Introduccin

BamHI (de Bacillus amyloli) es una endonucleasa de

restriccin de tipo II, que tiene la capacidad de reconocer
secuencias cortas (6 p.p.) de ADN y especficamente
escindirlas en un sitio diana. Esta exposicin se centra en
las relaciones estructura-funcin de BamHI como se
describe por Newman, et al. (1995). BamHI se une a la
secuencia de reconocimiento 5'-GGATCC-3 ', y escinde estas
secuencias justo despus de la 5'-guanina en cada hebra.
Esta escisin da como resultado "extremos pegajosos" que
son 4 p.e. largo. En su forma no unida, BamHI muestra una
hoja b central, que reside entre hlices. BamHI es una
molcula extraordinariamente nica en el sentido de que
experimenta una serie de cambios conformacionales no
convencionales sobre el reconocimiento del ADN. Esto
permite que el ADN mantenga su conformacin normal de
B-DNA sin distorsionar para facilitar la unin a enzimas.
BamHI es un dmero simtrico. El ADN se une en una
hendidura grande que se forma entre los dmeros; La
enzima se une de una manera "crossover". Cada subunidad
BamHI hace que la mayora de sus contactos de la columna
vertebral con los fosfatos de un medio sitio de ADN pero se
establezcan contactos de pares de bases entre cada
subunidad BamHI y bases nitrogenadas en el surco principal
de la mitad del sitio de ADN opuesto. La protena se une a
las bases a travs de puentes de hidrgeno directo o
enlaces H mediados por el agua entre la protena y cada
grupo donante / aceptor de enlace-H en la ranura principal.
Los contactos principales de la ranura estn formados por
tomos que residen en el extremo amino de un haz paralelo
de 4 hlices. Este haz marca la interfase del dmero BamHI
y se cree que los momentos dipolares de los tomos NH2-
terminales en este haz pueden contribuir a la estabilizacin
electrosttica.
II. Estructura enzimtica

Son dignas de mencin varias caractersticas de la

estructura monomrica BamHI. En primer lugar, una hoja
central b mezclada (hilos b 3, b 4, b 5, b 6, b 7, y b 1) est
flanqueada por grupos de hlices. Dentro de la hoja b
mezclada, se pueden encontrar algunos motivos
estructurales. Un meandro b anti-paralelo est compuesto
de hilos 3-5. En un extremo de este meandro b, se
encuentran tres residuos catalticos (Asp94, Glu111 y
Glu113). Este grupo reside en estrecha proximidad a un
grupo de fosfato scissile. Este fosfato escindible se coloca o
se excluye del sitio activo de la enzima, dependiendo de la
conformacin que adopte la protena (no mostrada). Los
hilos b paralelos 5-7 forman parte de un pliegue de unin
de mononucletidos. Este pliegue tambin incluye unas
hlices 4 y 6, que han sido identificadas como las hlices de
cruce. Cuando dos dimerizan dos subunidades simtricas, el
centro del complejo BamHI est formado por un 4 y un 6, a
partir de las subunidades izquierda y derecha. Juntas, las
cuatro hlices forman un haz paralelo de cuatro hlices. El
extremo NH2 de este haz se proyecta hacia la ranura
principal del ADN, y como se ha indicado anteriormente, la
enzima BamHI sufre cambios conformacionales marcados
tras la unin al ADN. Los medios por los cuales BamHI se
reorganiza son nicos en muchos aspectos.

III. BamHI experimenta cambios conformacionales

marcados tras la unin del ADN

Tras la unin al ADN, la molcula BamHI experimenta una

serie de cambios conformacionales nicos. El cambio
principal implica las hlices carboxi-terminales de cada
subunidad. En la forma de enzima libre, estas regiones se
ordenan, pero al unirse al ADN, estas hlices se
desenrollan, adoptando una estructura secundaria
helicoidal parcialmente desordenada, denominada brazo. El
surco menor de ADN acomoda el brazo desde la subunidad
derecha. El brazo de la subunidad izquierda sigue el
esqueleto azcar-fosfato del ADN (vase ms abajo). La
posicin de cada brazo con respecto al ADN se estabiliza
mediante un solo enlace de hidrgeno que se forma entre el
grupo amino del residuo Gly 194 y el grupo fosfato del
nucletido T7 sobre el ADN (mostrado aqu para el brazo
derecho). Aunque el brazo derecho encaja en el surco
menor, haciendo mltiples contactos de ADN, el brazo
izquierdo entra en contacto con el esqueleto de ADN (PO4)
directamente en el residuo Met 198. El brazo de la
subunidad izquierda muestra ms residuos bsicos que se
enfrentan al ncleo de la enzima. Arg201 forma un puente
salino con el residuo interno Glu69. Lys204 se mueve luego
cerca del grupo carbonilo de Asn 73. Adems, la colocacin
del brazo izquierdo se estabiliza a travs de la proximidad
cercana de Trp 206 con Tyr 75 y Tyr 96.

Otro cambio conformacional que se produce en la unin de

BamHI-ADN es un cambio en la estructura cuaternaria de la
enzima. Este cambio est marcado por una rotacin de las
subunidades BamHI, disminuyendo el ngulo entre las
subunidades en el lado de la hendidura de unin a ADN en
aproximadamente 19 grados. Esta accin "pinza" el ADN. La
hendidura estrechada que resulta se muestra por la
proximidad de Gly194s de cada subunidad en la enzima
unida a ADN (21 Angstroms frente a 31 Angstroms en la
enzima libre). Se predice que esta rotacin permite BamHI a
hacer muchos contactos con la columna vertebral de ADN
que sera de otra manera imposible.

Otro cambio conformacional de BamHI inducido por unin

implica una cadena corta de residuos que conectan b3 y b4.
Los residuos Pro79-Gly91 aparecen desordenados en la
forma no unida de BamHI, pero al unirse al ADN, los
residuos 81-84 se convierten en un 3A. Sin embargo, los
residuos 89-91 mantienen una conformacin extendida.
Esta regin reside en estrecha proximidad a la espina dorsal
del fosfato de azcar del ADN entre Thy3 y Gua4. La
presencia de glicina (residuos 90 y 91) proporciona
flexibilidad, permitiendo que esta regin siga la cadena
principal del ADN sin impedimentos estricos severos. Debe
observarse que esta regin tambin forma parte de la
interfaz de dmero BamHI, adems de un 4 y un 6 de cada
subunidad. Esta regin hace contactos con un 6 de cada
subunidad.

Otro cambio conformacional que BamHI sufre tras la unin

al ADN es el reordenamiento estructural de los residuos
152-157. stos forman un bucle que viene antes de la
hlice a 6. El reordenamiento est marcado por el resto
Arg155 girando su cadena lateral 90 grados respecto a su
posicin en la enzima libre. Al reordenarse, esta cadena
lateral gana la capacidad de realizar contactos que son
especficos para Gua3. La conformacin se estabiliza
mediante un enlace de hidrgeno que se forma entre el
oxgeno de Arg155 y el nitrgeno de Ile 117.

V. Sitios de Reconocimiento entre BamHI y ADN

La enzima BamHI es capaz de hacer un gran nmero de

contactos con el ADN. El enlace de hidrgeno mediado por
agua, as como las interacciones de cadena principal y de
cadena lateral ayudan en la unin de la secuencia de
reconocimiento de BamHI. En el surco principal, la mayora
de los contactos enzima / ADN tienen lugar en el extremo
amino del haz paralelo de 4 hlices, constituido por a4 y a6
de cada subunidad. Aunque un 6 de cada subunidad no
entra en el surco principal del ADN, sus bucles precedentes
interactan con los extremos exteriores del sitio de
reconocimiento. Por el contrario, un 4 de cada subunidad
entra en la ranura principal en el centro de la secuencia de
reconocimiento. Se forman un total de 18 enlaces entre la
enzima y el ADN a travs de la secuencia de
reconocimiento de 6 pares de bases (12 enlaces directos y
6 mediados por agua). Como se discuti anteriormente, las
subunidades L y R se unen de una manera cruzada, por lo
que la subunidad R de BamHI contacta con la mitad del sitio
de ADN izquierdo de la secuencia de reconocimiento. La
unin de cada subunidad BamHI es precisamente la misma
que su pareja simtrica. El sitio de reconocimiento para
BamHI tiene una secuencia palindrmica que se puede
cortar por la mitad para facilitar la presentacin de enlaces.

El bucle enzimtico que consiste en los restos 152-157 se

une con el par de base G-C exterior de la secuencia de
reconocimiento BamHI. Arg155 L dota dos enlaces de
hidrgeno a Gua4R. La unin de Arg155L y Gua4R no est
en la conformacin estndar de modo que Glu161L se une a
Arg155L para estabilizar esta conformacin de unin.
Asp154 L forma un enlace de hidrgeno con Cyt9 L. La
unin entre la arginina y la guanina es comn en muchas
interacciones protena / ADN. [Sintase libre de mover la
molcula alrededor para ver todos los enlaces, ya que los
botones siguientes posicionarn la molcula en su
orientacin correcta.]

Para el segundo par de bases G-C de la secuencia de

reconocimiento, la unin se lleva a cabo con el extremo
amino de un 4, el bucle precediendo a un 6 (152-157), as
como una molcula de agua. Esta secuencia implica la
donacin de un enlace de hidrgeno a Gua5R de Asn116 L.
El enlace deriva del grupo amino terminal, y la interaccin
se posiciona apropiadamente con otro enlace de hidrgeno
que es compartido por un oxgeno de Asn116L y el N del
principal Cadena (Ser118 L). Una molcula de agua, que se
mantiene en su lugar por un enlace de Asn 116 L y dos
enlaces de Arg 122 R, tambin se une a Gua 5 R. Asp 154 L
se une a Cyt 8 L para satisfacer el potencial de enlace de
hidrgeno. [Sintase libre de mover la molcula alrededor
para ver todos los enlaces, ya que los botones siguientes
posicionarn la molcula en su orientacin correcta.]

En contraste con el segundo par de bases G-C descrito

anteriormente, el par de bases A-T interno participa en un
solo enlace de hidrgeno con la protena. Este enlace se
forma entre Thy7 L y Asn116 L. Asn 116 L, en virtud de dos
donaciones de enlaces H, sirve para puentear Gua5 R y
Thy7 L. La adenina de este par de bases AT, en lugar de
participar en enlaces de hidrgeno con la enzima , Est
implicado en el mantenimiento de las interacciones con 3
molculas de agua altamente localizadas, que se
mantienen en su lugar por enlaces con Asn116 L, Ser118 L
y Asn116 R, por no mencionar los enlaces entre s.
[Sintase libre de mover la molcula alrededor para ver
todos los enlaces, ya que los botones siguientes
posicionarn la molcula en su orientacin correcta.]

Nteracciones en el surco menor de ADN tambin estn

presentes en el complejo BamHI / ADN. Esta unin se lleva
a cabo por el brazo de subunidad derecha del dmero
BamHI, como se ha comentado anteriormente. El R-brazo es
capaz de interacciones con los dos sitios de reconocimiento
de ADN. Se forman enlaces de hidrgeno entre Asp196R y
Gua5R, Gly197R y Cyt8L y Met198R y Thy7R. Adems, las
fuerzas de van der Waals ayudan a estabilizar el complejo.
Finalmente, el complejo enzima / ADN se caracteriza por
mltiples interacciones entre la enzima y el esqueleto
azcar-fosfato del ADN. Cada una de las subunidades
BamHI hace 11 enlaces H directos a la columna vertebral
del ADN, adems de ~ 8 interacciones mediadas por agua.
Los residuos que participan en estas interacciones son el
amino-terminal de a3 (57-61), la regin ordenada antes de
b4 (89-91), el amino-terminal de un 4 (111-126), el amino-
terminal de un 6 (146 - 165), y finalmente, los residuos 193
y 194 (inmediatamente antes del brazo de rea terminal
COOH replegado). Las dos subunidades BamHI se solapan
en contacto con los tomos de la columna vertebral de ADN
de los cuatro nucletidos centrales de la secuencia de
reconocimiento BamHI.