Raport de Cercetare

Grant: AT
Autor: MUCETE DANIELA
UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN VETERINAR A BANATULUI
TIMIOARA

Titlu grant: CERCETRI PRIVIND IZOLAREA, CARACTERIZAREA I UTILIZAREA UNOR

PRINCIPII ACTIVE DIN CATEGORIA FITONCIDELOR

1. IZOLAREA, PURIFICAREA I CARACTERIZAREA FIZICO-CHIMIC A SINIGRINEI

Omul trebuie s g seasc n alimente substan ele necesare proceselor biologice care se

produc n organism i care, trebuie determinate i utilizate la evaluarea calit ii alimentelor.

 

Datorit tuturor acestor dezechilibre alimentare specifice civiliza iei actuale i imunit ii destul




de precare a omului contemporan, se impune direc ionarea spre o alimenta ie ct mai bogat n
aminoacizi liberi, s ruri minerale, zaharuri u or asimilabile, fibre alimentare, vitamine i enzime, deci
 

alimente cu rol intermediar ntre medicament i aliment.



n acest context, n ultimul timp s-a observat o schimbare de atitudine privind alimenta ia, o
rentoarcere spre alimente naturale.

Interesul pentru glucosinola i a luat na tere pornind de la cteva

observa ii: ace ti 



compu i au efect antinutri ional la vite, sunt implica i n mecanismul defensiv al plantelor, au rol


protector mpotriva agen ilor chimici cancerigeni, intervin n metabolismul sulfului i ca urmare a


rela iilor lor cu auxinele n reglarea cre terii plantelor (Tolra .a., 2000).
 

Glucosinola ii sunt compu i naturali ce con in sulf sunt produ i de metabolismul secundar
  

al plantelor din ordinul Capparales, care printre alte familii include i Brassicaceele.




Propriet ile lor fiziologice sunt condamnabile pentru declan area enzimatic a agliconilor,


despre care se tie c determin aroma i mirosul multor compu i din plante.
  

Glucosinola ii, ca urmare a bioactivit ii lor nalte i a variet ii compu ilor ce pot fi ob inu i,
 

prezint un poten ial foarte mare pentru folosirea lor n chimie, tehnologia alimentar i aplica iile


alimentare.

De i la nceput glucosinola ii erau considera i compu i antinutri ionali, ulterior s-a demonstrat
 

eficien a lor n prevenirea unor boli i n prepararea i p strarea unor alimente ( Palmieri,1999).
 

Cercet rile recente au demonstrat c produ ii nutri ionali fac leg tura ntre alimente i
 

medicamente, ncercnd s se r spund la ntrebarea dac glucosinola ii sunt sau nu nutrien i ?



 

Mul i autori definesc nutrien ii ca fiind un aliment sau orice parte a alimentului care au un

beneficiu asupra s n t ii (Iori .a., 1999).



Aceast defini ie general acceptat , arat nu numai beneficiul pe care l are s n tatea n ceea

ce prive te prevenirea i tratarea unor boli ci i mbun t irea performan elor organismului
  

(Palmieri,1999).

n prezent n dieta oamenilor n multe p r i ale lumii, include cantit i considerabile de plante
din familia Crucifferae, acestea se ntind de la consumarea ridichilor procesate n Orientul ndep rtat

pn la cel al verzei i al legumelor r d cinoase tradi ionale n Europa sau America de Nord.


Glucosinola ii sunt responsabili pentru gustul iute al unor condimente importante cum sunt
hreanul i mu tarul, contribuind la aromele caracteristice multor legume, precum varza, brocolii,
 

conopida (Fenwick .a., 1983). 

n terapeutic glucosinola ii se utilizeaz intern, n forme farmaceutice n care degradarea



enzimatic la senevoli se face abia la nivelul traiectului digestiv, uneori i efectul antimicrobian gastro-


intestinal. Extern glucosinola ii se utilizeaz datorit calit ilor lor rubefiante, activatoare ale circula iei

dermice. Ei penetreaz repede n piele i declan eaz o eliberare masiv de histomin din esuturi,
 

din acest motiv fiind utiliza i cu bune rezultate n reumatism.

De asemenea, glucosinola ii determin propriet ile senzoriale ale multor speciide Brassica i





pot avea ac iune mpotriva cancerului. ns standardele Comunit ii Europene prev d un anumit nivel

de glucosinola i (sub 18 mimol/gram de semin e), deoarece peste acest nivel se reduce calitatea

senzorial i nutri ional a alimentelor (Palmieri, 1999).



De-a lungul aniilor s-au acumulat foarte multe informa ii despre glucosinola ii prezen i n

plantele din familia Brassicaceae, care con in peste 350 de genuri i 300 de specii. n urma studiilor


Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 1/13
efectuate s-a demonstrat c majoritatea speciilor de crucifere sunt capabile s sintetizeze

glucosinola i. Se poate spune c exist glucosinola i specifici anumitor familii.

Distribu ia natural a glucosinola ilor era cunoscut nc dinainte de 1980, iar studiile
ulterioare au venit n completarea celor existente (Fahey .a., 2001; Thies, 1977).


Glucosinola ii se g sesc n toate p r ile componente ale unei plantei, de asemenea, mai mul i

glucosinola i se g sesc n aceea i plant .



n func ie de stadiul vegetativ i de reproduc ia trzie a plantelor con inutul de glucosinola i



poate sc dea foarte mult, ajungnd pn la circa 1 4 moli GL totali / g material proasp t. Vrsta

plantei este unul din factorii de care depinde con inutul calitativ i cantitativ de glucosinola i.


Factorii de mediu cum ar fi fertilitatea solului, factorii patologici, ngr mintele de cre tere pot
 

avea de asemenea efecte semnificative asupra nivelului specific de glucosinola i n plantele care

cresc i pot afecta distribu ia acetora n p r ile plantelor.



Glucosinola ii constitue o familie omogen , a mai mult de 100 de metaboli i prezen i n

principal n familia Brassicaceae cu o conforma ie chimic diferit , depinznd de structura catenei

laterale, care poate fi alifatic (alchil, alchenil, hidroxialchenil, w-metiltioalchil), aromatic (benzil,

substituen ii benzilului) sau heterociclic (indolil) (Fahey .a., 2001). Ace ti compu i sunt tioesteri
  

anionici ai glucozei, con innd o leg tur de tip -tioglicozidic , care pot fi repede hidroliza i de

reac iile de cataliz MYR pentru a da o cantitate de D-glucoz , iar ionul de hidrogensulfat genernd o

serie de diver i agliconi, ca de exemplu, izotiociana i, nitrili, tiociana i i tioni (Palmieri, 1999).
 

Reac ia catalizat de enzima mirozinaz este urm toarea:

OH

HO
O
HO
S R
OH C

N
-O SO
3
Mirozinaza
H 2O
HS R
C
+ D-Glucoza
N
-
O3SO
- HSO4-
ESP pH > 6.5
Fe(II)
Cisteina R N C S
S Izotiocianati
pH<6.5
H2C CH (X) C N OR
R S C N R C N
Epitionitrili R' O S
Tiocianati Nitrili C
R"
N
H
Oxazolidin-2-Tioni

Figura 1. Hidroliza glucosinolailor catalizat de mirozinaz (Shikita .a., 1999)

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 2/13


Pornind de la efectele benefice ale glucosinola ilor asupra organismelor vii i de la tendin a


actual de g sire a unor posibilit i de nlocuire a E-urilor cu produse naturale, colectivul nostru de

cercet tori i-a propus studierea sinigrinei, compus care face parte din marea clas de glucosinola i.


Prin acest studiu se dore te aplicarea acesteia i a deriva ilor s i n produse alimentare cu rol
 

de conservant, pornindu-se de la ac iunea antimicrobian a deriva ilor sinigrinei (Shofran .a., 1998).





Determinarea glucosinola ilor din plantele apar innd familiei Brassicaceae se poate realiza
prin metode mai simple, pe cnd determinarea individual este mult mai complex .

n trecut izolarea glucosinola ilor s-a f cut cu ajutorul cromatografiei pe hrtie i n strat


sub ire. Mai trziu s-a folosit electroforeza la tensiune nalt combinat cu cromatografia pe hrtie dar

tot cu rezultate nemul umitoare.

Rezultate bune au fost ob inute n 1987, cnd s-a reu it izolarea unor glucosinola i din 

extracte crude prin faz invers . Thies n 1988 a pus la punct o metod prin care cantit i de un gram

de glucosinola i pot fi ob inute rapid. Dar prin aceast metod au fost cristaliza i doar doi glucosinola i

(sinigrina i glucotropaeolina), i mai trziu al i c iva care au fost cristaliza i ca s ruri de potasiu,
 

sodiu sau rubidiu (Fahey, .a., 2001).



Ulterior con inutul de glucosinola i a fost determinat printr-o serie de metode analitice, i


anume: prin distilarea i titrarea sub presiune a izotiociana ilor, prin spectroscopia UV a


oxazolidintiona, prin cromatografie de gaze a izotiociana ilor, prin cromatografie de gaze cuplat cu

spectroscopie UV. Mai trziu separarea glucosinola ilor a fost mbun t it cu ajutorul cromatografiei
de gaze sau lichid prin ndep rtarea grup rii sulfat.
n 1982 Christensen a cuplat aceast metod cu spectroscopia de mas . ndep rtarea
enzimatic a sulfatului nainte de derivare a condus la produ i multiplii 

( Thies, 1976, 1977, 1988). n 1983, G.R. Fenwick i colegii s i au dezvoltat faza reversibil a metodei


HPLC (cromatografiei de lichide de nalt performan ) pentru analiza cantitativ a desulfo-

glucosinola ilor care sunt cei mai folosi i ast zi.

Aceast metod const n desulfatarea enzimatic a extractului, urmat de detectarea HPLC

a desulfo-glucosinola ilor rezulta i.

De i, este cea mai utilizat metod de separare a glucosinola ilor, este totu i dificil de
 

interpretat, datorit efectelor pH-ului, duratei i activit ii enzimelor asupra produ ilor desulfata i.
 

Dup anii 90 au fost ncercate o serie de metode moderne de determinare a glucosinola ilor,
astfel, cromatografia de lichide cu faz invers a ionilor pereche combinat cu procedeul de izolare a

ntregii frac iunii glucozidazice a permis determinrea rapid i eficient glucosinola ilor individuali.


O alt metod a constat n determinare glucosinola ilor prin metoda HPLC-ISO modificat ,

reu indu-se reducerea timpului de extrac ie (Wathelet .a., 1999).

 

Alte metode folosite au fost spectroscopia IR de apropiere (Font .a., 1999), spectroscopia


de reflectan cuplat cu IR apropiat (Velasco .a., 1999), cromatografia lichid de interac ie



hidrofil (Fahey .a., 2001), ns cele mai bune rezultate au fost ob inute prin HPLC cu faz


invers , aceasta permi nd determinare glucosinola ilor individuali.

Colectivul de cercetare a studiat din marea clas de glucosinola i sinigrina. Sinigrina are o
greutate molecular de 397,45, se g se te sub form de cristale cu un punct de topire de 127-


1270C, este u or solubil n ap , n alcool cald, insolubil n benzen, cloroform, iar sub ac iunea




enzimei mirozinaz se descompune n alilsenevol, KHSO4 i glucoz .



Pornind de la aceste studii de literatur , colectivul de cercetare a efectuat mai nti analiza
materialului vegetal i apoi izolarea i purificarea sinigrinei.
 

Analiza materialului vegetal

Materiale i metode
Dup cum s-a mai spus materialul vegetal folosit a fost hreanul i mu tarul negru.
 

Metodele dup care s-a lucrat sunt cele clasice de determinare a acestor componente:

- determinarea umidit ii, a cenu ii brute, a zaharurilor reduc toare (Neam u, 1997),


- determinarea celulozei brute (Petrescu .a., 1967),



- determinarea proteinei brute (M nescu .a., 1982),



- determinarea cantitativ a glucosinola ilor (Dobrescu, 1998).

Rezultate obinute

Rezultatele ob inute n ceea ce prive te compozi ia chimic a hreanului i mu tarului negru

  

sunt prezentate n tabelul urm tor (tabelul 1), acestea ncadrndu-se n limitele prev zute de
literatura de specialitate:

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 3/13
 Tabelul 1. Compoziia chimic a hreanului i mutarului negru


Proba Umiditate Cenu Celuloz Protein Zaharuri Glucosinola i

analizat (%) brut brut brut reduc toare (% din s.u.)
(% din s.u.) (% din s.u.) (Nx6,25) (% din s.u.)
(% din
s.u.)
Hrean 71 5,13 12,9 2 6,03 1,015

Mu tar 7,57 4,97 13,1 2,7 3,45 1,25

negru

Izolarea sinigrinei

Materiale i metode
Semin ele de mu tar negru i r d cinile de hrean sunt nc lzite n autoclav la 1200C timp de


 

10 minute pentru inactivarea mirozinazei. Dup r cire, semin ele i r d cinile sunt m run ite. Din


fiecare prob cte 100 g se in pe o baie de ap , dup care se ad ug cte 500 ml solu ia tampon

fosfat adus la fierbere, astfel, probele sunt men inute pe baia de ap timp de 10 minute agitnd din

cnd n cnd. Dup r cire pe ghea probele sunt supuse centrifug rii la 6000 rot./min timp de 20
minute. Dup centrifugare, supernatantele sunt supuse defec rii cu reactivii Carrez I i Carrez II.


Dup defecare, supernatanele sunt din nou centrifugate la 6000 rot./min timp de 20 minute. Final se

realizeaz separarea extractului de agen ii de defecare.

Extractul ob inut este n continuare trecut pe coloan cu Sephadex A-50 pentru separarea

sinigrinei de ceilal i compu i (Jen .a., 2001).

 

Purificarea sinigrinei

1g DEAE-Sephadex A-50 uscat n prealabil, este nmuiat n ap distilat i l sat timp de dou 

zile pentru a se forma.

Dup aceea, gelul format se ad ug ntr-o coloan de 2,540 cm agitnd pentru a ndep rta
bulele de aer, l sndu-se ap deasupra pentru cl tire i aplicarea probei. nainte de ad ugarea


probei, se trec pe coloan 20 ml NaOH 0,5N i apoi se efectueaz sp larea cu ap distilat pn la



pH neutru. Dup aceea, con inutul din coloan se aduce la forma de acetat prin ad ugarea unei solu ii
de piridin acetat 0,5M i 100 ml ap distilat .


Proba se ad ug n coloan , apoi se efectueaz sp larea cu ap distilat , aruncndu-se de

fiecare dat . Sinigrina r mas pe coloan este eluat cu 1000 ml K2SO4 0,3M. Extractele astfel

ob inute sunt supuse determin rii cromatografice cu HPLC, determinndu-se totodat i con inutul de


sinigrin .
S-a folosit un sistem HPLC de tip Jassco cu un detector UV, detectarea s-a realizat la 227 nm,

coloana de tip C18 Nucleosil cu faz invers , eluentul folosit a fost solu ie tampon fosfat:metanol
(95:5) (Helboe, 1984).

Rezultate obinute

Folosind condi iile optime cromatogramele pentru solu ia stoc de sinigrin i pentru cele dou


probe sunt prezentate n figurile urm toare:

Din datele rezultate n urma prelucr rii cu ajutorul softului BORWIN putem aprecia
urm toarele:

- existen a a doi compu i n extractul din hrean, din care picul 2 este sinigrina, fapt dovedit


prin compararea cu cromatograma aferent solu iei stoc (timp reten ie solu ie stoc:

RT=2,987 iar timp reten ie prob analizat : RT=2,973);

- referitor la picul num rul 1 se consider c el (conform Helboe, 1980) ar putea fi
izotiocianatul rezultat ca urmare a hidrolizei enzimatice a sinigrinei.
Consider, n acest moment plauzibil aceast ipotez avnd n vedere c inactivarea enzimei
la 110C timp de 30 minute nu a dat rezultatul scon tat, deoarece i dup aceast perioad 

mirosul caracteristic de izotiocianat a persistat;

- n ceea ce prive te al doilea pic, se consider prin compara ie cu datele de literatur



(Shofran .a., 1998), c i acest compus neidentificat momentan face parte din clasa
 

glucosinola ilor. Una din cauze ar putea fi faptul c s-a lucrat cu Sephadex A50 n loc de

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 4/13
 Sephadex A25 cum prev d datele de literatur . O alt cauz ar putea fi faptul c sinigrina

prezint un maxim de absorb ie la o lungime de und caracteristic mai multor compu i



(227 nm).
- n figura 4 este prezentat cromatograma extractului din mu tar, i n aceast figur se
 

poate observa prezen a sinigrinei prin compararea cu cromatograma aferent solu iei stoc

(timp reten ie solu ie stoc: RT=2,987 iar timp reten ie prob analizat : RT=3,053);

Figura 2. Cromatograma HPLC a sinigrinei (solu ie standard)

Proba sinigrin (solu ie standard), Eluent tampon fosfat:metanol=95:5, Debit 1ml/minut,

Monitorizare la absorb ie 227 nm, Coloan NUCLEOSIL 100 C18

Figura 3. Cromatograma HPLC a extractului din hrean

Proba extract din hrean, Eluent tampon fosfat:metanol=95:5, Debit 1 ml/minut,

Monitorizare la absorb ie 227 nm, Coloan NUCLEOSIL 100 C18

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 5/13
 Figura 4. Cromatograma HPLC a extractului din mu tar
Proba extract din mu tar, Eluent tampon fosfat:metanol=95:5, Debit 1 ml/minut,


Monitorizare la absorb ie 227 nm, Coloan NUCLEOSIL 100 C18

2. STUDIUL COMPORTRII SINIGRINEI, SURS EXCEPIONAL DE INDUCTORI

ENZIMATICI CU ROL MICROBIOLOGIC ACTIV

n cadrul temei de cercetare privind hidroliza enzimatic a glucosinola ilor, reac ie ce conduce

la ob inerea izotiociana ilor, produ i cu ac iune antimicrobian , a fost studiat i mirozinaza, enzim de
 

care depinde aceast hidroliz .

Sinigrina face parte din clasa glucosinola ilor care sunt compu i cu sulf i sunt produ i de
  

metabolismul secundar al plantelor din ordinul Capparales, care printre alte familii include i


Brassicaceae (Palmieri, 1999).

Mirozinaza i glucosinola ii au fost pentru prima dat descoperi i n semin ele de mu tar de
 

c tre Bussy, n 1840. Mirozinazele ntotdeauna apar nso ite de unul sau mai mul i glucosinola i.
Enzimele cu activitatea mirozinazei au fost descoperite de asemenea n ciuperca Aspergillus sydowi
(Reese .a., 1958, Othsuru i Hata, 1972) i Aspergillius niger (Othsuru i Hata, 1973), n bacteria
   

intestinal Enterobacter cloacae (Tani .a., 1974) i Paracolobactrum aerogenoides (Oginsky .a.,
  

1965), n esuturile mamiferelor (Goodman .a., 1959) i n aphid cruciferelor Brevicoryne brassicae i
  

Lipaphis erisimi (MacGibbon i Beuzenberg, 1978). Aceste componente ale mirozinazei hidrolizeaz


2-hidroxi-2-feniletil glucozinolatul in vitro i manifest mobilit i electroforetice distincte de cele ale



izoenzimelor izolate din plantele gazd .

Acest comportament biochimic distinct nu exclude posibilitatea c , mirozinazele sunt
modificate de c tre enzimele acumulate din plantele gazd , n contrast cu sinteza mirozinazelor
endogene de novo din ciuperci i bacterii.


Activitatea mirozinazei din semin ele de Sinapis alba L, , Brassica campestris L, i Brassica


napus L, a fost analizat de c tre Henderson i McEwen, (1972), Bjorkman i Lonnerdal, (1973) i
  

Bones (1990).

Aceast enzim este n mod normal secretat fizic de c tre glucosinola i, dar cnd celulele

plantei sunt afectate (ex. n timpul prepar rii mnc rii, mastica iei sau lovirii de c tre pr d tori cum

sunt insectele) enzima este eliberat i catalizeaz hidroliza lor pentru a ob ine n principal


izotiociana i i de asemenea glucoz i sulfat. Reac ia implic o hidroliz ini ial a leg turii -
 

tioglucozidic cu eliberare de -D-glucoz (Shikita .a., 1999).



Mirozinaza este o glicoprotein cu greutatea molecular de 135000, ea este compus din

dou lan uri de peptide cu greutatea molecular de 65000 i con ine aproximativ 14% carbohidrat.




Exist n trei forme cu compozi ii de carbohidrat diferite i are urm toarele puncte izoelectrice 4,96;


4,99 i 5,06.


Mirozinazele (tioglucozid (glucosinolat) glucohidrolaza, EC 3.2.3.1.) sunt un grup de izoenzime

care catalizeaz hidroliza glucosinola ilor (tioglucuzide naturale) n izotiociana i goitrogenici, glucoz i


bisulfat, conform urm toarei reac ii:

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 6/13
 Figura 5. Hidroliza glucosinolailor din Brassica nigra n diferite condiii

n ceea ce prive te distribu ia activit ii mirozinazei, pe baza studiilor efectuate se poate



aprecia faptul c aceasta difer cu specia, organul i vrsta plantei. Astfel, n cazul r d cinilor 

plantelor ajunse la maturitate s-a observat o activitate enzimatic ridicat , comparativ cu activitatea
mai sc zut din alte organe ale plantelor (Bones, 1990).

n ceea ce prive te cre terea activit ii enzimatice a mirozinazei au fost studiate o serie de
 

posibilit i de activare cu diferite concentra ii de acid ascorbic, constatndu-se o cre tere de circa 400


de ori a vitezei de reac ie. De asemenea, a fost studiat i inhibarea activit ii mirozinazei cu acidul


trinitrobenzensulfonic n prezen a sau n absen a acidului ascorbic, astfel c , n prezen a acidului

ascorbic activitatea mirozinazei a fost redus cu circa 55%, n absen acidul trinitrobenzensulfonic
nu are nici un efect (Burmister .a., 2000).


Astfel, dup ce n prima parte a proiectului s-a reu it punerea la punct a unei metode


cromatografice moderne de izolare i purificare a sinigrinei ntr-un procent ct mai mare, a fost nevoie


de o serie de studii legate de activitatea enzimei mirozinaz . Aceste studii au fost necesare pentru a

cunoa te condi iile n care activitatea mirozinazei este maxim , n vederea ob inerii produ ilor de
 

hidroliz enzimatic ai sinigrinei, de asemenea ntr-o propor ie ct mai mare.

Pentru a putea aprecia cu exactitate rolul acestei enzime, au fost necesare studii cinetice,

termodinamice i de pH asupra activit ii mirozinazei. Activitatea mirozinazei n diferite condi ii de



temperatur , pH i timp de reac ie s-a determinat indirect prin m surarea cre terii concentra iei de
 

glucoz rezult n urma hidrolizei sinigrinei.

n vederea stabilirii activit ii mirozinazei mai nti s-a preg tit o proba pentru determinarea
con inutului de sinigrin din boabele de mu tar negru inactivate prin metoda cromatografic HPLC i
 

apoi s-a calculat con inutul rezidual de glucoz din proba inactivat la temperaturile 250C 750C.

n acest scop s-au parcurs urm toarele etape:

- inactivarea mirozinazei timp de 60 minute;

- extrac ia sinigrinei n tampon fosfat (pH=7);

- analiza HPLC a extractului rezultat.

Con inutul de sinigrin din proba inactivat determinat prin metoda cromatografic HPLC a

fost de 3,214mg/ml, iar con inutul rezidual de glucoz din proba inactivat este prezentat n tabelul
urm tor:

Tabelul 2. Calculul coninutului rezidual de glucoz (CRezGlu) din proba inactivat

(boabe de mutar negru, Brassica nigra), la temperaturile 250C 750C:

Nr. Concentraia de glucoz la Concentraia de glucoz Coninutul rezidual de glucoz din

crt. echilibru, la temperaturile din proba inactivat proba inactivat, la temperaturile
250C 750C (mutar boabe) 250C 750C
[mg/l] [mg/l] [mg/l]
1. 12,2387 3,586 8.6527
2. 24,9507 21.3647
3. 74,9753 71.3893
4. 54,4966 50.9106
5. 31,0847 27.4987
6. 11,4776 7.8916

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 7/13
 Influena pH-ului asupra activitii mirozinazei din Brassica nigra

Dup aceste calcule s-a studiat influen a pH-ului asupra activit ii mirozinazei. Valoarea pH-
ului solu iei de tampon fosfat a fost stabilit ntre 5 i 8,5. Cantitatea de prob luat n lucru a fost de 1g


peste care s-au ad ugat 10ml tampon fosfat. Etapele parcurse n acest caz au fost urm toarele:
- nc lzirea probelor la 35C timp de 30minute ntr-un sh acher;
- r cirea i apoi tratarea cu acid tricloracetic 20% pentru inactivarea enzimei;


- determinare spectrofotometric a concentra iei de glucoz din supernatantul ob inut.

Efectul pH-ului asupra activit ii mirozinazei din boabele de mu tar negru (ntregi i mojarate)
 

poate fi observat n figura 6 .

Rezultatele au indicat faptul c , mirozinaza a manifestat cea mai mare activitate la pH-ul
tamponului 7 i o activitate mai sc zut la pH-ul tamponul mai ridicat sau mai sc zut dect acest


punct.
Activitatea mirozinazei n mu tarul boabe la pH 7 este de 35,1248 g glucoz /g prob xh, iar


n mu tarul mojarat la pH 7 este de 133,7503 g glucoz /g prob xh. Totodat se poate observa faptul


c , activitatea mirozinazei este mai mare n cazul mu tarului mojarat dect n cazul mu tarului boabe
 

ca urmare a m run irii celulelor mirozin i activ rii mai mari a acestora.



Rezultatele ob inute sunt similare cu cele existente n literatur cnd a fost studiat activitatea
mirozinazei din alte specii de Brassica (Iori .a., 1996, Al-Turki i Dick, 2003).
 

145

125
activitatea enzimatica [ug glucoza/g proba*h]

105

85

65

45

25

5
4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9
pH

mustar boabe mustar mojarat

Figura 6. Efectul pH-ului tamponului asupra activitii mirozinazei

Influena temperaturii asupra activitii mirozinazei din Brassica nigra

n ceea ce prive te influen a temperaturii asupra activit ii mirozinazei, aceasta a fost studiat


prin varia ia acestui parametru n intervalul 250C 850C men innd constant timpul de 30minute

pentru fiecare determinare. Etapele parcurse n acest caz au fost urm toarele:
- nc lzirea probelor n intervalul 250C - 85C men innd constant timpul de 30minute ntr-

un shacher;
- r cirea i apoi tratarea cu acid tricloracetic 20% pentru inactivarea enzimei;


- determinarea spectrofotometric a concentra iei de glucoz din supernatantul ob inut;

- calculul entalpiei de reac ie.

Dup cum se poate observa din figura 6 activitatea mirozinazei din boabele de mu tar negru a


crescut cu cre terea temperaturii pn la 550C unde a atins valoarea maxim iar apoi la celelalte


temperaturi activitatea a sc zut. Se poate spune c temperatura de 550C este cea optim pentru ca
activitatea mirozinazei din boabele de mu tar negru s fie maxim .


Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 8/13
 S-a mai constatat faptul c la temperaturi mai mari de 650C, n paralel cu hidroliza enzimatic
a sinigrinei ncepe s se manifeste la nceput timid i apoi mai pregnant la 750C respectiv 850C o alt


reac ie enzimatic avnd ca substrat tot sinigrina, i anume reac ia de desulfatare n prezen a enzimei


sulfataz (van Doorn .a., 1999).



Efectul temperaturii asupra activit ii mirozinazei din boabele de mu tar negru poate fi 

observat n figura 7:

280

240
activitatea enzimatica [ug glucoza/g proba*h]

200

160

120

80

40
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90
temperatura de reactie [0C]

mustar boabe mustar mojarat

Figura 7. Efectul temperaturii asupra activitii mirozinazei

Activitatea mirozinazei n mu tarul boabe la 550C este de 252,9569 g glucoz /g prob xh,


respectiv n mu tarul mojarat la 550C este de 265,1234 g glucoz /g prob xh. Rezultatele ob inute




sunt caracteristice reac iilor catalizate de enzime i sunt similare cu cele ob inute de Sharma i Garg
 

(1996) pentru mirozinaza purificat din Brassica juncea.

Pentru calculul constantei de echilibru K nu s-au folosit i izotiociana ii pentru c , a a cum





este prezentat pe reac ie ei sunt compu i volatili. n acest caz are loc o singur reac ie enzimatic cu


un singur substrat i cu un singur produs de reac ie.



Graficul lui Arhenius cu valorile activit ii mirozinazei folosite pentru a calcula Ea, au fost
liniare ntre 250C i 650C. Energia de activare a reac iei catalizat de mirozinaz exprimat n j/mol




(jmol-1) a fost de 2327,92.

n urma analizei de regresie ln k func ie de 1/T s-a ob inut valoarea ln k necesar calcul rii
energiei de activare Ea.

Reac ia care are loc este urm toarea:

Mirozinaz
SINIGRIN GLUCOZ + IZOTIOCIANAI
(S) (E) (P)
Ca urmare a calcul rii constantei de vitez K i apoi a entalpiei s-a putut aprecia faptul c ,




deoarece H<0 reac ia de hidroliz enzimatic a sinigrinei este o reac ie exoterm care are loc cu

degajare de c ldur n mediul nconjur tor. Se poate spune din datele ob inute c H scade cu
cre terea temperaturii.


Studii cinetice asupra hidrolizei enzimatice a sinigrinei din Brassica nigra

n ceea ce prive te evolu ia activit ii mirozinazei din boabele de mu tar negru func ie de
 

timpul de reac ie, aceasta a fost urm rit la mai multe temperaturi pornindu-se de la 250C,

0
temperatur la care activitatea mirozinazei este slab pn la 65 C, de asemenea temperatur la

care activitatea mirozinazei este mai slab . A fost studiat efectul timpului de reac ie i la temperatura


de 750C, temperatur la care s-a observat c activitatea enzimei mirozinaz s-a diminuat lundu-i

locul o alt enzim i anume, sulfataza, practic avnd loc o alt reac ie enzimatic .


Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 9/13
 Studiile cinetice asupra hidrolizei sinigrinei din Brassica nigra au constat n urm toarele etape:
- nc lzirea probelor n intervalul de temperatur 250C 750C, timp de 30 - 390 minute;
- r cirea i apoi tratarea cu acid tricloracetic 20% pentru inactivarea enzimei;


- determinarea spectrofotometric a concentra iei de glucoz din supernatantul ob inut;

- calculul energiei de activare.

Valorile Ea au fost determinate prin fragmentarea diagramei activit ii mirozinazei, exprimat

ca g glucoz / g prob x h.

Efectul timpului de reac ie asupra activit ii mirozinazei din boabele de mu tar negru este


prezentat n figura 8:

250

210
activitatea enzimatica [ug glucoza/g proba*h]

170

130

90

50

10
10 40 70 100 130 160 190 220 250 280 310 340 370 400

timp de reactie [min]

25 [0c] 35 [0C] 45 [0C] 55 [0C] 65 [0C] 75 [0C]

Figura 8. Efectul timpului de reacie asupra activitii mirozinazei

n urma analizei de regresie ln k func ie de 1/T s-a ob inut valoarea ln k necesar calcul rii
energiei de activare Ea.Energia de activare a reac iei catalizat de mirozinaz exprimat n j/mol (jmol-

1
) a fost de 2327,92.
Constanta de vitez la diferite temperaturi s-a determinat prin regresie liniar .
La temperatura de 550C activitatea mirozinazei din boabele de mu tar negru a ajuns la


valoarea maxim dup 270 de minute.

Activitatea mirozinazei n mu tarul boabe la 550C este de 250,2452 g glucoz /g prob xh.


Aceasta este temperatura la care mirozinaza a avut cea mai mare valoare a activit ii.

n ceea ce prive te ordinul de reac ie, conform analizei de regresie a ln (conc) func ie de


timpul de reac ie s-a constatat faptul c , hidroliza enzimatic a sinigrinei este o reac ie de ordinul 1.

Ca urmare a acestui fapt se poate spune c viteza de reac ie este direct propor ional cu concentra ia
sinigrinei.
Efectul fitoremediator al mutarului asupra solului cu ioni ai metalelor

Una din plantele care pare s joace un rol important n fitoremediul solurilor cu ioni ai
metalelor este mu tarul. Cercet rile efectuate au demonstrat faptul c , mu tarul pare a fi cel mai
 

promi tor fitoremediator pentru Cu, Zn, Mn, Cd i alte metale tranzi ionale din sol (Chaney, 1996).


Con inuturile de metale din sol i materialul biologic au fost determinate prin spectrofotometrie de


absorb ie atomic . Concentra ia metalului a fost determinat prin raportarea la o solu ie standard de
metal (Bjorkman, 1976; Serkadis .a., 1999; Goldowitz .a., 2004).  

Activitatea mirozinazei a fost determinat prin m surarea vitezei de descre tere a



concentra iei sinigrinei n extractul de mu tar men innd la 35C pentru 240min utiliznd tehnica


cromatografic HPLC.

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 10/13


Cationii metalelor sunt de notat pentru tendin a de acumulare n selec ia celulelor vegetale ale

plantei de mu tar negru i poten ialul lor toxic la nivele nalte de expunere. n ceea ce prive te
  

influen a ionilor metalici acumula i n semin e asupra activit ii sistemului mirozinaz -sinigrin , datele

practice ob inute la o temperatur optim (55C) i pH 6,5 pentru enzim sunt prezentate n figura 8:


8.4
Concentratia de sinigrina [mmol]

8.3

8.2

8.1

7.9

7.8
30 60 90 120 150 180 210 240
Blank sample Mustard+ZnCl2 Mustard+MnCl2 T imp [min]

Mustard+CdCl2 Mustard+CuCl2

Figura 8. Influena unor urme de metal asupra hidrolizei enzimatice a sinigrinei din Brassica
nigra

Dup cum se poate vedea i din figura 8 urmele de cationi bivalen i i metale grele au att un
 

efect activator ct i un efect inhibitor la hidroliza enzimatic a sinigrinei, chiar dac cantitatea


ad ugat a fost aceea i n toate cazurile. Cd2+ ac ioneaz ca un inhibitor puternic, n timp ce Mn2+ sub




forma de sare a fost un activator slab.

O proprietate specific util a mirozinazei este absen a inhib rii de c tre Zn2+care este una

din cele mai importante urme de element pentru om. n ceea ce prive te ac iunea Cu2+ , el determin




o activare necompetitiv liniar a enzimei.

Astfel, se poate spune c n absen a unor activatori, enzima a hidrolizat sinigrina foarte lent,

iar n prezen a unor ioni metalici cunoscu i ca i cofactori (Cu, Zn i n unele condi ii Mn) viteza reac iei
 

a m rit foarte mult iar viteza hidrolizei a fost legat n mod liniar de concentra ia sinigrinei.

Concluzii generale

Pe baza rezultatelor ob inute se poate aprecia faptul c , aceast metod permite separarea

rapid a sinigrinei din produse naturale. Rezultate asem n toare au fost ob inute i de c tre Dl.


Reichelt de la Institutul Max-Planck fur Chemische Okologie din Germania care a analizat acelea i 

extracte prin LC-MS, ns metoda folosit de Dl Reichelt presupunea i o etap de desulfatare a



extractului cu enzima desulfataz .

De asemenea, ca o concluzie la cele studiate se poate aprecia faptul c mirozinaza prezint
activitate enzimatic maxim la pH 7, temperatura de 550C i timpul de reac ie de 270minute. Ace ti


 

paramentrii fiind necesari stabilirii condi iilor optime de on inere la un randament optim a

izotiociana ilor, principii active cu rol microbiologic activ.

n ceea ce prive te efectul fitoremediator al mu tarului asupra solului cu ioni ai metalelor s-a
 

putut concluziona faptul c , metoda analitic (HPLC) folosit pentru determinarea concentra iei de
sinigrin hidrolizat este rapid , precis i poate fi utilizat n majoritatea laboratoarelor.


Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 11/13
 Bibliografie

1. Al-Turki A., Dick A., 2003, Myrosinase Activity in Soil, Soil Science Society of America
Journal 67:139-145
2. Bjrkman, R. & Lnnerdal, B., 1973, Studies on myrosinases. III. Enzymatic properties of
myrosinases from Sinapis alba and Brassica napus seeds. - Biochim. Biophys. Acta 327:
121-131.
3. Bjorkman, R. 1976: In J.G. Vaughan et al. (ed.) The biology and chemistry of the Cruciferea.
Academic Press, London.
4. Bones, A.M., 1990, Distribution of thioglucosidase activity in intact plants, cell and tissue
cultures and regenerated plants of Brassica napus L. - J. Exp. Bot. 41: 737-744.
5. Bones, A.M., Rossiter, J.T., 1996, The myrosinase-glucosinolate system, its organisation
and biochemistry, Physiologia Plantarum 97,194208.
6. Buemeister W.P., Cottaz S., Driguez H., Iori R., Palmieri S., Henrissat B., 1997, Structure 5,
663-675.
7. Burmeister W.P., Cottaz S., Rollin P., Vasella A., Henrissat B., 2000, High Resolution X-ray
Crystallography Shows That Ascorbate Is a Cofactor for Myrosinase an Substitutes for the
Function of the Catalytic Base, Journal of Biological Chemistry, vol. 275 (50), 39385-39393 .
8. Chaney, R.L. 1996, Abstract: Phytoremediation of Zn and Cd contaminated soils using metal
hyperaccumulator plants: Progress in technology developments. International
Phytoremediation Conference, May 8-10, 1996, Arlington, VA. International Business
Communications, Southborough, MA.
9. Fahey, J.W., Zalcmann, A.T., Talalay, P., 2001, The chemical diversity and distribution of
glucosinolates and isothiocyanates among plants, Phytochemistry, 56, 5-51
10. Fenwick, G.R., Heaney, R.K., Mullin, W.J., 1983, Glucosinolates and their breakdown
products in food and food plants, CRC Critical Reviews in Food Science and Nutrition 18,
123201
11. Goldowitz I. S., Goldowitz J., 2004, Abstract: Phytoremediation of Lead Contaminated Soils
in the Urban Residential Environment using Seed Mustard, The 20th Annual International
Conference on soils, sediments and water, October 18-21, 2004 University of
Massachusetts, Amherst, MA, USA
12. Goodman, I., Fouts, J.R. Bresnick, E., Menegas, R. & Hitchings, G.H., 1959, A mammalian
thioglycosidase. - Science 130: 450-451.
13. Helboe, P., 1980, Separation of glucosinolates by high-performance liquid chromatography,
Journal of Chromatography, 197, 199-205
14. Henderson, H.M. & McEwen, T.J., 1972, Effect of ascorbic acid on thioglucosidases from
different crucifers. - Phytochemistry 11: 3127-3133.
15. Iori, R., P. Rollin, H. Streicher, J. Thiem, S. Palmieri, 1996, The myrosinase-glucosinolate
interaction mechanism studied using some synthetic competitive inhibitors, FEBS Lett.,
358:8790.
16. James, D. & Rossiter, J.T., 1991, Development and characteristics of myrosinase in
Brassica napus during early seedling growth. - Physiol. Plant. 82: 163-170.
17. Jen, J., Lin T., Huang, J., Chung, W., 2001, Direct determination of sinigrin in mustard seed
without desulfation by reversed-phase ion-pair liquid chromatography, Journal of
Chromatography A, 912, 363-368
18. MacGibbon, D.B. & Beuzenberg, E.J., 1978, Location of glucosinolase in Brevicoryne
brassicae and Lipaphis erysimi (Aphididae). - New Zealand J. Sci. 21:389-392.
19. Oginsky, E.L., Stein, A.E. & Greer, M.A., 1965, Myrosinase activity in bacteria as
demonstrated by the conversion of progoitrin to goitrin. - Soc. Exp. Biol. Med. Proc. 119:
360-364.
20. Ohtsuru, M. & Hata, T., 1973, Studies on the activation mechanism of the myrosinase by L-
ascorbic acid. - Agr. Biol. Chem. 37: 1971-1972.
21. Palmieri, S., 1999, Glucosinolates nutraceutical products ?, Instituto Sperimentale per le
Colture Industriali, Italy, 1-5
22. Rask, L., Andreasson, E., Ekbom, B., Eriksson, S., Pontoppidan, B., Meijer, J., 2000,
Myrosinase: gene family evolution and herbivore defense in Brassicaceae, Plant Molecular
Biology 42, 93 -113.
23. Reese, E. T., Clapp, R.C. & Mandels, M., 1958, A thioglucosidase in fungi. - Arch. Biochem.
Biophys. 75: 228-242.

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 12/13
24. Serkadis M. G. and Fung-Lung Chung, 1999, Cancer Epidemiology, Biomarkers &
Prevention, Vol. 8, 447451.
25. Shikita M., Fahey J., Golden T., Holtzclaw D., Talalay P., 1999, An unusual case of
uncompetitive activation by ascorbic acid: purification and kinetic properties of a
myrosinase from Raphanus sativus seedlings, Biochem. J., 341, 725-732
26. Shofran, B.G., Purrington, S., Breidt, F., Fleming, H., 1998, Antimicrobial Properties of
Sinigrin an its Hydrolisis Products, Journal of Food Science, Vol. 63, No. 4, 621-624
27. Springett, M.B. & Adams, J.B. 1989. Properties of brussels sprouts thioglucosidase. - Food
Chemistry 33: 173-186.
28. Talalay, P., Zhang, Y., 1996, Chemoprotection against cancer by isothiocyanates and
glucosinolates, Trans. Biochem. Soc., 24, 806-810
29. Thangstad, O.P., Winge, P., Husebye, H. & Bones, A., 1993, The thioglucoside
glucohydrolase (myrosinase) gene family in Brassicaceae. - Plant Mol Biol. 23: 511-524.
30. Thies W., 1976, Quantitative gas liquid chromatography of glucosinolates on a microliter
scale", Fette, Seifen, Anstrichm, 78, 231-234
31. Thies W., 1977, Analysis of glucosinolates in seeds of rapeseed (Brassica napus L.):
Concentration of glucosinolates by ion exchange", Pflanzenzuchtg, 79, 331-335
32. Thies, W., 1988, Isolation of sinigrin and glucotropaeolin from cruciferous seeds, Fat Science
and Technology, 90, 311-314
33. Tolra, R., Alonso, R., Poschenrieder, C., Barcelo, D., Barcelo, J., 2000, Determination of
glucosinolates in rapeseed and Thlaspi caerulescens plants by liquid chromatography-
atmospheric pressure chemical ioniyation mass spectrometry, Journal of Chromatography A,
889, 75-81.
34. van Doorn HE, van der Kruk GC, van Holst G-J, 1999,Large scale determination of
glucosinolates in Brussels sprout samples after degradation of endogenous glucose, J Agric.
Food. Chem., 47: 1029-1034.
35. Yen, G., Q. Wei, 1993, Myrosinase activity and total glucosinolate content of cruciferous
vegetables, and some properties of cabbage myrosinase in Taiwan, J. Sci. Food. Agric.,
61:471475.

Director proiect
.l.ing. drd. DANIELA MUCETE

Revista de Politica Stiintei si Scientometrie - Numar Special 2005 - ISSN- 1582-1218 13/13