ACIDOS NUCLEICOS: EXTRACCION DEL DNA DE LA FRESA Y OBSERVACION DE

PROPIEDADES.
Martin Prado 1 cd. 1310268; Jobana Solarte 2 cd. ; Rubn Gmez 3 cd. 1330963; Erika
Benavides 4 cd. 0923018
1
martin_k-hoz@hotmail.com ; 2jennyj3103@hotmail.com ; 3rfelipeg@gmail.com ;
4
erikajohanna1989@hotmail.com
12 de mayo de 2015. Departamento de Qumica- Universidad del Valle.
Abstract:

Key words:

Introduccin. Hebra de DNA.3 Apareamiento de

bases.2
Los cidos nuclecos son de gran
importancia puesto que son los
depositarios de la informacin gentica
de todos los seres vivos, la estructura de
todas las protenas, de todas las
biomoleculas y finalmente de todos los
componentes celulares son producto de
la informacin programada en las
secuencias de nucletidos en los cidos
nucleicos, adems de muchas otras
funciones como el ser en intercambio La capacidad de almacenamiento de
energtico en el metabolismo celular informacin que se transmite de
(ATP y ADP). generacin en generacin requiere de
una estabilidad primordial, a si pues, las
Estn constituidos por nucletidos los respuestas de estas molculas ante
cuales constan de un azcar, desoxi- cambios especficos del medio son
ribosa, unido a una base nitrogenada reversibles, como por ejemplo los
prica o pirimidnica en posicin C-1 y cambios de temperatura o de pH, la
un grupo fosfato en posicin C-5. El llamada desnaturalizacin del DNA
esqueleto covalente se forma por rompe enlaces de apilamiento de bases
uniones de nucletidos en posiciones C- y puentes de hidrogeno pero no el
3 y C-5 de enlaces fosfodiester. esqueleto covalente lo que le da la
capacidad de re naturalizacin.1
Las cinco bases nitrogenadas son:
1. Mtodo.
Pricas: Adenina, Guanina.
La metodologa empleada, as como los
Pirimidnicas: Timina, Citosina, Uracilo.
reactivos fueron los mismos planteados
Finamente la doble hlice del DNA se en la de laboratorio.4
forma por secuencias de nucletidos en
2. Resultados y discusin.
dos hebras diferentes unidas con la otra
por apareamiento de bases, A=T y G=C.
2.1 Cuantificacin de DNA por
colorimetra. (474nm)
2.2 Propiedades de DNA.
2.2.1 Determinacin de la
concentracin apropiada.
2.2.2 Efecto del calentamiento y
rpido enfriamiento.
El aumento de la temperatura trae
efectos sobre la doble hlice de DNA,
esta produce rompimientos de los
enlaces de apilamiento y puentes de
hidrogeno que mantienen la estructura
de la molcula pero no del esqueleto
covalente.
Inicialmente con los primeros
incrementos de la temperatura actan
sobre reas del DNA que contengan
mayor contenido de A=T, aqu es donde
se formaran las primeras burbujas,
debido a que presentan menores enlaces
de apilamiento entre estas bases, y solo
dos enlaces de puente de hidrogeno que
las une.
A medida q la temperatura aumente las
burbujas se expandirn porque la mayor
temperatura afectara ahora los pares
G=C que contienen mas interacciones de
apilamiento y tres enlaces de puente de
hidrogeno.
Finalmente el movimiento trmico poli
nucletido supera las fuerzas de
estabilizacin de la cadena de doble
hlice separndolas completamente.
El efecto del rpido enfriamiento es la
disminucin del movimiento trmico
polinucleotido, y esto provee la
renaturalizacion del DNA, un uno o dos
pasos siempre que sea el caso.
Cuando las dos hebras de DNA no se
han separado completamente, (al menos
doce pares de bases unidas) el DNA se
enrolla rpidamente y se hibridiza
nuevamente.
En caso de que la separacin haya sido
completa, primero debe haber un
reconocimiento de las dos hebras por
colisiones al azar, y luego las bases
entran en registro y se aparean.
2.2.3 Efecto del pH.
La dependencia de la estabilidad de la
estructura de la doble hlice o estructura
secundaria del DNA con el pH viene dada
porque l un principio todos los poli
nucletidos poseen una carga negativa sobre
el grupo fosfato en un amplio rango de pH.
En la prctica se relaciona la estabilidad de la
doble hlice con la Tm, as pues cuanto
mayor sea la estabilidad mayor ser la Tm.
La variacin del pH por encima de 7 hace
inestable la doble hlice, y esto disminuye la
temperatura de fusin o Tm, con pH mucho
mayores (alcalinos) las bases U, T y G
pierden un protn y la doble cadena no
puede formarse con las bases
desprotonadas, puesto que este protn es
uno de los implicados en el apareamiento de
bases.5
Para disminuciones de pH tambin se
disminuye la estabilidad de la doble hlice y
la Tm, puesto que los enlaces fosfodiester y
n-glucosdicos son inestables a pH muy
bajos, a pH alrededor de 4 los enlaces n-
glucosdicos de las purinas se rompe.6
2.2.4 Efecto de la Urea.
La urea y el formaldehido estn en
competencia por los puentes de hidrogeno
entre las bases, el aumento de la
temperatura crea un constante rompimiento y
formacin de dichos puentes de hidrogeno
por equilibrio trmico y permite que la urea
entre a competir por ellos, las bases que se
separan en el equilibrio trmico no se
vuelven a unir.
Preguntas.
I. Suponga que su ADN presenta
un elevado nmero de errores en
el apareamiento de las bases:
qu influencia tendra esto
sobre, por ejemplo, el Tm?
La Tm (temperatura de melting) es la
temperatura de fusin de un oligonucletido,
mide el des apilamiento y el rompimiento de
enlaces puentes de hidrogeno, en la que 50
% de todas las molculas de una secuencia
de ADN se hibridan en una cadena doble, y
el 50% estn presentes como cadenas
simples. Este puede variar y verse afectado
por distintos factores entre los cuales se
encuentran la secuencia del oligonucletido,
y las condiciones de hibridacin.
La desnaturalizacin del ADN est
directamente relacionada con la mayor
proporcin de triples enlaces, mientras ms
cantidad de estos se encuentren en la doble
hlice, es necesario suministrar mayor calor
para romper dichos enlaces, estos a su vez
sern mayores cuanto mayor sea el
contenido de G +C, puesto que G y C se
emparejan formando tres enlaces de puentes
de hidrogeno a diferencia del
emparejamiento de A y T que forman dos. 7
El Tm es funcin de dos variables
fisicoqumicas importantes:
- El contenido de G:C, Tm aumenta
con el aumento de G:C
- Y la fuerza inica ().
Figura No.1: apareamiento de bases. 8
La formula ms simple para el clculo del Tm
es la dada por la regla de Wallace:
En la cual se asignan 2C por cada A o
T y 4C por cada G o C, esta es
una formula bastante
aproximada, pero su precisin
disminuye con la longitud, es
decir, esta frmula sirve para
20bp o menos.
Tm=2 ( A+ T ) + 4(G+C )
Otros mtodos para el clculo de Tm ms
preciso se basan en la interaccin con los
vecinos, de la doble hebra del ADN. 7
La presencia de un elevado nmero de
errores en el apareamiento de las bases en
el DNA, afectara directamente el valor de Tm,
porque como se menciono anteriormente
este se encuentra directamente relacionado
con la secuenciacin, el clculo del mismo,
no solo se basa en la cantidad de bases
pareadas de A:T y G:C sino tambin en la
interaccin con los vecinos, ya que el
proceso de hibridacin es de colaboracin,
puesto que los pares de nucletidos ya
formados ayudan a sus vecinos nucletidos a
emparejarse tambin, luego a mayor
presencia de errores de apareamiento, mayor
variacin entre el Tm de hebra de DNA con
respecto al valor esperado. La composicin
de nucletidos de las hebras de DNA
determina directamente la temperatura de
melting, la Tm de segmentos de
DNA varia como consecuencia de
cambios mnimos en su
7
estrcutura.
II. Qu informacin se obtiene
a partir de la medida Abs a
mx / Abs a 280 nm para la
dilucin de trabajo de ADN
en el punto 4.3 A?
La determinacin de Los cidos nucledos
por espectrofotometra se hace midiendo a
260 nm y comparando con el blanco, esta
longitud de onda es aquella a la cual
absorben estos cidos si se encuentran en
alto grado de pureza, cuando no es as, la
presencia de contaminantes se hace bajo el
siguiente consiente A260/A280, puesto que
las protenas absorben a 280nm, las
proporciones aceptadas para DNA puro es de
1.8; valores por debajo de 1.8 indican
presencia de protenas.9,10
Otra determinacin de pureza de DNA se
hace con la proporcin de 260/230,
absorciones alrededor de 230nm se presenta
cuando la muestra est contaminada por
hidratos de carbono, pptidos, compuestos
aromticos, fenoles u otros. Los valores
aceptables para DNA puro son 2.0 a 2.2,
relaciones mayores indican contaminacin.
9,10
III. De acuerdo al rango de Tm que Ud.
determin para el ADN de la fresa y el
de esperma de arenque, Es un ADN
rico en C y G? Comprelo con el Tm de
otros ADN (otros vegetales, organismos
termfilos o psicrfilos) en la literatura.
IV Cul es la temperatura inicial de
ADN que ms cambio tuvo en la lectura
de
absorbancia a mx? Por qu esto fue
as?
La temperatura que mas cambio tubo????
El proceso de absorcin de luz UV est
directamente relacionado con las
interacciones presentes en las molculas de
DNA, los enlaces entre las cadenas de DNA
son enlaces de puentes de hidrogeno que
dirigen las bases nitrogenadas hacia el
interior de la molcula, las interacciones de
apilamiento son aquellas presentes entre las
bases y son interacciones de Van Deer
Waals y de ion dipolo-dipolo. Son las bases
nitrogenadas pricas y pirimidnicas las que
estn directamente relacionadas con la
absorcin de la luz UV por sus enlaces
conjugados. El menor grado de absorcin se
produce en un estado de doble hlice, y va
aumentando con relacin al aumento de la
desnaturalizacin pasando a un estado de
hebra sencilla con sus bases expuestas, este
es el llamado efecto hipercrmico
Cuando se controlan el pH y la fuerza inica
es posible observar el desmoronamiento del
DNA por medio de este efecto, la
temperatura a la cual la mitad de los
nucletidos se han separado se conoce
como Tm (temperatura de fusin).La Tm es
caracterstica de cada DNA puesto que est
directamente relacionada con la cantidad de
pares de bases de C=G.
Las primeros aumentos de temperaturas
presentan la formacin de burbujas en toda
la cadena, sobre las partes de las molculas
que presenten gran cantidad de pares de
bases A=T, debido a que presentan menores
enlaces de apilamiento entre estas bases, y
solo dos enlaces de puente de hidrogeno que
las une. A medida que aumenta la
temperatura, las burbujas se hacen cada vez
mas grandes porque a mayores T es posible
romper los enlaces entre las bases ms
fuertemente unidas G=C hasta que
finalmente el movimiento trmico poli
nucletido supera las fuerzas de
estabilizacin. El coeficiente de extincin no
es muy diferente al de la suma de las
absorbencias constituyentes de pricos y
pirimidnicos cuando el poli nucletido se
encuentra totalmente desordenado.11
Si hubiese realizado el experimento del
efecto de la temperatura en presencia
de formaldehdo. Cmo sera el
resultado de Tm obtenido en tales
condiciones frente al que obtuvo usted
en ausencia de formaldehido? Explique.
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