MILIEUX DE CULTURE

Introduction
Un milieu de culture doit satisfaire toutes les exigences nutritives des micro-organismes :
- apport de la source d'nergie, de carbone, d'azote;
- besoins en ions minraux, en facteurs de croissance;
- pH et force ionique voisins des valeurs optimum.

Il peut se prsenter sous forme liquide ou solide, par addition :

- d'aqar ou glose (intrt : fusion au del de 80C, mais possibilit de le maintenir en surfusion
45C, temprature compatible avec l'incorporation de micro-organismes ; pas d'hydrolyse de l'agar par
les -org),
C'est un polymre sulfat compos de D- et L-galactose. Il est produit par les Rhodophyces
(algues rouges)
- de glatine (hydrolysable par certains germes, utilisation historique),
- oeuf entier coagul (milieu de Jensen pour Mycobactries).
- Gel de silice, utilis pour la croissance des bactries autotrophes sur milieu solide(si on veut exclure
toute molcule organique).

1. Prparation des milieux

1) Considrations gnrales :
La plupart des milieux se prsentent sous forme dshydrate, ce qui assure une composition constante,
un stockage facile et une prparation simplifie.
Lors de la reconstitution des milieux, la poudre est mlange au volume d'eau prconis,
homognise, puis dissoute totalement par chauffage (l'bullition ne doit pas dpasser 1 2
minutes). Aprs refroidissement 50-60C, le milieu est distribu dans d'autres rcipients (tubes
essais) en vue d'tre strilis.
La strilisation se fait par autoclavage. Le temps et la temprature peuvent varier d'un milieu l'autre
(tenir compte galement du conditionnement, de prfrence des petits volumes). En gnral une
strilisation de 15-20 minutes 120C est prconise.
Les milieux sont ensuite laisss refroidir jusqu' 50C dans l'autoclave (ne pas les sortir avant car la
diffrence de tempratures provoquerait une dpression au sein des tubes).
Ils peuvent ensuite tre conservs tels quels aprs refroidissement en position verticale, ou inclins en
pente ou pente et culot, ou distribus en boite de ptri.

2) Cas particuliers :
Certains milieux ncessitent l'adjonction de produits ne supportant pas l'autoclavage (sang frais, jaune
d'uf, antibiotiques, complments vitaminiques...). Ces complments doivent alors tre apports striles
dans la glose en surfusion. La strilit des additifs est assure soit au moment du prlvement, soit par
filtration.
Certains milieux ncessitent d'tre rgnrs avant utilisation : ils sont placs pendant 20 minutes dans
un bain-mari bouillant de sorte chasser l'oxygne dissout (Ex : glose VF, milieu Hugh-Leifson ...).
Les milieux qui doivent tre ensemencs en profondeur sont pralablement liqufis au bain-mari,
puis maintenus en surfusion (45-50C) en bain thermostat jusqu' leur ensemencement.

2. Diffrents types de milieux

1)Milieux synthtiques ou dfinis :
Composition connue exactement qualitativement et quantitativement. Ces milieux sont utiliss
essentiellement pour l'tude de besoins nutritifs d'un germe.
Peu sont utiliss couramment : Glose pour auxanogramme , Citrate de Simmons, Ure-Indole ...
On les rencontre galement pour la culture de micro-organismes autotrophes chimio-lithotrophes telles
que les cyanobactries.
Dans ce cas :
- le carbone est apport sous forme de carbonate de sodium,
- l'azote est apport sous forme de nitrate ou d'ammoniac,
- les autres sels minraux sont les phosphates, sulfates, chlorures ...

2)Milieux empiriques ou complexes:

Composition connue partiellement car utilisation de matires premires +/- complexes : srum, sang,
peptone (hydrolysats pepsiques ou trypsiques de matire organique - foie, viande, soja, casine ...-
constituent la source azote)
Milieux usuels : composition et prparation simple, peu coteux et convenant un grand nombre de
germes. Ex :
- Eau peptonne, bouillon nutritif, dont les peptones sont simples, pour les germes htrotrophes ne
prsentant pas d'exigence particulire.
- TS, Columbia, Mueller-Hinton : peptones plus riches pour les germes plus exigeants

Milieux enrichis : addition de suspensions riches en molcules organiques (sang, srum, extrait
globulaire ...). Cf plus loin.
Milieux slectifs : contiennent des molcules empchant la culture de certains micro-organismes. Ils sont
utiliss pour isoler les germes de produits poly-microbiens. La nature des inhibiteurs est variable, il peut
s'agir :
- de NaCl : milieu de Chapman 75 pour Staphylococcus, bouillon hypersal 65
pour Enterococcus.
- de sels biliaires (dsoxycholate) : Mac Conkey, Hektoen pour Enterobacteriaceae
- d'antibiotiques: glose au sang + ANC (acide nalidixique, colistine) pour les Strep
tococcus.
- d'antiseptiques : glose au ctrimide pour Pseudomonas

Rmq :
1- On peut galement augmenter la slectivit des milieux en choisissant des conditions de culture
particulires.
Ex : la glose au ctrimide place 42C est plus slective pour Pseudomonas aeruginosa.
2- On parle de milieu "lectif" lorsqu'il ne contient pas d'agent inhibant mais qu'il favorise la croissance
d'un type de germes.
Le principal exemple est la glose au srum coagul pour les corynbactries.

Milieux d'orientation et d'identification ou milieux diffrentiels: la plupart des milieux contiennent des
lments permettant de mettre en vidence des caractres biochimiques en vue d'une orientation du
diagnostic.
La lecture de ces milieux peut :
- soit se faire directement :
- virage d'un indicateur de pH indiquant la consommation d'un sucre (milieu BCP pour le
lactose chez les Entrobactries, Chapman pour le mannitoi chez les Staphylococcus ...)
- prsence d'ions fer III qui rvlent la production d'H2S par apparition d'un prcipit noir
(milieu Hajna-Kligler, milieu SS...)
- soit se faire aprs addition de ractifs :
- addition d'acide suifanilique et d'-naphtylamine pour rvler la rduction des nitrates dans
le bouillon nitrate
- addition de perchlorure de fer pour rvler la prsence d'une tryptophane dsaminase en
milieu Ure-Indole ...

3. Les milieux enrichis

1)Milieux au sang:
- Milieu au sang frais : addition du sang dfibrin strile dans la glose en surfusion (~ 5%). Utilisation
de sang de mouton (indispensable pour le test de Camp) ou de cheval (permet une meilleure expression
de l'hmolyse de certains Streptococcusdu groupe D).
Intrt : - apport de facteurs de croissance,
- activits peroxydase et catalase qui favorisent la croissance des germes qui en sont
dpourvus (Streptococcaceae),
- neutralisation de certains inhibiteurs contenus dans les peptones,
- lecture des caractres d'hmolyse dus la prsence de lcithinase (= actylcholine-
estrase).
On parle d'hmolyse alpha () lorsqu'elle est incomplte (zone verdtre autour de la colonie), bta ()
lorsqu'elle est totale, ou de souche non-hmolytique.
Limites : prsence de transferrine qui peut mobiliser tout le fer disponible et empcher la croissance
de certains -org.

- Milieu au sang cuit : prparation idem sang frais + chauffage 10 min 75C.

- Glose chocolat : autoclavage d'un milieu de base + hmoglobine (milieu moins riche que le
prcdent, souvent ajout de complments poly-vitaminiques)
Intrts : - la cuisson permet de librer certains facteurs de croissance (telle que l'hmine =
prcurseur de coenzyme, transporteur d'lectrons des cytochromes; NAD)
- destruction de certains inhibiteurs
- libration du fer III de la transferrine

2) Autres additifs:
- Extrait globulaire : obtenu par expression d'un caillot de sang au travers d'un linge, il est strilis par
filtration. Ajout dans les milieux de base hauteur de 10%, sa caractristique fondamentale est sa
richesse en hmine (facteur X).

- Srum : obtenu par sparation du coagulum d'un sang normal ou par dcantation d'un sang dfibrin.
Il est strilis par filtration ou par tyndallisation. Ajout 5-10% dans les milieux, il permet la croissance
des germes srophiles (Glose au srum coagul pour Corynebacteriuni)

- Ascite : le liquide est obtenu par ponction strile chez des individus atteints d'hydropisie (accumulation
de srosit dans une cavit naturelle du corps). Il contient les mmes lments que le srum, mais
moins de glucose et d'enzymes pouvant interfrer avec les recherches biochimiques ralises.

- Jaune d'oeuf : prleve strilement, la solution de jaune d'uf est additionne aux milieux usuels pour
permettre la recherche de la lcithinase (milieu Baird-Parker pour Staphylococcus aureus)

- Lait : possibilit d'utiliser le lait UHT, qui est strile. Utilis pour l'isolement et le dnombrement des
bactries lactiques, pour la recherche de l'hydrolyse de la casine.

4. Les micro-mthodes : galeries miniaturises

Avec la multiplication des analyses bactriologiques, se sont dvelopps des systmes permettant
d'associer rapidit, reproductibilit et faible cot : les macro-galeries classiques ont t progressivement
miniaturises. On distingue deux catgories de dispositifs :
- certains proposent un assemblage de milieux classiques prts l'emploi disposs en mini tubes ou en
compartiments juxtaposs dans un mme conditionnement.
Dans ce cas l'ensemencement se fait dans les mmes conditions que pour la galerie classique, les
temps d'incubation et la lecture sont quivalents. Ex : Galeries Pasteur, Entrotube Roche
- d'autres proposent un assemblage de cupules contenant des substrats dshydrats qui sont rgnrs
avec la suspension de la bactrie tudier.
Ces dispositifs ncessitent de travailler en conditions standardises : densit et quantit de l'inoculum,
atmosphre d'incubation ...
La rduction du temps d'incubation est possible grce au travail avec des inoculum plus denses ou
l'utilisation de substrats artificiels (ractions plus sensibles).
Ex : Galeries API, RapID

BIBLIOGRAPHIE
Le laboratoire de bactriologie mdicale (MARCHAL N., BOURDON J.L, BIMET F.)
Microbiologie technique : 1-Dictionnaire des techniques (JOFFIN J.N., LEYRAL 6.)
Microbiologie (PRESCOTT, HARLEY, KLEIN)