Nombre: Prieto Escamilla Alexis S. Prctica No.

1 Aislamiento y
Grupo: 5QV1. Caracterizacin de DNA.

PROPIEDADES DEL DNA

En el aislamiento del DNA, una gran dificultad es el de mantener una molcula tan larga y rgida
fsicamente intacta. Se ha demostrado que las fuerzas de friccin que se establecen cuando una
solucin de DNA es agitada vigorosamente, son suficientes para romper la larga y rgida molcula de
DNA. Las molculas se rompen primero cerca de la parte media, despus en cuartos y as
sucesivamente hasta que se alcanza un tamao lo suficientemente corto para que la molcula sea
relativamente insensible a la ruptura por friccin.
Es difcil extrapolar el peso molecular del DNA encontrado en una solucin, con respecto al peso
molecular real que existe in vivo por la gran facilidad de degradacin por friccin durante la extraccin o
por la inadvertida accin de enzimas hidrolticas. Quizs las mejores estimaciones se deriven del trabajo
radioautogrfico en el cual el DNA es marcado con tritio. Por ejemplo, en E. coli, Cairns pudo detectar
molculas de DNA de hasta 1.1mm de longitud. Esto corresponde a un peso molecular de 2.8X109. De
manera similar, el DNA del bacterifago T2 tiene una longitud promedio de 49 , lo cual corresponde a
un peso molecular de 108. Un bacterifago bastantemente ms pequeo, llamado , tiene un DNA de 23
de longitud. Pero an en la muestras ms cuidadosamente preparadas de DNA extrado siempre hay
0.1 a 0.2% de protenas ligadas al material. Por lo tanto, existi la posibilidad que una molcula de DNA
est hecha por cadenas ms pequeas unidas por materia proteico o peptdico. A pesar de esto, la
sntesis exitosa in vitro, conocida como reacciones de la cadena circular doblemente cerrada del DNA
X 174 en su forma replicativa, capaz de infectar clulas husped, hace probable que dichas molculas
de DNA estn compuestas de nucletidos.
Un mtodo para aislar DNA casi libre de protenas y RNA fue publicado, por ejemplo, por
Marmur. Las paredes celulares bacterianas son digeridas con la lisozima o se rompen con un
detergente. El perclorato de sodio es utilizado para disociar el cido nucleico y las protenas, y la
solucin es desproteinizada por agitacin con una mezcla de cloroformo y alcohol isoamlico. El RNA es
removido con ribonucleasa o por centrifugacin en un gradiente de densidad de cloruro de Cesio. En
este gradiente, el RNA, el cual tiene una densidad mucho mayor que el DNA, es precipitado en el fondo
del tubo de centrifugacin. El DNA puede ser precipitado selectivamente con alcohol isoproplico. La
actividad de la desoxirrobonucleasa puede ser minimizado si las fases se llevan a cabo en presencia de
agentes quelantes o en presencia de un detergente como dodecil sulfato de Sodio. Este procedimiento
ofrece DNA biolgicamente activo como, por ejemplo, DNA transformante. Sin embargo, el DNA
obtenido es de alguna manera degradado por las fuerzas de friccin desarrolladas durante la agitacin.
Un procedimiento alternativo para el aislamiento de DNA altamente polimerizado a partir de
tejidos animales es el mtodo de extraccin con Fenol de Kirby, en el cual las protenas son
desnaturalizadas en la interface fenol-agua y los cidos nucleicos son extrados en la capa acuosa. El
RNA ser removido como se menciona para el mtodo anterior y el DNA ser precipitado.
Para la examinacin con el microscopio electrnico, las soluciones de DNA son pulverizadas
sobre la malla y se secan rpidamente. El DNA nativo da claramente molculas largas, rgidas y en
forma de vara, mientras que el DNA desnaturalizado por calor, o por alguna otra forma de
desnaturalizacin (espiral aleatoria), molculas en forma de charcos.
Casi todas las molculas nativas de DNA en solucin, provenientes de una gran variedad de
fuentes tienen estructura de doble hlice como se demuestra por el efecto hipercrmico, que ocurre
cuando una solucin de DNA es calentada. Por otra parte, el DNA desnaturalizado es una cadena
flexible, pobremente enroscada y de cadena polielectroltica, muy dependiente de sus propiedades
hidrodinmicas en un ambiente inico. De hecho, el DNA desnaturalizado en solucin es bastante
similar al RNA de alto peso molecular, el cual muestra cierta estructura secundaria, sin significar que
esta este completa. Tambin, son estrechamente similares los polirribonucletidos sintticos de cadena
sencilla, sintetizados por la polirribonucletido fosforilasa.
 En general, la estructura secundaria del DNA nativo depende del contenido de sus bases
nitrogenadas Guanina y Citosina (G + C). Entre mayor sea el contenido de G + C, mayores sern
las fuerzas que mantienen juntas a las dos cadenas. Esto es posible debido a que la Guanina y la
Citosina pueden formar tres puentes de Hidrgeno cuando se encuentran apareadas en la
estructura de DNA, mientras que Adenina y la Timina pueden formar solo dos (ver Fig. 2.3).
El efecto hipercrmico es el incremento en la absorbancia observado cuando el DNA de
doble hlice es desnaturalizado a la forma de cadena sencilla. En un caso anlogo (Fig. 2.11), los
dos polirribonucletidos cido poliadenlico ( Adenosin Polifosfato) y cido poliuridlico ( Uridina
Polifosfato), cuando se encuentran mezclados tienen una absorbancia menor a 260 nm que aquella
calculada para ambos polmeros medidos por separado. Esto es porque estos polirribonucletidos
pueden formar pares de bases Adenina-Uracilo. En cuanto a los polidesoxirribonucletidos, se
espera que se comporten de manera similar. Otra forma de observar el efecto hipercrmico es
mediante la destruccin de la estructura de doble hlice a travs de la accin hidroltica de una
nucleasa (Fig. 2.12).
Adems, existe el efecto hipercrmico residual, el cual est presente an en los polmeros de
cadena sencilla medidos de manera separada, y que slo se pone de manifiesto cuando el polmero
se rompe en sus mononucletidos. Tambin los di y trinucleotidos presentan efecto hipercrmico
residual. Esto se debe presumiblemente a una interaccin entre bases vecinas ligadas o unidas una
a la otra como oligo o polinucletidos.
La estructura nativa del DNA es estable a un intervalo de pH entre 2.7 a 12 y la molcula se
desnaturaliza por encima o debajo de estos valores de pH. La configuracin del DNA es inestable a
temperatura ambiente cuando la fuerza inica es menor a 10-4 M. Si la densidad ptica a 260 nm se
lee a 25C para el DNA T2 (ver la curva en la Fig. 2.13a), se observar que no hay cambio en la
absorbancia cuando dicha solucin es calentada hasta que se alcanza una temperatura de
alrededor de 75C. Si se continua el calentamiento, la densidad ptica de la solucin de DNA
incrementar en un 35% aproximadamente, en un intervalo alrededor de 4C. Eventualmente, la
absorbancia se estabiliza a un valor caracterstico al del DNA desnaturalizado. El DNA
desnaturalizado puede ser detectado mediante una observacin al microscopio electrnico o por el
gran decremento en la viscosidad de la solucin de DNA.
Para describir el efecto hipercrmico cuantitativamente, podemos definirlo en trminos de
una temperatura Tm (temperatura media de desnaturalizacin) a la cual el proceso est
parcialmente completo. El valor de Tm es caracterstico para una clase particular de DNA y es
dependiente, a primera vista, del contenido de G + C en ese DNA a un pH y fuerza inica
especficos. De hecho, Marmur y Doty han deducido una ecuacin emprica:

Tm = 69.3 + 0.41 (G + C)

donde (G + C) es el contenido de Guanina ms Citosina en porcentaje molar del total del contenido
de bases. El cambio en la absorbancia es caracterstica y sorprendentemente brusco para el DNA,
indicando que la fusin de la estructura de doble hlice del DNA es un fenmeno cooperativo. En
otras palabras, tan pronto como unos cuantos pares de bases comienzan a separarse, hay una
inmediata facilitacin correspondiente de la fusin de los pares de bases vecinas. Tambin se
deduce que la conformacin del DNA original debe haber sido bastante perfecta y que la mayora, si
no es que todas, las bases son complementarias de sus pares de Watson-Crick.
Si la solucin calentada es enfriada rpidamente se obtiene la curva b (en Fig. 2.13a), a partir
de la cual se puede observar que la densidad ptica no regresa a su valor original, an a 25C. En
efecto, si existe un decremento en la absorbancia, pero es mucho menor que el incremento
esperado si las molculas de DNA regresaran a su conformacin original de doble hlice altamente
ordenada. Las preparaciones de DNA que fueron calentadas y enfriadas rpidamente, an
presentan una forma enroscada al azar a 25C, como se puede observar mediante la examinacin
al microscopio electrnico y por la medida de su viscosidad relativa.
 Si, por otro lado, la muestra de la solucin de DNA calentada ahora es enfriada
extremadamente lento, tomando tal vez 3 horas para descender la temperatura desde 91C hasta
48C, la absorbancia del DNA a 25 C regresa casi a su valor original; esto equivale a decir que la
estructura de doble hlice, con su apareamiento de bases correcto, est altamente, si no es que
completamente, restaurado. Marmur, Doty y sus colegas, han mostrado que, si este calentamiento y
enfriamiento, este proceso de recalentado, se lleva a cabo con DNA transformante biolgicamente
activo de D. pneumoniae, es posible recuperar una cantidad importante, tal vez un 70 %, de la
actividad biolgica original. Este alto porcentaje de reactivacin de la capacidad transformante
indica que la estructura exacta de doble hlice se restaura bajo estas condiciones, al menos en
algunas regiones de la molcula de DNA.
La temperatura ptima para la renaturalizacin del DNA bacteriano es de aproximadamente
25C por debajo de su Tm a una concentracin de Na+ 0.4 M. La concentracin de DNA debe
mantenerse baja (alrededor de 6 g/mL) para minimizar la agregacin. La renaturalizacin del DNA
es un proceso extraordinario, considerando la gran longitud de las dos cadenas sencillas
enroscadas al azar del DNA desnaturalizado, las cuales tienen que encontrar su posicin exacta de
apareamiento para poder as restaurar una doble hlice correcta. La renaturalizacin se lleva a
cabo mejor en molculas pequeas de DNA fgico y con mayor dificultad en las grandes molculas
de DNA de organismos superiores. El DNA de E. coli ocupa una posicin intermedia, dependiendo
del grado de fragmentacin de la preparacin de DNA. La facilidad de renaturalizacin est
relacionada con la probabilidad de que cualquier parte de una cadena sencilla de nucletidos
encuentre su secuencia complementaria y se aparee con ella. Una vez que se ha logrado esto, el
resto de las cadenas se renaturaliza rpidamente. La probabilidad de este inicio de la
renaturalizacin se incrementa en gran medida si el DNA es qumicamente entrecruzado antes de la
desnaturalizacin o si las cadenas permanecen ntimamente entrelazadas despus de la
desnaturalizacin.

FIGURAS
Nucletidos

Polmeros por separado

Mezcla de polmeros
-3
Coeficiente de exticin X 10

Longitud de onda (nm)

Fig. 2.11 Espectro de absorcin de las cantidades equimolares del cido poliadenlico y cido
poliuridlico. La curva superior se refiere a los mononucletidos obtenidos por hidrlisis alcalina.
 % de Incremento

DNA del Timo

Producto Enzimtico

Tiempo (horas)

Fig. 2.12 Incremento de absorcin en luz ultravioleta a 260 nm del DNA natural y sinttico tras la
digestin con desoxirribonucleasa pancretica.
Absorbancia relativa (260 nm)

Enfriado rpidamente
Enfriado lentamente
Nativo

Temperatura (C)
(a)

M. phlei

Serratia sp.

E. coli
Guanina + Citosina (%)

Esperma de salmn

Timo de ternera

Pneumococcus sp.

Levadura

Bacterifago T4r

Poly (AT)
Tm (C)
 Absorbancia relativa (260 nm)

Temperatura (C)
(b)

Fig. 2.13 (a) Efecto hipercrmico del calentamiento de DNA nativo y rpido lentamente de DNA
enfriado proveniente del bacterifago T2. La muestra a no fue calentada; la muestra b fue calentada
15 minutos a 91 C y enfriada de forma rpida; la muestra c fue tratada como la b, pero despus fue
recalentada y enfriada lentamente (165 minutos de 91 C a 48 C). Las absorbancias fueron
medidas en muestras dializadas despus de diluirlas 15 veces en una solucin Tris
(trisaminometano) buffer 0.021 M a pH de 7.5, que contiene 0.02 M de NaCl. (b) Relacin entre el
contenido de Guanina + Citosina a temperatura de desnaturalizacin (Tm) para varios DNAs en
0.15 M de NaCl y 0.015 M de Citrato.