BIOLOGIE GENERAL

- molecular i celular -

CURS VII
Structura i replicarea materialului genetic
Experimente ce indic localizarea i natura
materialului genetic
1. Experimentele lui Hammerling (1930)
demonstreaz c informaia genetic
necesar funcionrii ntregii celule a algei 2. Experimentele de transplantare a nucleului
unicelulare Acetabulata este stocat n nucleul unuei celule conine informaia necesar
nucleul acesteia dezvoltrii i funcionrii tuturol celulelor unui
organism.
Acetabularia Acetabularia
crenulata mediterranea Embrion
anormal
Celula moare
Embrion

Celul ou Nucleul este

eliminat (celul
anucleat)
Nucleul celulei
epiteliale este
introdus n celula
Nucleul este anucleat
izolat cu o Embrion
Celule micropipet Broasc
Mormoloc Mormoloc
Nucleul din picior epiteliale adult
dicteaz ce tip de vrf
se formez
 Experimente ce indiclocalizarea i natura
materialului genetic
3. Experimentele lui Griffith (anii 1930) demonstreaz c informaia genetic
poate fi transferat de la o celul la alta n mod natural printr-un proces numit
transformare.

Streptococcus pneumoniae
Tulpin Tulpin ne-
Tulpin
patogen tip patogen
Tulpin patogen
Tulpin ne- R, moart, tip S, vie
patogen tip R, moart
patogen
tip R, vie tip S, vie

Capsul
polizaharide
(patogenitate)

n sangele soarecelui mort

apar celule de S. pneumoniae
patogene tip S vii
Experimente ce indiclocalizarea i natura
materialului genetic

4. Experimentele lui Avery i Hershey-Chase (1944) demonstreaz c informaia genetic este

codificat de moleculele de ADN. ADN-ul marcat cu 32P
Proteinele marcate cu 35S
Bacteriofagul T2
marcat
radioactiv

Bacteriofagul T2
infecteaz celule
de Escherichia coli

Celulele bacteriene
sunt agitate

Radioactivitatea
Radioactivitatea specific 32P se
specific 35S se regsete n celule
regsete n mediu
 Structura chimic ADN-ului
- n 1869 Friedrich Miescher izoleaz din nuclei o substan alb pe
care o denumete nuclein. Datorit caracterului uor acid capt
mai apoi denumirea de acid nucleic.
- funcia i structura acestei substane rmane necunoscut pan
n jurul anilor 1920.

Acizii nucleici sunt polimeri rezultai n urma legrii prin

Deoxiriboz Riboz
legturi fosfodiesterice unui numr mare de nucleotide.
(ADN) (ARN)
Funcie de tipul de nucleotide, acizii nucleici se clasific n:
- acid ribonucleic (ARN) conine n structura sa riboz
- acid dezoxiribonucleic (ADN) - conine n structura sa
deoxiriboz
Grup fosfat
O nucleotid este alctuit din
un glucid cu 5 atomi de C (riboza sau deoxiriboza)
o grupare fosfat (PO4) legat de atomul C 5 al glucidului
baz azotat legat de atomul C 1 al glucidului
Adenina Guanina
n acizii nucleici se ntlnesc dou
Purine
tipuri de baze azotate:
purinice - dou heterocicluri cu N:
Adenina (A) i Guanina (G) n ADN
i ARN
pirimidinice un heterociclu cu N:
Citozin (C) i Timin (T) n ADN i
C i Uracil (U) n ARN Uracil Timina
Citozina
(doar n ARN) (doar n ADN)

Pirimidine
 Structura primar a ADN-ului
ntre gruparea -PO4 de pe carbonul 5 (poziia 5') al unei nucleotide i gruparea -OH de pe
carbonul 3 (poziia 3') al altei nucleotide se poate elimina o molecul de ap cu formarea
unei legturi fosfodisterice (-O-P-O-). Se pot astfel forma astfel catene lungi de
nucleotide al cror schelet are structura:

PO4-C5'-C4'-C3'-O-P-O-C5'-C4'-C3'-O.............P-O-C5'-C4'-C3'-OH
Nucleotida 1 Nucleotida 2 Nucleotida n

Aproape toate moleculele de ADN au dou capete diferite:

- captul 3' cu o grupare -OH liber
- captul 5' cu o grupa -PO4 liber. Ce molecule de ADN nu respect aceast regul?

Prin convenie, secvena de nucleotide a ADN-ul se noteaz n direcia 5' 3'

Secvena de nucleotide GTCCAT se refer la o caten cu structura:

5' PO4-G-PO4-T-PO4-C-PO4-C-PO4-A-PO4-T-OH 3'

i nu la
5' PO4-T-PO4-A-PO4-C-PO4-C-PO4-T-PO4-G-OH 3' care este o molecul diferit
 Compoziia n baze azotate a ADN-ului

Analiza lui Chargaff privind compoziia n baze azotate a ADN-ului

Procente molare

Escherichia coli tulpina K12

Mycobacterium tuberculosis
Drojdia de bere
Hering
obolan
Om

Date din E. Chargaff and J. Davidson (editori), The Nucleic Acids, 1955, Academic Press, New York, NY.

Regulile lui Chargaff:

ntr-o molecul de ADN au loc ntotdeauna urmtoarele relaii:

proporia de A este ntodeauna egal cu cea de T, iar cea de G cu cea de C

A=T; G=C

proporia de baze azotate purinice este ntotdeauna egal cu cea de baze pirimidinice

A+G=T+C
 Structura tridimensional a ADN-ului
Analiznd modul n care razele X sunt difractate de o fibr cristalizat de ADN,
Franklin propune n 1953 c molecula de ADN are forma de tirbuon, cu
diametrul de 2 nm i o spir de 3.4 nm.
Watson and Crick propun in 1953 un model al structurii ADN-ului ce are la baz
un dublu helix

Rosalind Elsie Franklin (1920 - 1958)

Watson, J. D. & Crick, F. H. C. Molecular structure of nucleic acids: A structure for deoxyribose nucleic acid. Nature 171, 737738 (1953)
 2 nm

Structura tridimensional a ADN-ului

3,4 nm
Scheletul moleculei este reprezentat de catenele cu legturi fosfodiesterice ce
formeaz un dublu helix spre dreapta. Catenele sunt antiparalele, una are anul mic
orientare 5' 3' iar cealalt 3' 5'
0,34 nm
Bazele azotate sunt orientate spre interior. ntre bazele de pe o caten i formeaz
legturi de hidrogen pe baz de complementaritate: A-T (2 legturi); G-C (3
legturi). O pereche de baze azotate complementare formeaz un plan
perpendicular pe caten. Distana dintre 2 perechi de baze (pb) consecutive este anul mare

de 0.34 nm.

Legturile se formeaz ntotdeauna ntre o baz purinic i una pirimidinic -

dimensiunea unei perechi de baze complementare (pb) i deci diametrul helix-ului
dublu este constant 2 nm

O spir complet a dublul helix-ului are 10 pb - 3.4 nm

Au fost descrise dou sanuri:
anul mare larg de 22
- anul mic larg de 12

Cat de lungi sunt cele 2 anuri?

 Replicarea moleculei de ADN
Complementaritatea bazelor azotate din cele dou catene antiparalele dicteaz strict
secvena unei catene funcie de cealalt dac o caten este 5-ATTGCAT-3 cealalt
trebuie s fie obligatoriu 3-TAACGTA-5.

Pe baz de complementaritate, orice caten de ADN poate fi duplicat. Moleculele de ADN dublu
catenar se multiplic printr-un proces numit replicare semi-conservativ:

- secvena moleculei originale este replicat, nu molecula dublu catenar helicoidal n sine

- fiecare caten a moleculei dublu catenare originale devine parte component a uneia din cele
dou moleculei noi sintetizate
Replicarea moleculei de ADN este un proces esenial pentru celula i trebuie s fie rapid i precis.

Procesul de replicare ncepe n una sau mai

multe origini de replicare i este realizat prin
activitatea corelat a unui complex de proteine
dintre care cea mai important este ADN-
polimeraza. Elementul genetic ce este capabil
de replicare autonom se numete replicon.
La procariote repliconul - intregul cromozom sau un plasmid
La eucariote relpiconul o poriune de aprox. 100 000 pb un
cromozom are mai muli repliconi.
 Structura ADN-polimerazei III

- are capacitatea de a ataa nucleotide la captul 3' al unei catene

existente, ataarea realizndu-se pe baza complementaritii cu o a
doua caten (caten matri sau template). Direcia de polimerizare
este 5 3.
- viteza de polimerizare este de 1000 nucleotide/s
- enzim dimer, fiecare subunitate coninnd 10 catene polipeptidice
(domenii) diferite:
Domeniul domeniul catalitic - catalizeaz polimerizarea
nucleotidelor n direcia 5' 3'
Domeniul domeniul de verificare verific corectitudinea
bazelor azotate nserate n direcia 3' 5'
Domeniul 2 domeniul de legare fixeaz complexul enzimatic de
molecula de ADN

Domeniul2 Domeniul2 legat de ADN

 Mecanismul molecular al replicrii ADN-ului

1. Desfacera helix-ului dublu al ADN-ului se realizeaz n patru etape distincte:

a) legare unei proteine iniiator de originea de replicare
b) despiralizarea helix-ului dublu realizat prin aciunea unei helicaze. Apare o structur specific
numit furc de replicare.
c) protejarea zonelor monocatenare de proteine specifice (single-strand biding proteins) ce mpiedic
reformarea legturilor de H
e) relaxarea tensiunilor n caten. La o vitez de replicare de 1000 pb/s, helix-ul se despiralizeaz
(rsucete) cu o vitez de 100 rotaii/s. Tensiunea creat este eliminat prin clivarea unei legturii
fosfodiesterice, rotirea catenei clivatre n jurul celei intregi i refacerea legturii fosfodiesterice de ctre
enzima giraz (topoizomeraz).

2. Legarea oligonucleotidelor amors -

ADN-polimeraza poate ata nucleotide de o caten deja existent, de aceea pentru iniierea replicrii
n zonele monocatenare se atasez o oligo-nucleotid ARN sintetizat pe baz de complementaritate
de ctre o enzim specific primaz. Oligonucleotida amors produs ofer captul 3' necesar
iniierii polimerizrii. De ce nu amors ADN?

3. Sinteza propriu-zis a celor dou catene

ADN-polimeraza dimer se leag de furca de replicare o subunitate de o caten, cealalt de a
doua caten. Pe baza celor doua catene matria, se produc simultan doua catene noi, dup cum
urmeaz:
- n cazul catenei matri cu direcia 5' 3' - ADN-polimeraza ncepe s ncorporeze nucleotide
pornind de la oligonucleotida amors ARN n direcia 3' 5', adic spre furca de replicare caten
conductoare
 Mecanismul molecular al replicrii ADN-ului

- n cazul catenei matri cu direcia 3' 5' - ADN-polimeraza ncepe s ncorporeze nucleotide
pornind de la oligonucleotida amors ARN tot n direcia 3' 5' de acest dat dinspre furca de
replicare, indeprtandu-se de aceasta. Sintetizeaz un fragment scurt de ADN (100-200 de nucleotide
la EK, 1000 2000 nucleotide la PK), dup care elibereaz catena i se amplaseaz din nou lng
furca de replicare, unde este o nou oligonucleotid amors i procesul se reia. Sinteza nu este
continu, ci sub forma unor fragmente scurte - fragmente Okazaki. Catena se numete - caten
ntarziat.

4. Eliminarea oligonucleotidelor amors

O alt enzim - ADN-polimeraza I cliveaz oligonucleotidele ARN i sintetizeaz n locul lor catene de
ADN, atat pe catena conductoare cat si n zonele de la nceputul fragmentelor Okazaki. ntre 2
fragmente Okazaki rmane ns o legtura fofodiesteric 5' 3' pe care polimeraza nu o poate forma.

5. Ligarea fragmenetelor Okazaki

- fragmetele Okazaki sunt apoi conectate de ctre ADN-ligaz ce poate realiza legturi 5' 3'
 Mecanismul molecular al replicrii ADN-ului

Subunitatea I a ADN-
polimerazei III
Catena conductoare

Fragment
Okazaki Primer ARN

Helicaza
Primaza
Catena ntarziat Subunitatea II
ADN-ligaza ADN- a ADN-
polimeraza polimerazei III
II