DE LA PROBETA A LOS GENES

Hormona de crecimiento, una epopeya

cientfica argentina

Descripcin cientfica
Juan M. Dellacha Y Jos A. Santom.

Nora Br
 ndice

Prlogo 7

Frigorficos y mecheros de Bunsen 10

Carrera contra el tiempo 17

La fabriquita 23

De la mesada al consultorio 29

Cambio de rumbo 37

Una palabra que todava no estaba de moda 40

Una oveja llamada Dolly 46

La ingeniera de la vida 53

La farmacia en el tambo 63

Broche de oro 67

Eplogo 74

Los protagonistas 80

5
 DESCRIPCIN CIENTFICO- TCNICA. HORMONA DE 85
CRECIMIENTO. | Estudios realizados en Argentina. Juan
M. Dellacha - Jos A. Santom.

Sumario 86

Formacin del grupo de trabajo para: el estudio de la hor- 91

mona de crecimiento / Creacin del Centro para el Estudio
de las Hormonas Hipofisarias (CEHIP)

Investigaciones sobre hormonas del crecimiento del pero- 98

do 1963-1976

Investigaciones sobre hormonas del crecimiento posteriores 111

a 1976. Divisin del Grupo de Qumica Biolgica de la Facul-
tad de Farmacia y Bioqumica de la UBA

Colaboracin con la industria de investigadores de hormo- 136

nas de crecimiento

Anexo A. Estructura de protenas 142

Anexo B. Breve descripcin de los fundamentos y metodolo- 143

ga empleada para determinar la estructura primaria de la
hormona de crecimiento bovina

Anexo C. Evolucin de las metodologas para determinar la 148

estructura primaria de protenas

Anexo D. Resumen de los conocimientos estructurales ac- 150

tuales sobre hormonas de crecimiento

Anexo E. Receptores hormonales 152

Registro fotogrfico 153

6
 PRLOGO

A los nueve aos, despus de perder a su pap, Jseph Boruwlas-

ki fue entregado por su madre como acompaante y entretenimien-
to de aristcratas. Jseph haba nacido apenas nueve aos antes, en
Polonia, y de all en ms se dedic a recorrer las cortes de Pars, Vie-
na y Londres, deslumbr a prncipes y reyes, y hasta escribi un li-
bro sobre sus aventuras y experiencias. Es ms, su celebridad le vali
una entrada de la clebre Enciclopedia Diderot. All aparece citado
en la definicin de enano: segn las crnicas de la poca y sus pro-
pios recuerdos, no lleg a superar el metro de altura.

Se calcula que uno de cada cinco o seis mil de los bebs que nacen
diariamente en el mundo pueden padecer esta dolencia causada en
la mayora de los casos por un dficit hormonal que, sin atencin
mdica, les impedir alcanzar una altura considerada normal. Su hi-
pfisis, una glndula de forma ovalada situada en la base del crneo,
que mide milmetros, y pesa entre 500 y 700 miligramos, produce
una protena vital para que los tejidos se desarrollen, entre otras nu-
merosas funciones: la hormona de crecimiento.

Su carencia no slo se traduce en baja estatura, sino tambin en una

irregular acumulacin de grasa, particularmente en el tronco, hi-
persensibilidad a la insulina, rasgos infantiles, fragilidad sea. En el

7
 recin nacido, puede ocasionar hipoglucemias graves, que a su vez
pueden dejar secuelas cognitivas.

Hasta hace cuatro dcadas, los chicos nacidos con el mismo dficit
que padeci Jseph Boruwlaski (y dos de sus cinco hermanos) no
podan aspirar ms que a una vida de fenmenos. Las sociedades
humanas, se sabe, no perdonan a los que no caben en el molde de lo
previsto.

Hoy, detectado a tiempo, el enanismo hipofisario puede evitarse

reemplazando la hormona faltante por una versin prcticamente
idntica fabricada en el laboratorio.

Basta con realizar el tratamiento adecuado durante la adolescencia

para suplir lo que la naturaleza niega. Este consiste en administrar
una inyeccin subcutnea de la hormona biosinttica tres veces por
semana durante ocho a diez aos.

El resultado es notable: los chicos que responden bien pasan de cre-

cer tres centmetros anuales a doce, y ganan en total unos treinta.
Es la diferencia entre llegar o no a presionar los pedales del auto-
mvil, alcanzar los pasamanos de los colectivos y subtes, poder mi-
rar por sobre el mostrador del banco, tener derecho a unas fichas en
la lotera del amor, o poder presentarse a una entrevista de traba-
jo sin escuchar un no antes de siquiera abrir la boca.

Esos 30 centmetros marcan la distancia, en suma, entre insertarse

en la trama social o quedar relegado a los mrgenes.

La historia de la decodificacin, el desarrollo y la produccin indus-

trial de la hormona de crecimiento humana abarc ms de tres d-
cadas del ltimo siglo. Como muchos otros logros humanos, fue una
historia de tenacidad, pasin, inteligencia y mucho, mucho traba-

8
jo. Pero lo ms singular, para los que vivimos en esta parte del mun-
do, es que tuvo como protagonistas a dos generaciones de cientficos
argentinos que, aunque muchas veces competan con equipamiento
casero y menos recursos que sus colegas del hemisferio norte, mar-
caron hitos cientficos que ya forman parte sustancial de la gran no-
vela de la ciencia mundial.

Hombres y mujeres que trabajaron sin descanso para desentraar

uno a uno los 191 ladrillos (aminocidos) que componen la estructu-
ra de la hormona sintetizada, almacenada, y secretada por las clu-
las somatotropas de la hipfisis no slo investigaron en las fronteras
del conocimiento de su poca y publicaron sus trabajos en algunas
de las revistas ms prestigiosas del mundo cientfico, sino que al
mismo tiempo hicieron posible que decenas de chicos hasta ese mo-
mento excluidos u ocultados por sus propias familias recibieran
un tratamiento mdico que les cambi la vida.

Luego, fueron algunos de sus alumnos de la Universidad de Buenos

Aires, que ya haban abandonado las aulas y perseguan otros hori-
zontes, los que tomaron la posta y siguieron avanzando para produ-
cir la hormona no ya manipulando probetas sino insertando genes
humanos en bacterias y hasta desarrollando animales transgnicos
capaces de producir en sus clulas la hormona humana!, una tecno-
loga que dominan slo un puado de pases.

De esa aventura que tuvo ribetes de epopeya trata este libro.

9
 FRIGORFICOS Y MECHEROS DE BUNSEN

Corre 1958. El clebre Domenico Modugno se consagra en el Festi-

val de San Remo y en la Argentina, Arturo Frondizi acaba de asumir
la presidencia despus de haber sido elegido en elecciones en las que
est proscrito el peronismo.

Es el Ao Geofsico Internacional, y ms de 30.000 cientficos y tc-

nicos de 66 pases se unen para realizar observaciones sobre la Tie-
rra y sus alrededores csmicos.

Impulsada por la tecnologa, la humanidad avanza a grandes pasos,

tanto a ras del suelo como en el espacio. La expedicin neozelande-
sa dirigida por Edmund Hillary llega al Polo Sur. Rusos y norteame-
ricanos hacen sus primeros intentos de enviar satlites fuera de la
atmsfera y confirman que no es tarea sencilla. El Sputnik 1 se des-
integra a poco de ser lanzado y el cohete Atlas estalla en la platafor-
ma de lanzamiento de Cabo Caaveral; es el quinto fracaso de siete
intentos de lanzamiento. James Van Allen descubre los cinturones
que llevan su nombre, dos zonas de radiacin de alta energa que
circundan la Tierra, probablemente donde el viento solar y los rayos
csmicos interactan con los tomos de la atmsfera. Son los prime-
ros das de la NASA, cuando se pone en rbita el primer satlite de
comunicaciones de la historia.

10
La ciencia empieza a estar cada vez ms presente en los titulares
de la prensa. Por el Decreto Ley 1291, promulgado el 5 de febrero,
ese ao nace en la Argentina el Consejo Nacional de Investigaciones
Cientficas y Tcnicas (CONICET). El doctor Bernardo Houssay, que
en 1947 haba ganado el Premio Nobel de Fisiologa y Medicina por
su trabajo sobre la influencia del lbulo anterior de la hipfisis en la
distribucin de la glucosa en el organismo o, dicho de otro modo,
por demostrar que la hormona de crecimiento es antiinsulnica, es
elegido presidente, y el meteorlogo Rolando Garca, vicepresiden-
te, ambos por unanimidad.

Segn cuentan Diego Hurtado y Adriana Felds en un artculo para

la revista Nmada, slo dos aos ms tarde se crea la llamada ca-
rrera del investigador, que por primera vez permitira a cientficos
argentinos dedicarse por completo a la investigacin y la docencia.
Tambin se ponen en marcha un programa de becas destinadas a la
formacin de recursos humanos tanto en el pas como en el extran-
jero, y un programa de subsidios para investigaciones especficas, y
adquisicin de equipos e instrumental, repatriacin, contratacin de
investigadores extranjeros y viajes al exterior.

En la entonces Facultad de Ciencias Mdicas de la Universidad de

Buenos Aires, en el Instituto de Histologa y Embriologa, dirigido
por el doctor Eduardo De Robertis, integrante del primer directo-
rio del CONICET, el profesor Carlos Gmez, Juan Dellacha y Rober-
to Mancini empiezan a estudiar la distribucin de ciertas protenas
en los tejidos marcndolas con molculas fluorescentes, una tcnica
que estaba comenzando a utilizarse en el mundo.

Lo que hacan era inyectarles a roedores protenas marcadas con

un colorante que tiene la particularidad de emitir fluorescencia ro-
jiza cuando se lo excita con luz ultravioleta, la lisamina rodamina
B 200. Despus las sacrificaban en distintos momentos y procesa-

11
 ban los tejidos que resultaban de inters para estudiarlos bajo el mi-
croscopio.

Haciendo cortes muy delgados, los cientficos podan observar dn-

de se ubicaba la protena, tcnica esencial para saber cmo acta una
hormona. En esos aos prevaleca la idea que las hormonas no pene-
traban en las clulas, pero Dellacha y Mancini, trabajando con la ti-
rotrofina (TSH, segn sus siglas en ingls), que es secretada por el
lbulo anterior de la hipfisis y que le indica a la tiroides que debe au-
mentar su produccin de tiroxina y triodotironina, la inyectaron en
ratas de laboratorio y a los pocos minutos la localizaron en la mem-
brana celular de la tiroides. Instantes ms tarde, la fluorescencia de-
sapareca de la membrana y apareca en el interior de la clula, lo que
constituy una elegante demostracin de que la hormona s ingresa-
ba en el citoplasma celular, donde produce su efecto caracterstico.

Estos experimentos refutaron un dogma de la poca, se publicaron

en Nature y fueron los primeros en demostrar que las hormonas pe-
netran en la clula blanco a los pocos minutos de ser inyectada. Ms
tarde, Dellacha y Mancini marcaran con la protena fluorescente la
hormona de crecimiento, y tambin probaran el mismo efecto.

Dellacha era entonces un joven cientfico que, gracias a esos traba-

jos, obtuvo la nica beca que ofrecan los Institutos Nacionales de
Salud de los Estados Unidos a la Argentina para formarse en el Ins-
tituto Sloan-Kettering de Investigacin del Cncer bajo la direccin
del doctor Martin Sonenberg.

Haba nacido en el barrio porteo de Caballito, sobre la avenida Juan

Bautista Alberdi, salpicada de plazoletas, polvo de ladrillo, canteros
y grandes jarrones con plantas, y bordeada de casas bajas.

Hijo de un empresario textil que haba comenzado a trabajar des-

12
de muy joven como artesano en herrera y que junto con dos herma-
nos haba hecho parte de la verja de la Catedral de La Plata, Dellacha
sospecha que recibi de su padre parte de su curiosidad e ingenio
tcnico.

No era cientfico, pero tena una gran inclinacin tcnica recuer-

da. Le doy un ejemplo: tanto mi padre como mis dos tos solan
guardar en una caja las agujas que se usaban en las mquinas texti-
les que se rompan por arriba y en otra, las que se rompan por aba-
jo. Cuando estall la Segunda Guerra Mundial, las agujas, que eran
de fabricacin britnica, dejaron de llegar al pas y muchas fbricas
tuvieron que cerrar. Pero ellos inventaron un sistema para unir am-
bas partes, las soldaban con bronce, y as pudieron mantener la pro-
duccin.

Dellacha haba egresado como maestro de la escuela Mariano Acos-

ta. Pero dado que se haban eliminado las equivalencias entre el ma-
gisterio y el bachillerato, para dar el ingreso a la Escuela de Farmacia
y Bioqumica de la Facultad de Ciencias Mdicas de la Universidad
de Buenos Aires, rindi todas las materias de cuarto ao entre di-
ciembre y marzo, y curs quinto en el Urquiza, de Carabobo y Pe-
dro Goyena.

Como practicante en la farmacia del Hospital de Nios, fue compa-

ero del legendario Carlos Gianantonio. Si bien en esos das la carre-
ra de cientfico era algo as como una excentricidad, una ancdota
deja ver que ya lo dominaba la pasin del investigador. Al hospital
llegaban muchos chicos deshidratados cuenta. Yo me haba com-
prado el libro Bioqumica de la Enfermedad, de Bodansky y Bodans-
ky, que en uno de sus captulos desarrollaba el tema de la deshidra-
tacin infantil, y estableca la importancia de la determinacin de la
reserva alcalina para su tratamiento. As que fuimos con Giananto-
nio al laboratorio de infantes, que era el de los chicos ms chiquitos,

13
 y le pedimos al director que en nuestros das de guardia nos deja-
ra hacer el anlisis de las reservas alcalinas de esos chicos para po-
der formular un pronstico. Ah ya estbamos empezando a inves-
tigar...

Otro da, lleg un chico con sntomas que los mdicos no alcanzaban
a reconocer. Finalmente, les pareci que estaban ante un caso de es-
corbuto, algo excepcional en esta parte del mundo. Pero no haba
cmo probarlo. A Dellacha se le ocurri que los laboratorios Roche
deban tener un reactivo para detectar la deficiencia de vitamina C
y les pidi que se lo proporcionaran. Hicimos el anlisis y se confir-
m, tena una carencia absoluta, recuerda.

En 1962, Alejandro Paladini, profesor titular de Qumica Biolgica

I en la Facultad de Farmacia y Bioqumica, que haba intervenido en
los trabajos que le valieron el Nobel a Luis Federico Leloir y el nico
que en ese momento haca investigacin desde el punto de vista me-
tablico, lo invit junto con otro joven investigador, Jos Santom,
a un concurso de profesores adjuntos en el Departamento de Qumi-
ca Biolgica.

Paladini recuerda haberle propuesto a Dellacha regresar desde Nue-

va York para incorporarse a su grupo. No tena otro lugar de traba-
jo, salvo el Hospital de Nios, pero all no tendra ninguna posibili-
dad de continuar con sus investigaciones dice. Nosotros tenamos
un instituto que habamos armado para estudiar protenas. Adems
tenamos algn instrumental caro, como una ultracentrfuga ana-
ltica, que ya no usaba nadie. Con esa centrfuga prob que las dos
hormonas de crecimiento, la humana y la bovina, tenan el mismo
peso aproximadamente.

Santom haba nacido en Parque Patricios y, a pesar de que su padre

tena inclinacin por la literatura, desde chico se sinti deslumbra-

14
do frente al mundo natural. Tenamos todo tipo de animales: pa-
vos, patos, palomas, y un ao llegamos a criar 53 pollos recuerda,
divertido. Yo estudiaba qu coman, cmo iban creciendo. Me inte-
resaba cmo vivan.

Nunca se haba imaginado que poda dedicarse a la ciencia, pero en

la escuela secundaria Bernardino Rivadavia, despus de haber pasa-
do por un colegio religioso, se interes por la qumica y las ciencias
exactas. Me atraa mucho la evolucin; de hecho, trabaj durante
varios aos en la evolucin de la protena transportadora de cidos
grasos, cuenta.

Cuando lleg el momento de ingresar a la facultad, se decidi por

la bioqumica, una carrera que debi cursar mientras desempeaba
diversos trabajos, porque su padre falleci mientras comenzaba sus
estudios universitarios. Llegu a trabajar en cinco lugares diferen-
tes al mismo tiempo exclama: en una clnica oncolgica, en los la-
boratorios Dupont, realizando anlisis clnicos en un laboratorio... Y
en todos lados introduca una modificacin en los mtodos existen-
tes. Mis compaeros siempre me decan que tena que dedicarme a
la investigacin.

Uno de los temas del laboratorio de Sonenberg era la hormona de

crecimiento. En esos tiempos era comn utilizar insulina de origen
animal para el tratamiento de la diabetes en personas. Dado que es
casi idntica a la humana, se la extraa del pncreas de la vaca, el ca-
ballo, el cerdo y hasta de ciertos pescados, aunque en algunos casos
produca alergia por deficiencias en su purificacin.

De all surgi la idea de estudiar la posibilidad de utilizar la hormo-

na de crecimiento bovina para tratar la deficiencia de la misma pro-
tena en chicos, recuerdan hoy los investigadores. Sin embargo, en-
tre muchos otros obstculos derivados de la tecnologa disponible

15
 para estudiarla, haba uno fundamental: la hormona de crecimien-
to distaba mucho de ser homognea; es decir, estaba acompaada de
otros elementos.

Lo saban porque cuando la analizaban por centrifugacin, la velo-

cidad de sedimentacin indicaba que estaban ante varias sustancias.
Y lo mismo ocurra cuando la sometan a electroforesis libre, una
tcnica para separar molculas de acuerdo con su movilidad en un
campo elctrico. El procedimiento se realizaba sobre un acetato o a
travs de una matriz porosa donde se ubican en distintos lugares de
acuerdo con su carga.

Dellacha propuso entonces elaborar un mtodo para preparar, a par-

tir de hipfisis bovinas, hormona de crecimiento homognea para
emplearla en forma teraputica. Aunque lo lograron al cabo de un
par de meses, luego se vio que la idea inicial sera impracticable por-
que slo la hormona de crecimiento humana y de simio eran activas
en las personas, por lo que sera imposible usar hormonas de creci-
miento de otros mamferos en la clnica mdica.

Entre otras causas, se especul con que no actuaban debido a su ta-

mao molecular, ya que se crea que en las hormonas humana y de
simio era aproximadamente la mitad del de otras especies animales.
De hecho, algunos laboratorios en el mundo intentaron modificarlo
mediante digestiones enzimticas controladas para obtener un pro-
ducto activo en humanos a partir de hormonas animales. Esas mani-
pulaciones permitieron comprobar efectos metablicos y anablicos
(promotores del crecimiento muscular).

Se descubri, por ejemplo, que producan retencin de nitrgeno,

una seal de que haba sntesis de protena. Es decir, haba cier-
ta accin, pero no la accin. No hacan crecer, recuerda Santom.

16
 Carrera contra el tiempo

A pesar de las dificultades, a su regreso de los Estados Unidos De-

llacha sigui dispuesto a continuar en el tema e invit a Paladini y
Santom a formar un equipo de trabajo para as poder atacar el pro-
blema de la hormona de crecimiento bovina desde varios ngulos si-
multneamente.

El proyecto estaba en la cresta de la ola y posea el atractivo agre-

gado de que poda ayudar a aclarar porqu esa protena no actua-
ba en seres humanos y, tal vez, permitir su modificacin estructural
para que s lo hiciera. Adems, pensaron los cientficos, tambin po-
dra contribuir al tratamiento de chicos con retardo de crecimiento
de origen hipofisario mediante la obtencin de hormona a partir de
hipfisis humanas cadavricas.

Esta decisin los llev a ser protagonistas de una competencia inter-

nacional en la que tendran que medirse con cientficos del mundo
desarrollado que estaban tras la misma meta.

Segn cuenta en Das de Ciencia (Eudeba, 2010), Paladini vena de

trabajar en el Instituto Rockefeller, de Nueva York, con Lyman Craig,
en la purificacin de mezclas complejas con la tcnica de distribu-
cin en contracorriente, y con Moore y Stein, en la determinacin de

17
 la composicin en aminocidos de las protenas por cromatografa,
que consiste en filtrar una solucin de la mezcla que se desea anali-
zar a travs de un medio poroso.

Dellacha y Santom recuerdan que el departamento de Qumica

Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA tena
en ese entonces una buena cmara frigorfica que haba hecho cons-
truir precisamente Paladini. l la necesitaba porque trabajaba en
angiotensina de origen bovino, cuentan. La angiotensina, hormona
que eleva la presin sangunea y de la que hoy se sabe que hay tres
versiones, haba sido descubierta por el fisilogo argentino Eduardo
Braun-Menndez y su grupo hacia 1939.

Toda protena, y las hormonas lo son, es una cadena lineal de ami-

nocidos. Para poder catalogarlos, un paso ineludible para lograr el
objetivo que se haban planteado, Dellacha y Santom se enfrenta-
ban al desafo de producir y conservar cantidades importantes de
hormona de crecimiento bovina. Y como para poder extraerla es in-
dispensable mantener el tejido a una temperatura constante de en-
tre cero y cinco grados centgrados, esa cmara frigorfica resultaba
un recurso ideal para montar una pequea fbrica.

Lejos del glamour con que hoy los retrata el cine, los cientficos de
esos tiempos estaban obligados a asumir tambin el papel de arte-
sanos. El propio Paladini cuenta en su autobiografa que, tal vez por
las vivencias que le haba transmitido su padre escultor, tena una
inclinacin marcada por las artes manuales y que lo deslumbraba la
tarea de los vidrieros cientficos. Ellos transformaban sencillos tu-
bos en complicados aparatos, dice, que luego se usaban en los labo-
ratorios.

Pero en el proyecto que iban a acometer, los cientficos y tcnicos

que participaron no slo tendran que meter las manos en la masa,

18
sino que adems terminaran enfrentndose a una tarea titnica.

La historia, reconstruida hoy por Dellacha y Santom, haba comen-

zado con una propuesta de Paladini, que consider que el primer
aporte que el grupo podra hacer sera la separacin de las tres ban-
das que aparecan cuando se la someta a electroforesis en geles de
poliacrilamida, lo que les permitira verificar la homogeneidad de la
hormona de crecimiento bovina. Para esto, el laboratorio dispona
de un moderno equipo de distribucin en contracorriente de 1.000
tubos, sistema que haba demostrado un elevado poder de resolucin
de mezclas complejas, incluyendo polipptidos (molculas de ms
de diez aminocidos), pero que no se haba probado en protenas.

La distribucin en contracorriente es una tcnica que haba sido de-

sarrollada por Lyman Craig para resolver las dificultades que exi-
ga establecer la pureza qumica exacta de las drogas complejas para
prevenir y tratar la malaria, de elevado peso molecular e inestabi-
lidad qumica, que se introdujeron en la Segunda Guerra Mundial.
Craig transform una operacin clsica en qumica, como es el re-
parto de una substancia entre dos solventes no miscibles, en un m-
todo de purificacin de mezclas complejas, cuya potencialidad es,
tericamente, ilimitada, escribe Paladini en Das de Ciencia.

Segn explica el investigador, la operacin era increblemente tra-

bajosa. Consista en introducir una sustancia pura en la primera am-
polla de la serie de 1.000, junto con volmenes iguales de dos lqui-
dos que no se mezclan, como el ter y el agua. Se agitaba la ampolla
durante un tiempo, hasta que se distribua la sustancia entre los dos
lquidos, y luego se pasaba la fase superior a la ampolla siguiente,
que solo contena agua. Luego se agitaban ambas ampollas, y se pa-
saba el lquido de la primera a la segunda, y se repona la sustancia
pura en la primera. Este proceso se repeta cada vez con una nueva
ampolla, de modo que la sustancia se iba distribuyendo entre dos ca-

19
 pas de lquidos no miscibles que circulaban en direcciones opuestas.

Uno de los primeros frutos de esta tcnica fue la purificacin qumi-

ca de la penicilina en la Universidad de Cornell, en Nueva York.

En Buenos Aires, Paladini, Dellacha y Santom trabajaron varios

meses con ese equipo y enviaron las distintas fracciones que obte-
nan al laboratorio de Sonenberg, en Estados Unidos, para la de-
terminacin de su actividad biolgica. Con gran decepcin, com-
probaron que la distribucin en contracorriente desnaturalizaba la
molcula de la hormona y la inactivaba.

Por esos das, Dellacha recibi un subsidio de 4.000 dlares de los

Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos. Los aport a
todo el grupo y de ese modo pudieron sumar dos nuevos dispositivos
que resultaron fundamentales: un destilador y una centrfuga refri-
gerada, que todava se guardan entre los equipos del laboratorio.

Con estos insumos, los tres investigadores resolvieron que cada uno
se ocupara de un aspecto distinto del estudio de la hormona bovina
para acelerar la tarea. As, cada uno avanzara en su lnea de trabajo
y luego discutiran en conjunto los resultados para seguir adelante.

A fines de la dcada de 1960 se haba descubierto que las hormo-

nas de crecimiento constituan un grupo de protenas estrechamen-
te relacionadas, pero con una peculiar especificidad de especie en su
actividad biolgica. Quiere decir que las hormonas de otros mam-
feros no eran activas en primates dice Santom. Estas caracters-
ticas decidieron a varios investigadores a intentar modificaciones en
distintas hormonas de crecimiento para hacerlas activas en huma-
nos. Pero para aspirar a tener xito en esa tarea, era muy importan-
te conocer los engranajes moleculares que explicaban ese compor-
tamiento. Con el objetivo de contribuir a la solucin del problema, el

20
subgrupo de Paladini explor algunas caractersticas diferenciales
de la estructura tridimensional de las hormonas de crecimiento hu-
mana, bovina, ovina, porcina y equina.

Con una participacin protagnica del rosarino Csar Cambiaso,
que estaba haciendo su tesis de doctorado, pudieron comprobar, por
ejemplo, que la hormona de crecimiento humana es de dos a diez ve-
ces ms permeable al solvente que las otras. Tambin probaron que
existen diferencias de especie en la interaccin de las hormonas de
crecimiento con la membrana de los glbulos rojos de la sangre (eri-
trocitos).

El subgrupo de Dellacha, por su parte, decidi verificar si era cierta

la asignacin de un peso molecular de 46.000 a la hormona de creci-
miento bovina, aproximadamente el doble del correspondiente a las
hormonas de origen humano y de simio. Los resultados, obtenidos
con el nico equipo que tena la UBA para determinar el peso mole-
cular de protenas mediante la tcnica de centrifugacin analtica,
que consista en medir el desplazamiento de una protena en solu-
cin en un campo gravitacional intenso, les permitieron determinar
que rondaba los 22.000, similar al de la hormona humana.

Mientras tanto, Santom y la bioqumica Carlota Wolfenstein incu-

baron la hormona de crecimiento bovina con diversas enzimas para
determinar la secuencia de los aminocidos del extremo C-terminal
de la hormona. Y hasta tuvieron que destilar, con grandes precaucio-
nes, hidracina altamente explosiva (es un compuesto qumico fre-
cuentemente utilizado como precursor de catalizadores de polime-
rizacin y frmacos, pero que tambin se usa como combustible para
cohetes espaciales y satlites). Estos experimentos confirmaron los
resultados de Dellacha, que el peso molecular era cercano a 20.000,
y rectificaron los datos de otros autores.

21
 Wolfenstein recuerda que en esa poca era muy tmida, pero fue in-
vitada a integrar la ctedra de Qumica Biolgica porque haba dado
un examen excelente. A veces creo que el destino decide por uno lo
que va a hacer confiesa. A m me gustaba la medicina, pero me re-
sultaba demasiada la responsabilidad de tener una vida humana en
mis manos. La qumica me gust en cuanto la curs. Esa materia era
lo mximo para nosotros.

Un dato curioso ayuda a imaginar esos das en los que naca la cien-
cia local: las integrantes del grupo de Santom eran todas mujeres.
El doctor Houssay deca que si uno no tena un ingreso indepen-
diente no poda dedicarse a la investigacin, porque de eso no se po-
da vivir cuenta Wolfenstein. Los hombres, que tenan que mante-
ner una familia no podan darse el lujo de trabajar en ciencia.

Y agrega: Cuando yo empec, ramos dos becarias, una por Della-

cha y otra por Santom. Empezbamos por preparar la hormona.
Recibamos las hipfisis congeladas, que venan con cartlago, en-
tonces tenamos que entrar en la cmara fra bien abrigadas y cor-
tarlos con tijera para ir pelando las glndulas. Despus segua todo
el proceso de preparacin que hacamos en la cmara fra. Era muy
trabajoso. Pero el doctor Santom era la persona ms maravillosa
que se pueda imaginar: a l le debo todo lo que soy. Me acostumbr a
opinar y me dio ms confianza. Tiene una personalidad maravillosa,
siempre tuvo un trato muy clido con todos. Cuando trabajbamos
con la hidracina o con soplete, porque todo se haca a mano, siempre
me alejaba porque no quera que corriera peligro.

22
 La fabriquita

Una vez ms, el trabajo era lento y agotador.

Primero detallan Dellacha y Santom, haba que hacerse de las

hipfisis, una tarea que, contrariamente a lo que podra pensarse,
no iba a resultar nada sencilla. Decidieron comprar las glndulas bo-
vinas en frigorficos y procesarlas de a dos kilos por vez, utilizando
enormes ollas de acero inoxidable de 20 litros.

All las trituraban y comenzaba el trabajoso proceso de extraccin.

El tejido se dejaba macerar con agitacin continua durante doce ho-
ras para que las sustancias proteicas se solubilizaran. Se obtena un
lquido espeso y rojizo, que luego se centrifugaba cuentan.

Lo que no quedaba en solucin, se iba al fondo del recipiente. Se re-

tiraba el sobrenadante, se le agregaban sulfato de amonio y otras sa-
les, y se haca un fraccionamiento para sacar las protenas ms pesa-
das, que son las que primero se precipitan. Se volva a centrifugar, se
retiraba lo que quedaba en el fondo y comenzaba todo nuevamente.
El mismo proceso se repeta varias veces hasta que se haca un trata-
miento con alcohol en muy baja concentracin para llegar al precipi-
tado final, que era el que contena la hormona.

23
 Eso se liofilizaba (es decir, el agua pasaba del estado slido al gaseo-
so sin pasar por el lquido) y se obtenan aproximadamente tres gra-
mos de protena, que se purificaban colocndolos en columnas de
alrededor de un metro de largo de un polmero con esferitas espon-
josas que se conoca con el nombre de Sephadex.

De cada partida obtenan entre un gramo, y un gramo y medio de

hormona!

El Sephadex es un polmero que tiene una trama especial hecha

de esferitas esponjosas explican los cientficos. Uno tiene millo-
nes de sas, y cuando pone sustancias de distinto peso molecular, al-
gunas van a pasar por afuera porque no entran en los agujeritos, y
otras se deslizan a distinta velocidad segn puedan atravesar aguje-
ritos ms grandes o ms chicos. Por el extremo inferior de la colum-
na van saliendo las protenas, comenzando por las ms pesadas.

Gracias a un registro muy meticuloso, los cientficos podan descu-

brir por dnde sala la hormona que tena actividad biolgica. To-
mbamos esa fraccin y, ah s, la volvamos a dializar, volvamos a
liofilizarla y obtenamos un polvito, recuerdan.

Como todas las protenas, la hormona de crecimiento est formada

por una cadena de aminocidos, cada uno de los cuales tiene un gru-
po carboxilo y un grupo amino, y es capaz de unirse a otro para for-
mar una cadena mediante una reaccin entre el grupo amino de un
aminocido (N-terminal) y el grupo carboxilo (C-terminal) del si-
guiente. Las protenas son sintetizadas en los ribosomas celulares
desde el extremo N-terminal hasta el C-terminal.

Despus de llegar a determinar la secuencia del extremo C-termi-

nal, Paladini y Dellacha estimularon a Santom para que se lanzara
a revelar la estructura primaria total de la bGH, ofrecindole el apo-

24
yo de todos los integrantes del laboratorio, como as tambin la posi-
bilidad de usar los locales y equipos con que contaban.

A la distancia, los cientficos confiesan que por esos aos verdade-
ramente pareca un despropsito encarar en nuestro pas el proble-
ma de comparar las estructuras primarias (la secuencia en que se
unen 20 diferentes aminocidos para formar la cadena caractersti-
ca) de las hormonas de crecimiento humana y bovina, e intentar de-
terminar las razones moleculares de la falta de actividad de la bovi-
na en humanos.

Santom haba iniciado el estudio de la estructura del extremo C-
terminal de la hormona de crecimiento bovina en 1963, cuando se
conoca la estructura primaria de muy pocas protenas, diez aos
despus de que Sanger y Thomson publicaran la estructura primaria
de la primera protena en ser secuenciada, la insulina, y tres despus
de que Moore y Stein dieran a conocer la de la ribonucleasa, que fue
la segunda protena cuya estructura se develaba. Choh Hao Li esta-
ba determinando la de la hormona de crecimiento humana, tarea
que le llevara 10 aos.

Hicieron una evaluacin del equipamiento que posean, del nme-
ro de colaboradores con que contaban, de la provisin de hormona
de crecimiento bovina y los subsidios disponibles, y resolvieron en-
carar el trabajo a pesar de que a primera vista pareca de una mag-
nitud descomunal.

Segn dijo Paladini en su introduccin al Premio de la Academia Na-

cional de Ciencias a Santom por toda su trayectoria, el problema
qumico que implicaba determinar la secuencia de los aminocidos
que integran la hormona era formidable para la poca.

Si bien no estaban a la altura de los centros de primer nivel, tenan

25
 un autoanalizador Technicon, donado a Paladini por la Fundacin
Rockefeller y al que, junto con su tesista Nstor Gonzlez Cadavid,
haban dotado de nuevos mdulos y adaptado al anlisis automti-
co de aminocidos. Tambin contaban con resinas para el armado
de columnas cromatogrficas destinadas a la separacin de ppti-
dos resultantes de la digestin enzimtica de protenas, un equipo
de electroforesis de alto voltaje para la purificacin de pptidos y cu-
bas para la cromatografa en papel.

Con respecto a la cantidad de hormona necesaria, Moore y Stein

afirmaban que para determinar la estructura primaria de una pro-
tena se requera disponer de 1g mensual, cantidad que esperaban
obtener para la hormona de crecimiento bovina (bGH).

As las cosas, Dellacha mont una especie de fabriquita para pre-

parar de un gramo a un gramo y medio de la hormona, de los cua-
les 300 miligramos mensuales de bGH se destinaban a determinar
la estructura primaria a partir de decenas de kilos de hipfisis bovi-
nas adquiridas en frigorficos que eran congeladas individualmente,
inmediatamente despus de extradas del animal.

Para realizar las innumerables operaciones necesarias, se incorpo-

raron al grupo de Santom y Carlota Wolfenstein, Mirtha Biscoglio,
Clara Pea, Edgardo Poskus y Silvia Daurat. Tambin Zulema Maz-
zani, Vernica Fontanive y la tcnica Dora Beatti.

Con el primer analizador automtico de aminocidos, podan obte-
ner la composicin de un pptido cada 26 horas, pero gracias a la re-
novacin de los equipos, con el pasar de los aos ese tiempo se fue
reduciendo hasta poco ms de un hora.

Como se dijo, eran tiempos de ciencia artesanal, en los que los inves-
tigadores no slo deban estar al tanto de lo que se publicaba y del

26
trabajo de otros grupos en el mundo, sino tambin tener habilidad
manual y conocimientos tcnicos que les permitieran lidiar con apa-
ratos nicos en el pas.

Paladini y Dellacha se ocupaban personalmente de su actualizacin,

pero pronto estos dispositivos fueron superados cuando, en 1967,
Pehr Edman dio a conocer un equipo al que no poda aspirar el gru-
po de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de
la UBA: el primer secuenciador automtico de aminocidos. Era ca-
paz de determinar la secuencia N-terminal de 15 aminocidos en 24
horas con una nfima cantidad de la protena (250 nanomoles).

A poco de iniciado el proyecto, los argentinos se enteraron de que

haba otros dos grupos que tambin estaban determinando la es-
tructura primaria de la hormona de crecimiento bovina: uno de la
Universidad de Sussex, en Gran Bretaa, y otro del Centro Mdico
de la Universidad de Duke, en los Estados Unidos.

Sin quererlo, el Departamento de Qumica Biolgica tuvo que com-

petir con esos dos equipos, tratando de llegar antes a la meta para
no perder un trabajo de semejante magnitud si ellos daban a conocer
antes sus resultados, cuentan Santom y Dellacha.

Y a pesar de las dificultades, los cientficos de la UBA fueron los pri-

meros en publicar el trabajo completo. Tardaron siete aos en com-
pletar la estructura primaria de la hormona de crecimiento bovina,
un hito mundial si se tiene en cuenta que hasta ese momento slo se
haban podido secuenciar pocas protenas. Ese mismo ao, Wallis,
de Sussex, present sus resultados en una revista de publicaciones
rpidas.

El esfuerzo rindi sus frutos. Aprovechando la experiencia adquiri-

da y con la activa participacin de nuevos integrantes Horacio Fer-

27
 nndez, Mario Zakin y Pascual Ferrara, los cientficos siguieron
adelante y pudieron determinar mucho ms rpidamente la estruc-
tura primaria de las hormonas de crecimiento ovina y equina.

Detrs de estos estudios en distintos mamferos estaba la necesidad

de responder una pregunta que los inquietaba: porqu las hormo-
nas bovina, ovina y equina no son activas en humanos, a diferencia
de lo que ocurre con la insulina bovina y la porcina, que se utiliza-
ban en el tratamiento de la diabetes. Pensaron que la comparacin
de sus estructuras primarias permitira aclararlo e intentar modifi-
caciones estructurales en la protena para obtener un derivado acti-
vo en humanos.

La historia de estos estudios est salpicada de ancdotas que reve-

lan cmo la cotidianeidad y la trascendencia se entretejen en la vida
del cientfico. Una de ellas tiene ribetes entre cmicos e irreveren-
tes. A esta altura de las investigaciones, Li haba finalizado la deter-
minacin de la estructura de la hormona de crecimiento humana y
el grupo argentino las de origen bovino, ovino y equino. El estudio
comparativo mostr un alto grado de homologa entre ellas y no re-
vel diferencias a las que pudiera atribuirse la falta de actividad en
humanos de las hormonas de otras especies. La pregunta segua sin
respuesta.

28
 De la mesada, al consultorio

Antes de convertirse en investigador del recientemente creado CO-

NICET, Dellacha haba sido practicante en la farmacia del Hospital
de Nios Dr. Ricardo Gutirrez. A su regreso de los Estados Unidos,
haba sido invitado a exponer sus estudios en el servicio de Endo-
crinologa Infantil dirigido por Martn Cullen. All trabajaba Csar
Bergad, pionero de esta disciplina en el pas, pero que se haba es-
pecializado en endocrinologa infantil en los Estados Unidos, parti-
cularmente en el tratamiento de nios con graves trastornos de cre-
cimiento.

De ese encuentro, surgi la idea de obtener hormona de crecimien-

to a partir de hipfisis humanas. Estudiaron la propuesta con Cullen
y Paladini, y decidieron ir a ver a Bernardo Houssay para solicitarle
el apoyo del CONICET.

Empezamos a conversar con Bergad y con Juan Heinrich a travs

de Dellacha recuerda Paladini. Ellos estaban estudiando a chicos
deficitarios en la hormona; entonces ah surgi la idea de armar, con
ayuda del CONICET, un grupo para analizar la hormona con la fi-
nalidad de utilizarla en el tratamiento de esos chicos. Al principio,
Houssay no quiso. El pensaba que el CONICET no tena que dedicar-
se a hacer investigacin aplicada, deca que tena que hacer investi-

29
 gacin bsica. El que volc la balanza para que se creara un centro
fue Cullen. Lo conoca a Don Bernardo, no s de dnde, pero lo tra-
taba con mucha familiaridad y tena una presencia muy imponente.
Este Cullen se lo llev por delante... Tanto, que salimos con la pro-
mesa de que lo iba a pensar. Y al final se convenci de que estba-
mos en condiciones de hacerlo. As que pusimos en marcha el siste-
ma. Porque la preparacin de la hormona empezaba por conseguir
la glndula humana, que no era fcil.

As naci el Centro para el Estudio de Hormonas Hipofisarias (Ce-

hip), que integraron Paladini, Santom y Dellacha, del Departamen-
to de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica;
Cullen, Bergad y Juan J. Heinrich, del Servicio de Endocrinologa
del Hospital de Nios, y Jos Manuel Domnguez, del Instituto de In-
vestigaciones Mdicas de la Facultad de Medicina de la UBA.

El Cehip cont desde su creacin con subsidios del CONICET y apo-

yo econmico de la Fundacin de Endocrinologa Infantil, conocida
en el ambiente peditrico con el acrnimo FEI. Tena dos sedes: una
en el Departamento de Qumica Biolgica de la Facultad de Farma-
cia y Bioqumica, y la otra, ubicada en el Servicio de Endocrinologa
del Hospital de Nios.

La de la Facultad tena como misin preparar la hormona de creci-

miento humana (hGH) y realizar los ensayos y anlisis necesarios
para asegurar su actividad biolgica y su esterilidad. En el FEI se les
hacan los estudios clnicos a los chicos que asistan al hospital por
trastornos de crecimiento, especialmente a los que por su nivel de
deficiencia hipofisaria deban ser sometidos a tratamientos prolon-
gados con hormona de crecimiento.

Heinrich tena en ese momento 29 aos. Se haba formado en Suiza

con Andrea Prader, uno de los ms grandes endocrinlogos infanti-

30
les de la poca, y haba regresado a trabajar con Cullen y Bergad. La
causa de consulta ms frecuente para los especialistas de esos das
era la baja estatura. Cuando se deba a la deficiencia de la hormona,
no tenamos respuesta comenta Heinrich, hoy, un nombre de re-
ferencia en la especialidad. Se les daba hormona tiroidea, cuando
tambin faltaba, o cortisona, si les fallaba la suprarrenal. Se usaban
extractos de hipfisis de vaca, por ejemplo, pero no hacan crecer.

Dellacha se puso al frente de la obtencin de hormona de crecimien-

to humana en el Departamento de Qumica Biolgica de la UBA,
para lo cual tuvo que organizar un sistema de recoleccin de hipfi-
sis humanas que permitiera contar con un nmero adecuado para la
purificacin de la hormona, y que asegurara una provisin constante
de glndulas para atender los planes asistenciales y de investigacin.

Claro que, como suele suceder, el plan era ms fcil de enunciar que
de llevar a la prctica.

Lo primero que hizo falta fue un auto recuerda Paladini. Com-

pramos un Citron de tercera mano. Con esas latas, ese Citron, una
persona que se llamaba Roberto Rodrguez, recorra los hospitales y
la morgue judicial.

Rodrguez, frecuentemente con Heinrich, visitaba los hospitales l-

varez, Argerich, Cetrngolo, de Nios Ricardo Gutirrez, Durand,
Elizalde, Fernndez, Fiorito, Muiz, Policlnico Alejandro Posadas,
Policlnico de Avellaneda, Policlnico de Lans, Ramos Meja y Raw-
son, y hablaba del proyecto con los jefes de los departamentos de
anatoma patolgica, recuerdan Santom y Dellacha. Hay que su-
brayar que todos ellos se mostraron dispuestos a colaborar de forma
totalmente desinteresada subrayan. Particip tambin la Ctedra
de Patologa de la Universidad de Buenos Aires. Y hasta obtuvimos
una acordada de la Suprema Corte de Justicia de la Nacin para po-
der retirar las hipfisis de los cadveres de la Morgue Judicial.
31
 Entre 1970 y 1985, esta red informal permiti recolectar nada me-
nos que 66.000 hipfisis, que se conservaban en termos con nie-
ve carbnica o hielo seco. Una vez por semana, eran retirados y las
glndulas se transferan a una congeladora que se mantena a una
temperatura de -60 C hasta su procesamiento.

Uno de los problemas que tuvieron que analizar fue qu mtodo se

aplicara para extraer la hormona de la glndula y qu procedimien-
to de purificacin se adoptara.

En esa poca haba otros dos pases que lo tenan resuelto. Uno era
Estados Unidos. Ellos utilizaban un mtodo que ms tarde les trae-
ra serias complicaciones. En Inglaterra y Francia tambin se regis-
traron casos similares.

Los investigadores argentinos ensayaron varios mtodos descriptos

en la literatura, pero rpidamente los abandonaron porque obtenan
productos heterogneos. Finalmente seleccionaron uno que permi-
ti producir una protena apta para tratamientos clnicos. Un colec-
tor de fracciones, donado al FEI por la Embajada de Suecia, permi-
ti separar del gel la fraccin proteica con actividad hormonal.

La hormona liofilizada se esterilizaba y se fraccionaba en frascos

multidosis de 5 mg de hormona en forma totalmente gratuita, en los
Laboratorios Carlo Erba de Buenos Aires y posteriormente, por gen-
tileza del doctor Zenn Lugones, en el Laboratorio Roux-Ocefa S.A.

En el Servicio de Endocrinologa del Hospital de Nios, esta hormo-

na era aplicada en forma de inyecciones subcutneas, tres veces por
semana, a nios con graves trastornos de crecimiento, que haban
sido seleccionados despus de un riguroso estudio para obtener el
mximo beneficio teraputico.

32
Para determinar si la hormona que se preparaba en el laboratorio te-
na actividad biolgica, tambin tuvieron que poner a punto la tc-
nica de la hipofisectoma (extraccin quirgica de la hipfisis) en
ratas criadas en el Bioterio Central de la Facultad de Farmacia y Bio-
qumica.

A lo largo de ms de quince aos, el Cehip obtuvo en la Facultad

de Farmacia y Bioqumica alrededor de 130 g de hormona de creci-
miento humana, con un alto grado de pureza qumica y antignica
que permiti su uso para los estudios estructurales, fisicoqumicos
e inmunolgicos.

Corra la dcada del setenta cuando tuvimos que explicar cules

eran los beneficios de las investigaciones que encarbamos cuenta
Dellacha. Por eso, calculamos aproximadamente cunta hormona
habamos hecho y cul hubiera sido su costo internacional.

El resultado de esa estimacin es apabullante: con esos mtodos

agotadores y trabajando de lunes a lunes, los cientficos y sus equi-
pos haban fabricado 130.000 dosis de hormona de crecimiento.

Se calculaban dos hipfisis por semana y por chico agrega Santo-

m. Y se trataban grupos de treinta chicos.

Eran tiempos convulsionados, de huelgas, toma de ctedras y fa-

cultades. A veces tenamos que subir desde la planta baja al sexto
piso con bolsas de veinte kilos por la escalera!, que era la comida
para alimentar a los animales del bioterio.

En 1985, en los Estados Unidos, en Gran Bretaa y posteriormente

en Francia, fallecieron jvenes de la enfermedad de Creutzfeldt-Ja-
cob, un desorden neurolgico mortal cuyos primeros sntomas son

33
 fallas de memoria y cambios de comportamiento, pero que a medida
que progresa puede presentar movimientos involuntarios, ceguera,
debilidad de las extremidades y coma.

Todos ellos tenan en comn que haban sido tratados en su niez

con hormona de crecimiento humana. Los directores del Cehip re-
cibieron una llamada telefnica de la Organizacin Mundial de la
Salud ponindolos sobre aviso de lo sucedido y sugirindoles sus-
pender la produccin de hormona a partir de hipfisis humanas has-
ta tanto se averiguara el motivo de esos decesos, recuerdan hoy los
cientficos.

Tambin suspendieron la provisin de hormona la National Pitui-

tary Agency y el Instituto Nacional de la Salud, ambos de los Esta-
dos Unidos, y los laboratorios de Inglaterra, Francia y Suecia que la
producan. Si bien nunca se tuvo evidencia directa acerca del origen
del problema se supuso que estos casos fatales recibieron hormona
de hipfisis provenientes de pacientes con Creutzfeldt-Jacob y que
el mtodo de purificacin utilizado no permiti eliminar los priones
de la preparacin.

En la Argentina, sin embargo, no se registr ningn caso. Poste-

riormente se comprob que el mtodo de filtrado por columnas de
Sephadex que utilizaron los cientficos argentinos elimin el riesgo,
porque los priones quedaban retenidos en esa estructura.

El esfuerzo realizado durante ms de dos dcadas no slo benefi-

ci a 70 chicos hasta entonces marginados y sin posibilidad de trata-
miento, sino que contribuy a la formacin de numerosos investiga-
dores, y dio lugar a 28 trabajos de investigacin clnica (ver anexo) y
a innumerables tesis doctorales.

Hasta 1976, Paladini, Dellacha y Santom trabajaron en colabora-

34
cin, compartieron subsidios y equipos, y tambin sus resultados
en pos de un objetivo comn. Pero como cada uno de los subgrupos
que dirigan encaraba problemas tan distintos, las ideas no siempre
coincidan y comenz a resultarles difcil conducir en conjunto todas
la lneas de trabajo.

Haba llegado el momento de que cada uno dirigiera su grupo en

forma independiente y redistribuyeron a los colaboradores para
que cada uno tuviera a su cargo un nmero equivalente de inves-
tigadores.

El grupo de Paladini se consagr principalmente a las hormonas
de crecimiento y la deteccin de sus receptores celulares. Sintetiz
fragmentos hormonales y estudi las caractersticas de la hormona
marcada con yodo radiactivo. En particular, estudiaron los epitopes
de la protena; es decir, las regiones moleculares antignicas, las que
producen anticuerpos.

Plantearon la hiptesis de que cuando se le da hormona de creci-

miento a un chico, ste puede producir anticuerpos, porque es desco-
nocida, aunque sea humana cuenta Santom. Algunos la recono-
cen como propia y no la destruyen, pero para otros es una sustancia
extraa y por eso a veces el tratamiento no surta efecto. No siempre
se elaboran anticuerpos, pero puede suceder.

El equipo de Dellacha aplic tcnicas de marcacin de las hormonas

humana y bovina para analizar cmo se unen a receptores, tanto in
vitro como in vivo, y as confirmaron que el hgado tiene receptores
para la hormona de crecimiento.

Como todava se desconoca la estructura terciaria de las hormonas

de crecimiento, el grupo de Santom contribuy al conocimiento de
la conformacin molecular mediante modificaciones qumicas de

35
 distintos aminocidos para establecer el acceso al solvente de cada
uno de ellos y su participacin en el reconocimiento de los recepto-
res en la actividad biolgica.

Con apoyo del Programa de las Naciones Unidas para el Desarrollo,

Santom estudi la hormona de crecimiento de la alpaca, un cam-
lido que vive en los Andes, a entre 4.500 y 5.500 metros de altura.

El problema principal era conseguir las hipfisis recuerda Santo-

m. Como era una colaboracin con cientficos peruanos, ellos se
comprometieron a obtenerlas. Aparentemente, en Cuzco la hipfisis
es comestible, como la carne. En una oportunidad, estaba esperan-
do veinte hipfisis de alpaca y fue una becaria peruana para reco-
lectarlas. Cuando volvi a nuestro pas, voy a buscarla a Ezeiza para
que la dejen pasar, porque traa material biolgico. Cuando subimos
al auto, la becaria me confiesa que haba habido un problema y no
haba podido traer las hipfisis: las haba puesto en el freezer de la
familia del investigador; ellos las haban confundido y se las haban
comido...

36
 Cambio de rumbo

En 1985, primero en los Estados Unidos y luego en Gran Bretaa y

Francia, empezaron a llegar a los consultorios mdicos individuos
de entre 25 y 30 aos con signos que correspondan a los de la en-
fermedad de la vaca loca. Al estudiar las causas de seis muertes,
que fueron simultneas, encontraron que todos ellos haban recibi-
do hormona de crecimiento humana. La Organizacin Mundial de
la Salud emiti inmediatamente un llamado de alerta. Pero a dife-
rencia de lo que ocurri en los pases europeos, en la Argentina nun-
ca se registraron complicaciones por la aplicacin de la hormona
de crecimiento humana producida en los laboratorios del grupo de
Qumica Biolgica.

Recuerdo que estbamos en el laboratorio y nos llamaron de la Or-

ganizacin Mundial de la Salud dice Dellacha. Nos comunicaron
que consideraban apropiado detener la produccin o al menos dejar
de aplicar la hormona hasta determinar lo que estaba pasando. Tres
aos despus se supo que en Francia hubo 90 muertos. La hormona
haba sido mal purificada o se haba extrado de personas que ha-
bran tenido la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob. En una invitacin
que tuve en la Universidad de Oxford, Inglaterra, supe que al revi-
sar el caso se encontraron con que, si inyectaban en ratas la hormo-
na enriquecida que quedaba en la parte superior de la columna du-

37
 rante la produccin, los animales desarrollaban la enfermedad de
CreutzfeldtJacob. Entonces, dejamos de producir, aunque nosotros
hacamos una segunda etapa de purificacin. Lo que quedaba arriba
(hemoglobina y soluciones) se descartaba y usbamos slo la parte
de abajo. Por eso, nunca tuvimos problemas.

En este contexto internacional, entre 1983 y 1992, Paladini, Della-

cha y Santom dejaron de investigar sobre hormonas de crecimiento
para dedicarse a otros temas. Adems de la advertencia de la Orga-
nizacin Mundial de la Salud, se haba producido un avance deter-
minante: se confiaba su produccin, en grandes tanques con medios
de cultivo, a bacterias que haban sido modificadas para introducir-
les el gen humano que dirige su sntesis en el organismo.

En 1987, importantes avances internacionales imprimieron un cam-

bio de rumbo en las investigaciones: en los Estados Unidos, Sherin
S. Abdel-Meguid y colegas dieron a conocer la estructura tridimen-
sional (el plegamiento de la cadena de aminocidos en el espacio) de
la hormona porcina recombinante; es decir, producida por ingenie-
ra gentica.

Cuando se conoce bien la estructura tridimensional se puede ver

qu parte de la molcula interacta con los receptores; es decir, con
las distintas regiones que van a producir un efecto biolgico expli-
ca Wolfenstein. A veces, los grupos que estn lejos en la estructura
lineal, cuando la protena se pliega de cierta manera pueden quedar
cerca. Por eso las protenas mal plegadas pueden tener otro efecto
biolgico.

En ese momento hubo una revolucin metodolgica y tecnolgica

a partir de la aparicin de la biologa molecular, que permiti deter-
minar la estructura primaria de una protena en un tiempo much-
simo ms breve explica Santom. Si se aislaba un gen cuyo ADN

38
tena una secuencia de bases determinada a partir de la cual se po-
da deducir toda la secuencia de aminocidos de una protena; es
decir, su estructura primaria. Lo que a nosotros nos haba llevado
diez aos, se poda determinar en unos das! Pero adems, la biolo-
ga molecular trajo otra cosa extraordinaria: se pudo expresar ese
gen introducindolo en una bacteria, como la Escherichia coli, por
ejemplo. De all en ms pudieron producirse enormes cantidades de
protenas. En el Laboratorio Nacional de Investigacin y Servicios en
Qumica de Protenas (LANAIS-PRO), que yo diriga, podamos de-
terminar la secuencia de las protenas con gran rapidez. Utilizba-
mos mtodos automticos muy precisos.

Al tener la hormona pura, pudieron cristalizarla explica Della-

cha. Y por eso pudieron determinar, en 1987, la estructura tridi-
mensional de la hormona porcina recombinante, de la hormona
humana recombinante y la del complejo que forma con las dos mol-
culas del receptor, en 1992.

Se iniciaba una nueva era, pero la tarea de los cientficos del grupo
de Qumica Biolgica haba sido literalmente impagable: exploran-
do en las fronteras del conocimiento haban producido hormona de
crecimiento humana por un valor de... cuatro millones de dlares
de esos aos!

39
 Una palabra que todava no estaba de moda

A tono con el entusiasmo que produjo el retorno de la democracia al

pas en 1983, un hecho del mundo cientfico local acapar la aten-
cin de los diarios porteos: un grupo de investigadores del CONI-
CET abandonaba el sistema pblico para trabajar en una empresa
privada.

Era una movida indita para la Argentina. Para muchos de sus cole-
gas, los investigaodores se haban vendido al capital privado. Para
otros, eran la punta de lanza de una tendencia que ganaba adeptos
en todo el mundo: agregar valor (tecnologa) a los productos para
mejorar la competitividad. Varios de los protagonistas de esta inicia-
tiva sin precedente haban sido alumnos de los integrantes del gru-
po de qumica biolgica de la UBA.

La compaa Sidus, una tradicional firma familiar que participaba

del mercado farmacutico local, planeaba desarrollar proyectos en
un rea cuyo nombre sonaba poco conocido: la biotecnologa. Ni si-
quiera estaba de moda la palabra recuerda Marcelo Criscuolo, hoy
director ejecutivo de Biosidus S.A.. La idea era poder poner a pun-
to la tecnologa recombinante para la expresin de protenas huma-
nas en bacterias o clulas de mamferos.

40
Los investigadores del Departamento de Qumica Biolgica de la Fa-
cultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA cumplieron un impor-
tante papel en el desarrollo de la hormona de crecimiento recombi-
nante por su experiencia en la purificacin, estabilidad y control de
calidad de la hormona obtenida a partir de Escherichia coli.

En reuniones semanales, Juan Dellacha, se convirti en asesor cien-
tfico de Biosidus S.A. No slo discuta la produccin de la hormona,
sino que aportaba su experiencia a los trabajos que los investigadores
estaban realizando para conocer las propiedades qumicas, fisicoqu-
micas y biolgicas de las hormonas de crecimiento que le conferan
una mayor estabilidad en determinadas condiciones experimentales.

El grupo de Biosidus S.A. intentaba obtenerla por la bacteria Esche-

richia coli, pero se descompona, se alteraba explica Dellacha, por
eso, buscaron a quien conociera su funcionamiento y estabilidad.

A partir de estas experiencias y de comn acuerdo, introdujeron mo-

dificaciones en ciertos procedimientos y disearon nuevos experi-
mentos.

El doctor Santom se hizo cargo del estudio estructural, la secuencia-

cin de aminocidos y la determinacin de la masa molecular. As, pu-
dieron comprobar que la protena recombinante de Biosidus S.A. (co-
dificada como HCB-P001) tena idntica secuencia de aminocidos y
puentes disulfuro que la hormona de crecimiento humana natural.

Tambin compar, con participacin de otros investigadores, la in-

munorreactividad (su actividad frente a varios anticuerpos y su re-
conocimiento por receptores celulares especficos, as como la res-
puesta a cambios conformacionales producidos por anticuerpos) de
la hormona recombinante con la de origen hipofisario y otra de ori-
gen recombinante producida por Genentech en los Estados Unidos.

41
 Encontr una total identidad inmunolgica entre las tres. Santom
luego asesorara estudios similares para probar la actividad biolgi-
ca de la hormona de crecimiento humana producida en leche de va-
cas transgnicas.

Despus de ms de un lustro de intentos, Biosidus S.A. alcanza su

primer hito en 1990, cuando lanza al mercado la eritropoyetina re-
combinante, una hormona que estimula la produccin de glbulos
rojos, producida a partir del cultivo de clulas en las que se haba
insertado un gen humano. El siguiente paso fue el interfern alfa,
un medicamento que se utiliza para evitar la proliferacin de clu-
las tumorales y virus. Entre 1993 y 1994, estos productos empeza-
ron a exportarse a Brasil y Biosidus S.A. se independiz de su empre-
sa madre. Santom determin la estructura primaria de todas esas
protenas recombinantes.

En 1995, lanzaron una droga para combatir las neutropenias (defi-

ciencia de un tipo de glbulos sanguneos llamados granulocitos) ge-
neradas por los tratamientos citostticos en cncer o radioterapia: el
factor estimulante de colonias de granulocitos. Al mismo tiempo,
ponan a punto la produccin de hormona de crecimiento humana
fabricada por bacterias recombinantes (modificadas genticamente).

Fue una decisin empresaria que requera una dosis de audacia.

Marcelo Argelles, entonces al mando de la compaa, confiesa que,
ante el desafo, no le faltaron momentos de duda. Las dudas lo asal-
tan a uno todas las noches afirma. Como deca Steve Jobs, la in-
novacin no es perfecta al inicio, se hace camino al andar. Los da-
tos con los que uno inicia el trabajo no son 100% efectivos. No es lo
mismo calcular un puente o una usina nuclear, que una hormona
recombinante; cuando se manejan datos biolgicos, las variaciones
que surgen pueden ser la diferencia entre la posibilidad y la imposi-
bilidad de desarrollar un producto.

42
Al recordar esa poca, Criscuolo revive los infinitos contratiempos
que hubo que sortear. Cuando uno tiene que encarar el desarrollo
de un producto, no slo se trata de dominar la tecnologa subra-
ya, saber cmo es el gen, cmo lo ponemos en un plsmido (ADN
extracromosmico), cmo lo ponemos en un clon de bacterias pro-
ductoras, cmo mejoramos el mecanismo de fermentacin para que
sea rentable para la industria farmacutica, cmo es el mecanismo
de purificacin y su posterior envase. Sino tambin de entender un
poco la fisiologa de la hormona de crecimiento, cmo debe ser su
aplicacin clnica, a qu blanco debe dirigirse, cmo funciona. Y en
eso recurrimos a los acadmicos ms adecuados para que asesora-
ran a la empresa: al grupo de Santom y de Dellacha. Ms all de su
conocimiento y su probada eficiencia tcnica, eran los que ms co-
nocan la protena. Pero adems, haba un factor humano crucial: la
mayora de los integrantes de Biosidus S.A. haban sido alumnos de
los cientficos en la Facultad de Farmacia y Bioqumica. Era un ho-
nor, llegar, recibirse, estar en una empresa, hacer biotecnologa, y
adems, volver a los profesores que nos haban formado y traerlos
como asesores del grupo de desarrollo, dice Criscuolo.

Entre las ancdotas de esos aos, figura una que recuerda con una
gran emocin. Cuando uno tiene que manejar un grupo de gente
trabajando en un tema, algunos ms preocupados por el aislamien-
to de los clones, otros por producir el nmero ms alto de copias, el
mejor sistema de expresin, otros, el sistema de fermentacin o la
pureza, etctera, etctera, y todos ellos universitarios (que no slo
trabajan para saber hacer, sino que tienen que saber para qu traba-
jan, cmo funciona lo que estn haciendo), el doctor Dellacha, que
siempre fue un hombre y un profesor de carcter, impona orden y
respeto. Sola decir: yo el mircoles a las diez estoy ah, vengan to-
dos que voy a mostrar el avance de los trabajos, el seguimiento. Y a
las las diez cero uno, Dellacha abra la reunin y el que no estaba, no
estaba. Y aclara no era fcil no estar... Realmente su seguimiento

43
 de todo el grupo de desarrollo fue muy importante, no solo desde lo
tcnico, sino tambin desde el punto de vista humano. Y con Santo-
m tambin haba una relacin especial, porque estaba al frente del
LANAIS-PRO, que tena equipos importantes como el secuenciador
de protenas, que nos permiti hacer esa operacin en el pas. Fue
un placer y un honor que precisamente el doctor Santom, manejan-
do ese laboratorio, hiciera para nosotros en la Argentina la secuen-
cia completa de la hormona de crecimiento.

La prueba de fuego lleg tras los estudios clnicos y una vez aproba-
da por la ANMAT, cuando el grupo de Bio Sidus present la hormo-
na de crecimiento recombinante ante la plana mayor del servicio de
Endocrinologa del Hospital de Nios. All venan a entrenarse m-
dicos de todos los pases del mundo. Ellos haban participado de la
epopeya de Dellacha, Santom y Paladini. Nos miraban con un po-
quito de recelo recuerda Criscuolo. Estaban acostumbrados a
trabajar con productos de firmas importantes, de muchsima cali-
dad y nosotros ramos un grupo de jvenes que les estbamos tra-
yendo una hormona fabricada con bacterias recombinantes Has-
ta que pas algo en las presentaciones. Tenamos al lado nuestro a
Dellacha y Santom como asesores y, bueno, se arm debate y al-
guna controversia, sobre cmo asegurbamos la calidad. Porque de
alguna manera los bioqumicos tenamos nuestros geles, nuestras
corridas, nuestros cromatogramas, que era un lenguaje que los m-
dicos no podan entender. Y ellos nos hablaban de los nios, de lo
que pasaba, del riesgo, era casi un dilogo de sordos. Haba que rom-
per eso. Entonces, toman la palabra Dellacha y Santom, y les di-
cen: Miren, ustedes hace veinte aos confiaron en lo que nosotros
hacamos con nuestras manos. Y trabajamos con este producto que
tuvo mucho xito. Ahora les pedimos que confen en lo que hacen
nuestros alumnos. De una manera u otra las barreras cayeron. Em-
pez un dilogo distinto. La palabra de Dellacha y de Santom fue
muy especial, absolutamente espontnea, pero muy bien dirigida.

44
Fue una emocin tremenda... Nos sorprendieron. Haba una larga
historia de gente de Bio Sidus que haba trabajado en la ctedra con
ellos y que tambin haba conocido el trabajo en la hormona de cre-
cimiento. Fue como tomar la posta... Era 1997.

45
 Una oveja llamada Dolly

En 1984 haba regresado al pas despus de una temporada en los

Estados Unidos el doctor Lino Baraao, un qumico de intereses que
abarcaban desde la antropologa hasta las neurociencias y el com-
portamiento animal, y que jugara un rol decisivo en esta historia y
en la de la ciencia nacional.

Hijo de una maestra y de un empleado de Vialidad, Baraao confie-

sa que siempre fue muy curioso y que estaba fascinado por la cien-
cia: Hered esa curiosidad de mi padre afirma, que la conserv
hasta su muerte, a los 89. Alrededor de los 11 aos, le las obras com-
pletas de Julio Verne, donde el hroe siempre era un cientfico. Des-
pus devor la coleccin de libros de ciencia de Eudeba, en particu-
lar las de comportamiento animal, tema que todava me apasiona.

Aunque la vida es imprevisible, a la distancia, Baraao parece haber

estado predestinado a participar en el desarrollo de la hormona de
crecimiento y en el de vacas transgnicas.

Mi padre tuvo 11 hermanos cuenta. Uno de ellos, mi padrino Ar-

cadio Baraao, era qumico y trabajaba en hormonas. Fue el prime-
ro en hacer bioensayos en el pas. Siempre trabaj en el mbito pri-
vado. Otro de mis tos, Tefilo Baraao, era profesor de Maquinaria

46
Agrcola en la Facultad de Agronomia de la UBA (hasta hace poco
haba un aula que llevaba su nombre). Mi padre en su juventud tuvo
un tambo. O sea que no es de extraar que yo haya terminado ha-
ciendo vacas que producen hormonas en su leche.

Dada la pluralidad de intereses que lo motivaban, el aspirante a cien-

tfico se decidi por la qumica, porque la consideraba la disciplina
ms abarcadora. Curs desde mecnica cuntica hasta anatoma
humana, con cadveres y todo. Su anhelo era contribuir a desarro-
llar una ciencia orientada al uso, como deca Pasteur.

El sabio francs del siglo XIX realiz algunas de sus contribucio-

nes ms importantes mientras trataba de contestar preguntas que le
planteaban los viateros de su pas.

De chico cuenta Baraao, mi padre me di la Vida de Pasteur, la

biografa escrita por [su nieto], Vallery Radot. Y mi to tena en su
escritorio la frase de Pasteur que deca: Vivid en la paz serena de
los laboratorios y bibliotecas. All no hallars siempre la gloria, ja-
ms hallars la fortuna, pero en su seno sentirs la dulzura de ser
cada da ms que el anterior y de haber aportado al mundo tu parte
de verdad. Eso me marc.

Desde su regreso al pas, Baraao tuvo la idea de que haba que ha-
cer algo con biotecnologa animal. Se incorpor al Instituto de Bio-
loga y Medicina Experimental, que comparte edificio con el Insti-
tuto de Ingeniera Gentica y Biologa Molecular (INGEBI), donde
tambin trabajaban Hctor Torres, su primer director, y Marcelo Ru-
binstein, que haba logrado el primer ratn transgnico.

Torres fue el que tuvo la idea de empezar con los animales transg-
nicos, recuerda. Ya era 1994 cuando decide hablar con Argelles y
Criscuolo, y les propone hacer un bovino transgnico capaz de pro-

47
 ducir hormona de crecimiento en la leche.

Ellos ya estaban produciendo hormona con bacterias aclara Bara-

ao. En realidad, no sabamos si convendra una hormona de creci-
miento u otra protena recombinante. La primera en la que se pens
fue el activador tisular de plasmingeno (TPA), que se usa para com-
batir los infartos, una enzima que destruye el cogulo.

Haba que hacer la construccin [del segmento de ADN], e infiltrar-

lo con un promotor en la glndula mamaria. Ya se haba demostra-
do en algunos casos que si se le pona un gen a un promotor de la ca-
sena, la sustancia codificada por ese gen se segregaba en la leche de
la vaca, agrega.

Inicialmente, presentaron el proyecto de poner una protena de inte-

rs en la glndula mamaria de vacas al Fondo Tecnolgico Argenti-
no (FONTAR) de la Agencia Nacional de Promocin Cientfica y Tec-
nolgica, que ofreca crditos de devolucin contingente: si todo
iba bien haba que devolverlos y si no funcionaba, no se devolva
nada. Pero como la conclusin del proyecto deba respetar los pla-
zos del crdito, se inclinaron por probarlo en cabras, cuya gestacin
dura cinco meses. Ese tiempo, ms lo necesario para esperar a la ma-
durez, un lapso que sumaba aproximadamente tres aos, coincida
con el perodo mximo estipulado en el crdito.

Mientras tanto, Baraao y Daniel Salamone, un veterinario gradua-

do en la UBA y apasionado por los desafos ambiciosos, haban logra-
do los primeros terneros por fecundacin in vitro. Lo hicimos tra-
yendo ovarios de mataderos, fecundndolos en una cpsula de Petri
y luego implantndolos en vacas, comenta el primero.

Cuando se conoci que haba nacido el primer bovino producido

in vitro [Brackett et al. 1982] dije Guau, sta es nuestra oportuni-

48
dad recuerda hoy Salamone. Tuve la suerte de recibir una beca
de la Agencia Internacional de Japn (JICA) para viajar a ese pas y
aprender a hacer terneros in vitro. Al volver, en 1983, puse en prc-
tica el mtodo y cuando quise darme cuenta haba producido ms
de 60.000 [embriones] vacas en un mes! Por supuesto que no todos
los embriones podan implantarse, pero habamos hecho la prueba
de concepto.

Pero... para qu hacer fertilizacin in vitro de bovinos?

Entre otras cosas, en ese momento se pensaba que era una mane-
ra de mejorar genticamente el ganado. Como en la Argentina se
faenaban vacas de calidad relativamente buena, se podan produ-
cir embriones de alta calidad y los costos eran nfimos comparados
con los que exiga fecundar una vaca a la manera tradicional deta-
lla Baraao. Uno produca cientos de embriones, y aunque despus
se vio que stos bajaban de precio y finalmente las cuentas no ce-
rraban, era bueno dominar esa tecnologa.

Los terneros nacidos en la Argentina fueron los primeros de Am-

rica latina, y para los cientficos tenan una doble utilidad: por un
lado, les permitan desarrollar una aplicacin biotecnolgica, y por
el otro, estudiar los procesos de maduracin y fertilizacin de ovo-
citos en una especie distinta del ratn, con caractersticas ms pare-
cidas al ser humano.

Y ya que lo hacan en cabras... por qu no probarlo simultneamen-

te en vacas? Era un desafo ambicioso, entre otras cosas, porque ha-
ba que disear toda la logstica, desde la biologa molecular, has-
ta la biologa celular, la veterinaria explica Baraao Haba que
comprar cabras criollas, un chivo de una raza lechera... Adems, el
chivo slo se reproduce en determinada poca del ao. Un detalle
colorido es que tuvimos que alojarlo en Veterinaria, reparar un co-

49
 rral... Los investigadores tenamos que hacer de todo: desde arreglar
un alambrado, hasta bajar los fardos de pasto y preparar los medios
de cultivo. Era divertido, pero...

El Fondo Tecnolgico Argentino (FONTAR) les dio cerca de 800.000

dlares con los cuales montaron el laboratorio de Marcelo Rubins-
tein en el Ingebi y tambin arreglaron gran parte del resto del Insti-
tuto. Pero el camino que haban decidido tomar no careca de obs-
tculos. Haba que sincronizar el celo de las hembras, fertilizarlas
por laparoscopa, esperar 48 horas hasta que estuviera fecundado
el vulo, hacer la ciruga, lavar la trompa (de Falopio), y recoger los
huevos fecundados.

Despus de colocarlos en un tubito, haba que correr de la veterina-

ria al laboratorio, donde Rubinstein los esperaba con su microsco-
pio, los examinaba y deca: No, estn pasados, ilustra Baraao. Y
as todas las semanas.

Las vacas eran un poco ms previsibles... Pero una vez que los em-
briones llegaban a la etapa de blastocistos [embriones que se desarro-
llaron durante 5 o 6 das], haba que llevarlos al campo, en Baradero,
donde tenan que esperar al equipo encargado de realizar la trans-
ferencia; es decir, de insertarlos en el tero de las vacas portadoras.

Eso implicaba sincronizar el da en que haba que ir al matadero a

conseguir los vulos, con el momento en que se trataba a las vacas
en el campo con (hormonas) prostaglandinas para que estuvieran
listas para cuando llegara la camioneta con el embrin.

Me acuerdo de un da que tenamos listos unos animales buensimos

y pararon a la camioneta en la Aduana, viniendo de Uruguay, porque
tena una lupa que no estaba registrada o algo as rememora Bara-
ao con una sonrisa. Y mientras tanto, el tiempo pasaba y pasaba...

50
Finalmente, hicieron decenas de transferencias de embriones de ca-
bras y dos transferencias de vacas. De ellas, nacieron tres cabritos y
dos terneras.

Con Lino queramos producir animales con material de matadero,

pero esas vacas no eran muy atractivas porque no contaban con un
material gentico especial dice Salamone. En cambio, si a esas va-
cas se les sumaba valor agregado, algo que las hiciera nicas, el em-
brin resultara mucho ms valioso. As fue como Baraao empez
a intentar la transgnesis para convertirlas en fbricas de protenas
de inters farmacolgico.

Los primeros animales podan o no ser transgnicos. Haba que in-

yectar 2.500 ovocitos, de los cuales, una vez fecundados solo so-
breviva un 10 %. De stos se implantaba un 20%, y de sos haba
chances de que un animal fuera transgnico. Pero transgnico en
el sentido de que tuviese el gen, porque an as poda no expresar la
protena de inters, ya que si el gen que insertbamos no llegaba al
tejido o al rgano correspondiente..., detalla el cientfico.

Suele decirse que la ciencia es un largo camino de fracasos salpica-

do por un xito de tanto en tanto. Esta aventura no fue la excepcin.
Exigi un perodo de muchsimo trabajo, en el que nacan los anima-
les, pero no lograban lo que haban planeado y pareca que no iban
a llegar a la meta. Finalmente, Biosidus S.A. decidi seguir adelan-
te con otra metodologa, la clonacin, no obstante lo cual devolvi
el subsidio como si el proyecto hubiera sido exitoso, porque se ha-
ba desarrollado tecnologa y se haban formado recursos humanos.
Naci s, un toro Aberdeen Angus de alta calidad, que se us como
caso control.

A mediados de 1996, la idea original comenz a languidecer. Para

entonces, Salamone estaba deseoso de volver al campo para empa-

51
 parse de los problemas propios de los animales y de la logstica de
la explotacin ganadera, y decidi viajar al exterior a hacer un pos-
grado.

Luego de algn tiempo, haba estado trabajando mucho y no sa-

ba muy bien cul iba a ser mi prximo paso, cuando viajo a Niza
para participar en un congreso cuenta. Deambulando por los pa-
sillos, escucho [al cientfico argentino] Jos Cibelli. Exclamaba: Lo
logr! Qu maldito! Y encima es buena persona!.

Los diarios del mundo haban anunciado el nacimiento del primer

mamfero clonado de clulas adultas de la historia, la oveja Dolly.
Ah me dije: yo tengo que trabajar en esto, dice Salamone. Un ao
y medio ms tarde, en enero de 1998, precisamente Cibelli logra-
ra el nacimiento de los primeros terneros clonados transgnicos del
mundo.

52
 La ingeniera de la vida

Dolly naci al caer la tarde, el 5 de julio de 1996, cerca de Edim-

burgo, Escocia. Tena la apariencia de una tpica oveja de raza Finn-
Dorset, pero lo cierto es que era absolutamente extraordinadria: Ian
Wilmut, un embrilogo ingls (y marinero frustrado), y Keith Cam-
pbell, un bilogo de 42 aos de la misma nacionalidad, la haban
creado aplicndole una diminuta descarga elctrica a una clula de
ubre de una oveja ya muerta y a un vulo sin fertilizar desprovisto
de sus cromosomas. Si bien su embrin haba sido implantado en el
tero de otra oveja, en rigor, no tena ni madre ni padre: fue una her-
mana gemela de la oveja donante del material gentico.

A pesar de que evoca argumentos de ciencia ficcin, la clonacin es

una maniobra aparentemente sencilla. Una aguja penetra a travs
de la membrana exterior de un vulo. Con una maniobra diestra,
un tcnico extrae su ncleo y luego utiliza una segunda aguja para
inyectar en su lugar otro ncleo, extrado esta vez de una clula di-
ferenciada (con un juego completo de cromosomas). Una descarga
elctrica los fusiona. Y el embrin empieza a dividirse...

Muy pronto, la comunidad cientfica vislumbr las potencialidades

de este desarrollo que, tras repetidos fracasos durante un cuarto de
siglo, pocos haban credo posible. El artculo que lo describa fue

53
 publicado en Nature el 7 de marzo de 1996, y una semana ms tar-
de un editorial adverta que el poder creciente de la gentica mole-
cular nos enfrenta a la perspectiva futura de ser capaces de cambiar
la naturaleza de nuestra especie y plantea cuestiones que afectarn
a la humanidad.

Para apreciar el impacto que este avance tuvo en todo el mundo

baste con recordar que, poco tiempo despus, el presidente nor-
teamericano Bill Clinton recomend adoptar una mora en las inves-
tigaciones y prohibi el empleo de fondos federales para la experi-
mentacin con embriones humanos. Varios pases europeos hicieron
lo mismo. La Iglesia conden el uso inescrupuloso del cuerpo huma-
no, y hasta los mismos Wilmut y Campbell se opusieron al uso de la
clonacin con fines reproductivos: Todo tipo de manipulacin de
embriones humanos debera ser prohibida, declararon.

Los investigadores estaban asombrados porque veinticinco aos de

intentos los haban convencido de que, una vez que las clulas ha-
ban comenzado a diferenciarse hacia sus roles de adultas en el em-
brin temprano, no podan volver atrs. Dolly demostr lo contrario
(despus de 276 intentos fallidos) y abri la puerta a un sinnmero
de innovaciones biotecnolgicas. Una, en particular, acapar el inte-
rs de los cientficos: los clones transgnicos presentaban la posibi-
lidad de convertirse en fbricas de medicamentos. Como la hormo-
na de crecimiento...

Richard Palmiter, de la Universidad de Washington, y Ralph Brins-

ter, de la de Pensilvania, haban obtenido el primer animal transg-
nico en 1983. Los cientficos crearon un ratn gigante implantando
el gen responsable de la hormona de crecimiento humana en vu-
los de ratn fertilizados. Luego transfirieron los huevos a hembras
portadoras y documentaron que el gen funcionaba en varias de sus

54
cras. Tambin demostraron que el gen poda transmitirse de gene-
racin en generacin.

Los transgnicos podan producirse insertndoles o suprimindoles

un gen por medio de la tecnologa de recombinacin del ADN. Esas
modificaciones pueden agregar o suprimir una funcin.

El gen poda insertarse por microinyeccin en el proncleo de un ci-

goto (clula resultante de la unin de los gametos femenino y mas-
culino), utilizando un vector retroviral o transformando clulas em-
brionarias.

En 1996 viene a la Argentina Alan Trounson, lder de la fertiliza-

cin in vitro en Australia, un pope, y nos dice que ya no se hace ms
microinyeccin, que lo que deberamos estar haciendo era clona-
cin, cuenta Baraao.

Pero cambiar de caballo en medio del ro no era sencillo. Enton-

ces, a fines de 2000, Salamone, que haba estado trabajando en el ci-
clo reproductivo de bovinos en Canad y luego haba pasado a tra-
bajar con Jim Robl, otro referente en clonacin en cuyo laboratorio
precisamente el argentino Jos Cibelli haba producido las primeras
vacas transgnicas, le escribe a Baraao diciendo que quiere volver
a la Argentina.

En los Estados Unidos, Salamone haba aprendido una tcnica que

consista no en microinyectar vulos, sino en tomar fibroblastos de
feto (las clulas ms comunes y menos especializadas del tejido con-
juntivo), transfectarlos con (introducirles) un gen de resistencia a
los antibiticos, seleccionar las clulas transgnicas y luego hacer
el transplante nuclear. As se tienen altas probabilidades de obtener
embriones transgnicos.

55
 Esa tecnologa era un boom que incluso haba dado lugar a la crea-
cin de una empresa, Advanced Cell Technologies precisa Bara-
ao. As que volv a Biosidus S.A. y les dije: Vamos por esto.

Y all fueron. Segn cuenta Salamone, l volvi en enero, consigui

el equipo en julio, al mes tena los primeros clones y cinco meses ms
tarde los primeros transgnicos.

Desde su regreso al pas, Baraao haba tenido la idea de que era prio-
ritario desarrollar la biotecnologa animal. Los bioqumicos prefe-
ran trabajar con plantas, porque eran ms sencillas y las tenan en la
maceta, pero yo quera trabajar en transgnesis con vacas... aunque
la verdad es que no tena mucha idea, confiesa. Haba desarrollado
un mtodo para valorar de actividad biolgica de las hormonas que
se usan para superovular, haba trabajado con estas protenas para
inducir la superovulacin en yeguas y tambin haba intentado tra-
bajar con las empresas aportando elementos para la produccin ani-
mal, aunque sin mucho xito. Era tal la oscilacin de la economa,
que nadie quera embarcarse en proyectos de riesgo, apunta.

Entonces, decidi escribir un proyecto de dos carillas en el que esta-

bleca que no iban a desarrollar ratones, ni cabras: haran la prueba
de concepto en cultivos de glndula mamaria de vaca. No sera nece-
sario afrontar un proceso largo y costoso para crear un ratn trans-
gnico que permitiera probar si la construccin funcionaba o no. Lo
probaran in vitro. Y con la hormona de crecimiento.

Baraao seleccion un reducido grupo de trabajo integrado por Leo-

nardo Bussman, que se ocupara de las transfecciones (la insercin
de genes) y el cultivo de los fibroblastos, Daniel Salamone, para el
trasplante nuclear, y la empresa Munar y Asociados, para la transfe-
rencia de embriones.

56
La entretela de esta historia no carece de suspenso y hasta de condi-
mentos humorsticos. Mientras Salamone todava estaba en los Es-
tados Unidos, mandaron a un abogado a que lo convenciera de vol-
ver cuenta Baraao. Me acuerdo que ese verano yo estaba en Mar
del Plata con mis hijos, en [los juegos de] Sacoa y, ante la suspicacia
de los chicos, usaba las fichas para mandarle mails a Salamone que
cada tanto se arrepenta...

Finalmente, en diciembre de 2001, empezaron a trabajar. El pas se

caa a pedazos y nosotros lanzndonos a esta aventura!, recuerda.

Para los primeros intentos, utilizaron tejido de una oreja del toro que
haba resultado del embrin implantado en el experimento de aos
antes. La primera vez se dej sacar la muestra dcilmente comen-
ta, la segunda ya miraba con desconfianza, y despus empezaba a
raspar el suelo con la pata con nimo amenazante en cuanto vea al
tcnico que se acercaba con el sacabocado como si le dijera: Ac no
te acercs.

Sin embargo, de esas clulas bovinas se logr el primer embrin clo-

nado. Al mes y medio de transferido e implantado en el tero de la
vaca portadora, una ecografa mostraba la imagen del ternerito en
gestacin.

Fue maravilloso comenta Baraao: nunca haba puesto ecogra-

fas de mis hijos en la pantalla de la computadora, pero todo el gru-
po tena la imagen del ternerito en sus mquinas.

Lgicamente, la noticia provoc una enorme algaraba, entre otras

cosas, por la celeridad con que se obtuvo un resultado positivo, si se lo
compara con los casi 280 intentos que haba requerido clonar a la ove-
ja Dolly, el primer mamfero obtenido por esta tcnica de la historia.

57
 El parto estaba previsto para los primeros das de marzo de 2002. La
vaca, que pastaba en medio del campo rigurosamente vigilada, ha-
ba sido revisada por un batalln de especialistas en neonatologa
bovina y se encontraba en ptimas condiciones para dar a luz.

Pero (siempre hay un pero) un par de semanas antes de la fecha in-

dicada, Quelo Gmez, el encargado del campo, les advirti que se-
gn su experiencia el parto se adelantara.

Me acuerdo que dijo: Esta vaca pare en una semana, asegura Ba-
raao. Con la autosuficiencia que otorga una carrera universitaria,
los investigadores, por supuesto, confiaron ms en sus propios cl-
culos que en la intuicin y la experiencia de Quelo e hicieron caso
omiso de sus advertencias.

El sbado siguiente, sin ningn integrante del equipo cientfico

presente, la vaca entr en trabajo de parto cuenta. Cuando lle-
g el primero de nosotros, el ternero estaba atascado en el canal de
parto. Para cuando lograron sacarlo, ya haba muerto. Para colmo,
sabamos que en Balcarce haba vacas preadas por clonacin y en
Brasil tambin se estaba intentando. Finalmente, todas abortaron.

Un artculo de La Nacin dio a conocer la noticia de este modo: Ines-

peradamente, a fines de enero de 2002, el equipo de investigacin
de Biosidus S.A., que algo ms de nueve meses antes haba logrado
clonar terneros a partir de clulas adultas por primera vez en Amri-
ca latina, tuvo que trasladarse de urgencia al campo.

La vaca de raza Jersey que se encontraba en ms avanzado estado

de gravidez haba comenzado a tener sntomas de parto inminen-
te, dos semanas antes de la fecha prevista, que era el 11 de febrero.
Como se haba convenido de antemano, fue sometida a una ces-
rea, pero, a pesar de los esfuerzos de reanimacin y de que estaba

58
completamente formado, el ternerito falleci durante el parto, que
se haba producido el 28 de enero. De todos modos, y ms all de la
frustracin lgica, el equipo hizo un balance positivo de la experien-
cia: en apenas un ao de trabajo haban logrado dominar la tcni-
ca de la clonacin y cumplir todos los pasos que permiten producir
un animal totalmente formado. Y ya estaban preparados para seguir
adelante.

El ternerito clonado se haba producido insertando el ncleo de una

clula del toro Aberdeen Angus (un fibroblasto de la oreja) en un
vulo bovino. El embrin resultante fue incubado durante algo ms
de una semana antes de transferirlo a la vaca portadora.

Se gest como corresponde y lleg a tener todos sus rganos y teji-

dos explic en esa oportunidad Carlos Melo, de Biosidus S.A., a La
Nacin. Despus del nacimiento, se realizaron los estudios gen-
ticos e histopatolgicos. Era normal, anatmica y fisiolgicamente.
Slo tena lo que se conoce como hgado graso, algo tambin habi-
tual en estos animales. Las pruebas muestran de manera indudable
que era un clon. Mandamos muestras con varias trampas cruzadas
(una muestra del toro original, dos del ternero, dos de la madre no-
driza y una del hijo biolgico del toro) para tener la certeza, y los re-
sultados fueron irreprochables. Indican una identidad del 99,95%
(el 100% es imposible). Sobre 16 regiones del ADN que se estudia-
ron, las 16 coinciden. Es decir, la probabilidad de que por casualidad
haya habido un error es de 5 en 10.000.

Pero el plan seguira como estaba previsto. La meta era clonar vacas
transgnicas capaces de producir hormona de crecimiento humana,
y el equipo ya tena otra decena de preeces en marcha.

Si tenan xito, las vacas clonadas y modificadas genticamente se-

ran capaces de producir entre 15 y 20 litros de leche diarios. Cada li-

59
 tro de esta leche podra contener hasta cinco gramos de hormona de
crecimiento, lo que dara entre 75 y 100 gramos diarios.

Bastaran dos o tres vacas para abastecer la demanda mundial de

hormona de crecimiento. Es decir, que entre una vaca que produ-
ce una protena recombinante y una gallina que produce huevos de
oro, es ms conveniente la vaca, brome en ese momento Baraao.

Esta fue una prueba de que nuestra receta funcionaba... y llegamos

al parto. La moneda cay del otro lado, pero es chance. Significa que
dominamos la tecnologa, lo que es notablemente exitoso. Ahora es
cuestin de repetir. Estamos en un nivel avanzado. Pero tenemos
que ir paso a paso, agreg.

Una vez superada la frustracin, decidieron seguir adelante, pero

esta vez con fibroblastos fetales de raza jersey, de menor tamao,
para evitar los riesgos asociados a la particularidad de los terneros
clonados de ser ms grandes que los nacidos de forma natural.

Por fin, de las primeras clulas nace exitosamente Pampa, la prime-

ra ternera clonada en la Argentina. Para no dejar nada librado al
azar se haba instalado un verdadero quirfano en medio del campo
y el equipo encargado del parto inclua a ocho personas.

De all en ms, casi semana por medio se haca un asado para asis-
tir al nacimiento de un ternero clonado recuerda Baraao. Y aun-
que eran partos de alto riesgo, salan bien...

Con diferencia de meses nacen dos descendientes de esa dinasta,

con un valor agregado: son transgnicas. Las llaman Pampa Mansa y
Pampa Clara. Se les toman muestras de ADN y todas tienen el trans-
gen, pero la que arroja una seal ms potente es la primera.

60
El xito fue motivo de otro festejo cuyo registro fue una foto Pola-
roid de la bandita de barras oscuras y claras que mostraba la pre-
sencia del gen humano en medio del genoma bovino.

En cuanto la vaca lleg a la madurez, sus ubres comenzaron a dar

leche que contena la hormona humana, dato que se prob por ra-
dioinmunensayo.

De todas maneras, haba que probar que era exactamente igual a la

que ya produca Biosidus S.A. y se hizo: era bioqumicamente idn-
tica y biolgicamente activa, dice Baraao. Y acota que, ms all
del logro cientfico, fue una muestra notable de cmo dos docenas
de cientficos, empresarios, veterinarios y gente de campo argenti-
nos pudieron trabajar juntos en pos de un objetivo comn. Era la pri-
mera vez que se estableca una asociacin tan directa entre la cien-
cia y la empresa.

Cinco aos despus de que hubiera nacido el primer animal clonado

de la historia, haba apenas cuatro o cinco grupos en el mundo que
dominaban esta tecnologa y haban desarrollado el conocimiento
haciendo grandes inversiones.

No hay muchas tecnologas que cinco aos despus de ser desarro-

lladas ya se dominen en el pas dice Baraao. Para entender la
trascendencia de este logro podra decirse que es como si cientficos
espaciales argentinos hubieran podido lanzar el Sputnik en 1962.

El proyecto tambin result ejemplar para comprender el valor de la

inversin en innovacin, si se tiene en cuenta que, al crear una im-
portante plataforma tecnolgica, Biosidus S.A. no tuvo problemas
para gestionar financiacin ni siquiera en plena crisis.

61
 Para m fue una experiencia muy importante dice Baraao, la co-
ronacin de ms de 18 aos de esfuerzo. Siempre tuve un tiempo de
mi laboratorio dedicado a esto. Y pudimos mostrar cmo una asocia-
cin de fracasos puede conducir al xito. Como dice Pasteur: la ca-
sualidad slo favorece a espritus preparados.

62
 La farmacia en el tambo

Entre el 10 y el 24 de septiembre de 2002 nacieron en un campo de

la provincia de Buenos Aires tres terneritas de raza Jersey que hicie-
ron historia: Clara, Dulce y Mansa, los primeros bovinos clonados
transgnicos del pas. El logro ubic a la ciencia argentina en la van-
guardia de la biotecnologa mundial.

Las tres fueron la copia fiel de Pampa, la primera ternerita clonada

en la Argentina, que haba nacido dos meses antes. Pero diferan en
un detalle fundamental: sus clulas poseen el gen de la hormona de
crecimiento humana, por lo que se espera que sean capaces de pro-
ducir grandes cantidades de esa protena de uso teraputico que re-
sulta imprescindible para los chicos que sufren de enanismo hipofi-
sario, y a la que da a da se le encuentran nuevos usos.

En el programa de clonacin de vacas transgnicas que haba lanzado

un lustro antes la empresa de biotecnologa local Biosidus S.A. intervi-
nieron cientficos de distintos grupos de investigacin del CONICET,
la UBA y el Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria (INTA).

Las protenas humanas de inters farmacolgico se venan clonando

desde alrededor de dos dcadas antes. Pero no en mamferos supe-
riores, sino en bacterias y clulas.

63
 As se haban podido fabricar frmacos como el interfern, la eri-
tropoyetina o la insulina, que antes haba que obtener por mtodos
extractivos. Pero hay un problema: existen protenas de las que se
requiere mucha masa para que ejerzan su efecto teraputico. Por
ejemplo, en una ampolla de interfern hay entre 10 y 20 microgra-
mos de la sustancia de inters; en una de insulina, entre 30 y 40 mi-
ligramos. O sea, que con el mismo fermentador se pueden producir
2.000 veces ms ampollas de interfern que de insulina. Evidente-
mente, los mtodos que resultaban tan fascinantes en 1980 no son
adecuados para satisfacer las necesidades actuales, explic Cris-
cuolo en declaraciones para el diario La Nacin.

El nuevo avance introducira posibilidades industriales revoluciona-

rias. Por ejemplo, el fermentador de la planta de Biosidus S.A. del ba-
rrio de Boedo tiene 250 litros de capacidad. La relacin teraputica
entre el interfern, por ejemplo, y la hormona de crecimiento es de
100 a uno. Es decir explica Criscuolo, que si uno puede abaste-
cer un mercado de interfern con ese fermentador, para producir la
misma cantidad de hormona necesitara un tanque de 25.000 litros.
Y no slo hay que pensar en el tamao del tanque, sino en todas las
complicaciones asociadas: en lugar de agregar dos kilos y medio de
glucosa, voy a tener que agregarle una tonelada; adems, tendr que
disponer de una planta de tratamiento capaz de purificar miles de
litros de cultivo... En cambio, si yo reemplazo todo eso por un tam-
bo, y en cada litro de leche obtengo cinco gramos de hormona, tengo
cinco mil dosis por litro. Una vaca me da veinte litros por da... Los
nmeros son asombrosos.

En el plano estrictamente econmico, la inversin necesaria para

instalar una planta ronda los cincuenta millones de dlares; un tam-
bo, los cuatrocientos mil. Y hay otro tema agrega Criscuolo: la
flexibilidad. Cuando se hace una planta de produccin, se corre un
gran riesgo porque hay que evaluar muy bien el mercado. Si la pre-

64
paro para producir una cierta cantidad, tengo que vender por lo me-
nos el 70% de esa cifra. Si la demanda es mayor, puedo invertir cin-
cuenta millones de dlares y no alcanzar a abastecer el mercado.
Pero si me queda muy grande, tambin es complicado, porque el lu-
cro cesante va al costo del producto y lo encarece. En el caso del tam-
bo farmacutico, es muy fcil: ordeo una vaca y si no me alcanza,
pongo dos. O tres. Tengo una forma mucho ms flexible de acomo-
darme al mercado. Adems, el tiempo de ordee de una vaca es de
tres minutos. Puedo ordear veinte vacas en una hora. Tambin es
posible amoldar la purificacin de acuerdo al tamao del lote que se
necesite. Y no hay que comprar medios de cultivo, los pone la vaca.
O sea, vemos una cantidad enorme de ventajas. La vaca transforma
pasto, agua y un poco de maz en un producto farmacutico.

Proyecciones internacionales estiman que la demanda de productos

biotecnolgicos superar ampliamente la capacidad instalada global.

Las bacterias es decir, los reactores biolgicos para los que ya hay
aprobacin de las autoridades sanitarias argentinas tienen una ca-
pacidad de produccin limitada. Era necesario pasar a otra dimen-
sin y los bovinos ofrecan una salida inmejorable: basta una sola
vaca transgnica para abastecer la necesidad local de hormona de
crecimiento.

Era la oportunidad ideal para conjugar dos de las riquezas que el

pas a pesar de las crisis posee en abundancia: know-how cientfi-
co de alto nivel y tecnologa ganadera de avanzada, ambos saberes
cultivados a lo largo de dcadas.

Melo se encarg de subrayarlo en sus declaraciones a periodistas in-

teresados por el anuncio de la clonacin de la dinasta Pampa. Todo
esto no solo requiere dominio de ciencia bsica, sino tambin un
complejo trabajo de coordinacin en el campo mismo dijo. All

65
 mantenemos constantemente 200 vacas nodrizas preparadas para
ser implantadas con los embriones. Semanalmente se van poniendo
en fase 15 o 20, lo que requiere un trabajo muy delicado para que los
animales estn preparados en tiempo y forma. Por otro lado, los in-
dividuos clonados requieren cuidados especiales, y en esto los peo-
nes de campo cumplen una tarea fundamental, con guardias de 24
horas para que no les falte atencin ni un instante.

Igual que Pampa, Clara, Dulce y Mansa fueron creadas a partir de

una clula fetal de raza Jersey y de un vulo de descarte.

Ambas clulas se cultivaron y se fundieron in vitro, y en ese cultivo

se introdujo el gen humano de la hormona de crecimiento disfraza-
do de otro que se expresa normalmente en la glndula mamaria bo-
vina, el de la betacasena vacuna. De ese modo, nos aseguramos de
que se expresara precisamente en el lugar que queramos, explica
Salamone.

A los seis meses, las terneritas fueron estimuladas hormonalmente

para que produjeran leche, lo que permiti verificar si el gen huma-
no cumpla con su funcin. Dos aos ms tarde, cuando estuvieron
en condiciones de ser preadas y tener descendencia, comenzaron a
producir leche con la hormona medicinal.

66
 Broche de oro

Dos aos ms tarde, Biosidus S.A. le puso el broche de oro a su pro-

grama tambo farmacutico del tercer milenio: en el corral asp-
tico que la compaa posee en la provincia de Buenos Aires, naci
Pampero, el primer bovino de sexo masculino cuyo ADN contiene el
gen humano de la hormona de crecimiento.

Pampero es el macho que asegura la perpetuacin de la estirpe

transgnica y un logro que volvi a poner a la Argentina en la prime-
ra lnea de la investigacin mundial en este tema.

De color miel y con los ojos dulces de su madre biolgica, Pampa

Mansa, difera como el da de la noche de la vaca que lo haba ges-
tado en su tero durante 39 semanas. Se trat de un ternero abso-
lutamente extraordinario: al madurar, cada uno de sus espermato-
zoides tendra el gen humano de la hormona de crecimiento, que su
progenie heredara de acuerdo con la rigurosa lgica de las leyes de
Mendel.

Con un programa constante de obtencin de semen, que puede guar-

darse congelado en nitrgeno lquido, se aseguraba la conservacin
de la estirpe.

67
 La ecuacin tecnolgica haba sido impecable. El producto de una
eyaculacin de Pampero alcanzara para inseminar entre doscien-
tas y trescientas vacas normales con las tcnicas de rutina. La mi-
tad de los hijos seran transgnicos. De stos, la mitad sera de sexo
femenino; es decir, vacas productoras de grandes cantidades de hor-
mona de crecimiento humana en su leche.

Avanzar en el conocimiento de cmo manipular los engranajes de la

naturaleza resultaba infinitamente ms rendidor que ensamblar los
de la ingeniera tradicional. Mientras que una vaca puede dar hasta
tres kilos de hormona sin purificar por mes, un fermentador de 500
litros, trabajando seis das por semana, puede producir como mucho
sesenta gramos.

Con unas 14 vacas, se puede abastecer el mercado mundial de esta

protena. Con esta produccin, la Argentina podra ser el primer fa-
bricante mundial de hormona de crecimiento.

Nosotros tenamos un sistema muy eficiente, pero costoso, basado

en la clonacin, la generacin de embriones, la transferencia embrio-
naria, el parto por cesrea... Ahora, para este frmaco no necesitamos
seguir produciendo vacas por clonacin, porque el semen de Pampe-
ro puede generar todas las vaquitas transgnicas que uno quiera, con
la identidad gentica asegurada y por el mtodo ms econmico que
pueda pensarse, que es la inseminacin, explica Criscuolo.

El nacimiento de Pampero represent la culminacin de un progra-

ma que se haba iniciado siete aos antes, poco despus de que la
oveja Dolly se convirtiera en el primer mamfero de la historia obte-
nido a travs de la clonacin de un animal adulto.

El 6 de agosto de 2001 haba nacido Pampa, la primera vaca clonada

del pas; en 2002, Pampa Mansa, primera vaca clonada transgnica;

68
el 5 de enero de 2004 nacieron Pampa Mansa I y II, y el 7 de diciem-
bre naci Pampero. Todos los animales se mantuvieron en perfecto
estado de salud y aunque nacen en condiciones de estricta asepsia se
criaron de una forma lo ms parecida posible a la habitual.

Con el nacimiento del macho transgnico perpetuador casi todas

las posibilidades que tiene esta tecnologa fueron exploradas con
xito, subraya Criscuolo.

Para Marcelo Argelles, en ese momento presidente de BioSidus, el

logro no slo se debi al nivel cientfico de los investigadores locales,
sino tambin a la pericia y experiencia del personal de campo, que
tena un entrenamiento fenomenal.

Por ejemplo, el doctor Roberto Salaberry, que haca las cesreas, era
capaz de sacar al ternero en menos de tres minutos. Para evitar
riesgos, el equipo haba trabajado en un corral asptico, con veteri-
narios vestidos con traje de astronauta y paisanos de guardapolvo
blanco. Tambin haba participado un neonatlogo y haba hasta un
desfibrilador disponible.

Cuando en el laboratorio se preparan embriones para ser implanta-

dos, no hay mucho tiempo, de modo que los cientficos mantenan
ms de doscientas madres receptoras en ciclo, listas para ser uti-
lizadas y bajo el control de los encargados que las revisaban dos ve-
ces por da.

Cuando Salaberry vio el primer ternero clonado dice Argelles,

un bichito color beige de una madre negra, lo primero que dijo fue
Es hembra!, y lo segundo, Es [raza] Jersey!, con lo cual se cum-
plan las dos premisas que confirmaban que habamos logrado lo
que nos habamos propuesto y que se trataba efectivamente de un
animal clonado.

69
 Llegar a la meta exigi compatibilizar dos culturas y conocimientos
muy diferentes: los del campo y los del laboratorio, unos tan impor-
tante como los otros. La gran experiencia de nuestra gente de cam-
po fue vital para poder estimular la superovulacin en las vacas, la-
varles el tero, extraer los vulos e insertar los embriones clonados
en las hembras receptoras, subraya Criscuolo.

Para Baraao, la experiencia dej mucho ms que un rdito cientfi-

co y tecnolgico. Esto muestra lo que es posible hacer en la Argen-
tina y tambin que podemos participar en la nueva manera de ha-
cer ciencia que se est viendo en los pases desarrollados afirma.
Pasamos de la investigacin fundamentalmente acadmica, con fi-
nanciamiento exclusivamente estatal, a un trabajo grupal. Proyec-
tos tan ambiciosos como ste slo son posibles con la participacin
de grupos multidisciplinarios capacitados para resolver cada una de
las etapas del proceso. Adems de aumentar el conocimiento bsico,
tienen como objetivo la obtencin de un producto concreto. Parad-
jicamente, si bien sta es la nueva manera de hacer ciencia, es tam-
bin volver a Pasteur, que sent las bases de la microbiologa, pero
resolviendo problemas de los productores.

Y agrega: Armonizar grupos de trabajo y evitar el tradicional indi-

vidualismo argentino en funcin de un proyecto comn es un hecho
inusual y promisorio... Y un logro tanto o ms importante que obte-
ner vacas transgnicas.

Despus de cerrar el ciclo de la hormona de crecimiento, el equi-

po de Biosidus S.A. sigui adelante con su proyecto de tambo far-
macutico, y desarroll la dinasta Patagonia, que produce insulina
[para el tratamiento de la diabetes], y present a Portea, la primera
ternera del mundo capaz de producir hormona de crecimiento bovi-
na en su leche; es decir, le agregaron una construccin gentica (un
fragmento de ADN) para que esta hormona se exprese en un lugar

70
en el que no lo hace naturalmente, la glndula mamaria de las vacas.

La hormona de crecimiento bovino, aprobada por la Food and Drug

Administration de los Estados Unidos (FDA) en 1994, se utiliza para
estimular la produccin de leche en el ganado. Se sabe que puede
aumentarla alrededor de un 25%. La utilizan Estados Unidos, Mxi-
co y Brasil, y probablemente lo harn pases como Venezuela, Per y
Chile. El mercado mundial ronda los 500 millones de dlares. Y has-
ta ahora hay slo dos compaas que la fabrican.

Poco a poco, y con todo los recaudos que corresponden, el mundo

les est abriendo las puertas a las nuevas tecnologas. Las autorida-
des sanitarias europeas ya aprobaron el primer producto transg-
nico para uso en seres humanos producido en la leche de cabras. Y
la FDA, en los Estados Unidos, public una gua para la aprobacin
de drogas y alimentos producidos tambin por animales transgni-
cos, y los lineamientos que deben observarse para su cuidado, trata-
miento, conservacin y regulacin.

Pero los comienzos fueron diferentes. El equipo de Biosidus S.A. de-

bi enfrentar cuestionamientos que muchas veces se pasan por alto
cuando se trata de juzgar productos importados. Tuvimos que dar
muchos exmenes cuenta Criscuolo. Cuando presentamos la hor-
mona recombinante [producida en bacterias] el cuerpo mdico nos
exigi mucho ms por el prejuicio de que si es importado, tiene que
ser mejor. Cmo estos muchachos de Almagro, a tres cuadras de la
ex cancha de San Lorenzo, bamos a tener la protena recombinante?

La hormona de crecimiento est indicada para nios que no crecen

en altura en los ritmos considerados normales. El dficit se puede
comprobar con facilidad: bastara con que los maestros midieran a
sus chicos cada tres o seis meses en los colegios, algo que ayudara a
la deteccin precoz.

71
 Sera importantsimo, porque solo hay tiempo para tratarlos hasta
que termina la adolescencia. Y si se los individualiza tardamente no
alcanzan su altura potencial. Si uno detecta a un chico afectado de
enanismo hipofisario a los 12 aos, tiene seis ms para tratarlo. En
cambio, si lo detecta a los quince, tiene tres, afirma.

Pero esta protena no solo podra utilizarse para estos cuadros. En-
tre otros usos, tambin se estudia en la vejez para generar msculo,
en los casos en que hay deficiencia comprobada de hormona. Mu-
chas veces, hay viejitos que se caen y se fracturan, porque la cola
tambin es el colchn para no fracturarse, entonces cuanto menos
msculo, menos colchn. Con un buen colchn, disminuimos el ni-
vel de cadas y de fracturas.

Internacionalmente tambin est aprobado su uso en casos de dis-

minucin de estatura que pueden llevar a la discriminacin, como
cuando una persona tiene una talla que no le permite alcanzar las
manijas del subte o la altura de los mostradores para trmites.

La discriminacin puede llevar a una enfermedad por la angustia

que causa agrega. Entonces, con aprobacin de los padres, el m-
dico puede tratar estos casos para agregar varios centmetros de al-
tura.

Un chico tratado con hormona de crecimiento gana alrededor de

cinco centmetros por ao, dependiendo de su respuesta al trata-
miento.

En la Argentina, se venden actualmente ms de seis marcas de hor-

mona de crecimiento. El Estado atiende a los nios hasta los vein-
te aos, que es cuando, se calcula, se cierran las epfisis (cada uno
de los extremos) de los huesos largos y ya no crecen ms. Sin em-
bargo, hay que tener en cuenta que desde el punto de vista fisiolgi-

72
co, si una persona tiene deficiencia de hormona de crecimiento, si-
gue siendo deficiente aunque tenga veinte aos aclara Criscuolo.
La protena no sirve slo para los huesos. Quien es hormonodeficien-
te empieza a aumentar de peso, sufre cambios en la forma del cuer-
po y la distribucin de la grasa. Esto permite anticipar que habr un
grupo de nios que fueron tratados y salvados del problema de esta-
tura, pero luego enfrentan otro. Por eso, se espera que en algn mo-
mento la ley cambie y permita prolongar el tratamiento cuando sea
necesario.

73
 Eplogo

Por esa curiosa trama de hechos, personas y acontecimientos que

suelen entretejerse en la vida de un pas, desde hace medio siglo la
epopeya de la hormona de crecimiento no solo permiti destilar el ta-
lento de investigadores brillantes y audaces, sino tambin desarrollar
tecnologas para la salud que permiten mejorar la calidad de vida,
crear puestos de trabajo y competir en el mercado internacional.

Bastan un par de cifras para comprender la diferencia entre tener o

no el conocimiento desarrollado a lo largo de estas dcadas. El tra-
tamiento de un chico con enanismo hipofisario con hormona de cre-
cimiento importada cuesta alrededor de tres mil dlares mensuales;
con la producida localmente, dos mil pesos por mes. La dosis estn-
dar es de un miligramo y medio diario. Solo para esta indicacin, el
mercado mundial ronda los mil millones de dlares, o aproximada-
mente 70 kilos anuales... La hormona producida por vacas transg-
nicas podra bajar alrededor del treinta por ciento el costo del pro-
ducto. Existe adems un mercado potencial en crecimiento por la
suma de nuevas indicaciones: baja talla, sndrome de deficiencia de
hormona de crecimiento en mayores de 65 aos, prevencin del en-
vejecimiento.

Concluidos los exmenes preclnicos que mostraron que la prote-

74
na producida por las vacas transgnicas es estructural y funcional-
mente idntica a la producida por bacterias recombinantes, en 2012
comenzaran los ensayos clnicos finales y comparativos con un
producto de referencia para su aprobacin por las autoridades re-
gulatorias. Esto exige un enorme esfuerzo dice Criscuolo. Slo
comprarle el frmaco a la competencia implica una inversin de un
milln de dlares.

A la distancia, resulta fascinante comprobar cmo el azar y la nece-

sidad fueron encadenando las diferentes etapas que llevaron desde
el inters por desentraar la estructura ntima de una protena, con
los medios precarios con que contaba la bioqumica de la poca de
las probetas, hasta su produccin mediante la manipulacin del ge-
noma de animales superiores.

En realidad, bamos a hacer activador tisular del plasmingeno

(TPA, segn sus siglas en ingls, una protena tromboltica) en ca-
bras y terminamos haciendo hormona de crecimiento en vacas dice
Criscuolo, como si observara en perspectiva las insondables vueltas
del camino recorrido. Cuando pareca imposible producirla con c-
lulas, porque hubiera sido necesario tener una fbrica inmensa y hu-
biera involucrado costos muy altos, nos dimos cuenta de que tena-
mos lo ms importante para desarrollar la hormona de crecimiento:
todo el conocimiento de nuestros maestros y de la gente de campo.
De alguna manera se alinearon los planetas.

As, mientras los bovinos clonados ocupaban las primeras planas de

los diarios e inspiraban la imaginacin y frecuentemente los temo-
res del pblico, detrs de escena los cientficos podan contestar
las preguntas que los atormentaban. Por ejemplo, si los clones tie-
nen descendencia, si los animales transgnicos tambin pueden re-
producirse, si los ltimos individuos de la estirpe tienen ms errores
genticos que los primeros, si los clones nacen con la edad de la c-

75
 lula adulta de la que provienen sus dos juegos de cromosomas y se
mueren antes...

Cuando decidimos avanzar en ese camino, Santom y Dellacha fue-

ron nuestros asesores y cumplieron un papel fundamental subra-
ya. Nosotros tenamos que entender cmo funcionaba la mama, la
betacasena, si nos serva usar un promotor de esa materia blanca de
la leche, sus interacciones... Ellos nos ayudaron en cada nuevo inten-
to e inspiraron mucho respeto entre los jvenes.

Acaban de cumplirse 100 aos de la publicacin, en 1911, de la tesis

doctoral de Bernardo Houssay, considerada la piedra basal de la en-
docrinologa en el pas. Por una curiosa pirueta del destino, la inves-
tigacin del primer Premio Nobel argentino versaba sobre la gln-
dula hipfisis, encargada de producir nada menos que la hormona
de crecimiento. Se llam Estudios sobre la accin de los extractos
hipofisarios. Ensayos sobre la fisiologa del lbulo posterior de la hi-
pfisis.

Acerca de su trabajo Houssay, que entonces tena 23 aos, escribi

un texto que sorprende por su clarividencia:

Desde el ao 1907 form el propsito de ocuparme del estudio de

las funciones de la hipfisis, tema que atrajo mi inters por las gran-
des lagunas de nuestros conocimientos al respecto. Mi propsito fue
aplaudido y alentado por mi maestro doctor H. G. Piero, quien lu-
chando desde hace largos aos ha hecho comprender, respetar y es-
timar entre nosotros los estudios fisiolgicos habiendo conseguido
instalar un buen laboratorio y puesto su ctedra a tal altura que es
sin disputa una de las ms brillantes de la escuela. Habiendo dedica-
do a los estudios de fisiologa la mejor parte de mi tiempo a su lado,
me ha parecido justo escribir mi tesis inaugural sobre algn asun-
to de esta materia. La casi totalidad de experiencias de este estudio

76
han sido realizadas por el Laboratorio de Fisiologa de la Facultad de
Agronoma y Veterinaria cuya direccin, junto con la ctedra, fu-
ronme encargadas interinamente.

Este trabajo, en realidad, representa una de las direcciones de mi

labor experimental. Pudirasele con justicia considerar como un es-
tudio parcial sobre las funciones de la hipfisis, ya que se ocupa casi
nicamente de las del lbulo nervioso, que hasta hace poco se te-
na por rgano rudimentario. (...) los estudios de Histologa y Fisio-
loga comparadas; el rol de esta glndula en la acromegalia, gigan-
tismo, distrofia adiposo-genital, etc.; su papel en las toxiinfecciones;
los sndromes de hiper e hipofuncin y las aplicaciones teraputicas
de los preparados opoterpicos, etc., son temas que motivaron mi in-
ters, habiendo sido, alguno de ellos, objeto de mis investigaciones.
He preferido, sin embargo, no hacer mencin de ellos hasta obtener
resultados bien seguros, convencido como estoy de la nocuidad de
las publicaciones prematuras que no han sido siempre bastante me-
ditadas, que casi siempre estn sembradas de errores y cuyo mate-
rial principal est a menudo formado por una abundante copia, no
siempre prolija, de materiales ajenos. Como esto sucede entre no-
sotros con tal frecuencia, que pudiera decrsele el principal defecto
de nuestra literatura mdica nacional, he credo prudente salvar el
escollo en lo posible. La abundante bibliografa, bastante completa,
que acompaa a cada tema aqu tratado, se justifica por el carcter
de monografa de este estudio; por la utilidad de contraponer opi-
niones unas veces encontradas y otras complementarias, etc.; ade-
ms por la facilidad que reportar a quienes deseen estudiar estos
temas, evitndoles el largo y pesado trabajo de buscar uno por uno
los datos bibliogrficos.

Las dificultades materiales con que he debido luchar para prose-

guir estos estudios han sido muchas, queriendo dejar aqu anotada
slo una: la falta de perros en 1908-09, y comienzos de 1910, cuan-

77
 do por una medida inconsulta, nos lo negaba la perrera municipal.
Tengo adems la satisfaccin personal de haber costeado estos estu-
dios con mis recursos personales.

La creacin de institutos cientficos de investigacin no puede ha-

cerse bruscamente como por obra de magia, se impondr segu-
ramente cuando por el persistente esfuerzo de nuestros investiga-
dores, que felizmente los tenemos buenos y decididos, se imponga
claramente su necesidad, y cuando haya verdaderos espritus dis-
ciplinados y con ideal nacional, capaces de dirigirlos consciente y
fructferamente. Hoy que nuestro pas ha alcanzado ya una posicin
econmica brillante y est destinada a mejorarla constante y rpida-
mente por su prodigiosa potencialidad productora, es necesario que
nuestro progreso cientfico, que no est an a la par con el material,
merezca una atencin preferente del Estado y de las grandes fortu-
nas particulares. Estas encontraran mejor empleo para sus exceden-
tes, destinndolos a sostener institutos de investigacin o de benefi-
cencia social bien entendida, que emplendolos como sucede hoy en
numerosas obras infinitamente menos provechosas para el adelanto
material e intelectual del pas y que no pueden proporcionar iguales
satisfacciones a espritus verdaderamente cultos. En rigor ms que
una caridad sera a mi juicio un acto de justicia social. (...)

Hago pues votos porque pronto se consiga mejorar las condiciones

pecuniarias de los Laboratorios y que las mejores remuneraciones
permitan a los profesores de ciencias experimentales dedicarse ex-
clusivamente a ellas, sin necesidad de ejercer la profesin mdica
que forzosamente resta la mayor parte del tiempo, en materias que
por su ndole exigen una labor constante y de todos los momentos.

Dcadas ms tarde, sus alumnos tomaran la antorcha para seguir

avanzando precisamente en el conocimiento de los ms ntimos en-
granajes de la glndula que lo haba intrigado: no slo desentraa-

78
ron la estructura de una de las hormonas que secreta y que resul-
ta vital para el desarrollo del organismo, sino que adems lograron
producirla en bacterias genticamente modificadas y luego en vacas
transgnicas.

Aquel da en que Alejandro Paladini invit a Juan Dellacha y a Jos

Santom a sumarse a su ctedra de la Facultad de Farmacia y Bioqu-
mica de la UBA y les ofreci un laboratorio, una cmara helada sin
otro mobiliario que una mesada y un mechero de Bunsen, pocos hu-
bieran sospechado que llegaran tan lejos.

79
 Los protagonistas

Jos A. Santom
Durante ms de cuarenta aos, se dedic al es-
tudio de las protenas, a la enseanza de la bio-
qumica y a la formacin de decenas de discpu-
los. Hoy, es profesor emrito de la Universidad
de Buenos Aires, ex Coordinador del Laboratorio
Nacional de Investigacin y Servicios en Qumica de Protenas (LA-
NAIS-PRO), miembro de la Academia Nacional de Farmacia y Bio-
qumica, la Academia de Ciencias de Buenos Aires, la Academia de
Ciencias del Mundo en Desarrollo (TWAS), en Trieste, y la Academia
Latinoamericana de Ciencias, en Caracas. Tambin es aficionado a la
nutica, a recorrer el pas en automvil y a la observacion de pjaros.

Juan M. Dellacha
Fue durante dcadas investigador del CONICET
profesor titular del Departamento de Qumica
Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumi-
ca. Profesor Honorario de la Universidad de Bue-
nos Aires, miembro de la Academia Latinoame-
ricana de Ciencias, en Caracas. Integr el directorio de la Agencia
Nacional de Promocin Cientfica y Tecnolgica y de la Comisin de
Investigacines Cientficas de la Pcia de Buenos Aires. A su retiro, se

80
convirti en Director Cientfico del Foro Argentino de Biotecnologa,
creado en 1986, veinte aos despus de la primera aplicacin de la
hormona de crecimiento a un chiquito argentino afectado de enanis-
mo en el Cehip, puesto que ocupa hasta hoy.

Alejandro C. Paladini
Fue farmacutico (recibido con medalla de oro),
bioqumico y profesor de matemtica. Trabaj
con Leloir, Braun Menndez y Houssay. Despus
de recibir numerosos premios y de una vida de-
dicada a la ciencia, estuvo hasta su fallecimiento
(15/09/2012), a cargo de la organizacin del Museo Bernardo Hous-
say de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA.

Carlota Wolfenstein
Naci en Checoslovaquia, pero lleg a la Argenti-
na a los dos aos. Se declara ms argentina que
los argentinos, a pesar de que vivi 13 aos en
Nueva York, donde se cas y tuvo una hija. Fue la
primera becaria que integr el grupo de Santo-
m, apodado cariosamente por sus colegas Las Santoms Girls,
dado que estaba conformado slo por mujeres. Hoy, ya jubilada, es
investigadora ad honorem del CONICET en el Laboratorio Nacional
de Investigacin y Servicios en Pptidos y Protenas (LANAIS-PRO)
en el Instituto de Qumica y Fsicoqumica Biolgicas de la Facultad
de Farmacia y Bioqumica de la UBA.

Mirtha Biscoglio
La intrigaban la msica y la investigacin. Qui-
so ser concertista de piano, pero se decidi por la
ciencia para no tener que emigrar a Europa para
proseguir su carrera. Se recibi en Rosario y lle-
g a Buenos Aires con la ilusin de trabajar con

81
 Agustn Marenzi, autor del libro con el que en su poca estudiaban
qumica biolgica. Cuando se encontr con l, el cientfico le dijo que
ya estaba muy mayor y abandonando el cargo, pero le sugiri ir a ver-
los a Paladini, Leloir o Stoppani. Fue as como se integr a la ctedra
de Qumica Biolgica. Primero entr con una beca Biscoglio, porque
me sostena mi pap recuerda. Pero despus tuve la suerte de tra-
bajar con Santom y Paladini, y fue algo que agradec toda mi vida.
Yo llegu a vivir en la facultad: fui la primera mujer que ocup el de-
partamento de residentes. Siempre am lo que hago con pasin. Di-
rigi 16 tesis doctorales. Actualmente, es coordinadora del Labora-
torio Nacional de Investigacin y Servicios en Pptidos y Protenas
(LANAIS-PRO) en el Instituto de Qumica y Fsicoqumica Biolgicas
de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA.

Daniel Salamone
Se define como un gran provocador al que le gus-
ta internarse en caminos que no fueron recorri-
dos. Una vez habl con un antiguo amigo que
haba estudiado en la Universidad de Cornell y
cuando le plante lo que iba a hacer en clona-
cin, me contest que eso no era para la Argentina, sino para Gran
Bretaa o los Estados Unidos afirma. Esto siempre fue como un
sueo. Sin embargo, a veces me cuesta convencer a los estudiantes de
que hay que soar con lo imposible. Hoy es profesor de la Facultad
de Agronoma de la UBA e investigador independiente del CONICET.

Lino Baraao
Parece haber estado predestinado a participar en
esta historia. Su padre le hablaba de Alexis Ca-
rrell, el mdico, bilogo y Premio Nobel francs
que desarroll los primeros medios de cultivo y
logr mantener un corazn de pollo latiendo du-
rante meses. Carrell mantena correspondencia con el to de Baraao

82
y su viuda le leg los trabajos. El cientfico argentino se dedic al de-
sarrollo de medios de cultivo y en 2007 una becaria suya, que haba
trabajado en Francia, logr obtener los primeros cardiomiocitos (c-
lulas cardacas) diferenciados a partir de clulas madre embrionarias
que latan en una placa de cultivo.
Baraao reconoce, sin embargo, que adems de la influencia positi-
vista de estos dos tos, fue sensible a la influencia de un to poltico
llamado Honorio Serrano, salteo y coya, conocido como El brujo,
que lea las manos y adivinaba el futuro. Desde los ocho aos, l me
repeta que me vea hablando en pblico y que tena que prepararme
leyendo a Demstenes, afirma. Su profeca se cumpli: aunque to-
dava no ley a Demstenes, habla en pblico casi todos los das. Hoy
es el primer Ministro de Ciencia, Tecnologa e Innovacin Productiva
de la Repblica Argentina.

Marcelo Criscuolo
Se interes en la investigacin mientras cuidaba
a su padre en la seccin Hipertensin del Institu-
to Lanari. All integr un grupo que intentaba fa-
bricar interfern leucocitario y se vincul con la
compaa Sidus. Junto con Alberto Daz, lanz
la rama biotecnolgica de la empresa, Biosidus S.A., que en menos
de dos dcadas logr dominar la manipulacin de genes de utilidad
en salud humana, y la clonacin animal y vegetal, y aplicar esas tc-
nicas a la produccin de frmacos y especies vegetales. Hoy es su di-
rector ejecutivo.

...Y decenas de cientficos, estudiantes avanzados, tecnlogos, mdi-

cos, empresarios y gente de campo que sumaron su esfuerzo y cono-
cimiento para llegar a la meta...

83
 DESCRIPCIN CIENTFICO - TCNICA

HORMONA DE CRECIMIENTO

Estudios realizados en Argentina

Juan M. Dellacha Jos A. Santom

85
 SUMARIO

I FORMACIN DEL GRUPO DE TRABAJO PARA: el estudio

de la hormona de crecimiento / creacin del centro
para el estudio de las hormonas hipofisarias (cehip)

1. Antecedentes
2. Orgenes del grupo de trabajo del Departamento de Qumica Biolgica de la Facul-
tad de Farmacia y Bioqumica de la UBA
3. Creacin del Centro para el Estudio de las Hormonas Hipofisarias
3.1 Caractersticas del CEHIP

Publicaciones
Trabajos publicados con el grupo de Mancini Trabajos publicados con Sonenberg
Trabajos de investigacin clnica

II INVESTIGACIONES SOBRE HORMONAS DE CRECIMIENTO

DEL PERODO 1963-1976

a) Primeras experiencias
b) Formacin de subgrupos de trabajo

1. ESTUDIOS SOBRE CONFORMACIN MOLECULAR

1.1 Intercambio de hidrgeno
1.2 Prediccin de estructura secundaria

2. RESIDUO N-TERMINAL Y ESTUDIOS FISICOQUMICOS

2.1 Determinacin del residuo N-terminal
2.2 Estudios fisicoqumicos
2.2.1 Agregacin y disociacin de la bGH. Determinacin del peso molecular
2.2.2 Purificacin y caracterizacin de hormonas de crecimiento de otras es-
pecies
2.2.3 Marcacin de hormonas de crecimiento con radioactivos

86
3. ESTUDIOS SOBRE ESTRUCTURA PRIMARIA (SANTOM)
3.1 Caractersticas moleculares de las hormonas de crecimiento humana y bo-
vina, conocidas cuando el grupo de qumica biolgica inici sus investigaciones
3.2 Extremo C-terminal
3.3 Composicin en minocidos
3.4 Determinacin de la estructura primaria completa de la hormona de la bGH
3.4.1 Tcnica utilizada para la determinar la estructura primaria de la bGH
3.5 Estructura primaria de las hormonas de crecimiento ovina y equina
3.6 Influencia de la modificacin qumica de residuos de amino cidos de las dis-
tintas hormonas de crecimiento sobre su comportamiento inmunolgico

Publicaciones
Conformacin molecular Prediccin de estructura secundaria Determinacin
del residuo N-terminal Estudios fisicoqumicos Obtencin de hormonas Extre-
mo C-termina Estructura primaria de la bGH Estructura primaria de la oGH and
eGH Estudios inmunolgicos
TESIS DOCTORALES
Estudios conformacionales Estudios fisicoqumicos y purificacin de hormo-
nas Estructura primaria
CONFERENCIAS INTERNACIONALES

III INVESTIGACIONES POSTERIORES A 1976

Divisin del grupo de Qumica Biolgica de la UBA

1. GRUPO DIRIGIDO POR PALADINI

1.1 Estudios inmunolgicos
1.1.1 Deteccin de zonas inmunolgicas en las hormonas de crecimiento hu-
mana, bovina y equina
1.1.2 Deteccin de anticuerpos contra hormonas de crecimiento humana, bo-
vina y equina en pacientes tratados con hGH
1.1.3 Obtencin de anticuerpos monoclonales y su aplicacin
1.2 Receptores

Publicaciones
Estudios inmunolgicos Receptores Otros estudios

2. GRUPO DIRIGIDO POR DELLACHA

2.1 Marcacin de las hormonas de crecimiento
2.2 Receptores

87
 Publicaciones
Marcacin de hormonas de crecimiento con radioactivos Receptores
TESIS DOCTORALES

3. GRUPO DIRIGIDO POR SANTOM

3.1 Hormona de crecimiento de alpaca
3.2 Aportes al conocimiento de la conformacin molecular
3.2.1 Modificacin qumica de aminocidos
3.2.1.1 Identificacin de los residuos modificados y porcentaje de modi-
ficacin
3.2.1.2 Modificacin qumica de aminocidos y actividad biolgica
3.3 Modificacin qumica de distintos residuos
3.3.1 Formacin de subgrupos de investigacin
3.3.2 Modificacin qumica de lisinas
3.3.3 Modificacin de tirosinas y triptofano
3.3.4 Modificacin de metioninas
3.3.5 Modificacin de histidinas
3.3.6 Modificacin de grupos carboxilo
3.3.7 Modificacin de argininas
3.4 Introduccin de haptenos en el estudio de estructura y funcin
3.5 Determinacin de la proximidad de residuos con reactivos qumicos
3.6 Finalizacin de los estudios estructurales que realizaba el grupo de Santom

Publicaciones
Hormona de crecimiento de alpaca Modificaciones qumicas

4. APORTES DE OTROS GRUPOS SIN INTERVENCIN DE PALADINI, DELLACHA

O SANTOM
4.1 Biscoglio- Cascone
4.2 Fernndez- Delfino
4.3 Pea
4.4 Poskus
4.5 Retegui
4.6 Turyn

Publicaciones
Biscoglio-Cascone Fernndez-Delfino Poskus Retegui Turyn

88
IV COLABORACIN CON LA INDUSTRIA

1. HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANA RECOMBINANTE

1.1 Asesora de Dellacha
1.2 Asesora de Santom
1.2.1 Convenios epecficos de prestacin de servicios con la Facultad de Far-
macia y Bioqumica de la UBA
1.2.1.1 Determinacin de la estructura primaria completa de la hormona
hGH recombinante Biosidus S.A. (1996)
1.2.1.2 Estudio inmunoqumico comparativo entre hGH recombinante
producida por Biosidus S.A. y otras de diferente origen. (1995)

2. HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANA DE LECHE DE VACAS TRANSGNICAS

2.1 Convenios especficos de prestacin de servicios con la Facultad de Farmacia
y Bioqumica de la UBA
2.1.1 Determinacin de la estructura primaria completa de la hGH de leche
de vacas transgnicas. BIO-SIDUS S. A. (2003)
2.1.2 Estudio inmunoqumico comparativo entre la hGH obtenida por Biosi-
dus S.A. de leche de vacas transgnicas y hormonas de diferente origen. Acti-
vidad de las mismas frente a receptores de origen humano y sobre la prolife-
racin de clulas Nb2 (2004)
2.1.3 Determinar la capacidad de la hGH de leche de vacas transgnicas de
iniciar la transduccin de seales (2004)
2.1.4 Estudio comparativo por dicroismo circular y fluorescencia entre la
hGH (Biosidus S.A.), de leche de vacas transgnicas y hormonas de diferentes
orgenes. Anlisis de la estabilidad conformacional
2.1.5 Obtencin de sueros en conejos hiperinmunes hacia sistemas antigni-
cos complejos (2006)

ANEXO O ADDENDA

A. Estructura de protenas
B. Breve descripcin de los fundamentos y metodologa empleada para determinar
la estructura primaria de la hormona de crecimiento bovina
C. Evolucin de las metodologas para determinar la estructura primaria de protenas
D. Resumen de los conocimientos estructurales actuales sobre hormonas de creci-
miento
E. Receptores hormonales

89
 I FORMACIN DEL GRUPO DE TRABAJO PARA: el estudio
de la hormona de crecimiento / creacin del centro
para el estudio de las hormonas hipofisarias (cehip)

1. Antecedentes

En 1958, el Instituto de Histologa y Embriologa de la Facultad de Ciencias Mdicas

de la UBA, dirigido por el Dr. Eduardo De Robertis, estaba interesado en estudiar la
distribucin tisular de ciertas protenas, cuando stas eran marcadas con molcu-
las fluorescentes.
Dellacha comenz a trabajar en el Laboratorio que el Dr. Roberto Mancini, perte-
neciente a dicho Instituto, quin contaba con un microscopio de fluorescencia apto
para este tipo de estudios. Utilizaron el colorante Lisamina Rodamina B 200 que
tiene la particularidad de emitir fluorescencia rojiza cuando se lo excita con luz ul-
travioleta. Las protenas marcadas se inyectaban a ratas las que eran sacrificadas
en distintos tiempos y los tejidos de inters eran procesados histolgicamente y ob-
servados con el microscopio de fluorescencia. Por este procedimiento estudiaron
la distribucin tisular de la hormona tirotrfica (TSH). A los pocos minutos de in-
yectada la localizaron en la membrana celular de la tiroides y minutos ms tarde la
fluorescencia desapareca de la membrana y apareca en el interior de la clula. Es-
tos experimentos fueron publicados en Nature, 184, 1788 (1959) y fueron los pri-
meros en demostrar que las hormonas penetran en la clula blanco a los pocos mi-
nutos de ser inyectado el animal. En esos aos prevaleca la idea que las hormonas
no penetraban en las clulas. Dellacha y Mancini tambin marcaron la hormona de
crecimiento.
Posteriormente Dellacha trabaj con una beca del National Institutes of Health
(NIH) en el Sloan-Kettering Institute for Cancer Research bajo la Direccin de Mar-
tin Sonenberg. Estudiaban porqu la hormona de crecimiento acetilada era un in-
hibidor de dicha hormona. Sin embargo, la hormona de crecimiento bovina que ha-
ban obtenido de un prestigioso laboratorio distaba mucho de ser homognea. Ante
esta situacin Dellacha propuso elaborar un mtodo para preparar, a partir de hip-
fisis bovina, hormona de crecimiento homognea. Despus de un par de meses lo-
graron obtener hormona homognea analizada por ultracentrifugacin analtica y
electroforesis libre.
En ese tiempo se saba que slo la hormona de origen humano y de simio son biol-
gicamente activas en el humano. El dogma de la poca indicaba que se deba a su ta-
mao molecular, ya que se crea que las hormonas humana y de simio tenan un peso
molecular que era aproximadamente la mitad del de las otras especies animales. La
falta de actividad de las hormonas de crecimiento de otros mamferos en el humano,
no permita utilizarlas en clnica mdica, como se haca con la insulina. Ante esta li-

90
mitacin algunos laboratorios en el mundo intentaron, mediante digestiones enzi-
mticas controladas, obtener a partir de hormonas animales un producto activo en
humanos. Dellacha y Sonenberg intentaron, con la hormona bovina homognea que
haban obtenido, digestiones enzimticas controladas. Obtuvieron en humanos al-
gunos efectos metablicos y anablicos. Ninguno de estos estudios permiti obte-
ner productos capaces de reemplazar a la hormona de crecimiento humana en el tra-
tamiento de nios, por lo tanto este abordaje se abandon.

2. ORGENES DEL GRUPO DE TRABAJO DEL DEPARTAMENTO DE QUMICA

BIOLGICA DE LA UBA

En 1962 Paladini, Profesor Titular de Qumica Biolgica I de la Facultad de Farma-

cia y Bioqumica de la Universidad de Buenos Aires, invit a Dellacha y Santom a
presentarse a un concurso de profesores adjuntos en el Departamento de Qumica
Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica, concurso que ganaron y fueron
designados en 1963. Dellacha recin haba regresado de trabajar en Estados Unidos
con hormona de crecimiento bovina (bGH) y estaba dispuesto a continuar en Bue-
nos Aires con ese tema de investigacin. Invit a Paladini y Santom a formar un
equipo para trabajar con esa hormona. El tema, de gran actualidad en ese momen-
to, era muy interesante porque la hormona bovina no es activa en humanos, a dife-
rencia de lo que ocurre con la insulina bovina y porcina que son activas en humanos
y muy utilizadas en el tratamiento de la diabetes. La investigacin cientfica sobre
hormona de crecimiento bovina podra aclarar ese comportamiento y posiblemente
permitir su modificacin estructural para hacerla activa en humanos.
El grupo de trabajo formado, como complemento de su actividad cientfica, resolvi
contribuir al tratamiento de los nios con retardo de crecimiento de origen hipofi-
sario, mediante la obtencin de la hormona a partir de hipfisis humanas de cad-
veres. Antes de describir los aportes cientficos al conocimiento de las hormonas de
crecimiento, realizados por el grupo constituido en la Facultad de Farmacia y Bio-
qumica, se har una breve descripcin de las tareas realizadas para cumplir con el
objetivo social mencionado.

3. CREACIN DEL CENTRO PARA EL ESTUDIO DE LAS HORMONAS HIPOFI-

SARIAS (CEHIP)

Dellacha haba hecho su carrera de practicantado en Farmacia en el Hospital de Ni-

os Dr. Ricardo Gutierrez. All conoci, en 1963, a Csar Bergad que acababa de
llegar de Estados Unidos despus de haberse especializado en endocrinologa infan-
til, especialmente en el tratamiento de nios con severos trastornos de crecimien-

91
 to. Bergad se haba incorporado al Servicio de Endocrinologa Infantil dirigido por
Martn Cullen. Dellacha fue invitado a contar sus investigaciones en dicho Servicio
y all surgi la idea de obtener hormona de crecimiento a partir de hipfisis huma-
nas. Estudiaron la propuesta con Cullen y Paladini y decidieron entrevistar a Ber-
nardo Houssay para solicitarle el apoyo del CONICET. As naci el Centro para el Es-
tudio de Hormonas Hipofisarias, que integraron Paladini, Santom y Dellacha, del
Departamento de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica; Cu-
llen, Bergad y Juan J. Heinrich, del Servicio de Endocrinologa del Hospital de Ni-
os y Jos Manuel Domnguez, del Instituto de Investigaciones Mdicas de la Facul-
tad de Medicina de la UBA.

3.1 Caractersticas del CEHIP

El Centro para el Estudio de Hormonas Hipofisarias cont desde su creacin con
subsidios del CONICET y apoyo econmico de la Fundacin de Endocrinologa In-
fantil, conocida en el ambiente peditrico con el acrnimo FEI.
El CEHIP tena dos sectores bien diferenciados. Uno de ellos ubicado en el Depar-
tamento de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA y
el otro con asiento en el FEI ubicado en el Servicio de Endocrinologa del Hospital
de Nios Dr. Ricardo Gutirrez. El establecido en la Facultad tena como misin la
preparacin de la hormona de crecimiento humana (hGH) y los ensayos y anlisis
necesarios para asegurar su actividad biolgica y la esterilidad del producto. En el
FEI se realizaban los estudios clnicos en los nios que asistan al Hospital por tras-
tornos relacionados con su anormal crecimiento, seleccionando aquellos que por su
nivel de deficiencia hipofisaria deban ser sometidos a tratamientos prolongados
con hormona de crecimiento.
La obtencin de hGH en el Departamento de Qumica Biolgica, cuyo principal res-
ponsable fue Dellacha, demand organizar un sistema de recoleccin de hipfisis
humanas que asegurara contar con un nmero adecuado y una provisin constante
de glndulas para atender los planes asistenciales y de investigacin. En primer tr-
mino visitaron numerosos hospitales y se interes a los jefes de los departamentos
de anatoma patolgica del alcance del proyecto. Adems se obtuvo una acordada de
la Suprema Corte de Justicia de la Nacin para retirar las hipfisis de los cadveres
de la Morgue Judicial. As obtuvieron la colaboracin desinteresada que brindaron
la Morgue Judicial y los Servicios de Anatoma Patolgica de los Hospitales: Alva-
rez, Argerich, Cetrngolo, de Nios Ricardo Gutirrez, Durand, Elizalde, Fernn-
dez, Fiorito, Muiz, Policlnico Alejandro Posadas, Policlnico de Avellaneda, Poli-
clnico de Lans, Ramos Meja, Rawson y la Ctedra de Patologa de la Universidad
de Buenos Aires. Las hipfisis se conservaban en termos que contenan nieve carb-
nica y una vez por semana eran retirados y las glndulas se transferan a una conge-
ladora a -60 C hasta su procesamiento. Desde 1970 a 1985 se recolectaron alrede-
dor de 66.000 hipfisis.

92
Un aspecto a destacar fue estudiar qu mtodo se aplicara para extraer la hormo-
na de la glndula y qu procedimiento de purificacin se adoptara. Ensayaron va-
rios mtodos descriptos en la literatura (Raben, Wilhelmi, etc) que abandonaron
por dar productos heterogneos. Finalmente seleccionaron el mtodo de Roos al que
le aadieron una filtracin por gel, que permiti obtener una protena apta para
tratamientos clnicos. Un colector de fracciones, donado al FEI por la Embajada de
Suecia, transferido al laboratorio de Qumica Biolgica, permiti separar del gel, la
fraccin proteica con actividad hormonal. La hormona liofilizada se esterilizaba y
fraccionaba en frascos multidosis conteniendo 5 mg de hGH. Este procedimiento se
llev a cabo en forma gratuita, en los Laboratorios Carlo Erba de Buenos Aires y pos-
teriormente por gentileza del Dr. Zenn Lugones en el Laboratorio Roux-Ocefa S.A.
En el FEI ubicado en el Servicio de Endocrinologa del Hospital de Nios, esta hor-
mona era aplicada a nios con severos trastornos de crecimiento, que haban sido se-
leccionados despus de un riguroso estudio, para obtener el mximo beneficio tera-
putico, al suministrar la hormona extrada de hipfisis humanas.
Otro aspecto de importancia fue poner a punto en ratas Sprague Doley, provenien-
tes de una colonia cerrada criadas en el Bioterio Central de la Facultad de Farmacia
y Bioqumica, la tcnica de hipofisectoma e instalar en el Departamento un bioterio
especializado, donde un tcnico realizaba esta operacin y era el encargado del cui-
dado de estos animales. Era imprescindible contar con ratas hembras hipofisoprivas
para determinar la actividad biolgica de la hormona producida en el laboratorio.
En el CEHIP de la Facultad de Farmacia y Bioqumica se obtuvo alrededor de 130 g
de hGH durante un perodo de 15 aos aproximadamente. La hormona preparada en
el CEHIP cumpla con un alto grado de pureza qumica y antignica que posibilit su
utilizacin para los estudios estructurales, fisicoqumicos e inmunolgicos realizados
en el Departamento de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica.
En 1985, en Estados Unidos, Reino Unido y posteriormente en Francia, fallecieron
jvenes de la enfermedad de Creutzfeldt - Jacob. Todos ellos tenan en comn haber
sido inyectados en un perodo de su niez con hormona de crecimiento humana. El
CEHIP recibi un llamado telefnico de la WHO que le advirti de lo sucedido y le su-
giri suspender la produccin de hormona a partir de hipfisis humanas hasta tan-
to se supiera el motivo de esos decesos. Tambin suspendieron la provisin de hGH
la National Pituitary Agency y el Instituto Nacional de la Salud de los Estados Unidos
de Norteamrica y los laboratorios de Inglaterra, Francia y Suecia que la producan.
Si bien nunca se tuvo evidencia directa acerca del origen del problema se supuso que
estos casos fatales recibieron hormona de hipfisis provenientes de pacientes con
Creutzfeldt - Jacob y que el mtodo de purificacin utilizado no permiti eliminar de
la preparacin los priones presentes. Posteriormente a este hecho se comprob que
los priones eran retenidos en una columna de gel filtracin como la utilizada en Bue-
nos Aires. Afortunadamente se puede asegurar que en nuestro pas no se registraron
casos de esta enfermedad, relacionados al uso de la hGH de origen pituitario.

93
 Publicaciones.

Trabajos publicados con el grupo de Mancini:

Histological study of distribution of fluorescent serum proteins in connective tis-
sue. Mancini RE, Vilar O, Gmez C, Dellacha JM, Davidson OW, Castro A. J Histochem
Cytochem 9:356-62 (1961).
Histological localization in rat tissues of intravenously injected thyrotrophin labe-
led with a fluorescent dye , Vilar O, Dellacha JM, Davidson OW, Castro A. J Histochem
Cytochem 9:271-7 (1961).
Localization of fluorescent proteins in the follicles during growth of the rat ovary
Heinrich J. Davidson OW, Vilar O, Dellacha JM, Mancini RE. Rev Soc Argent Biol
37:63-4 (1961).
Participation of the kidney in the incorporation of fluorescent proteins and pituitary
hormones. Mancini RE, Dellacha JM, Davidson OW, Alvarez BJ. . J Histochem Cyto-
chem 9:614- (1961)

Trabajos publicados con Sonenberg:

Purification of bovine growth hormone. Dellacha JM, Sonenberg M J. Biol. Chem.,
239, 1515 (1964).
The metabolic effects in man of bovine growth hormone digested with tripsyn. Sonen-
berg M, Free CA, Dellacha JM, Bonadonna G, Haymowitz A. Naddler AC. Metabolism.
14, 1189-213 (1965).
Anabolic effect in man of papain digests of bovine growth hormone. Sonenberg M, De-
llacha JM. J. Clin. Endocrinology and Metabolism. 27, 1035-40 (1967).
Chemical Analysis of acetylated bovine growth hormone, a growth hormone inhibi-
tor. Oikawa A, Dellacha JM, Sonenberg M. Biochem. J. 104:947 (1967).
Chemical and biological characterization of clinically active tryptic digest of bovi-
ne growth hormone. Sonenberg M, Kikutani M, Free CA, Nadler AC, Dellacha JM. Ann.
New York Acad. Sci., 148, 532-58 (1968)
Growth hormone activity in man of chymotryptic digest of bovine growth hormone.
Sonenberg M, Dellacha JM, Free CA, Nadler AC. J. Endocr. 44, 255-65 (1969).

Trabajos de investigacin clnica:

Growth hormone treatment in younger than six years of age short children born small
for gestational age. Bergad I, Blanco M, Keselman A, Domen HM, Bergad C. Arch
Argent Pediatr. 2009; 107:410-6. Spanish.
Growth hormone insensitivity associated with a STAT5b mutation. Kofoed EM, Hwa
V, Little B, Woods KA, Buckway CK, Tsubaki J, Pratt KL, Bezrodnik L, Jasper H, Tepper
A, Heinrich JJ, Rosenfeld RG. N Engl J Med. 2003; 349:1139-47.
Estrogen priming effect on growth hormone (GH) provocative test: a useful tool for the
diagnosis of GH deficiency. Martnez AS, Domen HM, Ropelato MG, Jasper HG, Pennisi

94
PA, Escobar ME, Heinrich JJ. J Clin Endocrinol Metab. 2000; 85:4168-72.
Psychosocial outcome in growth hormone deficient patients diagnosed during child-
hood. Keselman A, Martnez A, Pantano L, Bergad C, Heinrich JJ. J Pediatr Endocri-
nol Metab. 2000; 13:409-16.
Reproducibility and comparison of growth hormone secretion tests. Ropelato MG,
Martnez A, Heinrich JJ, Bergad C. J Pediatr Endocrinol Metab. 1996;9:41-50.
Growth of Argentinian girls with Turner syndrome. Garcia Rudaz C, Martnez AS,
Heinrich JJ, Lejarraga H, Keselman A, Laspiur M, Bergad C. Ann Hum Biol. 1995;
22:533-44.
Heterologous humoral immune response in patients treated with human growth hor-
mone from different sources. Cardoso AI, Llera AS, Iacono RF, Domen HM, Martnez
AS, Heinrich JJ, Pea C, Poskus E. Acta Endocrinol (Copenh). 1993; 129:20-5.
Detection of autoantibodies against hGH in sera of idiopathic hypopituitary children.
Llera AS, Cardoso AI, Stumpo RR, Martinez AS, Heinrich JJ, Poskus E. Clin Immunol
Immunopathol. 1993;66:114-9.
High serum sex hormone-binding globulin (SHBG) and low serum non-SHBG-bound
testosterone in boys with idiopathic hypopituitarism: effect of recombinant human
growth hormone treatment. Belgorosky A, Martinez A, Domene H, Heinrich JJ, Berga-
da C, Rivarola MA. J Clin Endocrinol Metab. 1987; 65:1107-11.
High incidence of thyroid disturbances in 49 children with Turner syndrome. Gru-
eiro de Papendieck L, Iorcansky S, Coco R, Rivarola MA, Bergad C. J Pediatr. 1987;
111:258-61.
Etiology and association of growth hormone deficiency. Heinrich JJ, Martinez AS,
Bergada C. Acta Endocrinol Suppl (Copenh). 1986; 279:113-7.
Pubertal development in male hypopituitarism. Martnez AS, Heinrich JJ, Rivarola
MA, Bergad C. Eur J Pediatr. 1986; 145:384-8.
Antibodies against animal growth hormones appearing in patients treated with hu-
man growth hormone: their specificities and influence on growth velocity. Prez AR,
Pea C, Poskus E, Paladini AC, Domen HM, Martnez AS, Heinrich JJ. Acta Endocri-
nol (Copenh). 1985; 110:24-31.
Comparison of single and combined tests for the evaluation of plasma growth hormo-
ne secretion in normal short children. Bazn MC, Domen H, Heinrich JJ, Barontini M,
Bergad C.J Endocrinol Invest. 1984; 7:295-8.
Phenotypic heterogeneity in familial isolated growth hormone deficiency type I-A.
Rivarola MA, Phillips JA 3rd, Migeon CJ, Heinrich JJ, Hjelle BJ. J Clin Endocrinol Me-
tab. 1984; 59:34-40.
Somatomedin activity in patients with short stature due to hypopituitarism or cons-
titutional-familial growth retardation. Jasper HG, Martnez A, Heinrich JJ. Medicina
(B Aires). 1983; 43:308-14. Spanish.
Human, bovine, and equine growth hormone antibodies in patients treated with hu-
man growth hormone. Poskus E, Pea C, Prez AR, Vita N, Heinrich JJ, Paladini AC. J

95
 Clin Endocrinol Metab. 1982; 55:13-7.
Patterns of TSH response to TRH in children with hypopituitarism. Grueiro de
Papendieck L, Iorcansky S, Rivarola MA, Heinrich JJ, Bergad C. J Pediatr. 1982;
100:387-92.
Evaluation of short stature in children. Martnez A, Coianis L, Heinrich JJ, Rodrguez
A, Bergad C. Helv Paediatr Acta. 1982; 37:563-70.
Body growth and lymphocyte DNA polymerase activity in patients with hypopituita-
rism. Jasper HG, Bergad C. Medicina (B Aires). 1982; 42:238-42.
Effects of alpha-bromoergocryptine on pituitary hormone secretion in children. Ba-
zn MC, Barontini M, Domen H, Stefano FJ, Bergad C. J Clin Endocrinol Metab.
1981; 52:314-8.
The renin-angiotensin system in chronic idiopathic pituitary insufficiency. Levin GM,
Moyano MB, Bergad C. Medicina (B Aires). 1978; 38:519-23. Spanish.
Ovarian differentiation in Turners syndrome. Rivelis CF, Coco R, Bergada C. J Ge-
net Hum. 1978; 26:69-83.
Cytogenetic findings in 125 patients with Turners syndrome and abnormal karyoty-
pes. Coco R, Bergada C. J Genet Hum. 1977; 25:95-107.
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1969; 29:269-73. Spanish.

96
II INVESTIGACIONES SOBRE HORMONAS DE CRECIMIENTO
del PERODO 1963-1976

a) Primeras experiencias
Dellacha puso en marcha su mtodo de obtencin de la bGH a partir de hipfisis bo-
vinas suministradas por frigorficos que las haban sometido a un congelamiento r-
pido e individual, inmediatamente despus extradas.
Paladini consider que el primer aporte que el grupo poda encarar era verificar la
homogeneidad de la hormona intentando separar ambas cadenas y eliminando las
impurezas que podran contener las preparaciones de bGH. Para ello el laboratorio
dispona de un moderno equipo de Distribucin en Contra Corriente de 1.000 tubos,
sistema que haba demostrado un elevado poder de resolucin de mezclas comple-
jas, incluyendo polipptidos, pero que no se haba probado en protenas. Paladini,
Dellacha y Santom trabajaron varios meses con ese equipo y enviaron las distintas
fracciones que obtenan al laboratorio de Sonenberg, en Estados Unidos, para la de-
terminacin de la actividad biolgica de las fracciones obtenidas. Con gran decep-
cin comprobaron que la distribucin en contra corriente desnaturalizaba la mol-
cula de la hormona con la consiguiente prdida de actividad.

b) Formacin de subgrupos
Frente a los resultados descriptos, los tres investigadores resolvieron que cada uno
se ocupara de un aspecto distinto del estudio de la bGH y discutir en conjunto la pla-
nificacin y estado de avance de los experimentos. Encararon los siguientes temas:
1. Subgrupo de Paladini: Estudios sobre conformacin molecular.
2. Subgrupo de Dellacha: Determinacin del residuo N-terminal y estudios fisico-
qumicos que incluan la determinacin del peso molecular en la ultracentrfuga
analtica y la electroforesis libre en el aparato de Tiselius.
3. Subgrupo de Santom: Determinacin de la secuencia de aminocidos del extre-
mo C-terminal y de la composicin en aminocidos de la bGH.

1. ESTUDIOS SOBRE CONFORMACIN MOLECULAR (PALADINI)

1.1 Intercambio de hidrgeno.

A fines de la dcada de 1960 se conoca que las hormonas de crecimiento constituan
un grupo de protenas estrechamente relacionadas pero con una peculiar especifi-
cidad de especie en su actividad biolgica. As, por ejemplo, las hormonas de otros
mamferos no eran activas en primates. Estas caractersticas indujeron a distintos
investigadores a intentar modificaciones en distintas hormonas de crecimiento de
mamferos con la intencin de hacerlas activas en humanos. Para lograrlo era muy

97
 importante conocer las razones moleculares de ese comportamiento. El subgrupo de
Paladini con el objetivo de contribuir a la solucin del problema explor algunas ca-
ractersticas diferenciales de la estructura terciaria de varias hormonas de mamfe-
ros midiendo la cintica del intercambio de H, en varias condiciones experimenta-
les, en las hormonas de crecimiento humana, bovina, ovina, porcina y equina. Para
realizar estos estudios utilizaron la tcnica de dilisis inventada por Craig, la cual
permite realizar la dilisis en forma continua y en contracorriente.
Con especial participacin del tesista rosarino Csar Cambiaso realizaron interesan-
tes observaciones sobre los cambios conformacionales que ocurren en esas hormonas,
midiendo la cintica de intercambio de hidrgeno por tritio. Comprobaron que la hor-
mona de crecimiento humana es de dos a diez veces ms permeable al solvente que
las otras hormonas, justificando que sea la nica activa en humanos. Midiendo la ve-
locidad de intercambio de tritio, tambin comprobaron que existe especificidad de es-
pecie en la interaccin de las hormonas de crecimiento con membranas de eritrocitos.

1.2 Prediccin de estructura secundaria.

En colaboracin con John M. Stewart aplicaron el mtodo de Chou y Fasman para
predecir la estructura secundaria de las hormonas de crecimiento humana, bovina y
equina, del lactgeno placentario humano y de la prolactina ovina.

2. RESIDUO N-TERMINAL Y ESTUDIOS FISICOQUMICOS (DELLACHA)

2.1 Determinacin del residuo N-terminal.

Determinaron por mtodos qumicos que la mitad de las molculas de bGH tiene ala-
nina en el extremo N-terminal y en la otra mitad fenilalanina.

2.2 Estudios fisicoqumicos.

2.2.1 Agregacin y disociacin de la bGH. Determinacin del peso molecular.

El subgrupo de Dellacha encar estas investigaciones para verificar si era cierta la
asignacin de un peso molecular de 46.000 a la bGH, aproximadamente el doble del
correspondiente a las hormonas de origen humano y de simio. Comprobaron por fil-
traciones a travs de geles de Sephadex G-100, en medio neutro, que la hormona de
crecimiento bovina (bGH) se comporta con un perfil de elucin correspondiente a
un peso molecular (PM) de 22.000 aproximadamente.
El Departamento de Qumica Biolgica contaba con el nico equipo existente en la
UBA para determinar el peso molecular de protenas mediante la tcnica de centri-
fugacin analtica, consistente en medir el desplazamiento de una protena en solu-
cin en un campo gravitacional intenso. Con ese equipo determinaron el PM de la
bGH en una solucin reguladora donde la hormona no se agregaba. Determinaron

98
que el PM era similar a la de la hGH, confirmando el resultado obtenido por filtra-
cin en Sephadex.
Para determinar las razones que indujeron a atribuir un peso molecular erroneo a
la bGH, realizaron numerosos estudios fisicoqumicos que permitieron establecer la
influencia de ciertos aniones en los procesos de agregacin-disociacin de la bGH.
Utilizaron las tcnicas de ultracentrifugacin analtica, gel filtracin, viscosidad y
difusin a travs de membranas porosas.

2.2.2 Purificacin y caracterizacin de protenas de la familia de las hormonas de

crecimiento.
Dellacha fue el principal responsable del aislamiento, purificacin y caracterizacin
de las hormonas de crecimiento ovina y equina.

2.2.3 Marcacin de hormonas de crecimiento con radioactivos.

A mediados de los 70, pusieron a punto las tcnicas de marcacin de hGH y bGH
con molculas radiactivas. Marcaron la bGH con C14 mediante una reaccin qumi-
ca con O-metilisourea C14, consistente en transformar los residuos de lisina en ho-
moarginina, conservando la hormona su actividad biolgica. Con ella estudiaron su
distribucin tisular en ratas, midiendo la concentracin y los productos de digestin
radiactivos en diferentes tejidos.

3. ESTUDIOS SOBRE ESTRUCTURA PRIMARIA (SANTOM)

En este libro se utilizan una serie de trminos vinculados a estructura de protenas y

material gentico que para algunos lectores puede ser conveniente recordar. Se des-
criben en forma muy reducida en el Anexo A.

3.1 Caractersticas moleculares de las hormonas de crecimien-

to humana y bovina, conocidas cuando el grupo de qumica biol-
gica inici sus investigaciones.

Hormona PM Residuo N-terminal Residuo C-terminal

hGH Phe Phe

bGH 46.000 (Li y Pedersen, 1953) Phe, Ala Phe

20.000 (Andrews y Folley, 1963) Ala

Tambin se haban realizado determinaciones sobre la secuencia de aminocidos

del extremo C-terminal (Harris et al. 1954, Li, 1956) de acuerdo con las cuales se
haba sugerido la secuencia: (Val, Thr, Ser) Leu-Ala-Phe-Phe, considerando el peso
molecular 46.000.

99
 La presencia de dos residuos N-terminales en la bGH, cuando se le atribua un peso
molecular de 46.000, hizo suponer la presencia de una cadena ramificada de ami-
nocidos, pero cuando se inform un peso molecular de 20.000 se pens en la exis-
tencia de dos cadenas, una de ellas con Phe N-terminal y la otra con Ala. Estos co-
nocimientos escasos y confusos sobre la molcula de bGH ponan de manifiesto la
necesidad de nuevos estudios.
El laboratorio de Qumica Biolgica estaba en condiciones para encarar estos temas
por disponer del Autoanalizador Technicon con el que Gonzles Cadavid y Paladini
haban elaborado un mtodo de anlisis automtico de amino cidos (Gonzalez Ca-
david N. and Paladini AC. Automatic amino acid analysis: Reagent and instrumen-
tal improvements. Analytical Biochemistry. 9: 170-174, 1964).

3.2 Determinacin de la secuencia C-terminal de la bGH.

Santom y la bioqumica Carlota Wolfenstein, incubando la bGH durante 20 horas
con carboxipeptidasas (enzimas que liberan en forma sucesiva los residuos C- ter-
minales) slo consiguieron liberar un residuo de fenilalanina por mol de hormona,
atribuyendo a sta un peso molecular de 20.000. Llam la atencin que las carboxi-
peptidasas solo liberaran la fenilalanina y no continuaran con los siguientes resi-
duos. Ante la posibilidad de que la conformacin molecular de la bGH impidiera el
acceso del extremo C-terminal a las carboxipeptidas, repitieron el experimento en
presencia de 0,1 % de dodecil sulfato de sodio, detergente que no haba sido utiliza-
do previamente para facilitar el ataque enzimtico a protenas. La carboxipeptida-
sa-A liber rpidamente y en forma sucesiva fenilalanina y alanina del extremo C-
terminal. Resultados que se confirmaron con un mtodo qumico, la hidrazinolisis,
que se practic sobre la bGH nativa y sobre la bGH previamente desprovista de la fe-
nilalanina C-terminal por accin de la carboxipeptida-A. Tuvieron que destilar, con
grandes precauciones, hidrazina altamente explosiva. Por hidrazinolisis de la bGH
desprovista de la alanina y de la fenilalanina C-terminales y oxidada con cido per-
frmico, comprobaron que el tercer residuo es una media cistina.
Estos resultados constituyeron una fuerte evidencia del PM cercano a 20.000, que
Dellacha haba determinado experimentalmente, y rectificaron los datos de otros
autores.
En el siguiente trabajo determinaron la secuencia del pptido C-terminal: Phe-(Glu-
Gly)-Ala-Ser-Cys-Ala-Phe, al que aislaron por electroforesis en papel a partir de la
bGH oxidada y digerida con tripsina. Planificaron su obtencin considerando que es
el nico pptido trptico carente de arginina y/o lisina y que tiene carga fuertemen-
te negativa por poseer, adems del carboxilo C-terminal, cidos cisteico y glutmico.

3.3 Determinacin de la composicin en aminocidos.

Determinaron la composicin en aminocidos de la bGH preparada por el mtodo
de Dellacha y Sonenberg y la expresaron considerando el peso molecular 20.800.

100
3.4 Determinacin de la estructura primaria completa de la hor-
mona de crecimiento bovina.
Despus de los xitos en la determinacin de la secuencia del extremo C-terminal,
Paladini y Dellacha estimularon a Santom para que encarara la determinacin de
la estructura primaria total de la bGH, ofrecindole el apoyo de todos los integrantes
del laboratorio, como as tambin de la utilizacin de los locales y equipos existentes.
Pareca un despropsito encarar tal problema en nuestro pas, pero era demasiado
tentador poder comparar las estructuras primarias de las hormonas de crecimiento
humana y bovina e intentar determinar las razones moleculares de la falta de activi-
dad de la bovina en humanos.
Wolfenstein y Santom haban iniciado el estudio de la estructura del extremo C-
terminal, en 1963, cuando se conoca la estructura primaria de muy pocas prote-
nas, diez aos despus de que Sanger y Thomson publicaron la estructura primaria
de la primera protena, la insulina, y tres despus de que Moore y Stein dieran a co-
nocer la de la ribonucleasa, la segunda. Li estaba determinando la de la hormona de
crecimiento humana, tarea que le llev 10 aos.
Resolvieron encarar un trabajo de tal magnitud considerando que se podra afron-
tar con el equipamiento, el nmero de colaboradores, la provisin de bGH y los sub-
sidios disponibles.
El equipamiento de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica, si
bien no estaba a la altura del de los laboratorios internacionales de la especialidad,
haca posible encarar el problema por disponer de:
Un autoanalizador Technicon (donado a Paladini por una fundacin nor-
teamericana). Recientemente, Paladini y su tesista N. Gonzlez Cadavid ha-
ban armado sus numerosos mdulos adaptndolos al anlisis automtico de
aminocidos.
Resinas para el armado de columnas cromatogrficas destinadas a la sepa-
racin de pptidos resultantes de la digestin enzimtica de protenas.
Un equipo de electroforesis de alto voltaje para la purificacin de pptidos.
Cubas para cromatografia en papel.
Con respecto a la cantidad de hormona necesaria, Moore y Stein afirmaban que para
determinar la estructura primaria de una protena se requera disponer de 1 g men-
sual de esa protena, cantidad que esperaban producir para la bGH. Dellacha mont
una especie de fabriquita para preparar 300 milgramos mensuales de bGH a par-
tir de kilogramos de hipfisis bovinas adquiridas en frigorficos que las congelaban
individualmente, inmediatamente despus de extradas del animal.
Para realizar las innumerables operaciones tcnicas necesarias se incorporaron para
trabajar con Santom y Carlota Wolfenstein: Mirtha Biscoglio, que se ocup princi-
palmente de las degradaciones de Edman, Clara Pea del extremo N-terminal de la
molcula, Edgardo Poskus de la determinacin de los puentes disulfuro y Silvia Dau-
rat, del estudio de los pptidos hidrofbicos, poco solubles en los solventes conven-

101
 cionales. Adems, todo el grupo, incluyendo a Zulema Mazzani y Vernica Fontanive,
que trabajaban hasta ese momento con Paladini y Dellacha, particip en la realiza-
cin de las electroforesis, cromatografas, digestiones enzimticas y de todas las otras
tcnicas requeridas diariamente. En las determinaciones de la composicin en ami-
nocidos contaban con la valiosa colaboracin tcnica de Dora Beatti, ya fallecida.
En el transcurso del trabajo la metodologa fue perfeccionndose. El primer anali-
zador automtico de aminocidos permita tener la composicin de un pptido cada
26 horas, tiempo que se fue reduciendo hasta poco ms de 1 hora, gracias a que la
casa Technicon reemplaz el primer modelo por otro ms perfeccionado y finalmen-
te con la incorporacin de un equipo Beckman. Paladini y Dellacha se ocupaban del
mejoramiento de los equipos. Sin embargo, este equipamiento fue superado inter-
nacionalmente por la aparicin del primer secuenciador automtico de aminocidos
presentado en 1967 por Edman, capaz de determinar la secuencia N-terminal de 15
aminocidos en 24 horas con 250 nanomoles de protena. Equipo al que no poda as-
pirar el grupo de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la
Universidad de Buenos Aires.
Poco despus de iniciado el proyecto se conoci la existencia de otros 2 grupos que
estaban determinando la estructura primaria de la BGH:
Wallis, M. y col. Biochemistry Laboratory, School of Biological Sciences,
University of Sussex, Falmer, Brighton, U.K.
Robert E., Fellows, Jr. y Alan D. Rogol. Department of Physiology and Phar-
macology, Duke University Medical Center, Durham, North. Carolina.
Sin quererlo, el Departamento de Qumica Biolgica tuvo que competir con esos dos
grupos, procurando finalizar primero para no perder un trabajo de tal magnitud, en
el caso que los otros grupos lo publicaran antes, y las revistas no aceptaran el reali-
zado en Buenos Aires. El grupo de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y
Bioqumica tard 7 aos en completar la estructura primaria y fue el primero en pu-
blicar el trabajo completo en 1973.
Ese mismo ao Wallis present sus resultados en una revista de publicaciones r-
pidas: The primary structure of bovine growth hormone. Wallis, M.FEBS Lett.
35:11-14(1973).

3.4.1. Tcnica utilizada para la determinacin de la estructura primaria de la hor-

mona de crecimiento bovina.
En el Anexo B se describen brevemente:
La metodologa accesible en esa poca, para determinar la estructura pri-
maria de una protena.
La metodologa empleada para determinar la estructura primaria comple-
ta de la bGH.
En el Anexo C:
La evolucin que experimentaron posteriormente esas metodologas.

102
3.5 Estructura primaria de las hormonas de crecimiento ovina y
equina.
Aprovechando la experiencia adquirida y con la activa participacin de nuevos inte-
grantes del grupo: Horacio Fernndez, lamentablemente fallecido, Dr. Mario Zakin,
proveniente del Instituto Pasteur de Pars y Pascual Ferrara, que posteriormente hizo
su tesis con Paladini, el grupo de qumica biolgica determin la estructura prima-
ria de las hormonas de crecimiento ovina y equina en un tiempo mucho ms breve.
Los estudios estructurales se realizaron con las hormonas de crecimiento ovina y
equina preparadas por los mtodos de Dellacha y colaboradores, que permitieron te-
ner protenas homogneas, a diferencia de las resultantes de los mtodos precedentes.
Una de las razones que motivaron el estudio de la estructura primaria de las hormo-
nas de crecimiento de distintos mamferos fue procurar aclarar porque las hormo-
nas bovina, ovina y equina no son activas en humanos, a diferencia de lo que ocurre
con la insulina bovina y la porcina, que se utilizan en el tratamiento de la diabetes.
Pensaron en la posibilidad de que la comparacin de sus estructuras primarias po-
dra aclarar ese comportamiento y en intentar realizar modificaciones estructurales
para obtener un derivado activo en humanos. A esta altura de las investigaciones C.
H. Li haba finalizado la determinacin de la humana y el grupo de Qumica Biolgi-
ca las de origen bovino, ovino y equino. El estudio comparativo mostr un alto grado
de homologa entre ellas y no revel diferencias a las que pudiera atribuirse la falta
de actividad en humanos de las hormonas bovina, ovina y equina.

hGH:XFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQT
bGH:AAMSGAVQHAFKRTEGRIXTV
oGH:AAMSGAVQHAFKRTEGRIXTV
eGh:XAMPSAVQHAKREGRIXAA

hGH:SLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANS
bGH:AFTATGKNAEDQXGXT
oGH:AFTATGKNAEDQXGXT
eGH:AFTPATGKNARDMEFGLXT

hGH:LVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNS
bGH:FTRXEKLARETALDM
oGH:FTRXEKLAREVALDM
eGH:FTRXEKRARERALDL

hGH:HNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRXSVEGSCGF
bGH:RSSLHTYVMKRRFGAA
oGH:RSSLHTYVMKRRFGAA
eGH:RSSKKLHAYVMKRRFSSA

Los residuos idnticos se indican con guiones y los residuos faltantes con X.

103
 3.6 Influencia de la modificacin qumica de algunos residuos de
las distintas hormonas de crecimiento sobre su comportamien-
to inmunolgico.
La incorporacin de Zakin, inmunlogo proveniente del Instituto Pasteur de Pars,
motiv la aplicacin de esa disciplina al estudio de las diferencias entre las hormo-
nas estudiadas.
Se comprob que la modificacin de cistena, metionina, triptfano y tirosina, en las
hormonas humana y equina, tienen poca influencia sobre la respuesta inmunolgi-
ca al suero de conejo, en cambio, la bovina es muy sensible a la modificacin de cis-
tena, metionina y triptfano, pero no as a la de tirosina.

Publicaciones

Conformacin molecular
H-exchange behaviour and extent of reversible conformation changes in human, bo-
vine, ovine, porcine and equine growth hormones. C.L. Cambiaso, L.A. Retegui, J.M.
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Prediccin de estructura secundaria

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Zakin, E. Poskus, J.M. Dellacha, A.C. Paladini, J.A. Santom. FEBS Lett., 25: 77 (1972).
Isolation, purification and characterization of equine growth hormone. R.D. Con-
de, A.C. Paladini, J. A. Santom, J.M. Dellacha. Eur. J. Biochem., 32: 563 (1973).
The amino acid sequence of equine growth hormone. M.M. Zakin, E. Poskus, J.M.
Dellacha, A.C. Paladini, J.A. Santom. FEBS Lett., 34: 353 (1973).

106
 Primary structure of equine growth hormone. M.M. Zakin, E. Poskus, A.A. Lang-
ton, P. Ferrara, J.A. Santom, J.M. Dellacha, A.C. Paladini. Intl. J. Peptide Protein Res.
Vol. 8: 35-444 (1976).
Somatotropin-horse. M.M. Zakin, E. Poskus, A.A. Langton, P. Ferrara, J.A. San-
tom, J.M. Dellacha, A.C. Paladini. Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol.5,
Suppl.2, p. 138 (1976).
An Equine growth hormone molecular species lacking the 76-92 peptidic fragment
O. Cascone, J.G. Fukushima, V. Mihajlovich, J.A. Santom and M. Biscoglio. Int. J. Pep-
tide Protein Res. 39:397-400 (1992).

Estudios inmunolgicos
Influence of some chemical treatments on the inmunological properties of various
mammalians growth hormones. M.M. Zakin, E. Poskus, A.C. Paladini, J.M. Dellacha,
J.A. Santom. Inmunochemistry 12: 125-129 (1975).

TESIS DOCTORALES

Estudios conformacionales
ESTUDIO SOBRE LA HORMONA DE CRECIMIENTO BOVINA. Isidoro Faiferman,
1967. Director Alejandro C. Paladini. Calificacin: Sobresaliente
LA MEDIDA DEL INTERCAMBIO DE HIDRGENOS EN DISTINTAS HORMONAS DE
CRECIMIENTO Y LA RELACIN ENTRE LA ESPECIFICIDAD DE ESPECIE Y LA CON-
FORMACIN DE SUS PROTENAS. Csar L. Cambiaso. 1971. Director Alejandro C.
Paladini. Calificacin: Sobresaliente.

Estudios fisicoqumicos y purificacin de hormonas

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO OVI-
NA. Mara Amelia Enero. 1971. Director Juan M. Dellacha. Calificacin: Sobresaliente.
AISLAMIENTO, PURIFICACIN Y CARACTERIZACIN DE LA PROLACTINA OVI-
NA Rubn D. Conde. 1972. Director Juan M. Dellacha. Calificacin: Sobresaliente.

Estructura primaria
ESTUDIO QUMICO Y ESTRUCTURAL DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO BO-
VINA. Carlota E.M. Wolfenstein, 1967. Director Jos A. Santom. Calificacin Sobre-
saliente.
ESTUDIO DE LA ESTRUCTURA DEL EXTREMO AMINO-TERMINAL DE LA HOR-
MONA DE CRECIMIENTO BOVINA. Clara Pea, 1972. Director: Jos Alberto Santo-
m. Calificacin Sobresaliente
LOCALIZACIN E IMPORTANCIA BIOLGICA DEL RESIDUO DE TRIPTOFANO
PRESENTE EN LA HORMONA DE CRECIMIENTO BOVINA. Mirtha J. Biscoglio, 1972.
Director: Jos Alberto Santom. Calificacin Sobresaliente.

107
 ESTRUCTURA PRIMARIA DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO BOVINA. ESTU-
DIOS SOBRE UNO DE SUS PUENTES DISULFURO. Edgardo Poskus, 1972. Director:
Jos Alberto Santom. Calificacin Sobresaliente.
ESTRUCTURA PRIMARIA DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO BOVINA: ESTU-
DIO DE LOS PPTIDOS POCO SOLUBLES EN LOS SOLVENTES CONVENCIONALES.
Silvia Teresa Daurat, 1974. Director: Jos Alberto Santom. Calificacin Sobresaliente.
ESTUDIOS ESTRUCTURALES SOBRE LA HORMONA DE CRECIMIENTO OVINA.
SECUENCIA DE AMINOACIDOS. Horacio N. Fernndez, 1974. Director J.A. Santom.
Calificacin Sobresaliente.
APLICACIN DE ANTICUERPOS ANTI-HAPTENES EN EL ESTUDIO DE LA ESTRUC-
TURA Y FUNCIN DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO BOVINA. Cristina Nowicki,
1981. Director: Jos Alberto Santom. Calificacin Sobresaliente.
CONFERENCIAS INTERNACIONALES SOBRE bGH DICTADAS POR EL GRUPO DE

108
QUMICA BIOLGICA DE BUENOS AIRES.

Ao Orador Lugar Ttulo

1965 J.M. Dellacha VI Congreso Panamericano de Estudios fisicoqumicos
Endocrinologa. Mxico sobre la hormona de
crecimiento bovina.
1966 J.M.Dellacha New York Academy of Sciences. Physicochemical and
New York, USA structural studies on bovine
groth hormone.
1967 J.A. Santom Instituto G. Maraon. Madrid, Estructura y funcin de
Espaa protenas.
1967 J.A. Santom Instituto de Qumica Biolgica. Structural studies on bovine
Univ. de Npoles. Npoles. Italia growth hormone.
1967 J.A. Santom Universidad Rockefeller. Nueva Structural studies on bovine
York, USA growth hormone.
1967 J.A. Santom Laboratorio de Investigaciones Structural studies on bovine
Monsanto. St. Louis, USA growth hormone.
1967 J.A. Santom Departamento de Structural studies on bovine
BioqumicaUniv. de Emory. growth hormone.
Atlanta, USA
1967 J.A. Santom Inst. de Qumica Biolgica. Fac de Structural studies on bovine
Ciencias. Marsella. Francia growth hormone.
1970 A.C. Paladini Miami Winter Symposia Biochemical and
conformational studies on
growth hormones.
1971 J.A. Santom Fac. de Qumica y Farmacia Univ. Estructura y funcin de
Nac. de Asuncin. Paraguay protenas.
1971 J.A. Santom Inst. de Ciencias U. N. de Estructura de protenas.
Asuncin. Paraguay Hormona de Crecimiento.
1972 J.A Santom II International Symposium on Structural studies on bovine
Growth Hormone. Miln. Italia growth hormone.
1972 J.M. Dellacha IV International Congress of Structural studies on bovine
Endocrinology. Washington, USA growth hormone.
1972 J.M. Dellacha Laboratorio de I & D Upjohn Physicochemical studios on
Kalamazoo. USA. bovine growth hormone.
1973 J.A. Santom Dep.de Bioq. y Fisiologa. U. N Estructura primaria de la
Mayor de San Marcos. Lima. Per hormona de crecimiento
bovina.
1978 J.M. Dellacha 1 Jornada de la Soc. Argentino Unin especfica in vivo
Hispnica de Medicina y Ciencias de 125 I Hormonas de
Afines. Madrid, Espaa Crecimiento Bovinas.
1979 J.M. Dellacha VII Congreso Latinoamericano de Estudios Estructurales
Soc. de Biol. y Med. Nuclear Vias de 125 I Hormona de
del Mar, Chile Crecimiento Bovina
1981 J.A. Santom III Reunin Regional de PAABS Hormona de Crecimiento
Cono Sur. Caxamb. Brasil Relacin entre estructura y
funcin

109
 III INVESTIGACIONES SOBRE HORMONAS DE CRECIMIENTO
POSTERIORES A 1976 | Divisin del grupo de Qumica Biolgica de
la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA

Hasta 1976, los profesores titulares de los tres cursos de Qumica Biolgica, Pala-
dini, Dellacha y Santom, trabajaron en colaboracin, pero en esa fecha, cada uno
de los subgrupos que dirigan encaraba problemas tan distintos del estudio de las
hormonas de crecimiento, que resultaba difcil conducir en conjunto todas la lneas
de trabajo y las ideas no siempre coincidan. Por tal motivo, consideraron conve-
niente que cada uno de los profesores dirigiera a su grupo en forma independiente.
Convinieron redistribuir a los colaboradores para que cada uno tuviera a su cargo
un nmero equivalente. A los colaboradores C. Pea, E. Poskus y M. Zakin, les co-
rrespondi trabajar con Paladini; mientras que H. Fernndez y D. Turyn colabora-
ran con Dellacha, adems, Fernndez continuara los trabajos que estaba realizan-
do con Santom.

1. GRUPO DIRIGIDO POR PALADINI

Trabaj principalmente en inmunologa de las hormonas de crecimiento y en la de-

teccin de sus receptores celulares. Adems sintetiz fragmentos hormonales y estu-
di las caractersticas de la hormona marcada con yodo radioactivo.

1.1 Estudios inmunolgicos

1.1.1 Deteccin de zonas inmunolgicas en las hormonas de crecimiento humana,

bovina y equina.
Mario Zakin con el propsito de adquirir experiencia en qumica de protenas haba
participado activamente en la determinacin de la estructura primaria de la eGH e
iniciado la aplicacin de sus conocimientos inmunolgicos al estudio de las hormo-
nas de crecimiento. Cuando a partir de 1976 se incorpor al grupo de Paladini, jun-
to con Edgado Poskus, contino hasta su regreso al Instituto Pasteur con esa lnea de
trabajo, asociada con qumica proteica. Con el grupo de Paladini obtuvo fragmen-
tos peptdicos de la eGH mediante su escisin con bromuro de ciangeno y determi-
n la actividad inmunolgica de los fragmentos frente a antisuero de conejo contra
la hormona nativa. Comprobaron que la mayor actividad antignica corresponda al
fragmento 73-123, por ellos purificado, homlogo al 86-123 de la oGH y al fragmen-
to 73-123 de la hGH. Comprobaron que los tres segmentos peptdicos poseen acti-
vidad inmunolgica equivalente frente a antisueros contra hGH. Con este hallazgo

110
comprobaron la reactividad inmunolgica cruzada de las tres hormonas, e incluso,
del fragmento 87-124 de la bGH.

1.1.2. Deteccin de anticuerpos contra hormonas de crecimiento humana, bovina y

equina en pacientes tratados con hGH.
La inmunidad cruzada que revelaron fragmentos equivalentes de las cuatro hormo-
nas de crecimiento mencionadas, frente a antisueros contra la humana, indujo a sos-
pechar que el suero de los nios tratados con hGH podan poseer anticuerpos capa-
ces de reaccionar con bGH, oGH y eGH.

1.1.3 Obtencin de anticuerpos monoclonales y su aplicacin.

El grupo de Paladini obtuvo anticuerpos monoclonales contra hGH y bGH los cuales
tambin mostraron reaccin cruzada con distintas hormonas de crecimiento.

1.2 Receptores

En el anexo E se describen algunos conceptos sobre receptores. En 1977 los grupos

de Paladini y Dellacha inyectaron ratas con hormona marcada con C14 para medir
su localizacin en los distintos tejidos y comprobaron que se fijaba preferentemente
en hgado y rin. Al ao siguiente el grupo de Paladini aisl de microsomas de h-
gado de rata, la hGH marcada con I125 unida a un receptor. Estudi las caracters-
ticas del complejo y comprob que la unin es inhibida por hormonas lactognicas
(estimulantes de la produccin de leche) pero no por las somatognicas (estimulan-
tes del crecimiento). Por consiguiente la bGH que solo tiene actividad somatognica
no compite en esas condiciones con la hGH que posee ambas. No detectaron recep-
tores somatognicos. Tambin comprobaron que la hGH marcada se une a microso-
mas de rin de coneja.
No detectaron correlacin entre la actividad de crecimiento de la bGH, en ratas hi-
pofisoprivas y la capacidad de esta hormona de unirse in vitro a receptores hepti-
cos, posiblemente porque en esas condiciones de reaccin solo detectaban recepto-
res lactognicos.

Publicaciones

Estudios inmunolgicos
Detection of immunologically active zones in equine growth hormone. Poskus E, Za-
kin MM, Fernndez HN, Paladini AC. Eur J Immunol. 6:409-17(1976).
Immunological properties of two related fragments from human and equine growth
hormones. Zakin MM, Pea C, Poskus E, Stewart JM, Paladini AC. Eur J Immunol.
7:701-4 (1977).

111
 Immunologically active zones in bovine growth hormone. Ferrara P, Zakin MM,
Pea C, Paladini AC. Eur J Immunol. 9:1020-3 (1979).
A relevant antigenic site in human growth hormone localized in sequence 98-128.
Pea C, Poskus E, Paladini AC. Mol Immunol. 17:1487-91 (1980).
Preparation of 125I-labeled human growth hormone of high quality binding proper-
ties endowed with long-term stability. Biscayart PL, Paladini AC, Vita N, Roguin LP. J
Immunoassay. 10:37-56 (1989).
Human, bovine, and equine growth hormone antibodies in patients treated with hu-
man growth hormone. Poskus E, Pea C, Prez AR, Vita N, Heinrich JJ, Paladini AC. J
Clin Endocrinol Metab. 55:13-7(1982).
Specificities of antibodies to human growth hormone (hGH) in patients treated with
hGH: longitudinal study and comparison with the specificities of animal antisera. Re-
tegui LA, Masson PL, Paladini AC. J Clin Endocrinol Metab.60:184-90 (1985).
Antibodies against animal growth hormones appearing in patients treated with hu-
man growth hormone: their specificities and influence on growth velocity. Prez AR,
Pea C, Poskus E, Paladini AC, Domen HM, Martnez AS, Heinrich JJ. Acta Endocri-
nol (Copenh).110:24-31(1985).
Epitopes in human growth hormone and chorionic somatomammotropin studied
with monoclonal antibodies. Vita N, Poskus E, Pea C, Prez AR, Paladini AC. Arch
Biochem Biophys. 225:436-45(1983).
Heteroclitic behaviour of some monoclonal antibodies against bovine growth hor-
mone. Retegui LA, Paladini AC. Mol Immunol. 23:119-2(1986).
Stochastic humoral expression of human growth hormone epitopes. Etcheverrigaray
M, Paladini AC, Retegui LA. Immunology. 63:595-601(1988).
Receptores
Rate of concentration and digestion of radioactive growth hormone preparations in-
jected in rats, as measured by the amount and nature of radioactivity in the tissues.
Retegui-Sardou LA, Scaramal LO, Dellacha JM, Paladini AC. Mol Cell Biochem. 16:87-
96 (1977).
Solubilization of the lactogenic receptors from rat liver microsomes. Bonifacino JS,
Snchez SH, Paladini AC. Biochem Biophys Res Commun. 85:62-9 (1978).
Characterization of human somatotropin binding to detergent-solubilized lacto-
genic receptors from rat liver. Bonifacino JS, Snchez SH, Paladini AC. Biochem J.
194:385-94 (1981).
Human somatotropin binding to rabbit kidney microsomal fraction. Roguin LP,
Snchez SH, Bonifacino JS, Paladini AC. Biochem J. 200:257-64(1981).
Effect of the incomplete separation of bound and free ligand on binding measure-
ments. Bonifacino JS, Paladini AC. Anal Biochem. 1981 Dec;118(2):213-20 (1981).
Formation of complexes between 125I-labelled human or bovine somatotropins and
binding proteins in vivo in rat liver and kidney. Bonifacino JS, Roguin LP, Paladini AC.
Biochem J. 214:121-32(1983).

112
 Properties of human growth hormone binding sites solubilized from female rab-
bit kidney. Roguin LP, Bonifacino JS, Paladini AC. Biochim Biophys Acta. 715:222-
9 (1982).
Specificity of covalently stabilized complexes of 125I-labeled human somatotropin
and components of the lactogenic binding sites of rat liver. Caamao CA, Fernandez
HN, Paladini AC. Biochem Biophys Res Commun. 115:29-37 (1983).
Binding in vitro to rat liver receptors does not correlate with activities in vivo of bo-
vine somatotropin. Use of chemically modified derivatives as probes. Roguin LP, Delfi-
no JM, Vita N, Paladini AC. Biochem J.224:535-40 (1984).
Otros estudios:
Human growth hormone active site for membrane cooperative enzymes. Faras RN,
Uates LE, Moreno H, Pea C, Paladini AC. Biochem Biophys Res Commun. 85:85-91
(1978).
Synthesis and properties of human growth hormone fragments. Pea C, Stewart
JM, Ferrara P, Paladini AC. Int J Pept Protein Res.18:289-96 (1981).
Molecular biology of growth hormone. Paladini AC, Pea C, Poskus E. CRC Crit Rev
Biochem.15:25-56 (1983).
Proteolytic modification of growth hormone by a rat kidney lysosomal protease
Retegui LA, Scaramal LO, Paladini AC. Acta Physiol Pharmacol Latinoam. 37:521-32
(1987).

2. GRUPO DIRIGIDO POR DELLACHA

2.1 Marcacin de hormonas de crecimiento con radioactivos.

Aplicaron las tcnicas de marcacin de hGH y bGH con molculas radiactivas que
pusieron a punto a mediados de los 70. Con la bGH marcada con C14 estudiaron su
distribucin tisular en ratas, midiendo la concentracin y los productos de digestin
radiactivos en diferentes tejidos.
Utilizaron las hormonas humana y bovina marcadas con I125 para radio-inmuno-
ensayos y para realizar estudios de unin a receptores, tanto in vitro como in vivo.

2.2 Receptores
Al referirnos a los trabajos del grupo de Paladini mencionamos que junto con De-
llacha, en 1977, comprobaron que inoculando ratas con hGH marcada con carbono
radioactivo, la radioactividad se detecta principalmente en hgado y rin, y que,
adems, que el grupo de Paladini demostr que los receptores mitocondrales de h-
gado son de naturaleza lactognica en las condiciones de la experiencia.
En 1983, el grupo dirigido por Dellacha demostr que el hgado de rata tambin tie-
ne receptores somatognicos porque fija bGH marcada con I125 y que esa fijacin se
reduce significativamente cuando compite con un exceso de bGH sin marcar, hor-

113
 mona que solo tiene actividad de crecimiento.
En 1985 confirm, en hepatocitos aislados de ratones macho, que la hGH marcada
con yodo radioactivo se une especficamente a receptores lactognicos y somatog-
nicos y que los primeros se revelan en un medio conteniendo iones calcio y magne-
sio, mientras que los segundos se detectan en ausencia de esos iones.
El grupo realiz, adems, estudios estructurales y de caracterizacin biolgica e in-
munolgica de las protenas asociadas a los receptores.
Dellacha desde 1976 hasta 1990, en calidad de Profesor Visitante en el Departamen-
to de Fisiologa del Instituto de Biociencias de la Universidad Federal de Rio Gran-
de do Sul, Porto Alegre, Brasil, dict clases y realiz investigaciones con la Prof.
Mara Marques y sus colaboradores. Producto de esta interaccin publicaron 10 tra-
bajos de investigacin, 2 de ellos sobre hGH y el resto sobre insulina, tema que De-
llacha incluy en sus investigaciones pero cuyas publicaciones y tesis dirigidas no fi-
guran en este libro.
Invitado por el investigador R.S. Bartke de la Southern Illinois University de Estados
Unidos realiz, en colaboracin, investigaciones sobre receptores somatotrpicos y
lactotrpicos de hormona de crecimiento en ratones transgnicos.

Publicaciones

Marcacin de hormonas de crecimiento con radioactivos.

Specific binding of human and bovine growth hormones to hypophysectomized rat
hepatocytes. Turyn D, Santom JA, Dellacha JM, Stringa de Muzzio IG, Domergasso
CS. Acta Phys. Lat. 26: 395-402 (1976).
Rate of concentration and digestin of radioactive growth hormone preparations in-
jected in rats, as mesured by de amount and nature of radioactivity in tisssues. Rete-
gui-Sardou LA, Scaramal IO, Dellacha JM, Paladini AC. Mol. Cell Biochem. 16: 87-96
(1977).

Receptores
Specific binding of iodinated growth hormone to rat liver in vivo. Turyn D, Dellacha
JM. Endocrinology 103:1190-5 (1978).
Structural characterization of iodinated bovine growth hormone. Matera R, Turyn
D, Fernndez HN, Dellacha JM. Intl. J. Peptide Prot. Res. 19: i72-80 (1982).
Biological and immunological characterization of iodinated bovine groth hormo-
ne. Matera R, Dellacha JM, Intl. J. Peptide Prot. Res. 19, 181-6 (1982).
Influence of divalent cations on the detection of somatogenic and lactogenic binding
sites in the Mouse liver cells. Ciccia-Torres GN, Dellacha JM. Biochem. J. 228: 761-4
(1985).
Proteins associated with somatogenic and lactogenic receptors in microsomal mem-

114
branes and intact rat hepatocytes. Robetto EJ, Caamao CA, Fernndez HN, Dellacha
JM. Biochim. Biophys. Acta 1013: 223-30 (1989).
Distribution and specific binding in vivo of iodinated growth hormones in the turt-
le Chrysemys dorbigni. Marques M, Silva RS, Turyn D, Dellacha JM. Gen Comp Endo-
crinol, 37:487-92 (1979).
In vivo effect of temperature on the specific liver uptake and renal degradation of la-
beled human growth hormone in turtle Chrysemys dorbigni.Turyn D, Marques M, De-
llacha JM. Gen Comp Endocrinol. 44: 171-6 (1981).
Somatotropic and lactotropic receptors in transgenic mice expressing human or bovi-
ne growth hormone genes. Aguilar RC, Fernndez HN, Dellacha JN, Calandra RS, Bar-
tke A, Ghosh PK, Turyn D. Transgenic Res 1:221-7 (1992).
Identification of somatogenic binding sites in liver microsomes from normal mice and
trangenic mice expressing human growth hormone gene. Aguilar RC, Fernndez HN,
Dellacha JN, Calandra RS, Bartke A, Turyn D. Life Sci 50:615-20 (1992).

TESIS DOCTORALES

ESTUDIO ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE LA IODO HORMONA DE CRECIMIEN-

TO BOVINA. Rafael Matera, 1982. Director: J.M. Dellacha. Calificacin: Sobresaliente.
SITIOS DE UNIN ESPECFICOS PARA LA HORMONA DE CRECIMIENTO HUMA-
NA EN HGADO DE RATN. Graciela Ciccia-Torres, 1985. Director: J.M. Dellacha. Ca-
lificacin: Sobresaliente.
CARACTERIZACIN DE LOS RECEPTORES LACTOGNICOS Y SOMATOGNICOS
DE HEPATOCITOS AISLADOS DE RATA MEDIANTE UN DERIVADO FOTO-REACTIVO
DE SOMATOTROFINA HUMANA Eduardo Robetto, 1989. Director: J.M. Dellacha. Ca-
lificacin: Bueno.

3. GRUPO DIRIGIDO POR SANTOM

3.1 Hormona de crecimiento de alpaca.

Los estudios sobre la estructura primaria de esta hormona se realizaron con el apo-
yo de un Programa PNUD/UNESCO destinado a fomentar la relacin entre investi-
gadores latinoamericanos. Participaron los siguientes laboratorios:
Departamento de Qumica Biolgica de la Facultad de Farmacia y Bioqumi-
ca de la Universidad de Buenos Aires. Investigadores J.A. Santom, M.J. Bis-
coglio, O. Cascone, C. Pea y P. Ferrrara.
Instituto de Bioqumica y Nutricin de la Universidad Nacional Mayor de
San Marcos, Lima, Per. Investigadores M. Villavicencio, I.F. Arnao de Nu,
D. Snchez, R. Or, y J. Capdevielle.
La hormona se obtuvo de hipfisis de alpaca (Lama pacos) el primer miembro del

115
 infraorden Tylopoda. Vive en la Cordillera de los Andes entre 4.500 y 5.500 metros
de altura.

3.2 Aportes al conocimiento de la conformacin molecular y de-

terminacin de la importancia biolgica de los distintos amino-
cidos de las hormonas de crecimiento.

3.2.1 Modificacin qumica de aminocidos.

Durante varios aos, investigadores de distintos laboratorios internacionales inten-
taron cristalizar las hormonas de crecimiento obtenidas de hipfisis sin conseguirlo;
posiblemente, debido a que las hormonas aisladas no eran totalmente homogneas
por poseer cierto porcentaje de molculas que diferan de las restantes por la falta de
algn residuo de aminocido o por su reemplazo por otro. Como ejemplo menciona-
remos que en la mitad de las molculas nativas de las hormonas bovina y ovina falta
la alanina N-terminal y que el grupo de Qumica Biolgica demostr que el 30 % de
las molculas de bGH tiene valina en lugar de leucina en la posicin 125.
Ante el desconocimiento de la estructura terciaria de las hormonas de crecimiento,
el grupo de Santom, con la colaboracin de M. Biscoglio, S. Daurat, H. Fernndez y
C. Wolfenstein, y la incorporacin de Osvaldo Cascone, Cristina Nowicki, Jos Ma-
ra Delfino, Mario Ermcora y Perla Kaliman, decidi contribuir al conocimiento de
la conformacin molecular de esas hormonas, mediante modificaciones qumicas.
Para ello tuvieron en cuenta que varios residuos de aminocidos de las protenas po-
seen grupos qumicos susceptibles de reaccionar frente a reactivos especficos y que
esas reacciones son posibles cuando esos residuos estn ubicados en regiones mole-
culares a las que pueden llegar esos reactivos. Por consiguiente, los residuos de ma-
yor accesibilidad son los que sufren un mayor grado de reaccin, es decir los que se
modifican en mayor porcentaje. En realidad, esto es vlido cuando los reactivos son
hidroflicos y no se cumple con los hidrofbicos, capaces de penetrar en regiones mo-
leculares no accesibles a los solventes acuosos. Lgicamente, es fundamental que las
condiciones de las reacciones qumicas no alteren la conformacin de las molculas.
Los siguientes son los residuos de aminocidos susceptibles de ser modificados qu-
micamente: N-terminal, C-terminal, Tirosina, cido asprtico, cido glutmico, Li-
sina, Arginina, Metionina, Histidina y Cistena.

3.2.1.1 Identificacin de los residuos modificados y determinacin del porcentaje

de modificacin.
En general, con el objeto de lograr una modificacin gradual de cada residuo, hicie-
ron reaccionar las hormonas de crecimiento con los reactivos especficos, variando
el tiempo de reaccin o la concentracin del reactivo. Para identificar los residuos
modificados en cada caso, digeran con enzimas proteolticas a las protenas modifi-
cadas y aislaban cada uno de los pptidos obtenidos. La determinacin de la compo-

116
sicin en aminocidos de los pptidos resultantes les permita establecer su posicin
en la molcula de la hormona y, en aquellos pptidos que contenan los residuos mo-
dificables, establecer el porcentaje de modificacin.

3.2.1.2 Modificacin qumica de aminocidos y actividad biolgica.

La obtencin de hormonas de crecimiento con distintos grados de modificacin qu-
mica, les permiti determinar si los distintos aminocidos modificados alteraban
el reconocimiento de los receptores celulares y la expresin de la actividad biolgi-
ca. Lgicamente, para dar validez a los resultados obtenidos, tenan que asegurarse
que las condiciones de reaccin no alteraban la conformacin molecular. Recurran
para ello a procedimientos tales como las medidas de dicrosmo circular en el ultra-
violeta lejano y cercano, capaz de detectar variaciones en hlices-, cadenas- y es-
tructura terciaria.

3.3 Modificacin qumica de distintos residuos.

3.3.1 Formacin de subgrupos de investigacin.

A esta altura de las investigaciones, Biscoglio, Daurat, Fernndez y Wolfenstein, ha-
ban aprobado sus tesis doctorales y estaban en condiciones de co-dirigir lneas de
investigacin. Se les asign la realizacin de las siguientes modificaciones qumicas:
Lisinas: M. Biscoglio.
Tirosinas y triptfano: S. Daurat.
cidos glutmicos y asprticos: H. Fernndez.
Argininas: C. Wolfenstein.
Posteriormente otros colaboradores tambin adquirieron la experiencia requerida
para co-dirigir investigaciones, por lo cual se les asign responsabilidad en la reali-
zacin de otras modificaciones qumicas:
Introduccin de haptenos y obtencin de anticuerpos: C. Nowicki.
Metioninas: O. Cascone, colaborando con M. Biscoglio.
Histidinas: O. Cascone, colaborando con M. Biscoglio.
Determinacin de la proximidad de residuos unindolos con reactivos qu-
micos bifuncionales: C. Nowicki, M. Ermcora y C. Wolfenstein.
La determinacin de la accesibilidad de los distintos aminocidos a los reactivos es-
pecficos permiti que el grupo elaborara modelos de conformacin molecular de
las hormonas de crecimiento.

NOTA ACLARATORIA. A continuacin de la descripcin de cada una de las modifi-

caciones qumicas realizadas en el Departamento de Qumica Biolgica, se harn co-
mentarios sobre la validez de los resultados frente a los conocimientos estructurales ac-
tuales. Para facilitar la comprensin de esos comentarios, en el anexo D se describen
brevemente los conocimientos actuales.

117
 3.3.2 Modificacin qumica de lisinas
Biscoglio y colaboradores comenzaron con hormona de crecimiento equina. Utiliza-
ron cido 2,4,6-trinitrobenceno sulfnico que reacciona con el grupo -amino del
residuo N- terminal y con los grupos -amino de las lisinas.
Utilizaron distintos tiempos de reaccin para estudiar el efecto de la modificacin
gradual de esos residuos sobre el crecimiento de ratas hipofisoprivas y sobre la con-
formacin molecular controlada por dicroismo circular.
El residuo N-terminal fue el que mostr mayor reactividad, seguido por las lisinas
179, 156, 143, 63 y 165. No pudieron establecer una correlacin entre la modifica-
cin de cada residuo y la prdida de actividad biolgica debido a que sta se pierde
por la nitracin parcial del conjunto de residuos. No obstante, dedujeron que el re-
siduo N-terminal y la lisina 179 no son importantes para la actividad biolgica. En
cambio, observaron una cierta correlacin entre la nitracin de la lisina 156 y la per-
dida de actividad de crecimiento.
Con la intencin de aclarar la participacin de la lisina 156 resolvieron estudiar el
efecto de la trinitrofenilacin en la hormona de crecimiento bovina. El residuo N-
terminal tambin fue el ms reactivo, seguido en orden decreciente por las lisinas
178, 142, 64, 112, 169 y 165. Estos resultados coincidieron con los de la hormona
de crecimiento equina, excepto que la lisina 156 no se trinitrofenila en la hormo-
na bovina.
Nowicki contribuy a estudiar los efectos de la modificacin de los grupos amino,
carbamilando la hormona de crecimiento bovina en condiciones de asegurar la to-
tal reaccin del grupo N-terminal. Tambin se produjo la carbamilacin del 28% de
la lisina 179 y del 7 % de la lisina 143.
La hormona as modificada retuvo una importante actividad de crecimiento y fue tan
activa como la nativa en el ensayo de competicin in vivo por los receptores de h-
gado de rata. Sin embargo, tuvo que producirse algn cambio conformacional por-
que la lisina 69 que habitualmente reaccionaba poco con el cido trinitrobenceno
sulfnico, lo hizo fcilmente en la hormona carbamilada, con total destruccin de la
capacidad de unin a los receptores celulares y de la actividad promotora de creci-
miento. Este resultado sugiri la importancia de la lisina 69 en la actividad biolgica.

Discusin de los resultados aplicando los conocimientos actuales.

La determinacin de la estructura terciaria de las hormonas de crecimiento (ver
cuadro de interaccin de cadenas laterales y esquema de estructura terciaria)
confirm que:
El residuo N-terminal y las lisinas 63 y 143 de la eGH, 64, 70 y 142 de la bGH
estn expuestas al solvente, sin integrar las hlices-.
La lisina 69, sugerida como importante para la actividad biolgica, est ubi-
cada en el extremo del sitio 1 de reconocimiento del receptor, al cual debe alte-
rar cuando se trinitrofenila.

118
 Las lisinas 63, 165 y 179 de la eGH, 112, 165, 169 y 178 de la bGH, tambin se
trinitrofenilaron, aunque en menor grado, a pesar de integrar hlices-, porque
stas, si bien tienen una cara hidrofbica con residuos que interactan fuerte-
mente entre s formando el ncleo hidrofbico de la molcula, esas lisinas estn
ubicadas en la cara hidroflica, en contacto con el solvente.
La trinitrofenilacin parcial de las lisinas 156, 165 y 179 de la eGH, en conjun-
to, justifica la prdida de actividad biolgica por que estn ubicadas en el sitio 1
de unin de la hormona al receptor.

Sitio 1
Sitio 2

Diagrama de la estructura de la hGH sealando los sitios I y II de unin al receptor.

N: Residuo N-terminal; C: Residuo C-terminal; I, II, III y IV: Hlices .
Estn indicados los residuos iniciales y terminales de cada hlice.

3.3.3 Modificacin de tirosinas y triptfano.

Los primeros estudios que realiz el grupo de Santom sobre la modificacin e im-
portancia biolgica de esos residuos se realizaron con la principal participacin de
Daurat y Moya Portuguez, pasante de la Ciudad Universitaria Rodrigo Facio de
Honduras.
Las hormonas de crecimiento bovina y equina tienen el triptfano en posicin 85 y
las tirosinas en las posiciones: 35, 42, 109, 141, 158 y 174. Con tetranitrometano mo-
dificaron el 55-60 % del triptfano, el 38-100 % de la tirosinas 35, 42, 109, 141 y 174
sin alterar la actividad de crecimiento ni la capacidad antignica. La inaccesibilidad
de las tirosinas 28 y 158 al tetranitrometano no permitieron determinar su impor-
tancia en la actividad biolgica.
Teniendo en cuenta que el tetranitrometano, por su naturaleza hidrofbica no es un
reactivo adecuado para determinar la accesibilidad de las tirosinas, la becaria Blum-
grund acetil las tirosinas de la bGH con N-acetilimidazol, previa proteccin de las
lisinas mediante su amidinacin. Todas las tirosinas se acetilaron, incluso la 158, en
un porcentaje que vari entre 24 y el 81%. Estos resultados y los anteriores permi-
tieron postular que todas las tirosinas son accesibles al solvente y que la integridad
de las mismas no es indispensable para la actividad promotora de crecimiento de las
hormonas bovina y equina.
Otros autores (Ma L., Brovetto-Cruz J. y Li, C.H., 1971, Biochem. Biophys. Acta 229,
444-450; Kawauchi, H. y Li, C.H. Arch. Biochem. Biophys. 165: 255-262) haban in-

119
 formado que la modificacin de las tirosinas de la hGH disminuye su actividad pro-
motora de crecimiento pero no determinaron que tirosina era responsable. El grupo
de Santom confirm esa informacin y propuso que la disminucin de la actividad
en la hGH se deba a la modificacin de las tirosinas 160 y/o 164. Esta ltima no est
presente en las hormonas bovina, ovina y equina.

Discusin de los resultados aplicando los conocimientos actuales

La determinacin de la estructura terciaria de las hormonas de crecimiento (ver
cuadro de interaccin de cadenas laterales y esquema de estructura terciaria)
confirm que:
Todas las tirosinas son accesibles al solvente porque la mayora est ubica-
da fuera de las hlices- o en el extremo de stas. Las que integran la hlice IV
no forman parte de los residuos que interaccionan para formar el core hidro-
fbico.
La tirosina 164 de la hGH, debe ser la responsable de la prdida por acetilacin
de su capacidad de reconocer los receptores, porque slo est presente en esa hor-
mona y est ubicada en el sitio 1 de reconocimiento del receptor. Las tirosinas de
las hormonas bovina y equina no son importantes para la actividad biolgica.

3.3.4 Modificacin de metioninas.

Cuando se inici el estudio de la modificacin de los residuos de metionina de la
hGH, con la principal participacin de Cascone y Biscoglio, no existan datos con-
cluyentes en la literatura. En 1972 Wallis (Wallis M., 1972, FEBS Lett. 21: 118-122)
haba informado que la carboxilacin de las 4 metioninas de la bGH produca un
derivado prcticamente inactivo y el grupo de Li (Glaser C.B. y Li C.H. 1974. Bioche-
mistry 13: 1044-1047) oxid a metionilsulfxido las metioninas 4, 123 y 148 sin al-
teracin de la actividad biolgica, pero cuando modificaba la 178 en presencia de
urea, se produca una significativa prdida de actividad.
El laboratorio de Buenos Aires seleccion cloramina-T para oxidar las metioninas
debido a su alta especificidad en ausencia de grupos sulfidrlos y a su capacidad de
ingresar en regiones hidrofbicas en ausencia de agentes desnaturalizantes como
la urea utilizada por Glaser y Li. El grupo argentino, contradiciendo los trabajos de
otros autores, demostr que la integridad de las metioninas no es indispensable para
la actividad biolgica de la hormona. Consiguieron oxidar las 4 metioninas sin alte-
rar la actividad promotora de crecimiento.

3.3.5 Modificacin de histidinas.

El principal ejecutor de esta investigacin fue el becario Fukushima que trabaj en
colaboracin con Biscoglio y Cascone. Comenzaron determinando la reactividad de
las 3 histidinas de la bGH frente al anhdrido etoxifrmico y establecieron que las
histidinas 20 y 22 tenan una cintica rpida de reaccin, mientras que la 168 lo ha-

120
ca con lentitud. La etoxiformilacin de las 3 histidinas condujo a la prdida total de
la capacidad de la hormona para competir con la hGH, marcada con iodo 125, por
los receptores de hgado de rata y que la modificacin de aproximadamente la mitad
de las histidinas de reaccin rpida produca una importante disminucin de esa ca-
pacidad. Este resultado permiti sugerir que una de ellas, o las dos, eran las respon-
sable de la prdida. La modificacin de las histidinas no produjo cambios conforma-
cionales detectables por dicrosmo circular y la hormona etoxiformilada recuper
la capacidad de reconocer los receptores de hgado, cuando se revirti la modifica-
cin por tratamiento con hidroxilamida. Anlogos resultados obtuvieron por etoxi-
formilacin de la eGH.
Con la intencin de determinar cual de las dos histidinas es importante para la ac-
tividad biolgica realizaron un estudio semejante con hGH, considerando que sta
tiene dos de sus histidinas con distinta ubicacin que las de origen bovino y equino.
La histidina ms accesible al reactivo fu la 151 que ocupa una posicin molecular
distinta a la que ocupan esos residuos de aminocidos en las hormonas de origen bo-
vino, ovino y equino. La segunda fue la 18 ubicada en la hlice-1 a semejanza de las
histidinas 20 y 22 de la bGH y 19 y 21 de la eGH. La histidina 21 de la hGH no reac-
cion en las condiciones de la reaccin.
La histidina 151, exclusiva de la hGH, no parece importante para el reconocimiento
de los receptores de hgado porque cuando se etoxiformil totalmente, la hGH con-
serv el 53 % de su capacidad de reconocer esos receptores. La histidina 18 tampoco
parece indispensable porque despus de su modificacin total la hormona conserv
el 35 % de su capacidad de unin al receptor. Este ltimo resultado llam la atencin
por que la histidina 18, aunque reemplazada por glutamina en las hormonas bovina,
ovina y equina, se encuentra en el mismo segmento molecular que las histidinas 20
y 22 de la bGH y sus equivalentes 19 y 21 de la eGH, una o ambas importantes para
reconocer al receptor.

Discusin de los resultados aplicando los conocimientos actuales

La determinacin de la estructura terciaria de las hormonas de crecimiento (ver
cuadro de interaccin de cadenas laterales y esquema de estructura terciaria)
confirm que:
La histidina 151 de la hGH es muy accesible al solvente porque est ubicada
en una regin molecular muy expuesta. Est reemplazada por una arginina en
las otras tres hormonas y es evidente su irrelevancia en la actividad biolgica.
Las cuatro hormonas tienen dos histidinas muy prximas en la hlice-I. El
grupo de Argentina demostr que las ubicadas en posicin 20 y/o 22 de la bGH
y las 19 y/o 21 de la eGH son importantes para la actividad biolgica y que la 18
de la hGH, reemplazada por glutamina en las otras hormonas, no es indispen-
sable. Es probable que la histidina 22 de la bGH y la 21 de la eGH sean las que in-
tervienen en la unin con los receptores, porque ocupan posiciones equivalentes

121
 y en esa misma posicin est la histidina 24 de la hGH. No pudieron demostrar
su importancia porque no pudo ser modificada. Puede llamar la atencin que es-
tas histidinas se encuentran en la hlice-I, que forma parte del Sitio I de recono-
cimiento del receptor y que haya variaciones en la secuencia de las hormonas de
distintas especies, pero debe considerarse lgico porque las hormonas de otros
mamferos no reconocen los receptores humanos.

3.3.6 Modificacin de grupos carboxilo.

La ejecucin de los estudios realizados sobre esta modificacin qumica estuvo a car-
go de Fernndez y el becario J. M. Delfino.
Estudiaron la reactividad de los grupos carboxilos hacindolos reaccionar con 1-etil-
3-(3 dimetilamino propil) carbodiimida en presencia de glicinametilester para ob-
tener las amidas de los amino cidos con carboxilos libres. Los grupos carboxilo que
se modificaron con mayor velocidad fueron los correspondientes a Glu 30, Glu 124,
Glu 126 y Asp 127, seguidos por Glu 66, Asp 105, Asp 150, Asp 151, Glu 184 y Phe
C-terminal.
La modificacin de aproximadamente el 20 % de los grupos carboxilos condujo a
una importante disminucin de la actividad promotora de crecimiento en ratas hi-
pofisoprivas y de la capacidad de competir con hormona marcada con I-125 por los
receptores de hgado de rata, tanto in vivo como en hepatocitos aislados. Estos in-
vestigadores sugirieron que la modificacin de la carga es la responsable porque re-
cuperaron la mayor parte de la actividad biolgica por desmetoxilacin, reaccin
que deja los glutmicos y asprticos unidos a glicina con el carboxilo libre.
Los derivados que contenan 1.5 a 2.6 carboxilos modificados conservaron la mayor
parte de la actividad biolgica, mientras que los que tenan un promedio de aproxi-
madamente 5 residuos experimentaron una brusca reduccin de la actividad. Estos
resultados indicaron que los residuos responsables estn dentro de los de reaccin
rpida. Realizaron un estudio cintico de las curvas experimentales y llegaron a la
conclusin que la prdida es la consecuencia del efecto de la modificacin acumula-
tiva de 2 o 3 carboxilos de un conjunto de 3 a 8 residuos relevantes.

Discusin de los resultados aplicando los conocimientos actuales.

La determinacin de la estructura terciaria de las hormonas de crecimiento (ver
cuadro de interaccin de cadenas laterales y esquema de estructura terciaria)
confirm que:
Los posibles residuos relevantes pueden ser el glutmico 184 y la fenilalanina
C-terminal pertenecientes al sitio-1 de reconocimiento del receptor y los glut-
micos 124 y 126 del sitio-2.

3.3.7 Modificacin de argininas.

C. Wolfenstein fue la principal responsable de la modificacin de estos residuos. Es-

122
tudiaron los efectos de la modificacin de los residuos de arginina de las hormonas
de crecimiento bovina y humana. Tal como corresponde a residuos hidroflicos, ge-
neralmente expuestos al solvente, lograron modificar por tratamiento con 1.2 ci-
clohexanediona la totalidad de los residuos de arginina, con excepcin de la 183 de
la hGH y 180 de la bGH. La modificacin produjo la prdida total de la capacidad de
unirse a los receptores de hgado de rata. La hormona humana, capaz de reconocer
receptores lactognicos, adems de los de crecimiento, dej de reconocer a ambos.
El dicrosmo circular no evidenci cambios conformacionales y la actividad biolgi-
ca se recuper eliminando los grupos unidos a las argininas. Dedujeron que la modi-
ficacin de dos argininas provoc la prdida de actividad.

Discusin de los resultados aplicando los conocimientos actuales.

Evidentemente las argininas cuya modificacin provoc la prdida de capaci-
dad de unin a los receptores deben estar en el sitio-1 o en el sitio-2. Es intere-
sante sealar que en ambas hormonas, el residuo que no se modifica se encuen-
tra en el sitio-1.

3.4 Introduccin de haptenos en el estudio de estructura y fun-

cin.
La principal ejecutora de este proyecto fue la tesista C. Nowicki. El objetivo del estu-
dio fue la introduccin de haptenos en un nico residuo de la hormona y unirlo a an-
ticuerpos antihaptenos, previamente obtenidos, para investigar la importancia de la
regin molecular bloqueada, en la actividad biolgica.
Obtuvieron bGH con su residuo N-terminal bloqueado con un grupo trinitrofenilo,
al que unieron anticuerpos especficos para ese hapteno. El derivado obtenido con-
serv la actividad promotora de crecimiento de la hormona y su capacidad de reco-
nocer los receptores celulares. Este resultado indic que el residuo N-terminal no es
fundamental para la actividad biolgica como as tampoco la regin hormonal en
contacto con el anticuerpo.
Interpretacin de los resultados aplicando los conocimientos actuales.
A pesar de que los primeros residuos de la hlice-I, que comienza en el residuo 6,
forman parte del sitio-1 de reconocimiento del receptor, el anticuerpo unido al re-
siduo N-terminal no alter la actividad biolgica. Posiblemente, la flexibilidad del
segmento constituido por los cinco primeros residuos de la hormona impidi el blo-
queo del sitio-1.

3.5 Determinacin de la proximidad de residuos unindolos con

reactivos qumicos.
Los principales responsables de la ejecucin de estas investigaciones fueron Nowic-
ki, Ermcora y Wolfenstein. La idea del proyecto consisti en la utilizacin de reac-
tivos bifuncionales, que otros autores haban utilizado en distintas molculas para

123
 determinar que grupos estaban estericamente cercanos. Su utilizacin en las hor-
monas de crecimiento permita obtener informacin relacionada con la conforma-
cin molecular, desconocida hasta entonces.
Escogieron como reactivo bifuncional al 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno con el que
lograron obtener bGH con la tirosina 173 unida a la lisina 110 por un puente cons-
tituido por el grupo qumico dinitrofenileno. Este resultado indic que la distancia
que separa esos dos residuos en la molcula es aproximadamente la de la longitud
del dinitrofenilo (3 a 5 A).
Repitieron la experiencia variando las condiciones experimentales y comprobaron
que la tirosina 173 tambin se uni con un puente dinitrofenileno a las lisinas 30 y
169. Estos resultados les permitieron inferir que las lisinas 110, 30 y 169 estn loca-
lizadas a una distancia de aproximadamente 5 A de la tirosina 173.

Discusin de los resultados aplicando los conocimientos actuales.

Los resultados obtenidos son correctos si se tiene en cuenta que la tirosina 173 de
la hGH est ubicada en la hlice-IV, prxima a la lisina 169 de la misma hlice,
cercanas a la lisina 30 de la hlice-I, la cual integra con la IV, el Sitio-1 de reco-
nocimiento del receptor. El puente entre la tirosina 173 y la lisina 110, tambin
es posible si se considera que est ubicada en el segmento de estructura poco r-
gida que une las hlices II y III.

3.6 Finalizacin de los estudios sobre hormonas de crecimiento

que realizaba el grupo de Santom.
Los trabajos mencionados, conducentes a obtener informacin sobre la conforma-
cin de la molcula de la hormona, dejaron de tener significado a partir de 1987
cuando Abdel-Meguid y col. dieron a conocer la estructura tridimensional de la hor-
mona porcina recombinante y en 1992 de Vos y col. la estructura cristalina de la hGH
unida al dominio extracelular de su receptor.

Publicaciones

Hormona de crecimiento de alpaca

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"Identification of intramolecular crosslinks in bovine growth hormone after two-step
modification with 1,5 - difluoro - 2,4 - dinitrobenzene"
Ermcora M.R., Nowicki C., Wolfenstein-Todel C. and Santom J.A.
Int. J. Peptide Protein Res. 30: 423-430 (1987).
"An approach to the three-dimensional structure of bovine growth hormone based on
chemical modification and secondary structure prediction".
Ermcora M., Cascone O., Wolfenstein-Todel C., Biscoglio de Jimenez Bonino M.J.,
Nowicki C., Rivero J.L. and Santom J.A. Arch. Biol. Med. Exp. 21 109-115 (1988).

TESIS DOCTORALES

ESTUDIO DE LA REACTIVIDAD DE LOS AMINOGRUPOS EN LA HORMONA DE

CRECIMIENTO EQUINA Y DE SU IMPORTANCIA EN LA ACTIVIDAD BIOLGICA. Os-
valdo Cascone. Director Jos Alberto Santom.
ACETILACIN DE RESIDUOS DE TIROSINA DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO
HUMANA. SU EFECTO SOBRE LA CAPACIDAD DE UNIN A RECEPTORES LACTO-
GNICOS Y SOMATOGNICOS. PERLA KALIMAN, 1990. Director: Jos Alberto San-
tom.
ESTUDIO COMPARATIVO DE LA REACTIVIDAD DE LAS TIROSINAS DE LAS HOR-
MONAS DE CRECIMIENTO BOVINA Y EQUINA HACIA EL TETRANITROMETRANO.
TESIS DE LICENCIATURA EN QUMICA. Manuel Enrique Moya Portuguez. Ciudad
Universitaria Rodrigo Facio. Honduras. Director: Jos Alberto Santom.
ESTUDIO DE LA REACTIVIDAD DE LOS RESIDUOS DE HISTIDINA DE LAS HOR-
MONAS DE CRECIMIENTO DE MAMFEROS Y DE SU IMPORTANCIA EN LA ACTIVI-
DAD BIOLGICA DE ESAS PROTENAS. Jorge Guillermo Fukushima, 1986. Directo-
ra: Mirtha Biscoglio.
MODIFICACIN QUMICA ESPECFICA DE LOS GRUPOS CARBOXILATOS DE LA
SOMATOTROFINA BOVINA. Jos Mara Delfino, 1985. Calificacin: Sobresaliente.
Director: Jos Alberto Santom.
APLICACIN DE ANTICUERPOS ANTI-HAPTENES EN EL ESTUDIO DE LA ESTRUC-
TURA Y FUNCIN DE LA HORMONA DE CRECIMIENTO BOVINA. Cristina Nowicki,
1981. Director: Jos Alberto Santom.

126
4. APORTES DE OTROS GRUPOS SIN INTERVENCIN DE PALADINI, DELLA-
CHA Y SANTOM

En las ltimas etapas de los trabajos dirigidos por Paladini, Dellacha y Santom, se
fueron formando, entre sus colaboradores, nuevos grupos de investigacin, algunos
de los cuales continuaron trabajando en temas relacionados con las hormonas de
crecimiento. A continuacin se resumen los aportes que realizaron.

4.1 Biscoglio-Cascone
Cuando Santom dej de trabajar en hormonas de crecimiento, Biscoglio y Casco-
ne constituyeron un grupo independiente que en los comienzos de su actividad con-
tinu trabajando sobre hormonas de crecimiento. Realizaron los siguientes aportes
en ese campo.
Crearon un mtodo de purificacin de pptidos que contienen histidina ba-
sado en la modificacin de esos residuos con anhdrido etoxifrmico, reacti-
vo que haban utilizado en la modificacin de las histidinas en hormonas de
crecimiento.
Utilizaron un mtodo de prediccin de homologa conformacional que per-
miti postular al fragmento 42-49 como vinculado a la especificidad de espe-
cie en la familia de las hormonas de crecimiento.
Continuaron trabajando en la determinacin de la estructura primaria de
la hormona de crecimiento de alpaca. Estudiaron los pptidos trpticos de la
hormona reducida y carbamido-metilada. Con los datos obtenidos y los resul-
tados anteriores propusieron la estructura primaria total, parcialmente basa-
da en su homologa con la hormona equina.
Estudiaron la reactividad de las metioninas de la eGH frente a cloramina-T
y comprobaron que es semejante a la de la bGH.
En colaboracin con el grupo de Retegui detectaron regiones moleculares
de la hGH reconocidas por anticuerpos monoclonales. Determinaron, ade-
ms, qu anticuerpos monoclonales interferan en la unin de la hGH con re-
ceptores lactognicos.

4.2 Fernndez- Delfino

En trabajos realizados sin la participacin de Dellacha, Paladini y/o Santom estu-
diaron el equilibrio monmero-dmero de la bGH. En otros experimentos unieron el
receptor lactognico de hgado de rata con un derivado fotoactivable de hGH.
Comprobaron que:
La tirosina 142 est involucrada en el rea de contacto.
La estabilizacin covalente del dmero diminuye fuertemente la actividad
promotora de crecimiento y la unin a receptores en hgado de rata in vivo y
en microsomas de hgado de conejo.

127
 Aportaron evidencias de que los grupos amino involucrados en la unin co-
valente no son relevantes para la actividad biolgica.
La estabilizacin covalente del dmero no altera la actividad inmunolgica
medida por radioinmunoensayo.
Determinaron la presencia de una protena asociada al receptor lactognico.

4.3 Pea
Se dedic principalmente a investigaciones que involucraban la sntesis de pptidos,
convirtindose en una reconocida especialista de nuestro pas en ese tema. Su par-
ticipacin en los estudios sobre hormonas de crecimiento se limit a los trabajos en
colaboracin con otros grupos.

4.4 Poskus
Cuando integraba el grupo de Paladini, detect anticuerpos contra hormonas de
crecimiento humana, bovina y equina en pacientes tratados con hGH. Al constituir
su propio grupo de trabajo contino trabajando en el tema, al mismo tiempo que en-
caraba otros problemas inmunolgicos y estructurales.
El grupo de Poskus comprob que mientras que los pacientes tratados con hGH pro-
ducan un elevado tenor de anticuerpos, el tratamiento con la hormona recombinan-
te no los produca. Consider muy factible que la obtencin de la hormona de hip-
fisis y su purificacin podan alterar su estructura molecular desencadenando una
respuesta inmune heterloga.

4.5 Reteghi
Anticuerpos monoclonales
Durante su estada en el laboratorio de PL Masson en la Unit of Experimental Medi-
cine, de Duve Institute (ex Institute of Cellular and Molecular Pathology, ICP), Uni-
versit Catholique de Louvain, Bruxelles, Belgique, Retegui adquiri experiencia en
la obtencin y estudio de anticuerpos monoclonales, en especial contra las hormo-
nas de crecimiento. Obtuvieron en ratones cinco anticuerpos monoclonales contra
la hGH que tambin reaccionaron con el lactgeno placentario humano y tres de
ellos con prolactina humana. Cuatro de los 5 anticuerpos no reconocieron a la bGH.
Comprobaron que:
Los anticuerpos monoclonales reconocen una regin antignica principal.
La secuencia 98-129 est involucrada en el reconocimiento de los receptores.
La misma regin de la hGH est involucrada en la unin a los receptores de
hgado de conejo y de linfocitos humanos.
A su regreso al pas continu trabajando en ese tema, al principio con el grupo de Pa-
ladini (Ver investigaciones posteriores a 1976) y poco despus con su propio grupo
de trabajo. Realiz colaboraciones con los doctores Mirtha Biscoglio, Leonor P. Ro-
guin y Natalio Vita, todos miembros del Departamento de Qumica Biolgica. Las

128
principales contribuciones fueron las siguientes:
Utiliz 20 anticuerpos monoclonales contra hGH, que cubran la totalidad
de la molcula, para establecer la topografa antignica de la hormona. Obtu-
vo esa informacin midiendo la habilidad de pares de anticuerpos monoclona-
les para unirse simultneamente o no a la hGH marcada con yodo radioactivo.
Los resultados indicaron que los epitopes estudiados ocupaban toda la super-
ficie de la hormona.
La unin de algunos anticuerpos monoclonales a la hormona le induce cam-
bios conformacionales.
Establecieron qu monoclonales se unen a la regin de reconocimiento del
receptor y cuales no estn involucrados en la unin.
Cada una de las tres hormonas lactognicas: hGH, prolactina ovina y lact-
geno placentario humano al unirse al receptor prolactnico de hgado de rata
o de clulas Nb2 (provenientes de un linfoma de rata que prolifera en presen-
cia de hormonas lactognicas) impide la unin de las otras dos. Sin embargo,
comprobaron que los sitios de unin no son exactamente los mismos.
Ubicacin molecular del sitio de unin de los anticuerpos monoclonales
En colaboracin con Pea:
Examin el comportamiento inmunolgico de fragmentos de hGH, obteni-
dos por escisiones enzimticas y qumicas y purificados por HPLC, frente a an-
ticuerpos monoclonales dirigidos contra la hormona nativa. Comprobaron in-
munocidad en los dos tercios N-terminales de la molcula y falta de ella en la
secuencia 135-191.
Estudiaron el comportamiento de fragmentos de la eGH frente a distintos
anticuerpos y comprobaron que las zonas antignicas de la hormona se en-
cuentra en las posiciones 5-72 y 73-123 y que algunos anticuerpos reconocen
pequeos pptidos tales como 52-72 y 110-123.

4.6 Turyn
En 1990, Dellacha fue invitado por el investigador norteamericano R.S. Barke de la
Southern Illinois University de Estados Unidos para realizar trabajos, en colabora-
cin, sobre receptores somatotrpicos y lactotrpicos de hormona de crecimiento en
ratones transgnicos. Turyn, tuvo una predominante participacin en los dos traba-
jos que se publicaron (Ver Grupo dirigido por Dellacha). En relacin con esa colabo-
racin Turyn se asoci con Bartke para acceder a modelos de animales transgnicos
que le permitan estudiar los efectos de altas concentraciones de hormonas de creci-
miento sobre sus efectos en el animal y sobre la actividad de la insulina.
Los ratones deficientes en hormona de crecimiento o en su receptor son enanos y
ms sensibles a la accin de la insulina, mientras que los ratones que sobreexpresan
hormona de crecimiento tienen mayor tamao corporal que los controles y son insu-
linorresistentes. Sin embargo, el aumento de tamao corporal no es tan marcado, lo

129
 que sugiere que existen mecanismos que atenan el exceso de hormona. Turyn re-
solvi estudiar esos mecanismos. Antes de mencionar sus aportes debemos recordar
que la hormona de crecimiento se une a su receptor de membrana (GHR) para des-
encadenar una respuesta y que la hormona circulante, en parte, se une con alta es-
pecificidad a una protena transportadora de la hormona, la GHBP, cuya estructura
coincide con la porcin extracelular del receptor. La GHBP funciona como modula-
dor de la actividad de la GH y disminuye la tasa de eliminacin de la hormona, au-
mentando su vida media. La GHBP tambin se encuentra asociada a membranas mi-
crosomales hepticas (MA-GHBP) donde funcionara como competidor del receptor.
El grupo de Turyn estudi la fisiopatologa del sistema GHR, GHBP y MA-GHBP
frente a elevadas concentraciones de hormona, para determinar cmo son compen-
sados esos altos niveles de hormona circulante. Realiz los aportes siguientes:
En los modelos de sobreexpresin de GH se observa mayores niveles de
GHR, MA-GHBP, GHBP circulante y mayor capacidad de unin de la hormo-
na a membranas hepticas. Esto implica que en estos modelos hay mayor can-
tidad de receptores que en los animales normales, lo que indica que la hormo-
na induce la sntesis de su propio receptor.
Ratones enanos que no expresan hormona de crecimiento, tienen prote-
na transportadora, lo que sugiere que su sntesis no es totalmente regulada
por la hormona.
Comprob que el aumento de las concentraciones de GHBP srica y de la
asociada a membranas constituye un mecanismo compensador para contra-
rrestar las altas concentraciones de GH circulante ya que disminuyen la dis-
ponibilidad de la hormona para su unin al receptor. Sin embargo, a pesar de
esa disminucin de la hormona libre, los niveles de GH circulante siguen sien-
do muy elevados en los animales que la expresan en grandes cantidades, por
lo cual consider probable que tambin existan otros mecanismos intracelu-
lares que contribuyan a atenuar las consecuencias de la alta concentracin.
Para investigar dicha posibilidad, el grupo tuvo en cuenta que la hormona de creci-
miento pertenece al tipo de hormonas que al unirse al receptor, le induce un cam-
bio conformacional que activa las quinasas denominadas JAK, las que a su vez ac-
tivan factores de transcripcin citoplasmticos denominados STATs y que stos son
los que activan en el ncleo celular la transcripcin de genes especficos, responsa-
bles de la actividad hormonal. El grupo de Turyn evalu, en modelos que expresan
distintas concentraciones de hormona como responde la principal va de sealiza-
cin JAK2/STAT5. Comprob que:
La sobreexpresin de hormona se asocia con la desensibilizacin de la se-
al, mientras que su deficiencia aumenta su sensibilidad.
Al evaluar los posibles mecanismos implicados, detect que la protena su-
presora de la seal de citoquinas CIS aumenta ante el exceso de hormona
pero disminuye en su ausencia.

130
Finalmente, realiz estudios sobre los efectos adversos que resultan de niveles cr-
nicamente elevados de la hormona, entre los cuales se encuentra el desarrollo de tu-
mores, como el hepatocarcinoma.
Describi que el hgado de ratones transgnicos que sobreexpresan GH pre-
senta lesiones preneoplsicas que se asocian a la expresin de diversas prote-
nas involucradas en proliferacin y supervivencia celular

Publicaciones

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Poskus
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Increased sensitivity to GH in liver of Ames dwarf (Prop1df/ Prop1df) mice related to
diminished CIS abundance. Miquet JG, Sotelo AI, Dominici FP, Bonkowski MS, Bartke
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Differential regulation of membrane associated-growth hormone binding protein
(MA-GHBP) and growth hormone receptor (GHR) expression by growth hormone (GH)
in mouse liver. Gonzlez L, Curto LM, Miquet JG, Bartke A, Turyn D, Sotelo AI. GH &
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Transgenic mice overexpressing GH exhibit hepatic upregulation of GH-signaling
mediators involved in cell proliferation. Miquet J, Gonzlez L, Matos M, Hansen C,
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Growth hormone (GH) modulates hepatic epidermal growth factor (EGF) signa-
ling in the mouse. Gonzlez L, Daz ME, Miquet JG, Sotelo AI, Dominici FP, Bartke A,
Turyn D. J Endocrinol, 204:299-309 (2010).

134
IV COLABORACIN CON LA INDUSTRIA DE INVESTIGADO-
RES DE HORMONAS DE CRECIMIENTO

Los investigadores del Departamento de Qumica Biolgica de la Facultad de Farma-

cia y Bioqumica de la UBA fueron requeridos por la industria biotecnolgica (Biosi-
dus S.A.) para aplicar su experiencia en la purificacin, estabilidad y control de ca-
lidad de la hormona de crecimiento humana recombinante, obtenida a partir de E.
coli y de la proveniente de leche de vacas transgnicas.
La colaboracin se brind a travs de asesoras (Dellacha y Santom) y de convenios
con jefes de grupo, en los que intervenan los respectivos colaboradores. Menciona-
remos las siguientes:

1. HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANA RECOMBINANTE

1.1 Asesora de Dellacha.

Particip en calidad de Asesor Cientfico de Biosidus S.A. con el equipo de profe-
sionales a cargo de la obtencin de la hormona de crecimiento recombinante en E.
coli (hGHr), en las etapas de purificacin y estabilidad de la mencionada hormona.
En reuniones semanales se discuta la experiencia que los investigadores del Depar-
tamento de Qumica Biolgica haban adquirido en la purificacin de la hGH prove-
niente de hipfisis humanas, en trabajos subsidiados por el CONICET, la Fundacin
de Endocrinologa Infantil y la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA. Ade-
ms, se volc la experiencia resultante de una serie de trabajos que dichos inves-
tigadores estaban realizando acerca de las propiedades qumicas, fisicoqumicas y
biolgicas de las hormonas de crecimiento, que hacan a su mayor estabilidad en de-
terminadas condiciones experimentales.
En funcin de estas experiencias y de comn acuerdo, se introdujeron modificacio-
nes en ciertos procedimientos y se disearon nuevos experimentos, cuyos resulta-
dos fueron discutidos en las reuniones semanales. De ellas surgieron conocimientos
que contribuyeron a concretar la formulacin farmacutica de la hGHr.

1.2 Asesora de Santom

1.2.1 Convenios especficos de prestacin de servicios con la Facultad de Farmacia

y Bioqumica de la UBA

1.2.1.1 Determinacin de la estructura primaria completa de la Hgh recombinante

(HCB-P001) producida por Biosidus S.A. (1996)
La responsabilidad tcnica estuvo a cargo del Dr. Jos Alberto Santom. Profesor
Emrito de la Universidad de Buenos Aires y Coordinador del Laboratorio Nacional

135
 de Investigacin y Servicios en Qumica de Protenas (LANAIS-PRO).
El objeto del convenio fue realizar el estudio estructural y secuencia de aminocidos
de protenas obtenidas por la tcnica de ADN recombinante, consistente en escindir-
las con distintas enzimas y reactivos qumicos, purificar los fragmentos resultan-
tes, determinar las correspondientes secuencias de amino cidos, masa molecular
y composiciones de aminocidos. Con los datos obtenidos establecer si la secuencia
de aminocidos de la protena estudiada era correcta. Los anlisis de composicin
de aminocidos y de microsecuenciacin de pptidos se entregaban al LANAIS-PRO
para su realizacin.
Colaboradores:
Lic. Susana Linskens
Bioq. Evangelina Dacci
Ayudante ad-honorem Brian Cavagnari
Ayudante ad-honorem Santiago Di Pietro
Comprobaron que la protena recombinante codificada por Biosidus S.A. como HCB-
P001 tiene idntica secuencia de aminocidos y puentes disulfuro que la hormona de
crecimiento humana natural. (Hans Flodh, Acta Pediatr. Scand. Supp. 1986).

1.2.1.2 Estudio inmunoqumico comparativo entre la hGH recombinante producida

por Biosidus S.A. y otras de diferente origen. Control de calidad mediante el uso de
anticuerpos y receptores biolgicos. (1995)

1.2.1.3 La responsabilidad tcnica estuvo a cargo de la Dra. Lilia A. Retegui. Profeso-

ra Asociada de Qumica Biolgica. Investigador Independiente del CONICET.
Colaboradores:
Bioq. Viviana C. Blank.
Bioq. Karina A. Gmez.
Silvia A. Longhi.
El objetivo del trabajo fue estudiar en forma comparativa la inmunoreactividad de
la hormona de crecimiento humana recombinante producida por Biosidus S.A. con
respecto a la hormona de crecimiento humana de origen hipofisario (hGH-NIH lote
AFP-9775A) y la hGH Genotropin (hGH-KABI) de origen recombinante producida
en Estados Unidos por Genentech. El estudio consisti en evaluar la reactividad de
las diferentes hormonas frente a varios anticuerpos poli y monoclonales, su recono-
cimiento por receptores celulares especficos y la respuesta a cambios conformacio-
nales producidos por anticuerpos.
El estudio realizado demostr total identidad inmunolgica entre la hormona de
crecimiento humana recombinante producida por Biosidus S.A. y sus similares de
origen hipofisario (estndar) y recombinante (Genotropin).
La capacidad de unirse a los receptores celulares fue idntica en las tres hormonas.

136
2. HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANA DE LECHE DE VACAS TRANSG-
NICAS

2.1 Convenios especficos de prestacin de servicios con la Facul-

tad de Farmacia y Bioqumica DE LA UBA
El Dr. Santom, en calidad de asesor, particip con la Dra. Susana Dabsys de Biosi-
dus S.A. en la elaboracin de los proyectos y en el control de la marcha de los siguien-
tes convenios con la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la UBA, en los cuales la
responsabilidad tcnica estuvo a cargo de:
1. Dr. Jos Alberto Santom (2003).
2. Dras. Lilia Retegui y Leonor Roguin (2004).
3. Dr. Daniel Turyn (2004).
4. Dr. Jos Mara Delfino (2004)
5. Dr. Edgardo Poskus (2006).

2.1.1 Determinacin de la estructura primaria completa de la hormona de creci-

miento humana de leche de vacas transgnicas (protena HCL-E 02), obtenida en
Biosidus S.A. (2003).
La responsabilidad tcnica estuvo a cargo del Dr. Jos Alberto Santom.
El objeto del convenio fue realizar el estudio estructural y secuencia de aminocidos
de la hormona de crecimiento humana obtenida por Biosidus S.A. de leche de vacas
transgnicas. Dicho estudio consisti en escindir las hormonas con distintas enzi-
mas y reactivos qumicos, purificar los fragmentos resultantes, determinar las co-
rrespondientes secuencias de aminocidos, masa molecular y composicin en ami-
nocidos. Con los datos obtenidos establecer si la secuencia de aminocidos de la
protena estudiada era correcta (los anlisis de composicin de aminocidos, de mi-
crosecuenciacin y de espectrometra de masa se entregaban al LANAIS-PRO para
su realizacin).
El Dr. Santom designaba los colaboradores necesarios para cada caso.
Comprobaron que la hormona de crecimiento humana proveniente de leche de va-
cas transgnicas, codificada por Biosidus S.A. como HCL-E 02, tiene idntica se-
cuencia de aminocidos y ubicacin de los puentes disulfuro que la hormona de cre-
cimiento humana natural. (Hans Flodh, Acta Pediatr. Scand. Supp. 1986).

2.1.2 Estudio inmunoqumico comparativo entre la hormona de crecimiento huma-

na obtenida por Biosidus S.A. de leche de vacas transgnicas y hormonas de diferen-
te origen. Actividad de las mismas frente a receptores de origen humano y sobre la
proliferacin de clulas Nb2 (2004)
La responsabilidad tcnica estuvo a cargo de la Dra. Lilia Retegui, Profesora Asocia-
da de Qumica Biolgica, Investigador Independiente del CONICET y la Dra. Leonor
Roguin, Profesora Adjunta, Investigador Asistente del CONICET. Previamente am-

137
 bas investigadoras haban establecido con anticuerpos monoclonales la topografa
antignica de la hGH y haban obtenido 20 de esos anticuerpos que cubran la totali-
dad de la molcula de la hormona.
El objetivo del convenio fue:
Medir la reactividad de la hGH, obtenida de vacas transgnicas, en forma
comparativa con el estndar europeo de la protena recombinante y con el
producto comercial obtenido por Biosidus S.A., frente a varios anticuerpos
monoclonales dirigidos contra diferentes regiones de la superficie molecular.
Medir la reactividad de las mismas frente a receptores de origen humano.
Determinar el efecto de distintas concentraciones de la protena y de los dos
estndares sobre la proliferacin de clulas Nb2, provenientes de un linfoma
de rata que prolifera en presencia de hormonas lactognicas (hGH, lactge-
no placentario y prolactinas).
Participaron los siguientes investigadores:
Bioq. Viviana C. Blank, Ayudante 1 D.E.
Bioq. Vernica J. Marino, Ayudante 1 D.E.
Bioq. Patricia A. Mathieu, Ayudante 1 D.E.
Bioq. Mara E. Loudeiro, Ayudante 1 D.E.
Comprobaron que el estndar europeo de la protena recombinante, el obtenido
por Biosidus S.A. y la hGH obtenida por Biosidus S.A. de leche de vacas transgni-
cas (HCL-E 02) son esencialmente idnticos en su capacidad de ser reconocidas por
los anticuerpos monoclonales 3C11, 10D6 y AC8 (Mazza y Retegui, Mol Immunol
26:231-239, 1989). Las tres hormonas tuvieron un comportamiento esencialmente
idntico en su capacidad de estimular el crecimiento de las clulas Nb2, por lo cual
concluyeron que la actividad biolgica de las tres hormonas ensayadas es similar.

2.1.3 Determinar la capacidad de la hGH de leche de vacas transgnicas de iniciar la

transduccin de seales (2004).
La responsabilidad tcnica estuvo a cargo del Dr. Daniel Turyn. Profesor Asociado D.E.
Su grupo de trabajo tena experiencia en la transduccin de la seal de la hormo-
na de crecimiento conducente a la transcripcin de los genes responsables de las ac-
tividades estimulante del crecimiento y metablica de la hormona. Es decir, en la
unin de la hormona a su receptor y la dimerizacin del mismo, la cual inicia la serie
de fosforilaciones de protenas que resultan en la activacin de enzimas y factores
de transcripcin. La quinasa JAK2, activada luego de la dimerizacin del receptor,
fosforila a las protenas activadoras de la transcripcin y transductoras de seales
(STATs), que son varias. Las STATs penetran en el ncleo y activan a distintos genes.
El objetivo del convenio fue evaluar, en forma comparativa con el estndar europeo
de la protena recombinante y con el obtenido por Biosidus S.A., la capacidad de la
hGH de vacas transgnicas de iniciar la transduccin de seales midiendo la fosfori-
lacin en tirosina del STAT5.

138
Participaron los siguientes investigadores:
Dra. Ana Sotelo, Jefe de trabajos Prcticos. D.E.
Bioq. Johanna Miquet: Ayudante de Primera. D.E.
Las tres hormonas tuvieron un comportamiento esencialmente idntico en su capa-
cidad de estimular la fosforilacin en tirosinas del STAT5, por lo cual concluyeron
que la actividad biolgica de las tres hormonas ensayadas es similar.

2.1.4 Estudio comparativo por dicrosmo circular y fluorescencia entre la hormona

de crecimiento humana obtenida por Biosidus S.A. de leche de vacas transgnicas y
hormonas de diferentes orgenes. Anlisis de la estabilidad conformacional (2004).
La responsabilidad tcnica estuvo a cargo del Dr. Jos Mara Delfino. Prof. Asoc.
Reg. D.E. Investigador con experiencia en conformacin de protenas, especialmen-
te en la metodologa requerida para detectar cambios conformacionales.
El objetivo del convenio fue comparar la conformacin de la hGH obtenida de leche
de vacas transgnicas con la del estndar europeo de la protena recombinante y la
del obtenido por Biosidus S.A., por espectroscopa CD (UV lejano y UV cercano) y
por fluorescencia intrnseca (espectro de emisin), y evaluar la estabilidad confor-
macional de las muestras mediante curvas de desnaturalizacin por efecto de urea
o cloruro de guanidinio.
Participaron los siguientes investigadores:
Dr. Juan Pablo F.C. Rossi. Prof. Asoc. Reg. D.E.
Bioq. Lucrecia Mara Curto. Ayud. 1/Becaria.
Bioq. Gabriela Elena Gmez. Ayud. 2/Becaria.
Realizaron medidas espectroscpicas de dicrosmo circular en las zonas UV lejana
y cercana con el propsito de evaluar el contenido de estructura secundaria y la in-
tegridad de la estructura terciaria. Asimismo, colectaron los espectros de emisin
de fluorescencia a fin de comparar el entorno de los residuos de triptfano. Por am-
bas espectroscopias las muestras resultaron indistinguibles unas de otras y compa-
tibles con datos bibliogrficos. Result particularmente significativa la coinciden-
cia entre los espectros de CD en la zona UV cercana, de lo que se deduce un entorno
idntico para los residuos aromticos. Del mismo modo, comprobaron similitud en
el valor de longitud de onda mxima de emisin de fluorescencia: 335 nm, que coin-
cide con el valor publicado. Siguieron el proceso de desnaturalizacin a travs de la
medicin de la intensidad de fluorescencia a 370 nm y de la posicin del centro de
masa espectral.
De acuerdo con los datos informados, las tres muestras resultaron indistinguibles
entre s y coherentes con los datos correspondientes a la hormona de crecimiento hu-
mana informados en la literatura.

139
 2.1.5 Obtencin de sueros en conejos hiperinmunes hacia sistemas antignicos com-
plejos (2006).
La responsabilidad tcnica estuvo a cargo del Dr. Edgardo Poskus. Investigador
Principal CONICET. Director Interino del Instituto de Estudios de la Inmunidad Hu-
moral Profesor Ricardo A. Margni (IDEHU CONICET-UBA).
Objetivo del convenio: realizacin de los procedimientos necesarios para el desarro-
llo de sueros en conejos hiperinmunes hacia tres sistemas antignicos complejos de
protenas extractivas, con ejecucin de los respectivos anlisis de titulacin.
Participaron los siguientes investigadores:
Dr. Rubn F. Iacono. Profesional Principal, CONICET.
Dra. Silvia Noem Valdez. Docente Auxiliar. Investigador Asistente CONICET
Bioterista Mara Dolores Campos: Tcnica Asistente, CONICET.

140
ANEXO A

ESTRUCTURA DE PROTENAS

Las protenas son biopolmeros que se originan por la combinacin repetida de

aproximadamente 20 aminocidos diferentes. En la cadena polipeptdica forma-
da (alrededor de 190 en las hormonas de crecimiento), los aminocidos estn en-
lazados por la llamada unin peptdica entre los grupos -amino y -carboxilos
de aminocidos adyacentes. El primer aminocido de la secuencia tiene el grupo
-amino libre y se denomina extremo N-terminal y el ltimo llamado extremo C-
terminal tiene el grupo -carboxilo libre. Las protenas suelen tener puentes di-
sulfuro, tambin llamados puentes azufre, constituidos por la unin de los grupos
sulfidrilos de cistenas, no adyacentes en la secuencia pero prximos en el espacio.
Hasta aqu se ha descripto la llamada estructura primaria. Estructura secundaria es
la distribucin regular y peridica que adopta en el espacio esa cadena de aminoci-
dos (hlice-, estructura-) y estructura terciaria al plegamiento de la cadena en
el espacio, para adquirir la forma globular, de estas protenas.
La informacin gentica para la sntesis de las protenas en la mayora de los orga-
nismos, est contenida en forma codificada en las molculas de cido desoxirribo-
nucleico (DNA) que se presenta en una estructura de doble cadena. La informacin
contenida se copia bajo la forma de RNA de cadena nica. Los productos de esta
transcripcin son el RNA ribosmico, de transferencia y el mensajero. La traduccin
del RNA mensajero conduce a las protenas.
Se muestran, a continuacin, los dos tipos de abreviaturas que se utilizan para los
20 aminocidos:

Alanina Arginina Ac.asprtico c. Glutmico Asparragina Cistina Glutamina

Ala Arg Asp Glu Asn Cys Gln
A R D E N C Q

Glicina Histidina Iso leucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina

Gly His Ile Leu Lys Met Phe
G H I L K M F

Prolina Serina Treonina Triptofano Tirosina Valina

Pro Ser Thr Trp Tyr Val
P S T W Y V

141
 ANEXO B

BREVE DESCRIPCIN DE LOS FUNDAMENTOS Y METODOLOGA EMPLEA-

DA PARA DETERMINAR LA ESTRUCTURA PRIMARIA DE LA HORMONA DE
CRECIMIENTO BOVINA

El objetivo de este anexo es explicar a quienes no son especialistas en el tema, las

razones por los cuales Li necesit en la Universidad de California, 10 aos para de-
terminar la estructura primaria de la hormona de crecimiento humana y el grupo
de la Facultad de Farmacia y Bioqumica siete aos para determinar la de la hormo-
na bovina.
En primer lugar daremos una idea del proceso de determinacin que poda llevarse
a cabo, con la metodologa en esa poca, para determinar la estructura primaria de
una protena. Tomaremos, como ejemplo, una protena terica pequea, represen-
tada en el siguiente esquema como una lnea recta en la que aparecen los residuos
de aminocidos como guiones, con excepcin de los bsicos: arginina y lisina, que se
representan con sus smbolos: R y K.

1 2 3 4 5
H2N-------------R---------R---------K---------------R-------

6
---K----------COOH

Etapas posibles de la determinacin:

1. El primer paso para la determinacin de la estructura primaria de esta protena
terica, poda ser su fraccionamiento por incubacin con una enzima proteoltica,
la tripsina por ejemplo, la cual escinde las uniones peptdicas en las que participa
el grupo carboxilo de las argininas y lisinas. Se obtendran los siguientes fragmen-
tos o pptidos:

1 2 3
H2N-------------R ---------R ---------K

4 5 6
---------------R ----------K ----------COOH

2. Los 6 pptidos resultantes podran separarse mediante columnas de intercambio

inico especialmente preparadas para esas funciones.
3. Comprobada la pureza de los pptidos podra determinarse la secuencia de ami-

142
nocidos de cada uno de ellos, para lo cual los aminocidos se liberarn uno a uno
a partir del extremo N-terminal, mediante el proceso qumico conocido como de-
gradacin de Edman. Los aminocidos liberados en cada degradacin podran ca-
racterizarse en un analizador automtico de aminocidos o por cromatografa, ge-
neralmente en capa delgada. Con estas degradaciones de Edman manuales solo era
posible establecer la secuencia de pocos residuos de aminocidos. Para determinar
la secuencia a partir del extremo C-terminal poda recurrirse a las carboxipeptida-
sas, enzimas que liberan uno a uno los residuos de aminocidos; eran necesarios dis-
tintos tiempos de incubacin para determinar el orden de liberacin y caracterizar
los aminocidos liberados en cada etapa. Frecuentemente, la longitud del pptido,
no permita tener su secuencia total utilizando los procedimientos indicados; en es-
tos casos el pptido deba escindirse con otra enzima, separar los pptidos resultan-
tes y determinar la secuencia de cada uno de ellos.
4. Obtenida la secuencia de aminocidos de los 6 pptidos trpticos de esta prote-
na terica, sera necesario determinar su ubicacin en la molcula proteica, para lo
cual se escinda la protena con enzimas que rompan las uniones peptdicas de resi-
duos distintos a los de la tripsina, por ejemplo, en los puntos sealados en el esque-
ma, dando lugar a los pptidos que designamos con letras.

1 2 3 4
H2N---/ ------/ ----R----/ -----R---------K---/ ------/ ----
a b c d e

5 6
--R------/ ----K-------/ ---COOH
f g h

Los nuevos pptidos tambin deban separarse en columnas de resinas, purificarlos

y determinar su secuencia de aminocidos.
Los residuos comunes a los pptidos numerados y los indicados con letras permiti-
ran establecer la ubicacin de los 6 pptidos en la protena.
Este ejemplo terico de determinacin de estructura primaria es muy sencillo; las
protenas reales son de mayor peso molecular y suelen tener puentes disulfuro y re-
giones hidrofbicas que dan origen a pptidos de difcil purificacin. Generalmen-
te era necesario, adems de emplear distintas enzimas proteolticas, recurrir a esci-
siones qumicas.

Determinacin de la estructura primaria completa de la hormo-

na de crecimiento bovina
La bGH tiene una molcula mucho ms compleja que la correspondiente al ejemplo
terico descrito en el Anexo B. Como veremos ms adelante, es una mezcla de can-
tidades semejantes de dos cadenas polipeptdicas que slo difieren en que a una de

143
 ellas le falta la alanina del extremo N-terminal. Para la numeracin de los residuos
y dems descripciones moleculares nos referiremos a la molcula provista de esa
alanina, tambin existente en algunas hormonas de crecimiento de otras especies
La bGH posee:
189 residuos de aminocidos.
21.617 de masa molecular.
2 puentes disulfuro.
13 argininas y 11 lisinas
Con el objetivo de hacer una breve descripcin de la determinacin de la estructu-
ra primaria de la bGH, omitiremos la descripcin de los solventes utilizados, su pH y
concentracin, como as otras condiciones experimentales que no sean indispensa-
bles para entender este somero resumen. Seguiremos los pasos indicados en el ejem-
plo terico:
1. Digestin con tripsina. De acuerdo con el nmero de residuos bsicos se obten-
dran 25 pptidos trpticos, pero en realidad el nmero fue mayor porque cuando
no se rompe el 100% de una unin peptdica de arginina o lisina se originan pro-
ductos con dos pptidos trpticos unidos. Para encarar el aislamiento, purificacin y
posterior estudio de cada uno de los pptidos, utilizaron en cada digestin, 200 mg
de hormona, previamente oxidada con cido perfrmico, cantidad de bGH que jun-
to con la utilizada en otros procedimientos justific la necesidad de disponer de su-
ficiente produccin de hormona pura.
2. Aislamiento de los pptidos trpticos. Liofilizaron el digerido trptico y lo extra-
jeron con una solucin de acetato de piridina. Sembraron la fraccin soluble en una
columna de resina sulfnica Aminex AG 50W-X2 (0,9cm X 1,80cm) termostatizada
a 40 C, y convenientemente preparada. A continuacin, hicieron pasar a travs de
la columna 1.600 ml de un gradiente de solventes, con un flujo de 11 ml/hora. Re-
cogieron fracciones numeradas, de 1,60 ml cada una, utilizando un colector auto-
mtico. Los distintos pptidos trpticos tuvieron distintos grados de retencin en la
columna, por lo cual fueron eluyendo a distintos tiempos, permitiendo as, el ais-
lamiento de cada uno de ellos. Detectaron la presencia del material peptdico por
reacciones qumicas, en alcuotas de las fracciones. Unieron las fracciones que apa-
rentemente correspondan a cada pptido y examinaron su complejidad por electro-
foresis de alto voltaje en papel Whatman 3MM, a pH 6.45 en un sentido y a pH 2.00
en el normal. Las fracciones que por este procedimiento presentaron un solo compo-
nente, las purificaron por electroforesis de alto voltaje en las condiciones menciona-
das. La siembra en el papel la hicieron en lnea y despus de la electroforesis revela-
ron una tira del papel para detectar la ubicacin del material y proceder a su elucin
con solventes y posterior anlisis de aminocidos en el analizador automtico. Si el
resultado indicaba que el pptido no estaba puro, lo sometan a una cromatografa
en papel durante 14 horas. Por este procedimiento aislaron y purificaron a homoge-
neidad, 22 pptidos solubles del digerido trptico de la bGH.

144
3. Determinacin de la secuencia de aminocidos de los pptidos trpticos solubles.
Tal como se describi al tomar como ejemplo una protena terica, liberaron uno a
uno los aminocidos del extremo N-terminal como feniltiohidantonas, mediante
degradaciones de Edman y las caracterizaron por cromatografa en capa delgada.
Para determinar la secuencia a partir del extremo C-terminal, utilizaron carboxi-
peptidasas. As lograron determinar la secuencia total o parcial de los pptidos trp-
ticos mencionados.
4. Digestin con otras enzimas de la bGH nativa o qumicamente modificada. Despus
de determinar la secuencia total o parcial de los pptidos trpticos solubles, deban:
Aislar y determinar la secuencia del resto de los pptidos trpticos.
Digerir la hormona con otras enzimas proteolticas, o con mtodos qumicos,
y aislar y determinar la secuencia de aminocidos de los pptidos resultantes.
Determinar la ubicacin de los puentes disulfuro.
Con la secuencia parcial o total de todos los pptidos obtenidos establecer
la estructura primaria de la bGH mediante el solapado de los residuos comu-
nes de esos pptidos.
Para cumplir con ese programa de trabajo, escogieron la quimotripsina como segun-
da enzima proteoltica a utilizar. Aplicaron el procedimiento utilizado para la trip-
sina, adaptado a las caractersticas de la nueva enzima. Lograron determinar la se-
cuencia total o parcial de 26 pptidos quimotrpticos solubles.
Toda la informacin obtenida de los pptidos trpticos y quimotrpticos solubles les
permiti determinar la secuencia de 139 aminocidos. Para determinar la secuencia
de los 50 restantes siguieron varios caminos:
En primer lugar digirieron el material insoluble de los digeridos trpticos y quimo-
trpticos con Pepsina, enzima proteoltica que escinde un considerable nmero de
uniones peptdicas. Los pptidos resultantes se trataron en igual forma que los di-
geridos solubles de tripsina y quimotripsina. Determinaron as, la secuencia total o
parcial de 19 pptidos, la mitad de los aminocidos faltantes.
El mayor problema a resolver lo constituy la insolubilidad de varios pptidos trpti-
cos que por su hidrofobicidad se agregaban fcilmente. Para solucionarlo repitieron
la digestin con tripsina utilizando bGH qumicamente modificada para evitar la in-
solubilidad de los pptidos. Se recurri alternativamente a digerir hormona reduci-
da, carbamidometilada y maleinizada. El estudio de los pptidos resultantes y el em-
pleo de tcnicas especiales para determinar los puentes disulfuro y la ubicacin del
nico residuo de triptfano y de las 4 metioninas, permitieron la determinacin de
la estructura primaria completa de la bGH.
Magnitud del trabajo. Esta resumida descripcin de los procedimientos utilizados
para determinar la secuencia de aminocidos de la bGH, explica porque el grupo de
Buenos Aires necesit 7 aos para completarla y porque C.H. Li demor 10 aos con
la humana.
Dijimos que la bGH nativa o qumicamente modificada se someti a varias digestio-

145
 nes enzimticas y qumicas. Los pptidos resultantes se sometieron a un complejo
procedimiento para su aislamiento y purificacin, incluyendo resinas de intercam-
bio, electroforesis de alto voltaje y cromatografa en papel. Las numerosas fraccio-
nes provenientes de las resinas contenan pptidos o mezcla de pptidos muy di-
luidos, por lo cual se requera su concentracin en evaporadores rotatorio antes de
sembrarlos en los papeles Whatman 3 MM y someterlos a electroforesis de alto vol-
taje. Las nuevas fracciones obtenidas tenan que eluirse del papel, concentrarse y de-
terminar la composicin en aminocidos en una alcuota para averiguar si se trataba
de un pptido puro, en caso contrario lo sometan a otra electroforesis de altovoltaje
a distinto pH, cada una de las nuevas fracciones obtenidas deban someterse a anli-
sis automtico de aminocidos para establecer si era un pptido puro, un componen-
te desechable o una mezcla que justificaba ser eluda, concentrarse y someterse a un
fraccionamiento por cromatografa en papel.
De los centenares de fracciones estudiadas seleccionaron 124 pptidos para deter-
minar sus secuencias en aminocidos.

"Primary structure of bovine growth hormone". J.A. Santom, J.M. Dellacha, A.C. Pa-
ladini, C. Pea, M.J. Biscoglio, S.T. Daurat, E. Poskus, C.E.M. Wolfenstein. Eur. J. Bio-
chem., 37: 164 (1973).

La metodologa utilizada para determinar la estructura primaria de las protenas,

experiment desde entonces una intensa evolucin, como puede apreciarse en el
Anexo C.

146
ANEXO C

EVOLUCIN DE LAS METODOLOGAS PARA DETERMINAR LA ESTRUCTU-

RA PRIMARIA DE PROTENAS

Mencionamos que en 1967, Edman haba presentado el primer secuenciador autom-

tico de aminocidos, capaz de determinar la secuencia N-terminal de 15 aminoci-
dos en 24 horas con 250 nanomoles de pptidos o protenas, cantidad muy pequea
para la metodologa de la poca. Ese aparato redujo considerablemente el tiempo y
la cantidad de protena necesaria para determinar la estructura primaria. Hizo posi-
ble determinar la secuencia de un nmero elevado de residuos del extremo N-termi-
nal y secuenciar pptidos de mayor tamao molecular, reduciendo la necesidad de
fragmentar pptidos y protenas con enzimas productoras de fragmentos pequeos.
En la misma dcada tuvieron lugar una serie de descubrimientos en un campo muy
distinto al de la secuenciacin de protenas, pero que permitieron deducir numero-
sas estructuras primarias a partir del DNA o del RNA mensajeros. En 1960 Niren-
berg, Khorana y Ochoa describieron el cdigo gentico; ese mismo ao Sanger cre
un mtodo rpido para secuenciar RNA y, en 1975, el primer mtodo para secuen-
ciar DNA; en 1977 Maxan y Gilbert presentaron un mtodo para secuenciar DNA
por degradacin qumica y Sanger un nuevo mtodo para secuenciar DNA, que lo
hizo acreedor de su segundo premio Nobel. Adems, entre 1976 y 1980 aparecie-
ron mtodos rpidos para sintetizar oligonucletidos. Estos descubrimientos hicie-
ron ms rpido deducir la secuencia de aminocidos de una protena determinando
la del DNA, que secuenciando la protena directamente (semanas en lugar de me-
ses o aos).
Sin embargo, en sus comienzos, este procedimiento enfrent el problema de reque-
rir el aislamiento del DNA gentico o el RNA mensajero, generalmente presentes en
mezclas muy complejas. La solucin del problema surgi en 1980 cuando Fiddes y
Goodman a partir de la secuencia de 5 aminocidos de la subunidad b de la gonado-
tropina corinica humana obtuvieron su DNA complementario. Por consiguiente, a
partir de la secuencia de un fragmento de la protena fue posible sintetizar oligonu-
cletidos utilizables como:
una sonda especifica para detectar el RNA mensajero de la protena.
un iniciador (primer) para sintetizar el DNA complementario.
una sonda para detectar el gen de una protena a partir de una genoteca.
En 1981, Hankapiller y col. crearon un secuenciador de aminocidos en fase gaseo-
sa, capaz de determinar por degradaciones de Edman, la secuencia de numerosos
residuos de aminocidos con solo picomoles de protena. Es decir, con una cantidad
que puede obtenerse por elucin de una bandita de un gel de poliacrilamida. Este
aparato provoc un regreso a la secuenciacin qumica. El costo elevado de adquisi-

147
 cin y mantenimiento del aparato y la necesidad de personal tcnico especializado,
hizo conveniente que este secuenciador estuviera a cargo de un grupo de investiga-
cin en qumica de protenas. Para solucionar este problema numerosas universida-
des y centros de investigacin crearon laboratorios especializados para ofrecer ser-
vicios en una o ms de las siguientes determinaciones:
Composicin en aminocidos.
Secuenciacin de pptidos y protenas.
Sntesis de pptidos.
Sntesis de polinucletidos.
Secuenciacin de DNA.
Espectrometria de masa.
En nuestro pas, el CONICET, con un prstamo del BID, cre en 1990 el Laborato-
rio Nacional de Investigacin y Servicios en protenas (LANAIS-PRO), cuyo organi-
zador y Coordinador fue Santom, que estuvo a su cargo hasta su designacin como
Coordinador Honorario en 2003. Como todo LANAIS deba brindar sus servicios a
todos los investigadores y a la industria. Entre otros equipos fue provisto de un se-
cuenciador derivado del creado por Hankapiller. El LANAIS-PRO contina prestan-
do sus servicios a numerosos investigadores y a la industria biotecnolgica.
La prestacin de servicios por el LANAIS-PRO, por ejemplo, permitieron a Santom
y sus colaboradores (Santiago Di Pietro, Christian Schleicher, Osvaldo Crdoba, Es-
teban DellAnglica, Mario Ermcora y Brian Cavagnari) aislar y determinar la es-
tructura primaria total o casi total de: 23 protenas transportadoras de cidos gra-
sos, 4 protenas ligadoras de calcio y 1 puente disulfuro isomerasa. Adems de otras
3 protenas en colaboracin con otros grupos.
Con respecto a las hormonas de crecimiento obtenidas por la industria biotecnolgi-
ca, Santom determin, por convenio con Biosidus S.A., la estructura primaria com-
pleta de la hormona de crecimiento humana obtenida por la tcnica de DNA recom-
binante y la de dicha hormona obtenida en leche de vacas transgnicas.
En los ltimos aos los mtodos basados en las degradaciones de Edman estn sien-
do reemplazados por los que utilizan espectrometra de masa.

148
ANEXO D

RESUMEN DE LOS CONOCIMIENTOS ESTRUCTURALES ACTUALES SOBRE

HORMONAS DE CRECIMIENTO

La molcula de las hormonas de crecimiento contiene 4 hlices- de 21 a 30 residuos

cada una. Forman un manojo con las dos primeras hlices paralelas entre s y antipa-
ralelas con las otras dos. Para que esta conformacin sea posible las cadenas de ami-
no cidos que unen las cadenas laterales son largas, mientras que la que une las h-
lices antiparalelas es corta.
La hormona de crecimiento se une a las dos molculas de receptor en forma secuen-
cial. A travs del sitio 1 de la hormona (ver grfico) se une a la primera molcula de
receptor y por el sitio 2 a la segunda.

Sitio 1
Sitio 2

Diagrama de la estructura de la hGH sealando los sitios I y II de unin al re-

ceptor.
N: Residuo N-terminal; C: Residuo C-terminal; I, II, III y IV: Hlices .
Estn indicados los residuos iniciales y terminales de cada hlice

Residuos de las hormonas de crecimiento involucrados en la unin a los receptores

Cunningham y Wells, en 1989, utilizaron la tcnica conocida como alanine-scan-
ning mutagenesis para identificar los residuos de aminocidos de la hGH recombi-
nante que se unen al receptor. Mutaron por alanina cada residuo contenido en los
tres segmentos discontinuos de la hGH considerados implicados en el reconocimien-
to del receptor: residuos 2 a 19, 54 a 74 y 167 a 191. El trabajo revel la importancia
de doce residuos de cadena lateral larga. Muchos de esos residuos estn cambiados
en las prolactinas y lactgenos placentarios, hormonas homlogas que no reconocen
el receptor de la hGH. Los residuos mencionados pertenecen al sitio 1, el cual se une
a la primera molcula del receptor, pero la unin de la hormona a la segunda mol-
cula del receptor se hace a travs del sitio 2. El sitio 1 involucra la regin N-termi-
nal de la hlice 1, los residuos 54-68 y el extremo carboxilo terminal de la hlice 4.
El sitio 2, adyacente al primero comprende la regin N-terminal y central de la hli-
ce 3 (Wells y de Vos, 1993)

149
 Interaccin de cadenas laterales de aminocidos

El core de las 4 hlices de la hGH est constituido por los residuos L6, F10,A13,
A17, L20, A24, T27 y F31 de la hlice 1, N72, L76, S79, I83, W86 y V90 de la hlice 2,
V110, L114, L117, I121, L124 y L128 de la hlice 3, y N159, L163, F166, M170, V173,
L177, V180 y S184 de la hlice 4 (Ultsch et al, 1994). Sealados en negrita. X repre-
senta los residuos faltantes.

Hlice I .
6 10 13 17 20 24 27 30
hGH:XFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQT
bGH:A--AMS--G--A--V---QH-----A--FK---RT---EG-R--IX--T-V
oGH:A--AMS--G--A--V---QH-----A--FK---RT---EG-R--IX--T-V
eGh:X--AMP--S--A--V---QH-----A---K---R----EG-R--IX--A-A

Hlice II .
72 76 79 83 86 90
hGH:SLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANS
bGH:AF----T--A-TGKN-A-E--D---------------Q-XG---X--T--
oGH:AF----T--A-TGKN-A-E--D---------------Q-XG---X--T--
eGH:AF----T-PA-TGKN-A--R-DME---F---------G---L--X--T--

. Hlice III .
110 114 117 121 124 128
hGH:LVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNS
bGH:--F-T--RX--EK--------LA--RE----T-A---L----D-----M
oGH:--F-T--RX--EK--------LA--RE----V--A---L----D-----M
eGH:--F-T--RX--EK-R-------A--RE------RA---L----D-----L

. Hlice IV .
159 163 166 170 173 177180 184
hGH:HNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRXSVEGSCGF
bGH:RS-----------S-----LH-T--Y--VMK-RRFG-A--A-
oGH:RS-----------S-----LH-T--Y--VMK-RRFG-A--A-
eGH:RS-----------S--KK-LH-A--Y--VMK-RRF--SS-A-

150
ANEXO E

RECEPTORES HORMONALES

Las hormonas del sistema endocrino se pueden clasificar de acuerdo a su solubilidad

en dos grandes grupos: las solubles en lpidos y las que no lo son. Para ejercer su ac-
cin, las hormonas solubles en lpidos se desplazan libremente a travs de la mem-
brana celular externa, mientras que las hormonas insolubles no la atraviesan, sino
que necesitan de una estructura compleja, constituida mayoritariamente por pro-
tenas o glicoprotenas ubicadas en la membrana plasmtica, denominada receptor
endocrino.
Para iniciar su accin las hormonas interaccionan especficamente con el receptor,
desencadenando en el interior de la clula una cascada de reacciones (activacin de
enzimas o factores, modificacin en la permeabilidad de la membrana, transcrip-
cin, etc) que definen su respuesta biolgica.
Los receptores transmembrana son aquellos que atraviesan todo el espesor de la
membrana plasmtica de la clula, conservando un extremo libre en la cara exter-
na de la membrana plasmtica (dominio extracelular) y otro ubicado en la cara in-
terna (dominio intracelular). Existen distintos tipos de receptores transmembrana
a saber: receptores asociados a protenas G, receptores con actividad tirosina qui-
nasa intrnseca, receptores que no presentan actividad intrnseca y activan quina-
sas. Cuando el dominio extracelular de este ltimo tipo de receptores interacciona
con citoquinas, interferones, eritropoyetina, hormona de crecimiento o prolactina,
el receptor sufre un cambio conformacional que afecta al dominio intracelular, lo
que provoca la activacin de miembros de la familia de las quinasas denominadas
Janus quinasas JAK (por su sigla en ingls Janus Activation Kinases), las que a su vez
activan factores de transcripcin citoplasmticos denominados STATs (por su sigla
en ingls signal transducers and activation of transcription) responsables en el n-
cleo de activar la transcripcin de genes especficos. En otros casos estos recepto-
res activan la cascada de las MAP quinasas (por su sigla en ingls mitogen-activa-
ted proten).

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REGISTRO FOTOGRFICO

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Una de las vaquitas clonadas en el
programa de "tambo farmacutico" es
alimentada por su cuidador.

En la pgina opuesta, una nota

aparecida en La Prensa describe los es-
fuerzos para sintetizar la hormona en
la Facultad de Farmacia y Bioqumica.

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Los doctores Jos Santom, Juan
Dellacha y Alejandro Paladini,
reunidos varios aos despus de los
sucesos que cuenta este libro.

En la pgina opuesta, foto superior. En la pgina opuesta, foto inferior.

El equipo que trabaj en la produc-
cin biotecnolgica de la hormona de
crecimiento. De izquierda a derecha:
Ada Prync, Mara Teresa Pellerano,
Juan Zimmermann, Miguel Carcagno,
Csar Carbonetto, Susana Dabsys,
Miriam Denegri, Humberto De Pas-
quale, y Marcelo Criscuolo.
Protagonistas del desarrollo de la
hormona de crecimiento aplicando
biotecnologa: de izquierda a derecha,
doctor Daniel Salamone, ingeniero
Carlos Werning, doctor Claudio San-
tos y doctor Carlos Melo.

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