Capacidad citotxica de
clulas NK por
degranulacin frente a
melanoma.
Autores: Jose Antonio Cspedes Lagos, Ariana Joshkel Lima Ortiz
Resumen
Las clulas NK pertenecen a la
respuesta inmune innata, estas
tienen capacidad citotxica
mediante diferentes mtodos,
sobre clulas infectadas por virus
o clulas cancerosas. A diferencia
de los linfocitos T no necesitan
sensibilizacin previa por lo que
son una gran herramienta para la
inmunoterapia.
Las clulas NK desarrollan un
papel clave en la inmunoterapia
mediante la transferencia adoptiva
tanto autloga como alognica.
Estas necesitan ser activadas
previamente por interleucinas
como la IL-2 y pueden llevar a
cabo su funcin con ayuda de
otras herramientas como los
anticuerpos en su funcin de
inhibidores de checkpoints.
Se ha observado su eficacia
citotxica frente a clulas de
melanoma a travs de sus
granzimas y perforinas, sustancias
que inician la apoptosis de la
clula diana. Queda constancia de
ello debido a que, tras la liberacin
de estos granulos, quedan
marcadores en la membrana
superficial como son los CD107a/b.
Introduccin
El melanoma es un tipo de cncer
de piel, que se caracteriza por la
presencia de lunares y machas en
la piel de forma, color y tamao
irregular. Afecta a los melanocitos,
clulas que se encargan de
producir el pigmento melanina que
otorga el color caracterstico de la
piel. Las clulas de nuestro
sistema inmune que se encargan
de reconocer y eliminar las clulas
cancerosas, son las clulas NK de
la respuesta inmune innata y los
linfocitos T CD8+ de la respuesta
inmune adaptativa.
En concreto hablaremos sobre las
clulas NK, que a diferencia de los
linfocitos T, no necesitan una
sensibilizacin previa para su
activacini,ii. La activacin de estas
se produce a travs de receptores
inhibidores y activadores, hacen
un balance entre las seales y se
activa o no. El principal ligando
para estos receptores es el
complejo mayor de
histocompatibilidad (MHC) clase I,
mientras mayor nmero de estos,
mayor resistencia a las clulas
NKiii,iv.
Las clulas NK tienen varios
mtodos para llevar a cabo su
funcin citotxica frente a clulas
tumorales, pueden producir
citoquinas como el interfern
gamma o el factor de necrosis
tumoral, pero tambin puede
matar directamente a las clulas
tumorales mediante la liberacin
de perforinas y granzimasv.
El melanoma es un tumor muy
agresivo que se origina en los
melanocitos. Es considerado el
cncer con mayor tasa de
mortalidad, teniendo una gran
tendencia a la metstasisvivii. Las
clulas de melanoma pueden ser
reconocidas y eliminadas por
linfocitos CD8 y clulas NK,
expresan antgenos tumorales y
ligandos para receptores
activadores de las clulas NK. Una
prdida de la expresin de MHC-I
permite escaparse a la accin de
los linfocitos T CD8 pero a la vez
aumenta la capacidad de las
clulas NK. Esta prdida de
expresin de MHC-I convierte a las
clulas del melanoma en buenas
dianas contra las clulas NKviii.
El papel clave de las clulas NK
como primera lnea de defensa
contra tumores ha sido establecida
en enfermedades hematolgicas
basadas en el efecto injerto contra
leucemiaix. Sin embargo su papel
contra tumores slidos es menos
conocidox.
Las clulas NK expresan varios
receptores activadores que al
enlazarse a sus ligandos liberan
los grnulos citotxicos que
promueven la apoptosis en la
clula diana.
Una caracterstica del melanoma
es la alteracin de la expresin del
MHC-Ixi. Esto afecta a los
mecanismos citotxicos de las
clulas NK.
Las clulas tumorales de
melanoma expresan en su
superficie varios antgenos como
son MICA o ULBPs, se ha
observado que estos son ligandos
de receptores activadores
especficos de las clulas NK como
el NKG2Dxii. Otra familia de
receptores son los receptores
naturales de citotoxicidad (NCR),
los cuales se han observado que
tienen un papel fundamental en la
liberacin de grnulos por el
reconocimiento de ligandos de
clulas de melanomaxiii. Esta
especificidad de ligandos por parte
del melanoma para receptores
especficos de las clulas NK las
vuelve una herramienta muy
potente para este tipo de cncer
concreto.
Por estas caractersticas las
clulas NK podran ser una buena
opcin para un tratamiento de
inmunoterapia. Un uso de estas
podra realizarse con una
expansin previa in vitro, en un
cultivo con interleucina 2 (IL-2) o
interleucina 15 (IL-15) debido al
efecto de expansin y activacin
sobre las clulas NK, las cuales
pueden ser utilizadas
posteriormente en un tratamiento
de transferencia adoptiva al igual
que los linfocitos Txiv.
Un tratamiento de inmunoterapia
basado en transferencia adoptiva
contra el cncer debe enlazar la
respuesta inmune innata y la
adaptativa. Las clulas NK
deberan contribuir a la respuesta
inmune adaptativa favoreciendo la
maduracin de las clulas
xv
dendrticas . Las clulas NK
activadas tanto por IL-2 o clulas
dendrticas inducen la maduracin
de clulas dendrticas y la
maduracin de linfocitos T CD4 a
travs de las clulas dendrticas.
Un cocultivo de clulas dendrticas
y lymphokine-activated killer
(LAK) resulta en la activacin de
clulas NK y la produccin de
citoquinas inflamatorias y la lisis
de clulas de melanomaxvi.
El uso de clulas NK autlogas
fueron usadas en un paciente de
melanoma demostrando una
remisin total de la metstasis
debido a la combinacin del
tratamiento de LAK e IL-2. La
expresin de receptores
activadores se ve desregulada en
pacientes con cncer, por tanto, la
eficacia de la expansin de clulas
NK autologas est limitada.
Otra opcin es el uso de clulas NK
alogenicas, se ha observado que l
activacin de receptores activador
junto a la administracin de
anticuerpos antitumorales tiene
efectos anticancergenos que en
combinacin con clulas NK
alognicas y terapia basada en
anticuerpos puede ser una buena
estrategia para luchar contra el
cncerxvii. Se han observado en
varios pacientes un gran avance
frente a la enfermedad siguiendo
estos tratamientos.
La transferencia adoptiva de
clulas NK tiene sus limitaciones
debido a la dificultad de la
expansin y la baja eficacia de
transduccinxviii.
Uno de los mayores checkpoints
de clulas NK es el receptor
inhibidor de MHC-I. Una estrategia
til frente a esto, seria utilizar
anticuerpos para bloquear estos
checkpoints, y que las clulas NK
tuvieran un balance positivo en
cuanto a su activacin, reduciendo
la capacidad de los receptores
inhibidoresxix.
Otra opcin en cuanto a la
transferencia adoptiva es el uso de
clulas NK modificadas con
receptores quimricos (CAR).
Consisten en un dominio externo
que reconoce un antgeno tumoral,
enlazado a uno o ms dominios
intracelulares que desencadenan
en la activacin de las clulas NK xx.
Hiptesis y objetivos.
En nuestro experimento
realizamos una extensin de
clulas LAK en un cocultivo con IL-
2, lo que debera resultar en una
proliferacin y activacin de estas,
al juntar nuestras clulas LAK con
las clulas de melanoma, las LAK
deberan ejercer su capacidad
citotxica mediante granzimas y
perforinas debido a la expresin de
MHC-I, que libera la accin de las
clulas NK.
Al juntar las clulas LAK con
distintas clulas de melanoma
deberan liberar estas perforinas y
granzimas, lo que ser observable
gracias a la presencia de
marcadores como CD107a/b que
permanecen presentes en el
exterior de la membrana una vez
se liberan los grnulos. Estos
grnulos inician la apoptosis de las
clulas dianas.
Se espera observar tambin que al
bloquear la expresin de MHC-I
que activa los receptores
inhibidores, aumente la cantidad
de grnulos liberados.
Con esto se pretende obtener un
cultivo de clulas LAK activas que
puede ser utilizadas en
transferencia adoptiva autloga o
alognica en pacientes con
enfermedades cancergenas como
el melanoma.
Material
Biolgico
Muestra de sangre perifrica
Reactivos inmunologicos
Kit Ficoll-Hypaque
Kit aislamiento clulas NK
columnas magnticas MACS
Medio LAK
Interleucina humana recombinante
IL-2
Inhibidor de transporte de
protena, Monesina
Control isotipico de raton IgG1
HLA ABC purificado
Marcadores de subpoblaciones
linfoides
Marcador intracelular CD107a
Anticuerpo humano CD56
Anticuerpo humano CD3
Lineas celulares de melanoma
OISTER
K562
721.221
EST-136
EST-146
Material plstico y otros
Tubos cnicos, pipetas, placas de
Petri, tubos Eppendorf, placas con
pocillos
Cmara de Neubauer, porta y
cubre objetos.
Mtodo
1.Aislamiento y cultivo de
clulas NK
1.1 Extraccin de clulas
mononucleares de sangre
perifrica
A partir de sangre perifrica del
donante se separaron las clulas
mononucleares (CMSP) utilizando
la tcnica de separacin por
gradiente de densidad con Ficoll-
Hypaque. Para emplear esta
tcnica se realiz una dilucin de
la muestra sangunea con solucin
salina estril a un ratio 1:1. Dicha
dilucin se agreg suavemente
sobre el Ficoll y se centrifugo a
1500 rpm durante 30 min.
Tomando cuidadosamente el tubo
se retir la banda de CMSP
utilizando pipetas Pasteur de
plstico y se dispens en un tubo
nuevo para realizar el lavado de
las clulas.
1.2 Aislamiento de clulas
NK
Se realiz la separacin de clulas
NK de las CMSP mediante el uso
de esferas superparamagneticas
unidas a anticuerpos con el kit
comercial MACS. Para realizar esta
separacin se utilizaron esferas
CD33Micro Beads, por lo que la
seleccin fue de tipo negativa. Una
vez aadidas a la muestra las
microesferas, se hizo pasar la
muestra a travs de una columna,
en donde quedaron retenidas las
clulas que se unieron a las
microesferas y solo pasan las
clulas NK que son las de inters.
Estas clulas se proliferarn en un
medio de cultivo enriquecido con
IL2.
1.3 Marcaje extracelular
CD107a/b para medicin
indirecta de citotoxicidad.
Se contaron las clulas efectoras y
LAK obtenidas con la cmara de
Neubauer y se ajustaron a un ratio
2:1. Posteriormente se
resuspendieron dentro de una
placa con pocillos en 100 u/L del
medio RPM1640 C.
Se separaron e incubaron las
clulas de melanoma que llevaban
el anticuerpo anti-HLA1. Se
aadieron a una placa de 96
pocillos en fondo U los siguientes
reactivos: Golgi stop, 100ul de
clulas diana, 100 ul de clulas
efectoras y el marcador CD107a/b.
La placa se centrifugo e incubo a
37C y 5% de CO2
1.4 Citometra de flujo
El anlisis se realiz por citometra
de flujo mediante grficos del tipo
histograma, donde la proliferacin
se observa como la aparicin de
nuevos picos
1.5 Estadistica
Se utiliz el programa SPSS 19 Tabla1. Prueba Kolmogorov-Smirnov de lnea
para comprobar si se tena una
de melanoma 136 para designar normalidad
distribucin normal, utilizando
Kolmogorov Smirnov y Shapiro Contr
Wilk. Posteriormente se ol 721 136-
corroboraron estos resultados con
CD10 /22 antiH
el empleo de graficas P-P para
datos cuantitativos. Al ser 7 1 136 LA
muestras relacionadas y con N 4 4 4 4
distribucin normal, se realiz la Parmetros Media 14.65 32. 20. 19.60
prueba de T de student para a,b
normales 00 200 100 00
identificar si las diferencias entre
las lneas de melanoma y 0 0
bloqueantes con respecto del Desviacin 3.763 7.7 5.8 6.508
control eran estadsticamente tpica 42 833 985 97
significativas. Finalmente se
2 9
elabor una grfica de barras con
barra de error para representar los Diferencias Absoluta .259 . . .287
datos encontrados. ms 264 414
extremas Positiva .259 . . .287
Resultados
264 414
Negativa -.179 -.21 -.26 -.182
3 0
Z de Kolmogorov- .519 . . .573
Smirnov 528 828
Sig. asintt. (bilateral) .951 . . .897
943 499

a. La distribucin de contraste es la Normal.

b. Se han calculado a partir de los datos.

Ya que en la prueba de Kolmogorov-

Smirnov = p>0.05 se rechaza la
hiptesis nula y se afirma que las
variables cumplen con una
distribucin normal
 Tabla 2. Prueba Kolmogorov-Smirnov de lnea
melanoma, 136 y 136 anti-HLA en
comparacin con el control, estos
de melanoma 146 para designar normalidad datos son estadsticamente
Contr significativos p>0.05. La relacin
entre el bloqueante y el control no es
ol 146-
estadsticamente significativa
CD10 K5 antiH p=0.027. Los valores obtenidos con
7 62 146 LA melanoma (136) son ms elevados
que en presencia del bloqueante anti-
N 4 4 4 4
HLA, esta diferencia observada es
Parmetro Media 14.65 29. 53. 26.50 estadsticamente descriptiva p>0.05
s 00 125 600 00
a,b
normales 0 0
Desviacin 3.763 5.4 68. 5.438
tpica 42 847 432 75
Porcentaje de expresin de CD107
5 69
*
Diferencias Absoluta .259 . . .275
ms 268 413
extremas Positiva .259 . . .275
268 413
Negativa -.179 -.2 -.27 -.220
15 8
Z de Kolmogorov- .519 . . .549 * T-Student p>0.05
Smirnov 537 825 Figura 2. Se presenta mayor nmero
Sig. asintt. (bilateral) .951 . . .924 de eventos en las lneas de
melanoma, 146 en comparacin con
935 504
el control, estos datos son
a. La distribucin de contraste es la Normal. estadsticamente significativos
b. Se han calculado a partir de los datos. p>0.05. La relacin entre el
bloqueante y el control, as como 146
Ya que en la prueba de Kolmogorov- anti-HLA y control no son
Smirnov = p>0.05 se rechaza la estadsticamente significativas
hiptesis nula y se afirma que las p=0.001. Los valores obtenidos con
variables cumplen con una melanoma (EST146) son menos
distribucin normal elevados que en presencia del
bloqueante anti-HLA, esta diferencia
observada no es estadsticamente
significativa p=0.01

Porcentaje de expresin de CD107

Discusin
Las clulas NK son clulas de la
* * respuesta inmune innata con
capacidad de destruir clulas
infectadas por virus o clulas
tumorales. Sus mtodos de accin
son mediante citoquinas o
mediante la liberacin de grnulo
de perforinas y granzimas, al
* T-Student p>0.05 liberar el contenido de estos
Figura 1. Se presenta mayor nmero grnulos se puede observar
de eventos en las lneas de marcadores extracelulares
CD107a/b en la superficie los
cuales sirven como medida ms rpidas y efectivas en ciertas
indirecta de la capacidad ocasiones como la que puede
citotxica de la celula NK. presentar una clula cancerosa
Hemos observado que las clulas que no expresa MHC-I frente a un
LAK en cultivo con clulas de linfocito T CD8, por ello un trabajo
melanoma tras la extensin e conjunto a anticuerpos que
incubacin con IL-2 ha aumentado bloqueen los checkpoints de MHC-I
la expresin de marcadores
que activa los receptores
CD107a/b en todos los casos, por
inhibidores sera interesante como
lo que se corrobora el papel de
esta interleucina en la activacin terapia frente al cncer, una
de las LAK y el papel citotxico de posibilidad en cuanto al futuro de
LAK sobre las clulas de esta investigacin seria la
melanoma. En el caso de las lneas caracterizacin de estos ligandos y
146 que expresaban MHC-I para receptores caractersticos para
receptores inhibidores, se ha seguir profundizando en la buena
observado que al aplicar antgenos respuesta obtenida. Otro caso que
anti-HLA ha aumentado la hemos visto es el efecto nulo de
presencia de marcadores anticuerpos en cuanto a inhibicin
CD107a/b en la superficie celular de MHC-I en 136 por lo que
por lo que podemos confirmar que podramos intentar averiguar qu
la terapia de clulas LAK mecanismos de escape podran
extendidas con anticuerpos ha estar utilizando estas clulas e
aumentado la eficacia para este
intentar solucionar este problema,
casoxxi, sin embargo en la lnea
como puede ser la observacin de
celular 136 observamos que la
variacin entre el cultivo con LAK y produccin de citoquinas por parte
el cultivo de LAK ms anticuerpos de las clulas tumorales que
no genera varianza, es decir la podran ser inmuno supresoras, las
capacidad citotxica al inhibir los cuales podramos observar por
ligando de receptores inhibidores citometria o podramos aadir
sigue siendo el mismo. Podemos nuestras LAK a un cultivo con
decir que en este caso esta lnea anticuerpos que inhiban la accin
celular est evadiendo la de estas sustancias y observar el
capacidad citotxica de otra forma posible aumento de citotoxicidad,
sin que implique los ligandos MHC- tambin podra tratarse de un
I. mecanismo basado en la
Conclusiones. solubilizacin de los ligandos por
Debido a la eficacia de las clulas parte de las clulas de melanoma.
LAK sobre clulas cancerosas de Un punto de vista interesante sera
melanoma podemos tener en analizar la expresin de ligandos
cuenta las clulas NK para la para receptores activadores,
transferencia adoptiva como debido a que es un balance entre
herramienta inmunoterapica frente seales, si no fuera posible evitar
al cncer. la inhibicin sera interesante
aumentar la cantidad de seales
Lneas futuras de activadoras.
investigacin.
Aunque hemos visto que la
La parte ms interesante de expansin se realiza con IL-2,
trabajar con clulas NK es su podra experimentarse con otras
activacin sin una previa como la IL-15 para evitar la
sensibilizacin, lo que las hace toxicidad de la IL-2.
El efecto de las clulas NK se basa mencionado; e inhibir la actividad
en un balance entre receptores de los receptores inhibidores.
activadores e inhibidores, sera
interesante indagar en el aumento
de la actividad de los activadores
como por ejemplo con ingeniera
gentica a travs de los CAR,
aumentar su efectividad mediante
el uso de anticuerpos o
interleucina como ya hemos
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