytes mediate Staphylococcus
aureus Panton-Valentine leukocidin-induced lung inflammation and injury. Proc Natl Acad
Sci USA 2010; 107: 5587-92.

125
35. Dorneanu O, Miftode E, Vremer T, Nstase E, Filip O, Luca V. Prevalence and
characteristics of Staphylococcus aureus isolated from infections in Northeast Romania. J
Prev Med 2006; 14: 66-70.
36. Enright MC, Robinson DA, Randle G, et al. The evolutionary history of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus (MRSA). Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 7687-92.
37. European Centre for Disease Prevention and Control. Antimicrobial resistance surveillance
in Europe 2009. Annual Report of the European Antimicrobial Resistance Surveillance
Network (EARS-Net). Stockholm: ECDC 2010: 29-30.
38. Eveillard M, Lescure FX, Eb F, Schmit JL. Portage, acquisition et transmission de
Staphylococcus aureus rsistant la mticilline en milieu communautaire. Consquences
en terme de politique de prvention et d'antibiothrapie. Med Mal Infect 2002; 32: 717-
24.
39. Fang H, Hedin G, Li G, Nord CE. Genetic diversity of community-associated methicillin-
resistant Staphylococcus aureus in southern Stockholm. Clin Microbiol Infect 2008; 14:
370-76.
40. Faruk H, Murray P. Medium dependance for rapid detection of thermonuclease activity in
blood cultures broths. J Clin Microbiol 1986; 24: 483-3.
41. Felten A, Grandry B, Lagrange PH, Casin I. Evaluation of three techniques for detection of
low-level methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA): a disk diffusion method
with cefoxitin and moxalactam, the Vitek 2 system, and the MRSA-screen latex
agglutination test. J Clin Microbiol 2002; 40: 2766-71.
42. Fluit AC, Visser MR, Schmitz FJ. Molecular detection of antimicrobial resistance. Clin
Microbiol Rev 2001; 14: 83671.
43. Fong RK, Low J, Koh TH et al. Clinical features and treatment outcomes of vancomycin-
intermediate Staphylococcus aureus (VISA) and heteroresistant vancomycin-intermediate
Staphylococcus aureus (hVISA) in a tertiary care institution in Singapore. Eur J Clin
Microbiol Infect Dis 2009; 28: 983-7.
44. Fonsale N, Bes M, Verdier I et al. Specific identification of Staphylococcus aureus by
Staphychrom II, a rapid chromogenic staphycoagulase test. J Clin Microbiol 2004; 42:
1962-4.
45. Fridkin SK, Hageman J, McDougal LK et al. Epidemiological and microbiological
characterization of infections caused by Staphylococcus aureus with reduced
susceptibility to vancomycin, United States, 1997-2001. Clin Infect Dis 2003; 36: 429-39.
46. Fridkin SK, Hageman JC, Morrison M, et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
disease in three communities. N Engl J Med 2005; 352: 1436-44.
47. Gherardi G, De Florio L, Lorino G, et al. Macrolide resistance genotypes and phenotypes
among erythromycin-resistant clinical isolates of Staphylococcus aureus and coagulase-
negative staphylococci, Italy. FEMS Immunol Med Microbiol 2009; 55: 62-7.
48. Giannouli S, Labrou M, Kzritsis A, et al. Detection of mutations in the FemXAB protein
family in oxacillin-susceptible mecA-positive Staphylococcus aureus clinical isolates. J
Antimicrob Chemother 2010; 65: 626-33.
49. Gillet Y, Issartel B, Vanhems P, et al. Association between Staphylococcus aureus strains
carrying gene for Panton-Valentine leukocidin and highly lethal necrotising pneumonia in
young immunocompetent patients. Lancet 2002; 359: 753-9.
50. Gonzalez-Ruiz A, Richardson J. Are glycopeptides still appropriate and convenient for
empiric use? J Chemother 2008; 20: 531-41.
51. Gravet A, Colin DA, Keller D, et al. Characterization of a novel structural member, LukE-
LukD, of the bi-component staphylococcal leucotoxins family. FEBS Lett 1998; 436, 202-8.

126
52. Grisold AJ, Leitner E, Muhlbauer G et al. Detection of methicillin-resistant Staphylococcus
aureus and simultaneous confirmation bz automatic nucleic acid extraction and real-time
PCR. J Clin Microbiol 2002; 40: 2392-7.
53. Hanaki HK, Kuwahara-Arai K, Boyle-Vavra S et al. Activated cell-wall synthesis is associated
with vancomycin resistance in methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical strains
Mu3 and Mu50. J Antimicrob Chemother 1998; 42: 199-209.
54. Hedin G, Fang H. The epidemiology of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)
in southern Stockholm 2000-2003. Microb Drug Resist 2007; 13: 241-50.
55. Higuchi W, Takano T, Teng LJ, Yamamoto T. Structure and specific detection of
staphylococcal cassette chromosome mec type VII. Biochem Biophys Res Commun 2008;
377: 752-6.
56. Hiramatsu K, Aritaka N, Hanaki H et al. Dissemination in Japanese hospitals of strains of
Staphylococcus aureus heterogenously resistant to vancomycin. Lancet 1997; 350: 1670-
3.
57. Hiramatsu K, Hanaki H, Ino T et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus clinical
strain with reduced vancomycin susceptibility. J Antimicrob Chemother 1997; 40: 135-6.
58. Hiramatsu K, Katayama Y, Yuzawa H, Ito T. Molecular genetics of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus. Int J Med Microbiol 2002; 292: 67-74.
59. Hiramatsu K, Cui L, Kuroda M, Ito T. The emergence and evolution of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus. Trends Microbiol 2001; 9: 486-93.
60. Holmes A, Ganner M, McGuane S, Pitt TL, Cookson BD, Kearns AM. Staphylococcus aureus
isolates carrying Panton-Valentine Leucocidin genes in England and Wales: frequency,
characterization, and association with clinical disease. J Clin Microbiol 2005; 43: 2384- 90.
61. Horne KC, Howden BP, Grabsch EA et al. Prospective comparison of the clinical impact of
hetrogenous vancomycin-intermediate methicicllin-resistant Staphylococcus aureus
(MRSA) and vancomycin-susceptible MRSA. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53:
3447-52.
62. Howden BP, Ward BP, Charles PG et al. Treatment outcomes for serious infections caused
by methicillin-resistant Staphylococcus aureus with reduced vancomycin susceptibility.
Clin Infect Dis 2004; 38: 521-8.
63. Howden BP, Johnson PD, Ward PB, Stinear TP, Davies JK. Isolates with low-level
vancomycin resistance associated with persistent methicillin-resistant Staphylococcus
aureus bacteremia. Antimicrob Agents Chemother 2006; 50: 3039-47.
64. Howden BP, Davies JK, Johnson PDR, Stinear TP, Grayson ML. Reduced vancomycin
susceptibility in Staphylococcus aureus, including vancomycin-intermediate and
heterogeneous vancomycin-intermediate strains: resistance mechanisms, laboratory
detection, and clinical implications. Clin Microb Rev 2010; 23 (1): 99139.
65. Howe RA, Walsh TR. hGISA: seek and ye shall find. Lancet 2004; 364: 500-1.
66. Huletsky A, Giroux R, Rossbach V, et al. New real-time PCR assay for rapid detection of
methicillin-resistant Staphylococcus aureus directly from specimens containing a mixture
of staphylococci. J Clin Microbiol 2004; 42: 1875-84.
67. Hrlimann-Dalel RL, Ryffel C, Kayser FH, Berger-Bchi B. Survey of the methicillin
resistance-associated genes mecA, mecR1-mecI, and femA-femB in clinical isolates of
methicillin-resistant Staphylococcus aureus.Antimicrob Agents Chemother 1992; 36: 2617-
21.
68. Ionescu R, Mediavilla JR, Chen L, Grigorescu DO, Idomir M, Kreiswirth BN, et al. Molecular
characterization and antibiotic susceptibility of Staphylococcus aureus from a
multidisciplinary hospital in Romania. Microb Drug Resist 2010; 16(4):263-72.
69. International Working Group on the Classification of Staphylococcal Cassette
Chromosome Elements (IWG-SCC), Classification of Staphylococcal Cassette Chromosome

127
 mec (SCCmec): Guidelines for Reporting Novel SCCmec Elements. Antimicrob. Agents
Chemother 2009; 53: 4961-7.
70. Ippolito G, Leone S, Lauria FN, Nicastri E, Wenzel RP. Methicillin-resistant Staphylococcus
aureus: the superbug. Int J Infect Dis 2010; 14 Suppl 4:S7-11.
71. Jarvis WR. Epidemiology, appropriateness, and cost of vancomycin use. Clin Infect Dis
1998; 26: 1200-3.
72. Jehl F, Chromarat M, Weber M, Gerard A. De la antibiogram la prescripie. Ediie
bioMrieux. Ediia a 2-a. Editura tiinelor Medicale. 2003.
73. John CC, Schreiber JR. Therapies and vaccines for emerging bacterial infections: learning
from methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Pediatr Clin North Am 2006; 53: 699-
713.
74. Kilic A, Li H, Stratton CW, Tang YW. Antimicrobial susceptibility patterns and
staphylococcal cassette chromosome mec types of, as well as Panton-Valentine leukocidin
occurrence among, methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from children and
adults in middle Tennessee. J Clin Microbiol 2006; 44: 4436-40.
75. Kim JS, Song W, Kim HS, et al. Association between the methicillin resistance of clinical
isolates of Staphylococcus aureus, their staphylococcal cassette chromosome mec
(SCCmec) subtype classification, and their toxin gene profiles. Diagn Microbiol Infect Dis
2006; 56: 289-95.
76. Kinney KK. Treatment of infections caused by antimicrobial-resistant gram-positive
bacteria. Am J Med Sci 2010; 340(3):209-17.
77. Klevens RM, Morrison MA, Nadle J, et al. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus
aureus infections in the United States. JAMA 2007; 298: 1763-71.
78. Kluytmans-Vandenbergh MF, Kluytmans JA. Community-acquired methicillin- resistant
Staphylococcus aureus: current perspectives. Clin Microbiol Infect 2006; 12: 9-15.
79. Kck R, Becker K, Cookson B, et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA):
burden of disease and control challenges in Europe. Euro Surveill 2010; 15(14): 1-9.
80. Kubista M, Andrade JM, Bengtsson M, et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol
Aspects Med 2006; 27: 95-125.
81. Kuusela P, Hilden P, Savolainen K et al. Rapid detection of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus strains not identified by slide agglutination tests. J Clin Microbiol
1994; 32: 143-7.
82. Lawyer F, Stoffel S, Saiki RK, et al. High-level expression, purification, and enzymatic
characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form
deficient in 5' to 3' exonuclease activity. Genome Res 1993; 2: 275287.
83. Levi K, Towner KJ. Evaluation of Roche LightCycler kits for the detection of
methicillin+resistant Staphylococcus aureus in patient screening broths. Clin Microbiol
Infect 2003; 10 Suppl 3: 273.
84. Licker M, Bdioiu L, Negru C, Brnzeu C, Zugravu R, Horhat F, et al. Bacterial
multiresistance emergence in South-Western Romania. Bacteriol Virusol Parazitol
Epidemiol 2009; 54(2):79-86.
85. Lina G, Pimont Y, Godail-Gamot F et al. Involvement of Panton-Valentine-leukocidin-
producing Staphylococcus aureus in primary skin infections and pneumonia. Clin Infect Dis
1999; 29: 1128-32.
86. Lipinska U, Hermans K, Meulemans L, et al. Panton-Valentine leukocidin does play a role
in the early stage of Staphylococcus aureus skin infections: A Rabbit Model. PLoS One
2011; 6(8): e22864.
87. Liu C, Bayer A., Cosgrove SE et al. Clinical Practice Guidelines by the Infectious Diseases
Society of America for the Treatment of Methicillin-Resistant StaphylococcusAureus
Infections in Adults and Children. Clin Infect Dis 2011:1-38.

128
88. Llarrull LI, Fisher JF, Mobashery S. Molecular basis and phenotype of methicillin resistance
in Staphylococcus aureus and insights into new beta-lactams that meet the challenge.
Antimicrob. Agents Chemother 2009; 53 (10): 4051-63.
89. Leffler B, Hussain M, Grundmeier M et al. Staphylococcus aureus panton-valentine
leukocidin is a very potent cytotoxic factor for human neutrophils. PLoS Pathog 2010;
6(1).
90. Madison BM, Baselski VS. Rapid identification of Staphylococcus aureus in blood cultures
by thermonuclease testing. J Clin Microbiol 1983; 18: 722-4.
91. Mainardi JL, Shlaes DM, Goering RV et al. Decreased teicoplanin susceptibility of
methicillin-resistant strains of Staphylococcus aureus. J Infect Dis 1995; 171: 1646-50.
92. Maor Y, Hagin M, Belausov N et al. Clinical features of heteroresistant vancomycin-
intermediate Staphylococcus aureus bacteremia versus those of methicillin-resistant S.
aureus bacteremia. J Infect Dis 2009; 199: 619-24.
93. McDonald RR, Antonishyn NA, Hansen T, et al. Development of a triplex real-time PCR
assay for detection of Panton-Valentine Leukocidin toxin genes in clinical isolates of
methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 2005; 43: 6147-9.
94. Memmi G, Filipe SR, Pinho MG, Fu Z, Cheung A. Staphylococcus aureus PBP4 Is Essential
for -Lactam Resistance in Community-Acquired Methicillin-Resistant Strains. Antimicrob
Agents Chemother 2008; 52 (11): 3955-66.
95. Miller MB, Meyer H, Rogers E, et al. Comparison of conventional susceptibility testing,
penicillin-binding protein 2a latex agglutination testing, and mecA real-time PCR for
detection of oxacillin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase-negative
Staphylococcus. J Clin Microbiol 2005; 43: 3450-2.
96. Moise PA, Sakoulas G, Forrest A et al. Vancomycin in vitro bactericidal activity and its
relationship to efficacy in clearance of methicillin-resistant Staphylococcus aureus
bacteremia. Antimicrob Agents Chemother 2007; 51: 2582-6.
97. Moroney SM, Heller LC, Arbuckle J, et al. Staphylococcal cassette chromosome mec and
Panton-Valentine leukocidin characterization of methicillin-resistant Staphylococcus
aureus clones. J Clin Microbiol 2007; 45: 1019-21.
98. Musta AC, Riederer K, Shemes S et al. Vancomycin MIC plus heteroresistance and
outcome of methicillin-resistant Staphylococcus aureus bacteremia: trends over 11 years.
J Clin Microbiol 2009; 47: 1640-44.
99. Muttaiyah S, Coombs G, Pandey S et al. Incidence, risk factors and outcomes of Panton-
Valentine leukocidin-positive methicillin-susceptible Staphylococcus aureus infections in
Auckland, New Zeeland. J Clin Microbiol 2010; 48: 3470-4.
100. Nstase E, Dorneanu O, Vremer T, Logigan C, Miftode E, Dorob C. MecA and pvl genes
detection in Staphylococcus aureus strains isolated from lower respiratory tract
infections. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi 2010; 114 (4): 1162-8.
101. Nelson JL, Rice KC, Slater SR et al. Vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus
strains have impaired acetate catabolism: implications for polysaccharide intercellular
adhesin synthesis and autolysis. Antimicrob Agents Chemother 2007; 51: 616-22.
102. Noto MJ, Kreiswirth BN, Monk AB, Archer GL. Gene acquisition at the insertion site for
SCCmec, the genomic island conferring methicillin resistance in Staphylococcus aureus. J
Bacteriol 2008; 190: 1276-83.
103. Okuma K, Iwakawa K, Turnidge JD, et al. Dissemination of new methicillin-resistant
Staphylococcus aureus clones in the community. J Clin Microbiol 2002; 40: 4289-94.
104. Ornskov D, Kolmos B, Bendix Horn P, et al. Screening for methicillin-resistant
Staphylococcus aureus in clinical swabs using a high-throughput real-time PCR-based
method. Clin Microbiol Infect 2008; 14: 22-28.

129
105. Otter JA, French GL. Nosocomial transmission of community associated methicillin-
resistant Staphylococcus aureus: an emerging threat. Lancet Infect Dis 2006; 6: 753-5.
106. Peterson LR. A review of tigecycline - the first glycylcycline. Int J Antimicrob Agents 2008;
32: S215-22.
107. Plipat N, Livni G, Bertram H, Thomson RB Jr. Unstable vancomycin heteroresistance is
common among clinical isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin
Microbiol 2005; 43(5): 2494-6.
108. Pottumarthya S, Fritschea TR, Jones RN. Evaluation of alternative disk diffusion methods
for detecting mecA-mediated oxacillin resistance in an international collection of
staphylococci: Validation report from the SENTRY antimicrobial surveillance program.
Diag Micro Infect Dis 2005; 51: 57-62.
109. Prevost G, Couppie P, Prevost P, et al. Epidemiological data on Staphylococcus aureus
strains producing synergohymenotropic toxins. J Med Microbiol 1995; 42, 237-45.
110. Rachel JG. Understanding the success of methicillin-resistant Staphylococcus aureus
strains causing epidemic disease in the community. J Infect Dis 2008; 197: 179-82.
111. Reiter KC, Machado AB, Freitas AL et al. High prevalence of methicillin-resistant
Staphylococcus aureus with SCCmec type III in cystic fibrosis patients in southern. Brazil.
Rev Soc Bras Med Trop 2010; 43(4):377-81.
112. Renwick L, Hardie A, Girvan EK, et al. Detection of meticillin-resistant Staphylococcus
aureus and Panton-Valentine leukocidin directly from clinical samples and the
development of a multiplex assay using real-time polymerase chain reaction. Eur J Clin
Microbiol Infect Dis 2008; 27: 791-6.
113. Reygaert W. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA): identification and
susceptibility testing techniques. Clin Lab Sci 2009; 22: 120-4.
114. Richter SS, Kealey DE, Murray CT et al. The in vitro activity of daptomycin against
Staphylococcus aureus and Enterococcus species. J Antimicrob Chemother 2003; 52: 123-
7.
115. Riederer K, Shemes S, Chase P et al. Detection of vancomycin-intermediately susceptible
and heterogeneous Staphylococcus aureus isolates: comparison of Etest and agar
screening methods. J Clin Microbiol 2011(Epub).
116. Said-Salim B, Mathema B, Kreiswirth BN. Community-acquired methicillin-resistant
Staphylococcus aureus: an emerging pathogen. Infect Control Hosp Epidemiol 2003; 24:
451-5.
117. Said-Salim B, Mathema B, Braughton K, et al. Differential distribution and expression of
Panton-Valentine leucocidin among community-acquired methicillin-resistant
Staphylococcus aureus strains. J Clin Microbiol 2005; 43: 3373-9.
118. Sakoulas G, Moise-Broder PA, Schentag J et al. Relationship of MIC and bactericidal
activity to efficacy of vancomycin for treatment of methicillin-resistant Staphylococcus
aureus bacteremia. J Clin Microbiol 2004; 42: 2398-402.
119. Salimnia H, Brown WJ. Detection of Oxacillin Resistance in Staphylococcus aureus:
Comparison of Phoenix Oxacillin and Cefoxitin MICs, MicroScan Oxacillin MIC, Oxacillin
and Cefoxitin Disk Diffusion, and mecA Gene Detection. Interscience Conference on
Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC). 2005.
120. Satola SW, Farley MM, Anderson KF et al. Comparison of detection methods for
heteroresistant vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus, with the population
analysis profile method as the reference method. J Clin Microbiol 2011; 49(1):177-83.
121. Schentag JJ. Antimicrobial action and pharmacokinetics/pharmacodynamics: the use of
AUIC to improve efficacy and avoid resistance. J Chemother 1999; 11: 426-39.
122. Schentag JJ, Hyatt JM, Carr JC et al. Genesis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus
(MRSA), how treatment of MRSA infections has selected for vancomycin-resistant

130
 Enterococcus faecium, and the importance of antibiotic management and infection
control. Clin Infect Dis 1998; 26(5): 1204-14.
123. Schito GC. The importance of the development of antibiotic resistance in Staphylococcus
aureus. Clin Microbiol Infect 2006; 12: 3-8.
124. Seybold U, Kourbatova EV, Johnson JG, et al. Emergence of community-associated
methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA300 genotype as a major cause of health
care-associated blood stream infections. Clin Infect Dis 2006; 42: 647-56.
125. Shrestha B, Pokhrel BM, Mohapatra TM. Antibiotic susceptibility pattern of nosocomial
isolates of Staphylococcus aureus in a tertiary care hospital, Nepal. J Nepal Med Assoc
2009; 48(175):234-8.
126. Sieradzki K, Tomasz A. Inhibition of cell wall turnover and autolysis by vancomycin in a
highly vancomycin-resistant mutant of Staphylococcus aureus. J Bacteriol 1997; 179:
2557-66.
127. Sieradzki K, Tomasz A. Gradual alterations in cell wall strcuture and methabolism in
vancomycin-resistant mutants of Staphylococcus aureus. J Bacteriol 1999; 181: 7566-70.
128. Silverman JA, Oliver N, Andrew T et al. Resistance studies with daptomycin. Antimicrobial
Agents Chemother 2001; 45: 1799802.
129. Sisea C, Pamfil D. Testarea OMG. Editura Bioflux, Cluj-Napoca, 2009, p. 137-141.
130. Soriano A, Marco F, Martinez JA et al. Influence of vancomycin minimum inhibitory
concentration on the treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus
bacteremia.Clin Infect Dis 2008; 56: 193-200.
131. Spanu T, Sanguinetti M, Ciccaglione D et al. Use of VITEK 2 system for rapid identification
of clinical isolates of staphylococci from bloodstream infections. J Clin Microbiol 2003; 4:
4259-63.
132. Srinivasan A, Dick JD, Perl TM. Vancomycin resistance in staphylococci. Clin Microbiol Rev
2002; 15: 430-8.
133. Steenbergen JN, Adler J, Thorne GM et al. Daptomycin: a lipopeptide antibiotic for the
treatment of serious Gram-positive infections. J Antimicrob Chemother 2005; 55: 283-8.
134. Stefani S, Goglio A. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: related infections and
antibiotic resistance. Int J Infect Dis 2010; 14 Suppl 4:S19-22.
135. Szkely E, Lorinczi L, Bilca D, Fodor E, Ski J, Sabau M. Incidence, antibiotic resistance and
clonal relations of MRSA strains isolated from a Romanian university hospital. Acta
Microbiol Immunol Hung 2008; 55(1):1-13.
136. Tavares A, Miragaia M, Mato R, et al. High prevalence of hospital-associated
Staphylococcus aureus epidemic clones in the community in Portugal: evidence for
blurring of community-hospital boundaries. Abstracts of 21st ECCMID / 27th ICC. 2011;
Abstract number: 0350.
137. Tristan A, Ferry T, Durand G, et al. Virulence determinants in community and hospital
meticillin-resistant Staphylococcus aureus. J Hosp Infect 2007; 65: 105-9.
138. Tsiodras S, Gold HS, Sakoulas G et al. Linezolid resistance in a clinical isolate of
Staphylococcus aureus. Lancet 200; 358: 207-8.
139. Valsesia G, Rossi M, Bertschy S, Pfyffer GE. Emergence of SCCmec type IV and SCCmec
type V methicillin-resistant Staphylococcus aureus containing the Panton-Valentine
leukocidin genes in a large Academic Teaching Hospital in Central Switzerland: external
invaders or persisting circulators? J Clin Microbiol 2010; 48: 720-7.
140. van Hal JS, Paterson DL. Systematic review and meta-analysis of the significance of
heterogeneous vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus isolates. Antimicrob
Agents Chemother 2011; 55: 405-10.
141. van Hal JS, Paterson DL. New Gram-positive antibiotics: better than vancomycin? Curr
Opin Infect Dis 2011; 24: 515-20.

131
142. van Hal SJ, Wehrhahn MC, Barbagiannakos T et al. Performance of various testing
methodologies for detection of heteroresistant vancomycin-intermediate Staphylococcus
aureus in bloodstream isolates. J Clin Microbiol 2011; 49: 1489-94.
143. Vandenesch F, Naimi T, Enright M, et al. Community-acquired methicillin-resistant
Staphylococcus aureus carrying Panton-Valentine leukocidin genes: worldwide
emergence. Emerg Infect Dis 2003; 9: 978-84.
144. Vremer T, Iancu LS, Logigan C, Nstase E, Miftode E, Lunc C, Dorneanu O. Optimization
of Triplex Real Time PCR for detecting Staphylococcus aureus mecA, pvl and nuc genes.
Rom Arch Microbiol Immunol 2011; 70 (2): 69-73.
145. Walsh TR, howe RA, Wootton M et al. Detection of glycopeptide resistance in
Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother 2001; 47: 357-8.
146. Wichelhaus TA, Kern S, Schafer V et al. Evaluation of modern agglutination tests for
identification of methicillin-susceptible and methicillin-resistant Staphylococcus aureus.
Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1999; 18: 756-8.
147. Wysocki M, Delatour F, Faurisson F et al. Continuous versus intermittent infusion of
vancomycin in severe Staphylococcal infections: prospective multicenter randomized
study. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45: 2460-7.
148. Witte W, Braulke C, Cuny C, et al. Emergence of methicillin-resistant Staphylococcus
aureus with Panton-Valentine leukocidin genes in central Europe. Eur J Clin Microbiol
Infect Dis 2005; 24: 1-5.
149. Zhanel CG, DeCorby M, Adam H, et al. Prevalence of antimicrobial-resistant pathogens in
Canadian hospitals: results of the Canadian Ward Surveillance Study (CANWARD 2008).
Antimicrob Agents Chemother 2010; 54(11):4684-93.
150. Zhang K, McClure JA, Elsayed S et al. Coexistence of Panton-Valentine leukocidin positive
and negative community-associated MRSA USA400 sibling strain in a large Canadian
health-care region. J Infect Dis 2008; 197: 195-204.

132
Carte editat i tiparit din fondurile proiectului PNII IDEI cod ID_1586/2008,
finanat de UEFISCDI.

Echipa de cercetare:

Conf.Dr. Olivia Simona Dorneanu Director

Prof. Dr. Luminia Smaranda Iancu Membru

Conf.Dr. Egidia Gabriela Miftode Membru

Drd. Eduard Vasile Nastase Membru

Asist. Drd. Teodora Vremer Membru

Dr. Ctlina Logigan Membru

133