NORTHERN BLOT

NORTHERN BLOT

Es una tcnica de deteccin de

molculas de cido ribonucleico
(ARN) de una secuencia dada
dentro de una mezcla compleja.
Este mtodo se utiliza muy
frecuente para realizar estudios
de expresin gnica.

El procedimiento usado en el
Northern bloot es exactamente el
mismo que el del Southern bloot ,
con la diferencia de que el
Northern bloot busca secuencias
en el ARN en vez del ADN
La tcnica consiste en extraer el RNA de las clulas
pertinentes y su posterior separacin por tamao
mediante electroforesis en gel. Las molculas de
RNA son transferidas y unidas al filtro, al igual que
en el Southern blot. Despus de la hibridacin con
una sonda marcada (y posterior a la deteccin segn
el mtodo de marcaje utilizado), las bandas en el gel
indican la ubicacin de los tipos de RNA que sean
complementarios a la sonda. Teniendo marcadores
de RNA de tamao adecuado, se puede conocer el
tamao de los RNA que se han identificado.
 1.Extraccion del RNA

Se extrae una muestra

de ARN ,debe tenerse
mucho cuidado para
impedir la degradacin
por las ribonucleasas
(ARNasas )para esto las
clulas y tejidos que
contienen ARN se
homogenizan en una
solucin que contenga
inhibidores de ARNasas ,
como el agente
enofropico
isotiacianato de Lisis con tiocianato de guanidina
guanidinio. inactivacin de RNasas.
Particin de DNA, RNA y protenas
en fenol cido (pH 5-6).
Precipitacin con isopropanol +
LiCl2.
Luego se separa el ADN del ARN y finalmente el ARN
purificado se precipita con etanol. Para el caso del ARN
mensajero se aprovecha la propiedad de que posea cola
de poli-A; en el primer paso el ARN celular total se pasa
por una columna que posee poli-dT unido a una fase
slida quedando el ARN retenido en fase slida cuando
se nela poli-dT quedando excluido el resto de ARN
celular.
Se desnaturalizan la muestra, a menudo la totalidad del
ARN celular, mediante tratamiento con un agente que
puede ser formamida o glioxal, que impide unin por
puente de hidrgeno entre los pares de bases, lo cul
asegura que todas las molculas de ARN presenten una
conformacin lineal no plegado.
 2.Electroforesis

Se separan los ARN de acuerdo con

su tamao, mediante electroforesis
en gel.
La electroforesis es un mtodo de
laboratorio en el que se utiliza una
corriente elctrica controlada con la
finalidad de separar biomolculas
segn su tamao y carga elctrica a
travs de una matriz gelatinosa.
Se usa la electroforesis en gel de
agarosa
3.Transferencia a una membrana
Existen 2 tipos de membranas

a) NITROCELULOSA
baja capacidad de unin de cidos nucleicos (80 g/ cc2)
frgil
carga negativa

b) NYLON
mayor capacidad de unin (400-500 g/cc2 )
mayor resistencia
carga neutra o positiva
Es necesario inmovilizar el RNA en la membrana y esto
se puede conseguir a travs de dos maneras:
a) Horno de vaco
Aplicable slo a membranas de nitrocelulosa
La membrana es tratada por 2 horas a 80 C. Al parecer el
RNA forma enlaces hidrofbicos con la membrana.
b) Irradiacin UV
Aplicable slo a membranas de nylon
La exposicin a la luz UV activa las bases T/U hacindolas
altamente reactivas con los grupos amino de la superficie de la
membrana y formando enlaces covalentes. Aumenta la
estabilidad y permanencia de los cidos nucleicos en la
membrana
4.GENERACION DE UNA SONDA

Las sondas son fragmentos

monocatenarios de DNA o
RNA marcados con una
molcula reporter, que
pueden ser enzimas,
sustratos antignicos,
radioistopos, los que se
pueden unirse con una alta
especificidad a una
secuencia complementaria
de cido nucleico de cadena
sencilla (diana), a fin de
hacer posible su posterior
deteccin y de esta manera
la identificacin de la
secuencia de ARN de
inters.
 5.Hibridacion

ste es un proceso de complementacin de pares de

bases entre dos hebras sencillas de ADN y ARN, o ARN s
pero cuyo origen es distinto; cuyo fin principal es
conseguir la mxima interaccin entre la sonda y la
molcula de cido nucleico que se quiere detectar.
PROCEDIMIENTO
La hibridacin se lleva a cabo en tres etapas:
a) Pre Hibridacin
b) Hibridacin
c) Lavados
Pre Hibridacin o bloqueo
Por qu?
La membrana une cidos nucleicos ,la sonda marcada puede
unirse de forma inespecfica y aumentar el ruido
Cmo?
La membrana es incubada con una solucin de prehibridacin
a la temperatura de hibridacin.
La solucin de pre-hibridacin contiene compuestos que se
unen inespecficamente a la membrana previniendo la unin de
la sonda a regiones de la membrana que no contienen su
hebra complementaria.
Hibridacin
Se expone el filtro a una zona de ADN con marca radiactiva con la cul
se produce una hibridacin ya que dicha sonda es complementaria al
ARN.
La cadena de mRNA que se quiere cuantificar se une con la sonda
complementaria se hibridizan de forma antiparalela, para forman
una molcula de doble cadena.
Esto se logra sumergiendo la membrana de fijacin en un buffer que
contiene la sonda.
Lavado
Al final del perodo de hibridizacin, se debe retirar el buffer de
hibridizacin y lavar los filtros para remover la sonda que est en
exceso, unida de manera inespecfica o unida con poca
complementariedad. Esto se lleva a cabo incubando la membrana en
una solucin que carece de sonda marcada y utilizando condiciones
que minimizan la hibridacin inespecfica(Estrictez)
*ESTRICTEZ
Una medida de la
habilidad de un
ac.nucleico de hebra
simple (sonda) de
discriminar entre
molculas con las que
comparte un alto o un bajo
grado de
complementariedad
Para lograr una meyor
estrictezse debe aumentar
la T,incluir
formamida,etc
6.Visualizacion

Captura de la radiacin ionizante

por una emulsin
fotogrfica
La membrana es expuesta a un
film por tiempos variables
El film es revelado y analizado
 APLICACIONES

Esta tcnica se ha aplicado en:

Se utiliza para detectar la presencia de molculas especficas de ARN en una
muestra especfica.
Proporciona informacin sobre molculas que hibridan. Por ejemplo, su tamao
molecular.
3.Se usan generalmente para caracterizar la identidad de genes especficos, para
localizar regiones codificantes o regiones reguladoras flanqueantes en secuencias
clonadas. Por ende, sirve para investigar la organizacin molecular de las
secuencias genmicas.
4.Se utiliza para examinar patrones de expresin gnica en tejidos embrionarios y
en adultos.
5.En la deteccin de cortes y empalmes alternativos del ARNm.
6.Tambin se aplica en la deteccin de mltiples tipos de transcritos proveniente
de un solo gen.
La transferencia de NORTHERN se utiliza tambin para caracterizar y cuantificar
la actividad transcripcional de un gen determinado en distintas clulas, tejidos u
organismos.
Es de suma importancia en el estudio de la modulacin de la sntesis de
interleucina 6 en pacientes con artritis reumatoide.
De su anlisis se rescata la secuencia y organizacin molecular.
Es indispensable en el anlisis de expresin de receptores que participan en la
sntesis de molculas en cultivos celulares.
5.En la deteccin de cortes y empalmes alternativos del
ARNm.
6.Tambin se aplica en la deteccin de mltiples tipos de
transcritos proveniente de un solo gen.
7.La transferencia de NORTHERN se utiliza tambin para
caracterizar y cuantificar la actividad transcripcional de un
gen determinado en distintas clulas, tejidos u organismos.
8.Es de suma importancia en el estudio de la modulacin de la
sntesis de interleucina 6 en pacientes con artritis
reumatoide.
9.De su anlisis se rescata la secuencia y organizacin
molecular.
10.Es indispensable en el anlisis de expresin de receptores
que participan en la sntesis de molculas en cultivos
celulares.
 VENTAJAS Y DESVENTAJAS

VENTAJAS Y DESVENTAJAS
Ventajas
-La muestra de ARN requiere un mnimo de procesamiento.
-La tcnica puede ser fcilmente evaluada (degradacin, lmite de deteccin).
-Nos permite reconocer el anlisis de mutaciones y alteraciones del RNAm de
enzimas, y en la regulacin de la expresin gnica de marcadores moleculares de
clulas leucmicas humanas y molculas del reconocimiento inmunolgico.

DESVENTAJAS
-El costo elevado de su elaboracin.
-La reproducibilidad de los datos no siempre es consistente. Este problema se ha resulto
parcialmente haciendo mediciones por duplicado (dos puntos en la matriz que corresponden al
mismos gen).
-Su resultado depende de la sonda que se utilice, de las propiedades qumicas de esta.
-Se requiere mucha masa de ARN (se requieren aproximadamente 20ug
de ARN total).