Digitally signed by

Library TUM
Reason: I attest to the
accuracy and integrity
of this document
UNIVERSITATEA TEHNIC A MOLDOVEI

MICROBIOLOGIA GENERAL

Note de curs
Partea II

Chiinu
2015
UNIVERSITATEA TEHNIC A MOLDOVEI

FACULTATEA TEHNOLOGIE I MANAGEMENT N

INDUSTRIA ALIMENTAR
CATEDRA TEHNOLOGIA PRODUSELOR ALIMENTARE

MICROBIOLOGIA GENERAL

Note de curs
Partea II

Chiinu
Editura Tehnica-UTM
2015
1
 Notele de curs la disciplina Microbiologia general sunt
destinate studenilor de la specialitile: 541.1 Tehnologia i
Managementul Alimentaiei Publice; 541.2 Tehnologia
Produselor Alimentare; 541.3 Tehnologia Vinului i a Produselor
Obinute prin Fermentare; 552.2 Biotehnologii Industriale; 551.8
Inginerie i Management n Industria Alimentar, Facultatea
Tehnologie i Management n Industria Alimentar, cu forma de
nvmnt la zi i cu frecven redus.
Materialul este structurat n trei pri i este prezentat n
conformitate cu programul de nvmnt universitar de licen,
UTM. Partea a II-a cuprinde compoziia chimic i nutriia
microorganismelor, medii nutritive, creterea i multiplicarea bacteriilor,
metodele de izolare i obinere a culturilor pure.

Autori: dr., conf. univ. Luiza SANDULACHI

dr., conf. univ. Liliana POPESCU
dr., conf. univ. Viorica BULGARU

Redactor responsabil: dr., conf. univ. Luiza SANDULACHI

Recenzent: dr., conf. univ. Aurelia CHIRSANOVA

UTM, 2015
2
 INTRODUCERE

Microbiologia este tiin biologic fundamental, care studiaz

morfologia, fiziologia i sistematica microorganismelor, originea i
evoluia lor, fenomenele de ereditare i variabilitatea microbian,
cuprinznd un sistem organizat de cunotine privind legile dup care se
desfoar viaa microorganismelor.
Microbiologia general studiaz legile de dezvoltare a tuturor
grupelor de microorganisme i a rolului lor n circuitul azotului i
carbonului n natur.
Cunoaterea particularitilor microorganismelor permite
dezvoltarea unor aplicaii n diferite domenii ale agriculturii, industriei
alimentare, industriei farmaceutice, industriei chimice, a proteciei
mediului etc. n acest context este necesar a studia nu doar aspectele
legate de cultivarea microorganismelor, conservarea, ameliorarea prin
metode convenionale (mutaie i selecie a mutantelor de interes), ci i
utilizarea lor practic pentru obinerea unor produse specifice.
Obiectivele cursului sunt:
- studierea proprietilor culturale i morfologice ale bacteriilor,
levurilor, fungilor i virusurilor (expuse n partea I a cursului);
- cunoaterea caracterelor morfologice i fiziologice ale
principalelor grupe de microorganisme cu implicaii n industria
alimentar (drojdii, mucegaiuri, bacterii, virusuri);
- studierea compoziiei chimice a microorganismelor;
- studierea nutriiei microorganismelor i a factorilor ce controleaz
creterea microbian;
- nsuirea metodelor de izolare i obinere a culturilor pure;
- studierea factorilor de control ai creterii microorganismelor
(factori extrinseci, intrinseci i implicii).

3
 1. COMPOZIIA CHIMIC A MICROORGANISMELOR

Microorganismele, n funcie de natura lor i condiiile de

cultivare, au compoziie chimic diversificat n care intr aceleai
elemente biogene ntlnite i n celelalte forme de via, formnd structuri
similare sau strict specifice i demonstreaz materialitatea lumii.
Celula microbian poate fi privit ca o fabric biochimic
mininatural, dar autonom, n care n mod continuu se prelucreaz
substane nutritive, se sintetizeaz noi substane necesare pentru via i se
elimin substanele inutile.
Cunoaterea compoziiei specifice a diverselor microorganisme
este important n cultivarea microorganismelor cu importan industrial,
deoarece diversele elemente care intr n compoziie trebuie asigurate n
mediu pentru ca celulei s nu-i lipseasc elementele necesare pentru
activitatea fiziologic. Un alt aspect l reprezint valoarea deosebit a unor
compui microbieni intracelulari care se pot obine avantajos pe diverse
ci biotehnologice [1, 8, 10].

1.1. Compoziia chimic a microorganismelor

Compoziia chimic a celulelor microbiene poate fi studiat
aplicnd urmtoarele metode [3]:
- colorarea selectiv prin metode citochimice i examinarea
microscopic. Astfel poate fi pus n eviden localizarea celular
a diferitor substane chimice. De exemplu, coloraia cu iod poate
pune n eviden amidonul i glicogenul sub form de granule
colorate n albastru i, respectiv, n negru brun; acidul osmic
coloreaz n negru picturile de grsime nesaturate etc.);
- izolarea substanelor chimice n stare pur, urmat de identificarea
i dozarea lor.
Citoplasma celulei microbiene const din 7080% ap i substan
de baz sau matrice. Substana de baz a citoplasmei conine structuri
foarte subiri filamentoase de diferite lungimi i granule ce reprezint n
sine molecule de proteine, lipide, hidrai de carbon i acizi nucleici. n
4
fracia solubil a citoplasmei, de rnd cu compuii cu mas molecular
mare, se conin de asemenea molecule cu mas molecular mic:
nucleotide, aminoacizi, substane minerale (tabelul 1) [3].

Tabelul 1. Compoziia chimic a celulei procariote [3]

Numrul
Component % din Diversitatea
aproximativ de
chimic masa total (tipuri)
molecule
Ap 70,0 40000000000 1
ADN 1,0 14 1
ARN 6,0 500000 3000
Proteine 15,0 1000000 3000
Nucleotide i
0,4 12000000 200
precursori
Aminoacizi i
0,4 30000000 50
precursori
Hidrai de carbon i
3,0 250000000 200
precursori
Lipide 2,0 25000000 50
Ioni 1,0 250000000 20
Deeuri i
0,2 15000000 200
intermediari

Prezena diverilor compui organici n citoplasma celulelor

microbiene asigur creterea densitii ei. Densitatea citoplasmei este de
300-8000 ori mai mare dect cea a apei i corespunde densitii glicerinei
sau unui sirop vscos.
Compoziia chimic a celulei bacteriene reprezint manifestarea
fenotipic a genomului bacterian. Pentru fiecare specie/tulpin bacterian
este caracteristic numrul i diversitatea micro- i macromoleculelor att
de natur organic, ct i anorganic.

5
 Compoziia chimic a bacteriilor nu este absolut. Fiecare specie
poate fi caracterizat prin variabilitatea fenotipic a componenei chimice
explicat prin intervenia factorilor mediului n realizarea informaiei
genetice bacteriene. Ca urmare, compoziia chimic a bacteriilor crescute
n medii optimale se deosebete ca i cantitate de proteine, glucide, lipide
etc. de reprezentanii aceleiai specii crescui pe medii incomplete.
Aceste variaii sunt explicate prin existena unor mecanisme
celulare de control a metabolismului bacterian n raport cu condiiile
mediului i cu necesitile vitale ale celulei.
Compoziia chimic a celulei procariote, sub raportul diversitii
elementelor chimice este similar celulei eucariote, elementele de baz
fiind: C, O, H, N, S, P, Na, Ca, Mg etc [1, 2, 8].
Substana uscat a celulelor microbiene este alctuit din dou
mari grupe de elemente [1]:
- macroelemente (elemente universale): C, H, O, N, S, P; de
asemenea n aceast grup mai intr Na, K, i Fe, necesare n
cantiti mari la unele microorganisme specifice;
- microelemente n cantiti de ordinul microgramelor din care
fac parte: Cu, Mg, Zn, Co .a. Dintre acestea Mg are un rol
important n creterea termorezistenei endosporilor bacterieni,
Co intr n componena vitaminei B12.
Celula procariot se deosebete de celula eucariot prin structura
constituenilor macromoleculari.
Cele mai numeroase date privind compoziia chimic cantitativ i
calitativ a bacteriilor au fost obinute prin studiul analitic al bacteriei
Escherichia coli. S-a constatat c Escherichia coli conine ntre 3000 i
6000 tipuri de diferite molecule dintre care [3]:
- sunt molecule mici (cu masa molecular mic) din care fac
parte i aa molecule simple ca CO2 i H2O;
- molecule complexe care formeaz rezerva de metabolii necesari
pentru utilizare n scopuri vitale (zaharurile, aminoacizii
proteinogeni, acizii organici, nucleotidele, coenzimele etc.);

6
 - macromolecule aa ca cca 200 tipuri de polizaharide i precursori,
50 tipuri de lipide, 106 polipeptide;
- ADN, ARN etc.
Apa reprezint componentul celular care predomin cantitativ,
constituind cca 75%-85% din greutatea umed a celulei vegetative.
Celulele n forma de spori practic nu conin ap liber.
n celula microbian apa se afl n dou stri:
- ap liber n citoplasm, ap folosit de ctre celula vie pentru
desfurarea normal a metabolismului;
- ap legat de compui organici: protide, acizi nucleici,
fosfolipide, sub forma unor straturi de molecule de ap cu rol n
funcionarea macromoleculelor organice [1, 3].
Apa ndeplinete un ir de funcii biologice semnificative cum ar fi:
1) apa celular - un sistem dinamic interacionnd puternic cu grupul
de tipul C-H; CH-NH, formnd ntre moleculele organice
legturi de hidrogen;
2) datorit formrii nveliului hidratat prin care moleculele de ap
ecraneaz moleculele ncrcate cu sarcin negativ, crete
stabilizarea n medii de dispersie i asigur funcionarea
macromoleculelor n sistemele vii;
3) apa liber - ca dielectric solubilizeaz srurile anorganice i le
disociaz n ioni; solubilizeaz de asemenea alcoolii alifatici i
acizii, multe substane heterociclice aromatice .a., participnd la
procesele de hidroliz, respiraie, nutriie.
n condiii extreme prin care se ndeprteaz apa intracelular
(evaporare, osmoz, congelare) prin pierderea apei libere, celula trece n
stare de anabioz.
Termenul anabioz descrie starea de via latent a celulei cnd
activitatea metabolic nu poate fi msurat, ca urmare a trecerii enzimelor
ntr-o stare inactiv. n funcie de procesul care conduce la instalarea
anabiozei se folosete urmtoarea terminologie [1]:
anhidrobioza - stare provocat de pierderea unei cantiti
mari de ap prin evaporare;
7
 osmobioza - stare care apare prin eliminarea apei cu ajutorul
soluiilor (de sare/zahr) cu o presiune osmotic ridicat;
criobioza - cnd are loc congelarea celulelor vii i
cristalizarea apei libere.
Deshidratarea celulei bacteriene are ca urmare diminuarea
activitii metabolice, iar reducerea maximal a apei libere duce la
ntreruperea activitii metabolice celulare.
Anabioza este o stare reversibil a sistemelor biologice care i
pstreaz energia suficient pentru reactivare, cnd apa devine
disponibil.
Biomasa celular obinut dup ndeprtarea apei, respectiv
substan uscat, este format din compui organici i anorganici.
Compuii organici reprezint 86-98% raportai la substana
uscat i ndeplinesc n celula microbian trei roluri de baz [1, 8, 10]:
- rol structural, intrnd n compoziia nveliurilor celulare; sunt
de natura hidrailor de carbon, exemplu: glucani, manani,
celuloze;
- rol funcional, participnd activ la desfurarea proceselor
metabolice, ca de exemplu: protide cu funcii enzimatice,
vitamine cu rol de coeziune, unele fosfolipide .a.;
- rol energetic, prin acumularea intracelular a compuilor de
rezerva de natur glucidic: trehaloza, glicogenul i incluziuni
lipidice.
n tabelul 2 sunt date valorile pentru compuii organici ntlnii n
principalele grupe de microorganisme [1].
Acizii nucleici
ADN dup Watson constituie circa 1/5 din coninutul celulei.
Cantitatea de ADN al celulei microbiene stabilete numrul-limit de
lanuri peptidice de proteine i enzime care pot fi sintetizate n celul.

8
 Tabelul 2. Compui organici ai principalelor grupe
de microorganisme
Grupe de Coninutul, %
microorganisme protide lipide acizi nucleici
Drojdii 45-55 1-6 4-10
Mucegaiuri 10-25 1-7 1-3
Bacterii 40-50 10-15 13-25
Virusuri 50-90 1-5 5-50

ARN se gsete n celula microbian sub trei forme diferite cum

ar fi mrimea moleculei, funcia i secvena bazelor din structura lor [3]:
ARN-mesager constituie cca 1/5 din ARN celular total i este de
aproximativ 1000 tipuri diferite. El asigur realizarea informaiei genetice,
transportnd mesajul genelor ADN spre ribozomi. La bacterii ARN-
mesager are o via scurt, deoarece degradeaz dup cca 1-2 minute
dup ce a fost sintetizat. Din aceast cauz celula procariot sintetizeaz
cca 1250025000 molecule de ARN-mesager n perioada unei generaii
celulare.
ARN-transport corespunde celor 20 tipuri de aminoacizi
proteinogeni.
ARN-ribozomal face parte din structura ribozomilor [3].
Protidele reprezint 50-55% din biomasa uscat. Structura lor
este similar cu cea ntlnit n produsele de origine vegetal sau animal
sau pot s prezinte caractere specifice (de exemplu: mucorine la
mucegaiurile inferioare). n general, protidele microbiene au compoziie
echilibrat n aminoacizi eseniali, spre deosebire de protidele de origine
animal. Acestea au o concentraie mai redus de aminoacizi cu sulf
metionin i cistein, iar spre deosebire de protidele vegetale conin mai
mult lizin i triptofan. Datorit coninutului ridicat de protide, biomasa
microbian (dup uscarea i inactivarea celulelor) se poate folosi n
nutriia animalelor sau a obinerii dup purificare a proteinelor folosite ca
aditivi alimentari [1, 2].

9
 n celula microbian numeroase protide ndeplinesc funcii de
biocatalizatori. Enzimele pot fi constitutive mereu prezent n celula vie
i adaptive (induse), endogene i exogene sintetizate ca urmare a adaptrii
metabolismului la noi condiii de mediu.
Din totalul proteinelor celulare l formeaz nucleoproteidele ce
intr n structura materialului nuclear/nucleu.
Unele bacterii pot produce protide cu efect toxic ca de exemplu
toxina butulinic produs de Clostridium botulinum, enterotoxinele
produse de bacterii ale g. Staphylococcus, enterotoxine produse de g.
Salmonella . a. [1].
Substanele de natur glucidic reprezint 16-40% i sunt
ntlnite n structura pereilor celulari (glucani, manani, celuloze) sau n
structuri extraparietale ale bacteriilor (dextran la Leuconostoc
mesenteroides, xanthan la g. Xanthomonas, acetat de celuloz la g.
Acetobacter, fosfomanani la drojdii).
Glucidele simple nu se ntlnesc n stare liber, fiind uor
metabolizate, dar intr ca uniti de baz n structura poliglucidelor sau a
acizilor nucleici (riboza, deoxiriboza). n celulele de drojdii i mucegaiuri
se acumuleaz n faza activ de cretere trehaloza, glicogenul, iar la
bacterii granuloza, substane ce pot fi consumate de celule n condiii de
nfometare.
Unele mucegaiuri pot produce substane toxice micotoxine de
natur hidrocarbonat [1].
Lipidele intr n structura membranelor, a incluziunilor libere sau
asociate cu compui macromoleculari - poliglucide sau protide. Unele
drojdii ale g. Rhodotorulaca i mucegaiuri ale g. Aspergillus, Fusarium,
Geotrichum, n funcie de condiiile de cultivare pot acumula intracelular
20-35% lipide. Acumularea lipidelor n interiorul celulelor are loc n
condiii speciale de mediu (bogat n carbon i energie i insuficien de
azot). Dintre lipidele complexe n celula microbian pot fi prezente
fosfolipidele, cerurile, acidul micolic.

10
 n celula microbian sunt ntlnite numeroase vitamine printre
care predomin vitaminele din grupul B (B1, B2, B12), ergosterolul
(provitamin D2), -carotenul (provitamina A) .a. nct microorganismele
selecionate sunt folosite pentru obinerea pe cale industrial a
acestora [1].
Pigmenii dau colorarea caracteristic a coloniilor, cu rol de
protecie fa de aciunea unor radiaii sau cu rol funcional n cazul n
care particip la obinerea energiei n procesul de fotosintez. Au fost
identificai pigmeni caratenoidici (la g. Rhodotorula, g. Monascus, g.
Blakeslea), antocianici (g. Actinomyces), melanici (g. Azotobaccter),
fenazinici (g. Pseudomonas) . a. [1].
Substanele minerale sunt constituite din electrolii, sruri
minerale insolubile i substane minerale care fac parte din componena
organic a celulelor (de exemplu: cofactorii enzimelor, metaloproteinele).
Cantitatea de electrolii celulari se afl n raport cu cantitatea de
ap liber intracelular. Ei determin permeabilitatea peretelui celular,
asigurnd schimbul de substane dintre celul i mediul extern; regleaz
presiunea osmotic; au rol de substane de tampon (menin pH celular);
menin potenialul electo-chimic al celulei etc. (tabelul 3) [3].

Tabelul 3. Ionii depistai n celula bacterian n faza de cretere

Ioni Funcia
K+ Menine echilibrul ionic, cofactor
NH4+ Sursa de baz a azotului mineral
Ca2+ Cofactor
Fe2+ Component al citocromilor i cofactor
2+
Mg Cofactor, component al membranei externe a bacteriilor Gram-
2+
Mn Cofactor
Co2+ Component la vitaminei B12, cofactor
Cu2+ Cofactor
Mo2+ Cofactor
Ni2+ Cofactor
Zn2+ Cofactor
2-
SO4 Sursa de baz de sulf anorganic
PO43- Sursa de baz de fosfor anorganic
11
 1.2. Setul enzimatic al microorganismelor
n toate reaciile metabolice intervin catalizatorii proteici specifici
enzimele.
n celula microbian, au loc continuu reacii biochimice:
biosintetice i de descompunere.
Toate reaciile chimice au nevoie de o anumit energie de
activare pentru a rupe legturile chimice. Necesitatea existenei energiei
de activare reprezint o barier n desfurarea reaciilor i/sau o barier n
dezvoltarea vitezei cu care se desfoar reaciile chimice [3, 10].
Enzimele reprezint substanele care diminueaz dependena
desfurrii reaciei de cantitatea sau existena energiei de activare.
Ele iniiaz reaciile chimice, micornd energia de activare a lor
i/sau mresc viteza de desfurare a reaciei chimice.
n corespundere cu locul (n raport cu celula) unde enzimele i
ndeplinesc funciile, ele se clasific n endoenzime i exoenzime.
Endoenzimele activeaz n interiorul celulelor. n funcie de
condiiile care determin prezena enzimelor, n celula microbian ele se
clasific n enzime constitutive i inductive.
Enzimele constitutive sunt prezente n celul sau n mediul din
jurul celulei indiferent de compoziia chimic calitativ a mediului
nutritiv.
Enzimele inductive apar doar cnd n mediul extern exist
substratul specific lor. De exemplu: n genomul E. coli este codificat
informaia despre structura enzimei care catalizeaz procesul de hidroliz
a lactozei. Prezena n celul a acestei enzime este proporional cu
prezena lactozei n mediul extern.
Exoenzimele sunt sintetizate intracelular i sunt eliminate n
mediul extracelular unde funcioneaz. Din grupul exoenzimelor fac parte
n special hidrolazele care scindeaz macromoleculele pn la monomeri
accesibili celulelor. Unele exoenzime au rol protector mpotriva
antibioticelor sau menin starea de turgescen a celulei [3].

12
 2. NUTRIIA MICROORGANISMELOR

Nutriia este un proces fiziologic complex prin care

microorganismele i asigur energia i toate elementele necesare creterii,
reproducerii i ntreinerii funciilor vitale [1, 8, 12].
Procesul de nutriie se realizeaz n cadrul metabolismului celular
care cuprinde dou laturi eseniale:
- reaciile de catabolism care constau n degradarea secvenial a
compuilor macromoleculari prin aciunea catalitic a enzimelor.
Degradarea const n formarea de compui cu molecule mici i se face
secvenial pe cai biochimice, prin care se elibereaz cuantificat energia
potenial cuprins n produsul catabolizat. Aceste reacii au caracter
exergonic.
- reaciile de anabolism se desfoar concomitent cu reaciile de
catabolism i constau n reacii de biosintez catalizate enzimatic prin care
celula vie, folosind compui cu molecule mici i o cantitate de energie,
cldete compui macromoleculari, care intra n structura celulei cu rol
funcional sau de rezerv. Totalitatea reaciilor de anabolism contribuie la
creterea n dimensiune i la reproducerea celulelor i au caracter
endergonic.
Deeuri (produse de
Nutrieni pentru biosintez fermentaie; acizi, alcooli,
CO2 .a.; acceptori de
electroni n numr redus)

Energie Energie
Anabolism pentru biosintez pentru
(biosintez) transport
de
nutrien i

Catabolism
Macromolecule i ali
componeni ai celulei
Produse chimice,
lumin
(surs de energie)

Figura 1. Procesul de nutriie din cadrul metabolismului celular [18]

13
 Pentru asigurarea procesului de nutriie celula microbiana necesit
diferii nutrieni care trebuie s aib anumite dimensiuni care s le permit
trecerea prin peretele celular i membrana citoplasmatic. Apoi sunt
transformai n celul, avnd loc formarea compuilor celulari (figura 1).
n cazul reaciilor de catabolism, compuii macromoleculari sunt
coninui de substratul care este nutrient pentru celula vie, iar n cel al
reaciilor de anabolism compuii macromoleculari se regsesc n
componenii celulari eseniali pentru cretere, reproducere i ntreinerea
funciilor vitale. Compuii cu molecule mici care nu mai sunt necesari se
elimin sub forma produilor de catabolism [19].

2.1. Condiiile de desfurare a procesului de nutriie

n procesul de nutriie se stabilete o interdependen ntre
microorganisme i mediu. n aceast unitate dialectic mediul are rol
activ, iar microorganismele se adapteaz la condiiile de mediu, acionnd
i transformnd mediul. Aceast interrelaie a condiionat adaptrile
specifice ale microorganismelor la cele mai dificile condiii create de
mediul ambiant.
Mediul acioneaz asupra microorganismelor prin asigurarea unui
substrat nutrit, temperatur, umiditate, pH, concentraie de oxigen
favorabile, iar microorganismele acioneaz asupra mediului prin diferite
transformri care au loc n procesul de nutriie. Astfel, prin aciunea de
degradare pe care o exercit microorganismele asupra mediului, pot avea
loc urmtoarele transformri: reducerea consistenei, tulburarea, formarea
de voal, scderea concentraiei n extract, acidifierea, alcalinizarea [19].
Pentru asigurarea vieii celulelor microbiene, microorganismele
folosesc din mediu substraturi nutritive sau alimente.
Prin substrat nutritiv se nelege mediul care conine ap, surse
de energie (de natur glucidic), surse asimilabile de azot, sruri minerale
i facultativ factori de cretere.
Condiiile pentru desfurarea procesului de nutriie sunt
urmtoarele [1, 11, 19]:

14
 - n mediul nutritiv, celulele microbiene trebuie s beneficieze de
condiii compatibile cu viaa;
- mediul nutritiv trebuie s asigure urmtoarele componente: ap,
sursele hidrocarbonate - principalele surse furnizoare de energie,
surse azotate, surse minerale, factori de cretere (facultativ);
- mediul trebuie s fie caracterizat de un anumit pH, un anumit
potenial de oxido-reducere favorabile creterii i multiplicrii
celulelor;
- absena din mediu a unor substane toxice sau a posibilitii ca
prin transformarea substanelor nutritive din mediu s se formeze
substane toxice.
n absena apei celula nu va putea s se hrneasc, apa fiind cea
care solubilizeaz compuii din mediu, asigur transportul i
transformrile n interiorul celulei. Totalitatea substanelor nutritive
solubile n apa trebuie s se afle ntr-o concentraie apropiat celei
existente n citoplasm, deoarece dac mediul nutritiv este hipertonic, se
produce plasmoliza celulelor. De aceea, mediile de cultur destinate
cultivrii microorganismelor au o concentraie de 3-15% substane
nutritive solubilizate. Dac concentraia este foarte mic se produce
turgescena celulelor [11, 19].

2.2. Modaliti de transport al nutrienilor

Creterea i multiplicarea microorganismelor sunt condiionate de
ptrunderea nutrienilor eseniali prin nveliurile celulare i de eliminare
a unor substane rezultate din catabolism, mpiedicnd ns pierderea din
celul a substanelor necesare. Toate microorganismele au structuri-
barier i adevrate pori moleculare care asigur integritatea lor i
limiteaz intrarea i ieirea anumitor compui chimici. Datorit acestor
structuri, celula bacterian, de exemplu, nu este niciodat ntr-o stare de
echilibru n raport cu mediul nconjurtor n ceea ce privete concentraia
diferitelor substane de cele dou pri ale membranelor celulare [7, 12].
Unele substane trec liber de cele dou pri ale membranei, dar
cele mai multe nu pot fi transportate numai sub impulsul gradientului de
15
concentraie, astfel nct transportul lor este condiionat de intervenia
unor mecanisme speciale [7].
innd cont de diversitatea surselor nutritive i de faptul c, prin
structur, peretele celular i membrana nu permit fizic dect ptrunderea
moleculelor mici, are loc prehidroliza n exteriorul celulei ca urmare a
sintezei i eliberrii unor enzime extracelulare. n urma hidrolizei
compuilor macromoleculari va rezulta o cantitate mic de energie (1%)
pe care celula nu o poate folosi [19].
Astfel, diferitele polioze pot constitui sursa de energie sau
alimente pentru microorganisme numai dac acestea sunt capabile s
produc enzime care s le scindeze n compui mai simpli.
n funcie de mecanismele fizico-chimice care stau la baza lor,
modalitile generale de transport prin membranele biologice ale
electroliilor i neelectroliilor sunt: difuzia pasiv, difuzia facilitat,
translocaia de grup, transportul activ, exocitoza, endocitoza . a [10, 19].
Difuzia simpl (pasiv) reprezint cel mai
frecvent mod posibil de transfer pentru
moleculele cu dimensiuni mici (0,4-0,6 nm):
moleculele de ap, ioni, gaze, glicerol. Difuzia
are loc ca urmare a existenei unui gradient de
Por concentraie ntre exteriorul i interiorul celulei
i nceteaz cnd se produce izotonia (figura 2)
[1].
Figura 2. Se realizeaz ca urmare a unui gradient de
Transportul concentraie, posibil cnd n exteriorul celulei
nutrienilor prin concentraia este superioar celei din interiorul
difuzia simpl acesteia.
Difuzia pasiv este procesul de trecere liber a substanelor
solubile prin membrana plasmatic fr a interaciona cu moleculele din
structura acesteia i fr consum de energie. Moleculele cu grad ridicat de
solubilitate n lipide traverseaz mai uor regiunea hidrofob a
membranei. Deoarece concentraia celor mai muli metabolii este mai
mare n interiorul dect n afara celulei, difuzia pasiv este restrns, pe
16
lng ap, la un mic grup de substane (unele gaze ca O2 i CO2, acizii
grai i substanele liosolubile, anumii ioni). Difuzia pasiv se produce
lent i nespecific i nceteaz cnd compusul respectiv ajunge n aceeai
concentraie att n interiorul, ct i n afara celulei [7, 12, 19].
Difuzia facilitat (cu proteine purttor) se realizeaz ca urmare a
prezenei unor proteine-receptor numite permeaze, localizate la nivelul
plasmalemei sau n spaiul periplasmic. Difuzia facilitat se poate realiza
fa de un gradient de concentraie, iar celula nu consum energie pentru
acest transfer [7, 12]. Permeaza recunoate nutrientul necesar celulei, l
reine i prin procesul de translaie, rotaie l aduce spre partea interioar a
celulei. n final are loc disocierea nutrientului n interiorul celulei. Acest
proces poate avea loc atta timp, ct concentraia moleculelor nutrientului
este mai mare n exteriorul celulei fa de cea intern (figura 3).
Difuzia facilitat este mai important la celulele de tip eucariot
pentru transportul aminoacizilor i a glucidelor, n timp ce la procariote
servete pentru transportul glicerolului [12].
Translocaia de grup (difuzia fosforilat) este un transport activ
ntlnit la drojdii i mucegaiuri, n care intervine un sistem enzimatic
complex de transferaze i transfosfataze, ce permit ptrunderea glucidelor
prin membrane sub forma esterilor fosforici. Astfel, fosfoenol-piruvatul se
poate combina cu molecula de glucid din exteriorul celulei i se
transform n piruvat i esterul fosforic al glucidului, care sub aceast
form este transportat n interior [1, 7].
Prin translocaia de grup pot fi transportate n celula bacterian:
glucoza, manitolul, N-acetilglucozamina, fructoza, maltoza i glicerolul,
proces n care sunt implicate 4 proteine transportoare.
Transportul activ are urmtoarele particulariti: transportul n
celul este asigurat chiar n absena gradientului de concentraie i se
realizeaz cu consum de energie. Acest transport a fost demonstrat n
cazul drojdiilor care pot acumula intracelular o cantitate de glucide i de
aminoacizi mai mare dect cea existent n mediul de cultur. Se admite
ca o molecul-transportor, care consum o cantitate de energie pentru a se
activa i a produce o legtur instabil cu molecula nutrientului printr-o
17
reacie catalizat enzimatic, transfer nutrientul i l elibereaz n interior.
Transportorul se activeaz ca urmare a energiei eliberate prin
transformarea ATP n ADP (figura 3) [1, 7].

Citoplasm

Difuzie facilitat Molecule

transportatoare

ATP sau for

prolomotiv
Transport activ

Molecule
transportatoare

Transloca ie de
PEP Piruvat
grup

Modificate chimic

Molecule
transportatoare

Figura 3. Modaliti de transport al nutrienilor n celula

microbian [3]

Celulele pot face schimb cu mediul exterior nu numai cu ionii i

glucidele, dar i cu compuii macromoleculari. De exemplu, bacteriile pot
secreta proteine (enzime exogene, proteine din structura capsulelor)
printr-un proces de exocitoz [1].
Este posibil i ptrunderea macromoleculelor n interiorul celulei
prin procese de endocitoz.
Endocitoza poate fi ntlnit la drojdii cnd regiuni mici ale
plasmei sufer plieri n interior cu formarea de vezicule cu diametrul de
aproximativ 0,1 nm. Endocitoza poate fi mediat de anumii receptori
plasai pe suprafaa membranei care recunosc macromelecula, iar regiunea
18
plasmalemei ce conine complexul receptor ligant sufer invaginri i are
loc internalizarea macromoleculei [1].
Pinocitoza se ntlnete la microorganismele acvatice
protozoare. Prin pinocitoz nutrientul din exterior este nglobat n interior
(se formeaz o pictur suspendat), apoi pictura este eliberat n
interiorul celulei.
Numeroase microorganisme, mai ales bacteriile, mai pot folosi n
afara energiei din legturi macroergice pentru transport intracelular aa-
numitul gradient protonic, rezultat n urma transportului de protoni i
ioni care acioneaz permanent n celula vie. Se admite ca acest gradient
protonic acioneaz ca o pomp electrochimic, deoarece Na+ de exemplu,
ajungnd n exterior, poate lega o molecul de nutrient, poate modifica
configuraia proteinei membranare, poate adera la molecula nutrientului i
mpreun s ajung n interiorul celulei. Dac intracelular ionii de sodiu se
afl n concentraie redus, acesta se elibereaz de pe molecula nutrient i
este transferat n exterior [1, 11].
Transportul fierului n celul. Fierul trivalent este insolubil i
transportul n celul (la bacterii i fungi) poate fi realizat prin intermediul
unor substane cu mas molecular redus denumite siderofori care
formeaz un complex cu ionul feric. Cnd complexul fier-siderofor a atins
suprafaa celulei, acesta este legat de o protein siderofor receptoare i
ntregul complex este transportat n interior unde Fe3+ este redus la forma
de ion feros (Fe2+) care intr n componena citocromilor i a
enzimelor [1].

2.3. Tipuri de nutriie

Microorganismele au nevoie pentru cretere i multiplicare, ca i
pentru alte manifestri ale activitii lor biologice, de aceleai elemente
biogene ntlnite n structura oricrui sistem biologic, difereniate astfel:
- macroelemente: C, O, H, N, S, P, K, Mg, Ca, Fe primele 6
elemente reprezint 95% din greutatea uscat a bacteriilor i au roluri
eseniale; din punct de vedere structural i funcional, celelalte sunt
cofactori enzimatici. De exemplu: sulful intr n structura aminoacizilor
19
cu sulf, a endosporului, a unor coenzime; fosforul intr n structura
nucleotidelor, acizilor nucleici, a fosfolipidelor, a acizilor teichoici;
- microelemente: Zn, Mn, Na, Cl, Mo, Se, Co, Cu, W, Ni sunt
prezente n cantiti reduse, dar cu roluri foarte importante. De exemplu:
zincul i manganul intr n structura ADN i ARNpolimerazelor,
fosfatazei alcaline; zincul intr n structura superoxiddismutazei la
celulele eucariote, cofactorului enzimatic; molibdenul intr n structura
nitrogenezei [1, 10, 12].

I. Clasificarea microorganismelor dup natura sursei de

carbon utilizate
n funcie de acest criteriu, nutriia microorganismelor poate fi [1,
3, 20]:
nutriie autotrof CO2 este utilizat ca surs unic sau
principal de carbon celular;
nutriie heterotrof (organotrof) materia organic este
utilizat ca surs de carbon i energie .

II. Clasificarea microorganismelor pe baza efectului direct al

oxigenului asupra creterii i metabolismului
Oxigenul este un alt constituent universal al celulelor vii furnizat
n primul rnd de nutrieni i de apa din mediul natural/de cultur. Din
cauza solubilitii sale reduse, oxigenul molecular aflat n soluie este
utilizat repede de bacteriile aerobe, astfel nct densitatea atins de o
cultur este limitat de rata de difuzie a oxigenului prin interfaa aer/ap.
Pentru necesiti de ordin practic, pe baza efectului pe care oxigenul l
exercit asupra metabolismului i creterii microorganismelor, acestea se
difereniaz n 4 tipuri [20]:
microorganisme strict aerobe care au nevoie absolut de
oxigen atmosferic i sunt incapabile s triasc n anaerobioz. De
exemplu: sp. Bacillus, sp. Mycobacterium, Pseudomonas Aeruginosa,
mucegaiuri;

20
 microorganisme strict anaerobe care nu se pot dezvolta n
prezenta O2 i care pot fi cultivate doar n medii srace n O2, deoarece
chiar la presiuni joase, oxigenul poate avea efect inhibitor, toxic. De
exemplu: Clostridium (C. botulinum, C tetani, C. perfringens),
Bifidobacterium sp., Peptococcus, Peptostreptococcus etc.;
microorganisme facultativ anaerobe care i pot orienta
metabolismul n funcie de disponibilitatea oxigenului n mediu, spre
respiraie sau fermentaie. Unele bacterii lactice desfoar un metabolism
de tip fermentativ chiar n prezenta oxigenului, altele i orienteaz
metabolismul spre respiraie sau fermentaie, n funcie de condiiile de
mediu; de exemplu. E. coli, toate speciile incluse n fam.
Enterobacteriaceae, Staphylcoccus sp., Streptococcus sp., levurile
(Saccharomyces sp., Candida sp. etc.);
microorganisme microaerofile au nevoie de cantiti
extrem de mici de oxigen. Aceast particularitate reflect prezena unor
enzime ce sunt inactivate n condiii de oxidare puternic i care pot fi
meninute n stare funcional numai la presiuni relativ reduse ale
oxigenului (~0,2 atm). Respiraie aerob, cu tendin spre respiraie
anaerob/fermentaie. De exemplu: Spirochaetales, Thiobacteriales,
Campylobacterjejuni, Helicobacterpylori.
Pentru cultivarea bacteriilor strict anaerobe se folosesc
urmtoarele metode:
- cultivarea n anaerostat (aparat n care nu este permis accesul
aerului) i n plci Petri, pstrate n gaz inert. Exist anaerostate
simplificate care pot capta oxigenul, legndu-l cu un element chimic;
- cultivarea n medii solide, n eprubete cu nlime mare, astfel
nct n zona n care oxigenul se poate dizolva, microorganismele s nu
existe;
- metoda chimic consta n introducerea n mediul de cultur a
unor substane puternic reductoare (tioglicolat de sodiu), care scad
potenialul de oxidoreducere la valori ntre 012 mV, domeniu n care se
dezvolt microorganismele anaerobe.

21
 Necesitatea n oxigen reflect mecanismul molecular prin care
microorganismele i satisfac nevoile energetice, reflect deci tipul de
metabolism energetic.
Metabolismul energetic al microorganismelor
Sistemele biologice sunt dependente de obinerea energiei prin
cuplare chimic cu reaciile oxidative. Reaciile metabolice, ca toate
reaciile chimice, se mpart n cele 2 mari categorii:
reacii exergonice - productoare de energie, sunt reacii
potenial spontane i corespund tranziiei de la o stare mai instabil, cu un
coninut mai mare de energie chimic, la o stare mai stabil, cu un
coninut de energie mai mic;
reacii endergonice - consumatoare de energie, au loc numai
cu un aport de energie i nu sunt spontane. n celule, reaciile endergonice
au loc datorit cuplrii lor cu reaciile exergonice care confer sistemului,
n ansamblu, un caracter exergonic. n unele cazuri aceast cuplare
necesit prezena unui purttor intermediar obligatoriu, cum ar fi cazul
cuplrii reaciilor de dehidrogenare cu cele de hidrogenare. De multe ori
ns cuplarea se realizeaz prin sintez n reaciile exergonice ale unui
compus cu potenial macroergic i utilizarea sa n cele endergonice. Acest
intermediar, reprezentat de regul de ATP, poate servi ca transductor de
energie, practic pentru cele mai multe reacii, endergonice i exergonice.

III. Clasificarea microorganismelor dup natura sursei de energie

folosite [1, 3, 12]:
microorganisme fototrofe sau fotosintetizante energia
folosit n reaciile de biosintez este energia fotonic, datorit
capacitii microorganismelor de a o converti n energie
chimic, sub forma legturilor macroergice din ATP;
microorganisme chemotrofe sau chemosintetizante - energia
folosit n biosintez este cea eliberat din reacii biochimice de
oxidoreducere. Bacteriile chemotrofe aparin grupului
Scotobacteria (gr. scotos - ntuneric), fiind bacterii care nu
depind de energia luminoas.
22
Tabelul 4. Principalele tipuri de metabolism al microorganismelor [3]
Tipul de Donor
Sursa de Sursa de
metabolism de e- i/ Exemple
carbon energie
energetic/nutriie sau H+
Cianobacterii,
Foto-lito- Energie H2O, S0, Anoxifotobacterii:
CO2
autotrofi luminoas H2S, H2 Chromatium
Autotrofi

Chlorobium
NH3,
Oxidarea
Chemo-lito- NO2-, S0,
CO2 compuilor Rhodospirillum
autotrofi H2S, H2,
anorganici
Fe
Bacterii
Substane nitrificatoare,
Foto-organo- Energie Substane
organice, sulfooxidante,
heterotrofi luminoas organice
rar CO2 ferobacterii, H-
Heterotrofi

bacterii
Majoritatea
Substane Oxidarea bacteriilor,
Chemo-organo- Substane
organice, compuilor microfungii (levuri,
heterotrofi organice
rar CO2 anorganici mucegaiuri),
protozoare

VI. Clasificarea microorganismelor n funcie de natura

donorului de e- i H+
n funcie de donorul de e-/H+ microorganismele pot fi:
litotrofe donori de e-i H+, sunt substane anorganice simple
oxidabile, cum ar fi: H2, H2S, ionii feroi, nitrit sau NH3 pe care i
oxideaz la H2O, SO42-, Fe3+, NO3- prin reacii exergonice cuplate cu
sintez de ATP;
organotrofe donori de e- i H+, sunt substane organice
oxidabile.
n definirea complet a tipului de metabolism se ine cont i de
sursa de carbon. Prin combinarea criteriilor de clasificare (surse de

23
carbon, energie i natura donorilor de e- i H+) rezult tipurile de
metabolism prezentate n tabelul 4, figura 4 [20].

2.4. Surse de carbon

Nu exist nici o surs de carbon care s nu fie utilizat pe cale
microbian. Exist microorganisme care pot utiliza foarte mult sursa de
carbon, de exemplu: Pseudomonascepacia care pot utiliza peste 100 surse
diferite de carbon, alte bacterii, de exemplu: din g. Letospira folosesc ca
surs principal de carbon i energie numai acizii grai cu numr mare de
carbon n molecul.
Dintre sursele de C naturale ntlnite n materiile prime alimentare
sau utilizate n compoziia mediilor de cultur sunt preferate urmtoarele:
- poliglucidele: amidon, celuloz, substane pectice care pot fi
folosite n special de ctre bacterii i microorganismele productoare de
enzime specifice extracelulare. Drojdiile fermentative ale g.
Saccharomyces nu pot produce amilaze, motiv pentru care nainte de
fermentare, plmezile amidonoase sunt zaharificate chimic;
- monoglucidele (hexoze, pentoze), diglucidele, reprezint att
sursa de carbon, ct i de energie pentru toate microorganismele i sursa
de baz n nutriia drojdiilor;
- acizii organici (acid lactic, malic, acetic) pot fi o surs de
carbon pentru microorganisme i unele drojdii;
- alcoolii sunt utilizai de ctre drojdiile oxidative (g. Candida,
g. Pichia) i de bacterii (g. Acetobacter).
Deoarece carbonul reprezint maximum 50% din substana uscat
a celulei, la alctuirea mediilor de cultur se calculeaz cantitatea de
nutrient ce trebuie adugat (n funcie de masa molecular i de
coninutul n carbon) pentru obinerea unei cantiti corespunztoare de
biomas.

24
 Organisme

Surse de energie

Chimic Lumin

Chemotrofe Fototrofe

Surs de carbon Surs de carbon

Compui organici CO2 Compui organici CO2

Chemoheterotrofe Chemoautotrofe Fotoheterotrofe Fotoautotrofe

Acceptor final de H2O utilizat la

electroni reducerea CO2
Hidrogen, sulf, Bacterii verzi,
O2 fier, bacterii nesulfurice Da Nu
nitrificatoare

Animale, Fotosintez Fotosintez

protozoare, cu O2 (plante, fr O2
bacterii alge, (bacterii verzi,
cianobacterii)
Fr O2 purpurii,
sulfurice)
Compui organici Compui anorganici

de exemplu de exemplu
Streptococcus Clostridium lan de
fermentativ transport electroni

Figura 4. Principalele tipuri de metabolism al microorganismelor

[13]

25
 2.5. Surse de azot, fosfor, sulf
Pentru cretere, microorganismele necesit cantiti mari de azot,
fosfor i sulf, iar organotrofele le pot asimila fie din sursele organice cu
carbon, fie din compuii anorganici.
Se tie c azotul (10-14% din substana uscat a celulei) este
necesar pentru sinteza de aminoacizi, purine, puridine, unele lipide,
coenzime . a.
Multe microorganisme pot folosi azotul din aminoacizi i amoniac
prin ncorporare direct, cu ajutorul unor enzime (glutamatdehidrogenaza,
glutaminsintetaza). Unele bacterii pot reduce i asimila azotul atmosferic
folosind un sistem de nitrogenaze i au un rol vital n asigurarea
circuitului natural al azotului [1, 11].
Pentru organotrofi, nutriia azotat este asigurat de compuii
organici macromoleculari cu azot, produii de hidroliz ai acestora,
precum i de alte sruri cu azot (sruri amoniacale, azotai . a.).
Proteinele pot fi folosite n nutriie numai de ctre
microorganismele ce produc proteaze extracelulare, respectiv bacterii -
ageni de putrefacie i mucegaiuri - ageni de putrezire. Se mai pot folosi
n mediile de cultur ale drojdiilor - sulfatul de amoniu i ureea. Astfel, n
mediile de cultur ale drojdiilor se poate aduga fie sulfatul de amoniu, fie
uree 1-2%. Cantitatea de azot necesar se determin tiind c acesta
reprezint 10% din substana uscat de drojdie. Musturile naturale conin
azot natural. Mediile industriale conin finuri proteice (fina de soia, de
pete, sau extract).
Ali compui cum ar fi nitraii sunt asimilai de ctre mucegaiuri i
bacterii, nitriii numai de ctre bacterii (g. Nitrosomonas) i cu efect toxic
pentru drojdii (nmulirea este oprit la concentraii de 200 mg nitrai
/dm3) [1, 2].

2.6. Nutriia mineral

Nutriia mineral asigur microorganismelor att elemente
universale, ct i elemente minore care intr n structura componenilor
celulari. Din mediul de cultur, pentru asimilarea fosforului,
26
microorganismele folosesc ortofosfaii i fosfaii monobazici i dibazici ai
diferitelor elemente. Ca surs mineral folosit de microorganisme
menionm: fosfaii de potasiu care reprezint sursa dubl de fosfor i
potasiu, KH2PO4, K2HPO4.
Cuprul, magneziul, fierul i alte elemente cu rol funcional se
adaug n mediul de cultur al microorganismelor sub form de sulfai,
care sunt srurile cele mai accesibile. Diferitele sruri minerale sunt
necesare n concentraii foarte mici, uneori suficiente n ap.
Efectul pe care l are adugarea diferitelor substane minerale asupra
creterii poate fi diferit prin indicele de utilitate specific, ce reprezint
raportul dintre biomasa format pe un mediu de cultur complet i cea
rezultat n mediul srac n substana /elementul respectiv [1].

2.7. Factorii de cretere

Multe microorganisme pot s creasc folosind sursele nutritive din care i
asimileaz macro- i microelementele necesare pentru sinteza integral a
tuturor compuilor celulari. Alte microorganisme, prin pierderea unor
enzime, nu sunt capabile de a sintetiza toi constituenii indispensabili
creterii, motiv pentru care necesit prezena acestora (sau a unor
precursori) n mediul ambiant [1, 2, 8].
Factorii de cretere sunt substanele organice eseniale pentru
creterea microbian i nu pot fi sintetizate de microorganismul respectiv.
Conform exigenelor nutritive ale microorganismelor ncadrate n primul
tip de nutriie, se poate stabili o anumit succesiune, cele mai pretenioase
din punct de vedere nutritiv fiind bacteriile Gram-pozitive urmate de
bacteriile Gram-negative i respectiv drojdii i mucegaiuri.
Factorii de cretere ca structur i funcie metabolic intr n urmtoarele
trei categorii [1]:
aminoacizii sunt necesari pentru sinteza de proteine / enzime;
purine i pirimidine, pentru sinteza acizilor nucleici;
vitamine, care funcioneaz ca grupri prostetice ale unor
enzime sau cu funcie de coenzime.

27
 n funcie de natura microorganismelor, necesarul de aminoacizi
variaz ntre 0 i 18 aminoacizi. De exemplu: Leuconostoc mesenteroides
are nevoie de 17 aminoacizi i poate utiliza i peptidele ce i conin. Dintre
microorganismele din industria alimentar drojdiile din g.
Saccharomyces necesit biotin i acid paraaminobenzoic bacteriile
lactice ale g. Lactobacillus necesit acid folic, acid nicotinic, biotin,
vitamina B12, piridoxin, bacteriile acetice necesit acid p-aminobenzoic,
iar Enteracoccus faecales are nevoie de 8 vitamine diferite pentru cretere
[10].
Microorganismele dependente de aceti factori de cretere se
numesc microorganisme auxotrofe (de exemplu: Streptococcus necesit
ca factori de cretere acid folic, nicotin, vitamine; drojdiile necesit
aminoacizi, vitamine, biotin). Microorganismele paratrofe nu depind de
factorii de cretere (de exemplu: mucegaiurile).
Exist i un grup restrns de substane denumite factori
stimulatori de cretere care fr s fie indispensabile, prezena lor
accelereaz ritmul de cretere celular. Unele microorganisme sunt
dependente de prezena n mediu a acestor factori, deoarece au capacitatea
de a-i autosintetiza factorii de cretere necesari. Din acest grup fac parte
mucegaiurile i multe bacterii care se dezvolt n cele mai nefavorabile
condiii de via [10].
Cunoaterea condiiilor de cultur i a exigenelor de nutriie a
fiecrui microorganism are o importan deosebit att n practica de
laborator, ct i la cultivarea industrial, deoarece permite reglarea
activitii fiziologice fie n direcia obinerii de biomas, fie a unor
produse de metabolism cu importan economic [2].

28
 3. MEDII DE CULTUR

Mediul de cultur reprezint un substrat nutritiv complex, cu rol

de aliment, care trebuie s asigure microorganismului ce urmeaz a fi
cultivat cantitatea necesar de ap, surse de carbon, azot, substane
minerale, factori de cretere, substane care s i furnizeze cantitatea de
energie ct i toate elementele folosite de celul n procesele de cretere,
reproducere i ntreinerea funciilor vitale [1, 8, 11].
Mediul de cultur trebuie s ndeplineasc urmtoarele
condiii [1]:
- s corespund din punct de vedere nutritiv;
- s aib o concentraie a substanei dizolvate n mediu care s nu
influeneze negativ schimburile osmotice ale celulei;
- s nu conin substane toxice sau s genereze compui toxici n
urma creterii culturii microbiene;
- s aib un anumit pH sau rH;
- s fie transportabile;
- s fie att de steril, nct s nu dezvolte numai celule introduse
prin inocul.
Sterilizarea se poate face pe cale termic, cnd ntr-un anumit
regim de timp i temperatur are loc denaturarea proteinelor din
citoplasm i inactivarea celulelor microbiene. Mediile de cultur, care au
n componen substane termolabile (vitamine), sunt sterilizate prin
filtrare. n acest scop se folosesc filtre cu dimensiunea porilor mai mic
dect a celulelor pe care trebuie s le eliminm. Prin filtrare se obine un
mediu lichid steril.
Mediile de cultur au o mare importan cum ar fi:
- izolarea din medii naturale a diferitelor microorganisme;
- obinerea de culturi pure;
- cultivarea microorganismelor n scopul obinerii de biomas;
- ntreinerea culturilor pure selecionate;

29
 - identificarea microorganismelor i studiul caracterelor lor
fiziologice i morfologice.
Mediile de cultur se comercializeaz ca atare sub form
liofilizat, gelificat sau gata turnate n plci Petri sau pot fi manufacturate
n multe laboratoare.
n cazul mediilor complexe se utilizeaz suplimente selective sub
form de tablete, liofilizate, care se adaug direct la un volum precizat de
medii de cultura pentru inhibarea / mbuntirea / selectarea / creterea
bacterian n vederea izolrii unor anumite specii de germeni patogeni
[10, 11].

3.1. Clasificarea mediilor de cultur

Dup consisten, mediile de cultur se clasific astfel [1, 6]:
lichide (bulion) utilizate pentru obinerea biomasei bacteriene
i a produselor lor (antibiotice, enzime, toxine);
solide obinute prin adugarea n mediile lichide a unor ageni de
solidificare. Pentru solidificarea mediilor de cultur se folosete: agar
agarul (geloza), un diglucid obinut din alge ale genului Gelidium, avnd
n structur molecule de galactoz i acid D galacturonic legate prin
legturi 1,2,1,3 glicozidice; n stare purificat se prezint sub form de
pulbere sau fibre i se adaug n cantitate de 0,52% mediu lichid i
gelatina agent de solidificare de natur proteic, extras din esuturi
organice; se folosete n cantitate de 1215%;
semisolide 0,20,5% agar-agar. Se utilizeaz pentru studierea
activitii biochimice sau a mobilitii bacteriilor.
Dup provenien, mediile de cultur se clasific astfel
[1, 6, 11]:
naturale - sunt cele mai utilizate, deoarece reproduc condiiile
n care se dezvolt microorganismele. Mediile naturale se obin prin
extracie apoas sau prin hidroliz din produse de origine animal sau
vegetal. Mediile naturale de origine vegetal sunt sucurile de fructe, de
legume, mustul de mal, legumele fierte/terciuite, fructele, infuziile de
plante. Ca medii de origine animal se folosesc dup sterilizare, laptele,
30
sngele, zerul, carnea, bulionul de carne, ficatul, oule. Compoziia lor
chimic precis nu poate fi controlat;
sintetice ce conin numai compui cu structur chimic
cunoscut i pot fi simple: solide - geloza sau lichide - bulion, ap
peptonat sau complexe: geloz-snge, geloz-ser sau lichide bulion-ser,
bulion- snge;
semisintetice.
Dup tipul respirator al bacteriilor cultivate mediile de cultur
se clasific astfel:
- medii pentru aerobi;
- medii pentru anaerobi; pot fi la fel ca cele pentru aerobi la care
se adaug substane reductoare tioglicolat de sodiu, acid ascorbic etc.
Dup compoziia chimic i destinaie mediile de cultur se
clasific astfel:
A. Medii simple folosite n mod curent n laboratoarele de
microbiologie pentru cultivarea unui numr mare de bacterii. De exemplu:
bulion simplu, ap peptonat, geloz simpl.
B. Medii complexe
Mediile neselective sunt formate din mediul de baz i substane
organice (snge, ser, glucoz). De exemplu: geloz-snge, geloz-ser,
bulion-snge, bulion -ser, bulion-glucozat.
Mediile selective sunt medii cu o compoziie specific care
permite dezvoltarea unui grup restrns de microorganisme sau chiar a unei
specii. Aceste medii conin pe lng substane nutritive i substane cu
efect inhibitor (antibiotice, sruri biliare) asupra altor microorganisme
nsoitoare ntlnite n microbiota din care se face izolarea culturii ce
dorim s o selectm. Printre antibioticele utilizate n mediile selective
putem meniona [1]:
- colimicina i acidul nalidixic: inhib dezvoltarea bacteriilor
Gram-negative i favorizeaz dezvoltarea celor Gram-pozitive;
- bacitracina: inhib dezvoltarea bacteriilor Gram-pozitive i
favorizeaz izolarea hemofililor;

31
 - kanamicina i vancomicina: favorizeaz izolarea bacililor
Gram-negativi anaerobi.
Numrul mediilor selective este foarte mare i permit izolarea
unor specii de interes industrial sau se folosesc pentru identificarea,
prezena microorganismelor contaminante n produsele alimentare.
Pentru izolarea Enterobacteriaceelor exista medii cu trei
niveluri de selectivitate [4, 15]:
- slab selective: mediul Mac Conkey (ageni inhibitori: sruri
biliare i cristal violet, mediul EMB (Levin) (ageni inhibitori:
eozina Y i albastru de metilen). Inhib bacteriile Gram-pozitive;
- moderat selective: mediul ADCL, mediul Hektoen, mediul XLD,
mediul IstratiMeitert. Ageni inhibitori: sruri biliare i verde
briliant. Inhib bacteriile Gram-pozitive i o parte din bacilii
Gram-negativi comensali;
- medii nalt selective: mediu WilsonBlair. Agent inhibitor: verde
brilliant. Inhib o gam larg de bacterii pentru a facilita izolarea
Salmonelei.
Mediile folosite i aspectul coloniilor la principalele genuri de
enterobacteriacee sunt prezentate n anexa 1.
Medii de difereniere permit diferenierea speciilor bacteriene
n baza activitii lor biochimice (zaharolitice, proteolitice, lipolitice, de
oxido-reducere) atunci cnd au fost selectate dintr-o microbiot
heterogen. Aceste medii conin, de regul substratul pentru o anumit
enzim sau citotoxina bacterian i un indicator de pH. De exemplu:
mediu TSI este utilizat n diferenierea enterobacteriilor pe baza
fermentrii glucozei, lactozei, zaharozei i a producerii de hidrogen
sulfurat [1, 2].
Medii de mbogire - sunt destinate separrii i cultivrii unor
microorganisme pretenioase din punct de vedere nutritiv i care se afl n
numr redus n produsul analizat din punct de vedre microbiologic. Pentru
a le pune n eviden se fac treceri din produsul alimentar n mediul de
mbogire, steril i se asigur nmulirea celulelor izolate. Din mediul n
care s-a produs nmulirea acestora se face transferul de celule pe mediile
32
de difereniere, iar rezultatul se exprim n prezena/absena lor. Astfel,
mediile de mbogire sunt medii care prin anumite substane inhibitoare
prelungesc faza de lag a bacteriilor de contaminare, fr a ntrzia ns
intrarea anumitor patogeni n faza exponenial. De exemplu: mediul
bulion cu selenit acid de natriu. Preincubarea materiilor fecale timp de 18
ore la 37C n acest mediu favorizeaz izolarea bacteriilor din g.
Salmonella [1].
Medii speciale - conin compui speciali care permit cultivarea
unor microorganisme. De exemplu: mediul Lowenstein-Jenseneste
utilizat n cultivarea i diferenierea speciilor de Mycobacterium,
Gordona, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella; mediul Sabouraud
izolarea i cultivarea fungilor [6, 14].
Teste biochimice - bacteriile pot fi identificate i prin
comportarea lor metabolic, prin produsele care rezult n urma reaciilor
biochimice. Testele biochimice se clasific n teste rezultate din
metabolismul energetic bacterian, teste rezultate din tipurile fermentative,
teste rezultate din metabolizarea compuilor azotai, teste rezultate din
necesiti nutritive minimale. De exemplu: mediul cu uree urmrete
producerea de ureaz de ctre bacterii, nroirea mediului indicnd
producerea de ureaz; testul catalazei urmrete producerea de catalaz de
ctre bacterii, testul pozitiv indicnd eliberarea de oxigen (efervescen) n
prezena apei oxigenate.

3.2. Manifestarea creterii i multiplicrii microorganismelor

Prin reproducere dintr-o celul microbian aflat pe mediul de
cultur solid ia natere o clon sau colonie.
Colonie o aglomerare de bacterii care se dezvolt dintr-o
singur celul sau un grup de celule (ufc - unitate formatoare de colonii)
pe suprafaa unui mediu solid.
Aspectul culturilor constituie un criteriu de recunoatere a
speciilor bacteriene, deoarece de multe ori bacteriile au aspecte
caracteristice ale coloniilor att pe mediul lichid, ct i solid [3, 4, 15]. n

33
scopul identificrii bacteriilor studierea caracterelor culturale ale
coloniilor va fi completat n mod obligatoriu cu alte teste microbiologice
(anexa 2).
Caracterele de cultur ale coloniilor sunt determinate de
urmtoarele:
- dimensiuni: colonii mici ( < 1 mm), colonii mijlocii ( ~ 1
mm), microcolonii (vizibile numai cu stereo microscopul), colonii
mari ( > 2 mm);
- form: punctiforme, circulare, neregulate, filamentoase,
dendritice, lenticulare;
- relief: plane, aplatizate, convexe, bombate, acuminate, pulvinate,
ombilicate;
- margini: ntregi, ondulate, lobate, zimate, filamentoase, cu valuri
succesive de invadare a mediului (anexa 1, partea 1);
- densitate optic a coloniilor: transparente, semitransparente,
opace;
- culoare: alb, galben, aurie, neagr;
- aderen la mediu: neaderente (antrenate de ans alunec pe
suprafaa mediului), puin aderente, aderente, ncastrate n mediu.
n funcie de dimensiuni, contur, consisten, transparen,
aspectul suprafeei, pigment, aderen la mediu etc. coloniile pot fi:
colonii tip S (smooth) - rotunde, bombate, suprafa neted,
lucioase, margini circulare, suspensioneaz omogen n ser
fiziologic, produc tulburare n mediul lichid, caracteristice
bacteriilor patogene;
colonii tip R (rough) - margini neregulate, plate, suprafa
rugoas, uscat, aderente de mediu, aglutineaz spontan n ser
fiziologic, n mediul lichid produc depozit cu supernatant clar,
sunt caracteristice pentru germeni degradai, cu modificri
antigenice, de virulen. Exist trei specii bacteriene care fac
exceptie, crescnd sub form de colonii R pentru tulpini patogene:
Mycobacterium tuberculosis; Corynebacterium diphtheriae;
Bacillus anthracis;
34
 colonii M (mucoid) - foarte mari, lucioase, suprafa neted,
aspect uleios, caracteristice pentru bacterii cu capsul;
colonii U untoase - rotunde, bombate, margini regulate, suprafa
neted, mat, consistena pstoas (cremoas), uneori pigmentate,
caracteristice pentru levuri;
colonii pufoase - reea de filamente (hife) aeriene, caracteristice
fungilor filamentoi;
colonii cu fenomen de crare (invazie, migrare, roire) -
creterea se exprim printr-un strat continuu, sub forma unor
valuri succesive; fenomen caracteristic pentru Proteus spp
(anexa 3).
Mediile lichide se folosesc pentru nmulirea unor microbi care se
gsesc n numr mic ntr-un anumit produs. Cultivarea unui produs pe
medii lichide are dezavantajul c nu permite obinerea unei culturi pure.
Prin cultivare n mediu de cultur lichid caracterele culturale ale
microorganismelor difer (figura 5) prin urmtoarele:
- tulburare, de exemplu: bacteriile din familia Enterobacteraceae;
- sediment ce se depune pe peretele eprubetei sau la fundul
mediului, de exemplu: bacteriile g. Streptococcus;
- voal caracteristic pe suprafaa mediului, de exemplu: bacteriile
strict aerobe (Pseudomonas, Nocardia);
- pigmeni difuzabili, de exemplu bacilul piocianic Ps. aeruginosa.

Turbiditate fin uniform Floculent Pelicul Sediment Fr cretere

Figura 5. Manifestarea caracterelor culturale ale microorganismelor

n mediile lichide

35
 Tradiional, numrul de bacterii se determin indirect, pe baza
numrului de colonii generate de celulele acestor microorganisme
prezente n proba de analizat, care se formeaz cnd proba sau o diluie a
acesteia vine n contact cu un mediu nutritiv, dup termostatare la 37C,
timp de 48 de ore.
Aceast tehnic de laborator este cronofag, pe cnd procedurile
moderne de detectare a bacteriilor sunt simple i rapide, genernd
rezultate ntr-un interval scurt de timp. Printre acestea putem enumera:
Aparate pentru detectarea rapid a bacteriilor. Lumitester C-
100 permit evaluarea cantitii i calitii contaminrii biologice i
monitorizarea igienei, funcionnd pe principiul bioluminiscenei ATP.
Aceste aparate msoar nivelul de luminiscen pe baza reaciilor
biochimice dintre ATP i enzima Luciferase.

Figura 6. Kit-ul portabil
Colifast
Tehnologia detectorului de
coliforme n ap Colifast (figura 6)
este fundamentat pe o reacie
chimic dintre un substrat de
mediul de cretere i enzimele
produse de bacteriile coliforme.
Enzima bacterian galactozidaza
E-D hidrolizeaz 4-methyl-
umbelliferyl-E-D-galactozide i
rezult un compus florescent.

Pe lng acest substrat, activatori, factori de cretere, mediul de

cultur mai conine inhibitori care mpiedic dezvoltarea bacteriilor, altele
dect coliformele.
Kit-uri de detectare i identificare pentru grupele de
microorganisme, de exemplu: Enterobacteriaceae, Lactobacillus spp.,
Salmonella spp., S. aureus, mucegaiuri.
Fiole cu membran. Funcionarea fiolelor cu membran se
bazeaz pe detectarea schimbrilor datorate metabolismului microbian ce
36
are loc n mediul de cultur lichid, utiliznd tehnologia markerelor. Prin
combinarea markerului, o nou surs de lumin i un senzor optic, acest
sistem permite detecia simultan a schimbrilor de culoare i fluorescen
cu ajutorul unui singur senzor-receptor (figura 7). Culoarea senzorului n
fiolele sterile este negru. Pe msur ce microorganismele cresc, senzorul
i schimb culoarea n galben, indicnd producia de dioxid de carbon i
creterea metabolic.
Printre aplicaiile fiolei cu
membran putem meniona:
numrul total de germeni,
combinaii coliforme i E. coli,
drojdii i mucegaiuri, bacterii
formatoare de acid lactic, test
challenge etc. Fiolele pot fi
aplicate n monitorizarea strii
sanitaro-igienice a spaiilor de
producere, utilajelor tehnologice
prin inserarea direct a
Figura 7. Construcia fiolei cu tampoanelor sau bureilor direct n
membran
fiola de testare.

37
 4. DINAMICA PROCESULUI DE MULTIPLICARE A
BACTERIILOR

4.1. Creterea i multiplicarea bacteriilor

Creterea i multiplicarea reprezint rezultatul metabolismului
microbian. Aceste procese au o serie de particulariti marcate de
intensitatea deosebit i de reglarea perfect a metabolismului microbian
[1, 5].
Creterea, n sens biologic, este definit ca procesul de mrire
coordonat a tuturor constituenilor unui organism ca rezultat al producerii
sau adugrii de substan nou. Pornind de la nutrienii din mediu,
creterea se realizeaz prin sinteza specific i echilibrat a unor compui
de baz care sunt asamblai ulterior pentru a forma copii fidele ale
constituenilor celulari i ulterior noi celule, prin multiplicare. Creterea
nu se realizeaz la infinit, deoarece este un proces controlat genetic, iar
dimensiunile bacteriilor sunt caracteristice n condiii normale. Atunci
cnd este atins un volum critic, creterea nceteaz i este urmat de
diviziunea celular. Mecanismul molecular declanator al diviziunii
celulare nu este bine cunoscut.
n mod obinuit, exist un raport echilibrat, controlat genetic, ntre
suprafaa i volumul celulei (S/V), astfel nct un rol important l are
dezechilibrul S/V aprut ca rezultat al creterii, care declaneaz
diviziunea, prin care se restabilete raportul echilibrat S/V. Mecanismul
de multiplicare cel mai rspndit i caracteristic bacteriilor tipice este
diviziunea simpl = binar, izomorf (mai rar, heteromorf, cu apariia
minicelulelor) [9, 8, 11].

4.2. Dinamica procesului de multiplicare a bacteriilor

Creterea bacterian se refer nu numai la dimensiunea unei
celule, ci i la numrul acestora n populaia bacterian rezultat la masa
total (biomasa) care este proporional cu numrul de celule bacteriene.
Baza creterii populaiei este diviziunea binar [2, 8, 10]. Prin diviziunea

38
unei celule sunt produse dou celule-fiice, iar acestea vor genera 4 celule-
fiice. Apoi diviziunile devin asincrone. Pornind de la o singur celul, se
ajunge la un numr de celule ce crete n progresie geometric (figura 8).

0 minute 20 minute 40 minute 60 minute

1 bacterie 2 bacterii 4 bacterii 8 bacterii

Figura 8. Diviziunea celulelor bacteriene [21]

n condiii artificiale de cretere, pe medii de cultur,

multiplicarea bacteriilor poate fi studiat pe populaii omogene de bacterii,
folosind dou tipuri principale de culturi:
- culturi discontinue, asincrone (cu alternativa culturilor
sincrone, necesare n anumite condiii);
- culturi de tip continuu.
Culturi discontinue, asincrone corespund modalitii de
cultivare n sistem nchis (de exemplu: flacoane sau eprubete) n care
cultivarea are loc ntr-un volum fix de mediu nutritiv de la nceputul pn
la sfritul experimentului. Cultivarea discontinu se caracterizeaz astfel:
- volumul fix de mediu pe tot parcursul cercetrii;
- compoziia chimic a mediului se modific pe parcursul
cultivrii sub raportul coninutului n nutrieni, a valorii pH i a produilor
de metabolism rezultai (acumularea de catabolii dintre care unii toxici);

39
 - numrul celulelor viabile este variabil n timp: la nceput crete
progresiv, ulterior ncepe s scad prin mbtrnire i moarte;
- ritmul de diviziune este mai mare la nceput cnd populaia
este tnr i mediul optim, pentru ca apoi s scad progresiv n funcie de
vrsta celulelor;
- numrul de generaii este limitat datorit limitrii procesului de
multiplicare de ctre anumite condiii de mediu.
Dei, are unele dezavantaje, metoda de cultivare n sisteme
nchise satisface cerinele necesare, practice i este utilizat n mod curent
n laborator. Pentru atenuarea unor dezavantaje ale metodei n care
creterea este asincron, se recurge la culturile sincrone. Ele sunt obinute
cu ajutorul tehnicilor speciale prin care se regleaz ritmul de diviziune a
bacteriilor, astfel nct majoritatea sau chiar toate bacteriile se divid n
acelai timp (sincron).

Curba de cretere a unei culturi bacteriene discontinue,

asincrone
Prin inocularea de celule bacteriene ntr-un mediu nutritiv steril se
poate stabili dinamica de cretere prin creterea numrului de celule
raportat la unitatea de volum a mediului [1, 5,12].
Evoluia unei populaii de bacterii ntr-o cultur discontinu,
asincron n funcie de timp, corespunde unei curbe de cretere
reprezentat grafic n figura 9.
Curba de cretere a unei culturi bacteriene discontinue asincrone
este alctuit din patru faze distincte: faza de lag, faza de cretere
logaritmic, faza staionar i faza de declin [1, 8, 10, 11].
Faza lag ncepe din momentul introducerii inoculului n mediul
de cultura. Numrul celulelor bacteriene rmne neschimbat sau se
modific neesenial. n aceast faz celulele nu sunt latente, ci au un
metabolism activ (sinteza de enzime induse), celulele pregtindu-se de
multiplicare.
La sfritul fazei celulele bacteriene cresc n dimensiuni i ncepe
faza de iniiere a creterii.
40
 Log nr. de celule
Faza Faza staionar
exponenial

Faza de declin

Faza
lag

Timpul
Figura 9. Curba de cretere a unei culturi bacteriene
discontinue asincrone

Faza exponenial (faza logaritmic) se caracterizeaz printr-un

ritm exponenial de cretere n care celulele bacteriene se acumuleaz cu o
vitez maxim, ritmul de cretere este constant i maxim, durata de
generaie atinge un minimum constant. Deoarece timpul de dublare este
constant, reprezentarea logaritmic a creterii n cursul fazei log este o
linie dreapt. Dac unghiul pantei acestei drepte este mic, rezult c
condiiile de cretere nu sunt favorabile [1, 20].
n cursul fazei log celulele manifest caracteristici evidente n
ceea ce privete forma, culoarea, densitatea i gruparea coloniilor. Faza
log este de asemenea perioada n care celulele au cea mai intens
activitate metabolic i n producia industrial aceasta este perioada de
vrf a activitii i eficienei.
Capacitatea exponenial de cretere dureaz ns o perioad de
timp limitat, datorit condiiilor limitante care apar n mediul de cultur
sau n natur. La sfritul fazei de cretere exponenial se evideniaz o
perioad de ncetinire a ritmului de cretere i cultura trece n faza
staionar de cretere.
41
 Faza staionar de cretere este faza n care numrul celulelor
viabile este maxim i rmne constant o perioad de timp: numrul de
celule viabile este egal cu cel al celulelor autolizate. Cantitatea de biomas
poate rmne constant, dei se schimb compoziia celulelor. Datorit
lizei unor celule se elibereaz noi substraturi care vor servi drept nutrieni
pentru celulele viabile. Aceast faz poate fi prelungit atunci cnd
urmrim pstrarea culturii pure, prin modificarea unor factori care scad
viteza de metabolism celular.
Faza de declin are loc o regresie exponenial (rata de autoliz
a celulelor microbiene este constant). Pe msur ce mediul devine mai
puin favorabil, ca urmare a lipsei de surse de nutriie i energie, de
denaturare a componenilor celulari n prezena substanelor de acumulare
(alcooli, acizi etc.), celulele vii nu se mai multiplic, dei activitatea lor
mai continu un timp dup care mor i intr n autoliz.
n unele surse bibliografice curba de cretere a microorganismelor
este alctuit din ase faze distincte: faza lag, faza de nceput de cretere,
faza exponenial, faza de ncetinire a creterii, faza staionar de cretere
i faza de declin [1].
Culturi discontinue sincrone
n cazul culturilor bacteriene obinuite diviziunile celulelor
individuale urmeaz ritmuri proprii, astfel nct rezult o populaie
eterogen, format din indivizi aflai, practic, n toate fazele ciclului lor de
cretere i multiplicare. Chiar n cazuri speciale, n care pornim de la o
singur celul, se constat c la descendenii acesteia, dup o perioad de
diviziune sincron apar diferene, decurgnd din timpul diferit necesar
celulelor s se divid.
Culturile cu cretere sincron sunt selecionate din culturi
asincrone i conin organisme foarte asemntoare, deoarece aparin
aceleiai categorii de vrst i/sau de dimensiune i ca urmare se divid
aproape simultan.
Procesul de diviziune sincron dureaz numai cteva generaii (2-
3), deoarece diferenele individuale determin procese de defazare n
ritmul de cretere, chiar ntre descendenii unei singure celule.
42
 Tehnicile de obinere a culturilor sincrone pot fi grupate n dou
categorii:
- tehnici bazate pe selecie dup dimensiuni de vrst:
filtrarea prin filtre suprapuse; separarea prin centrifugare n gradieni de
densitate nemetabolizabili de microorganismul studiat; separarea prin
filtrare pe filtre de membran;
- tehnici bazate pe modificri ale mediului: expunerea
microorganismelor autotrofe la o perioad de nfometare; medii fr un
factor de cretere esenial nainte de a fi trecute microorganismele ntr-un
mediu complet; expunerea la doze subletale de radiaii; expunerea la
aciunea unui antibiotic care inhib sinteza proteinelor; expunerea
microorganismelor fotosintetizante alternativ la ntuneric i lumin etc.
Parametrii de cretere bacterian
Dup stabilirea experimental a curbei de cretere se pot calcula
urmtorii indici [1]:
- numrul de generaii produse n timpul t (n):

- viteza (rata) de cretere este dat de numrul de generaii

pe unitatea de timp ()
-

unde: numrul iniial de celule din mediu, ufc/cm3;

numrul de celule rezultate prin multiplicarea n
timpul cultivrii, ufc/cm3;
timpul zero al determinrii, ore;
intervalul de timp studiat, ore;

- timpul de generaie (tg):

unde: intervalul de timp analizat, ore;

numrul de generaii produse n timpul, t.
43
 Exemplu de calcul

Timpul de generaie reprezint perioada de timp necesar pentru

ca o celul s se divid i deci populaia s se dubleze, sau timpul dintre
dou diviziuni succesive. Timpul de generaie variaz n funcie de specia
i de condiiile de mediu. n tabelul 5 sunt prezentate valori ale timpului
de generaie pentru unele microorganisme cultivate n condiii optime [1].

Tabelul 5. Timpul de generaie pentru unele microorganisme [1]

Timpul de
Microorganismele Temperatura, oC
generaie, ore
Bacterii:
Escherichia coli 40 0,35
Bacillussubtilis 40 0,43
Clostridiumbotulinum 37 0,58
Mycobacteriumtuberculosis 37 12
Fungi:
Saccharomycescerevisiae 30 2
Monilia fructicola 25 30

n cazul stabilirii dinamicii de cretere a microorganismelor prin

studiul vitezei de acumulare a biomasei, se determin randamentul de
cretere. Randamentul de cretere este un indice care exprim cantitatea
de biomas rezultat prin consumul unui nutrient.

44
 Acest indice arat eficiena de conversie a nutrienilor n
materialul celular. Astfel, randamentul crete odat cu majorarea
concentraiei nutrientului pn cnd aceasta atinge o valoare de saturaie i
rata de cretere rmne constant sau scade. Uneori creterea microbian
este limitat de un anumit nutrient necesar (vitamine i ali factori de
cretere), n acest caz randamentul va depinde de coninutul acestui
nutriment.
Culturi de tip continuu - corespund modalitii de cultivare n
sistemul deschis, cnd mediul de cultur este continuu rennoit printr-un
mecanism dublu: adugare de mediu proaspt cu acelai ritm cu care se
recolteaz i ndeprteaz cultura microbian rezultat.
Culturile de tip continuu formeaz celule cu proprieti uniforme
i activiti fiziologice optime, fiind utilizate n procese biotehnologice
industriale. Se realizeaz n chemostat sau turbidistat, cultura aflndu-se
permanent n faza exponenial.
Mediu nutritiv pentru chemostat
conine un nutrient esenial (de
Mediu proaspt
exemplu: un aminoacid) n cantiti
limitate nct rata de cretere este
Valva de control determinat de rata cu care se
introduce mediul proaspt i n final
densitatea celulelor depinde de
Alimentare aer
concentraia nutrientului limitant
Filtru de (figura 10).
aer
Turbidistatul este echipat cu o
Valv fotocelul care msoar absorbana
de cultur sau turbiditatea culturii din vasul de
cultivare. Rata de furnizare a
Colector mediului nutritiv steril este reglat
Figura 10. Reprezentarea automat pentru a menine constant
schematic a chemostatului [1] densitatea celulelor.

45
 5. METODE DE IZOLARE I OBINERE A
CULTURILOR PURE

Cultura pur reprezint o biomas de celule rezultate prin

reproducere dintr-o singur celul aflat ntr-un mediu nutritiv steril, cu
volum limitat. Cultura pur este considerat i colonia care se formeaz ca
rezultat al izolrii unei celule sau a unei uniti formatoare de colonii,
atunci cnd aceasta este localizat pe un mediu nutritiv solid. Puritatea
unei culturi se poate obine i prin repicare, deci prin transfer de celule din
eprubeta ce conine cultura pur, n alt vas cu mediu de cultur steril [1,
10, 15].
n practica de laborator se cunosc numeroase metode prin care se
poate realiza separarea unei singure celule din microbiota eterogen a
mediilor naturale. Metodele cunoscute i practicate n laborator n scopul
izolrii culturilor pure pot fi clasificate n metode fizice i metode
biologice [1, 9, 15].

5.1. Metode fizice de izolare i de obinere a culturilor pure

Metodele bazate pe tehnici de rspndire se folosesc pe scar
larg, fiind uor de executat, avnd ca principiu rspndirea celulelor din
medii naturale unde acestea se afl n numr mare, prin diluare n medii
lichide sau prin diseminare mecanic pe suprafaa mediilor sterile.
Tehnica de rspndire pe plac (tehnica Drigalsky) este o
tehnic de laborator des utilizat n microbiologie. Aceast tehnic este
utilizat att n determinarea numrului de bacterii prezente n proba de
analizat, ct i n izolarea acestora. n figura 11 sunt prezentate dou
metode de placare:
Metoda A. Pe mediul nutritiv solid steril se distribuie trei picturi
distincte de prob selectat pentru analiz, apoi cu ajutorul spatulei
Drigalsky, n prealabil sterilizat, picturile se uniformizeaz, fr a strivi
suprafaa mediului nutritiv. Placa Petri se termostateaz la temperatura

46
optim de dezvoltare a microorganismelor cercetate. Dup 48-72, ore pe
suprafaa plcii se disting colonii separate.
Metoda B. Pe placa Petri steril se picur trei picturi (100 l) de
prob selectat pentru analiz, apoi se toarn mediul fluid, se las s se
solidifice. Dup o termostatare corespunztoare constatm o cretere a
coloniilor microbiene bine conturate.
Metoda A Colonii de
suprafa
Incubare

Proba este pipetat pe Proba este rspndit uniform pe

placa cu agar suprafaa de agar utiliznd
bagheta de sticl steril
Metoda B Colonii de Colonii de
suprafa suprafa
Incubare

Proba este pipetat pe Este adugat mediu steril i

placa steril amestecat bine cu inoculul

Figura 11. Metoda de rspndire plan[14]

Metoda de rspndire prin striuri pe placa Petri. Aceast

metod const n efectuarea inoculrii probei de cercetare (analizate) n
patru sectoare. Cu ajutorul ansei sterile se preleveaz proba cu produs i
se fac nsmnri prin striuri n sectorul 1 (figura 12). Apoi din primul
sector cu ansa sterilizat se fac trasri n sectorul 2, n direcia acelor
ceasornicului. Trasrile sunt continuate n sectorul 3, iar n sectorul 4 se
efectueaz printr-un striu n form de zig-zag.
Metode scarificate. n placa Petri se repartizeaz un mediu de
cultur adecvat, de exemplu MMA/BCA i dup solidificarea mediului cu
firul metalic se recolteaz celule din mediul natural i se execut trasri pe
suprafaa mediului, astfel nct diversele celule rmn distanate ntre ele.
Prin termostatare, 48-72 ore, din colonia care corespunde

47
microorganismului ce trebuie izolat se face repicare ntr-o eprubet cu
mediu solid nclinat i astfel se obine o cultur pur (figura 13).

Figura 12. Metoda de rspndire prin striuri pe placa Petri [14]

Figura 13. Metode scarificate de izolare [14]

48
 Metoda n strii este
similar celei scarificate,
n schimb drept suprafa
de rspndire se folosete
mediul nclinat din 2-3
eprubete, prin transferul
de celule din mediul
natural, prin realizarea de
striuri, n mod succesiv.
Aceste metode se folosesc
i n cazul n care o
cultur pur este
contaminat cu
microorganisme strine n
perioada de pstrare a
Figura 14. Metoda n strii de rspndire culturii i aceasta trebuie
pe mediul solid nclinat[4] s fie salvat (figura 14)
[1, 4].

Metoda cultural Koch este folosit n special la izolarea

drojdiilor. Ca mediu de rspndire se folosete MMA repartizat n 3
eprubete, fluidificat i meninut la 40C. Din mediul natural, de exemplu
un must n fermentaie, se recolteaz proba de cercetare cu ajutorul ansei
care se introduce succesiv n cele 3 eprubete, cu agitare, pentru ca s
asigure desprinderea celulelor. Dup inoculare i uniformizare, coninutul
fiecrei eprubete se repartizeaz n cte o plac Petri. Prin solidificare
celulele rmn fixate n gel i prin multiplicare vor forma colonii izolate.
n funcie de densitatea celulelor recoltate, iniial n placa a 2-a sau a 3-a
coloniile sunt suficient de distanate (se prefer o distan de circa 2 cm),
pentru a putea face izolarea din colonia adecvat a culturii pure, prin
repicare n eprubeta cu MMA (figura 15) [1, 9, 14].

49
 a

Suspensia celulelor
microbiene 9 ml soluie salin
Diluii 1:10 1:100 1:1000 1:10000 1:100000 1:10000000

colonii

Mediu
fluidizat

Turnarea n plac Colonii izolate

Figura 15. Metoda cultural Koch [14]

Metode prin diluare. n prima etap, din mediul natural se

execut diluii decimale n ser fiziologic steril, astfel nct numrul de
celule ntr-o micropictur din ultima diluie s fie redus (figura 16).
Metoda Lindner se folosete pentru izolarea de drojdii
fermentative. Din diluia convenabil, cu ajutorul unei penie topografice
se plaseaz aproximativ 9 picturi pe suprafaa unei lamele sterile. Lamela
se amplaseaz cu picturile n jos pe o lam cu excavaie i se studiaz la
microscop fiecare pictur. Se noteaz cu un marker conturul picturii n
care se afl o singur celul. Se desprinde lamela i cu ajutorul unei benzi
sterile de hrtie se absoarbe pictura notat. Odat cu lichidul se adsoarbe
i celula de izolat, apoi banda se introduce ntr-o eprubet cu mult lichid.
Celula va da prin reproducere o cultur pur. Dei este meticuloas,
metoda propus de Lindner este o metod precis, deoarece se face sub
controlul microscopic.

50
 Probele s fie
numrate
1 ml
Dilu ii
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

9 ml
bulion
1/10 1/100 1/103 1/104 1/105 1/106
(10-1) (10-2) (10-3) (10-4) (10-5) (10-6)
Plac 1-ml prob

159 17 2 0
Prea multe colonii pentru colonii colonii colonii colonii
a putea fi numrate
159 x 103 = 1,59 x 105
nr. de factorul celule (colonii uniti formatoare
germeni de diluie de colonii) per ml de prob original

Figura 16. Efectuarea diluiilor i determinarea numrului total

de germeni [13]

Metoda Naumov este folosit pentru izolarea culturilor pure de

mucegaiuri. Dintr-o diluie convenabil se aplic distanat micropicturi
peste care se adaug picturi de mediu MMA fluidificat (42C) i dup 3-
8 zile se selecteaz din pictura cu o singur colonie cultura pur dorit.
O metod simplificat pentru separarea sporilor fungici const n
inundarea unei plci cu MMA cu 1-2 cm3 din diluia convenabil. Sporii
care au rmas ataai de mediu vor da colonii izolate. n general
mucegaiurile nu creeaz probleme la izolare, deoarece cresc sub form de
colonii mari pe diverse alimente i pentru obinerea n cultur pur se face
repicarea de spori situai n centrul coloniei.
Metode de izolare cu ajutorul micromanipulatorului. Este o
metod precis i se realizeaz cu ajutorul unui aparat prevzut cu tuburi
capilare cu care se poate face selecia celulelor dorite din preparate

51
studiate la microscop. Cu ajutorul micromanipulatorului se poate face
recoltarea de ascospori din celule ascogene i este folosit la dirijarea
proceselor de fuziune a protoplastelor, pentru conjugare etc.

5.2. Metode biologice de izolare i de obinere a culturilor pure

Metodele biologice sunt foarte diverse i se bazeaz pe
proprietile fiziologice ale microorganismelor de izolat care s se
diferenieze clar de cele ale microorganismelor nsoitoare din acelai
biotop. Uneori prin aceste metode se face izolarea unui grup cu caractere
taxonomice apropiate, apoi se face izolarea de culturi pure prin tehnici de
rspndire sau prin folosirea mediilor selective [2,.
O metod biologic clasic este metoda Burri prin care se face
separarea microorganismelor n funcie de necesarul de oxigen pentru
cretere (figura 17).

Zone de
cre tere
Coninut nalt de oxigen
Aerobe
Microaerofilic
Facultativ

Coninut redus de oxigen

Anaerobe

Lips oxigen

Figura 17. Zone de cretere a microorganismelor n funcie

de necesarul de oxigen pentru cretere [13]

Dintr-un mediu natural se face inocularea n BCA termostatat la

42C i dup uniformizare acesta se introduce ntr-un tub de sticl
prevzut la un capt cu dop de cauciuc. Prin rcire celulele sunt
imobilizate n gel i prin termostatare n funcie de accesul oxigenului din
aer, n zona tubului prevzut cu dop de cauciuc se vor dezvolta bacterii

52
anaerobe, intermediar bacterii microaerofile, iar n stratul de mediu la care
aerul a ptruns prin dopul de vat al tubului, bacterii aerobe (figura 18).

Concentraie Dop din

nalt de vat
Oxigen

Sczut
Obligatoriu Obligatoriu Facultativ Aerotolerant
aerobe anaerobe anaerobe anaerobe

Figura 18. Metoda Burri de izolare i obinere a culturilor pure [13]

Prin metode biologice pot fi selectate bacteriile sporogene din

medii naturale pe baza termorezistenei endosporilor. De exemplu,
Bacillussubtilis poate fi izolat din infuzia de fn, deoarece endosporii
rezist la fierbere, n timp ce formele vegetative sunt distruse. Apoi
endosporii prin germinare trec n forme vegetative, formnd n 24 ore un
voal cutat.
Numeroase metode de izolare se bazeaz pe introducerea n
mediile de cultur a unor substane chimice cu efect inhibitor asupra
microorganismelor de care trebuie separat cultura dorit. De exemplu,
prin introducerea de 0,02% actidion are loc inhibarea dezvoltrii
drojdiilor aflate n amestec cu bacteriile. Metoda este folosit pentru
izolarea unor bacterii ce pot produce contaminarea drojdiilor folosite sub
form de culturi pure n industriile fermentative (vezi clasificarea mediilor
de cultur, p. 30).

53
 5.3. Importana practic a culturilor pure
Culturile pure sunt folosite pentru studiul proprietilor
morfologie i fiziologice n scopul identificrii, caracterizrii i stabilirii
domeniului de utilizare a culturii. Sub form de culturi pure
microorganismele pot fi supuse unor tratamente fizico-chimice prin care
se pot induce modificri genetice la nivelul acizilor nucleici, cu obinerea
de culturi mutante, din rndul crora se face din nou selecia tulpinilor
performante.
Obinerea culturilor-starter n procesele fermentative
industriale. Pornind de la cultura pur, n biotehnologiile alimentare prin
cultivarea n medii adecvate se obine cantitatea necesar de inocul/maia
folosit drept cultur-starter a procesului fermentativ.
Inoculul reprezint un mediu nutritiv steril n care s-au nmulit
celulele aparinnd unei culturi pure, aflat n etapa final a creterii
exponeniale. Cantitatea de inocul trebuie astfel calculat, nct prin
introducerea sa n mediul fermentativ steril, concentraia n celule s
asigure declanarea rapid a procesului. n funcie de specificul
biotehnologic este obligatorie asigurarea continuitii n transfer pentru
aprovizionarea cu inocul activ, la perioada solicitat de producie.
Utilizarea culturilor pure n biotehnologiile alimentare (la
fabricarea berii, alcoolului, vinului, produselor lactate acide, panificaie
etc.) permite obinerea unor produse de calitate constant.
Pentru cultivarea bacteriilor, o cantitate mic de material ce
conine bacterii (inoculum) se introduce ntr-un mediu de cultur
(nsmnare, inoculare), care ulterior va fi incubat n termostat (pentru
asigurarea temperaturii optime).
n timpul incubrii (18-24-48 ore) bacteriile cresc i se divid,
formnd o cultur bacterian (totalitatea bacteriilor acumulate prin
multiplicare ntr-un mediu).

54
 5.4. Procedee de conservare a culturilor pure
Repicarea periodic prin transfer de celule din eprubeta cu o
cultur pur n care mediul nutritiv este epuizat, n eprubeta cu mediu
nutritiv steril cu compoziie similar. Procedeul de repicare periodic
necesit un mare volum de munc, prezint risc de contaminare i este
greu de realizat atunci cnd numrul de culturi de ntreinut este mare.
Prelungirea intervalului dintre dou repicri prin scderea
vitezei de metabolism a celulelor i deci evitarea strii de declin ce poate
duce la pierderea culturii; aceasta se poate realiza astfel:
meninerea culturilor la temperaturi sczute n condiii de
refrigerare sau congelare. Culturile de fungi pstrate la 5C se transfer
anual, iar dac pstrarea se face la 16C la interval de 6 luni;
privarea de oxigen. n absena oxigenului din aer,
microorganismele aerobe trec n stare latent de via;
reducerea umiditii mediului conduce la trecerea celulelor
n stare de anabioz care poate fi meninut timp ndelungat fr a se
produce modificri intracelulare, ireversibile;
pstrarea culturilor n stare liofilizat. Este tehnica cea mai
utilizat i avantajoas, deoarece prelungete cel mai mult intervalul de
conservare a culturilor, fr s produc modificri ale proprietilor lor
fiziologice. n cazul mucegaiurilor, o suspensie de spori n lapte degresat
se congeleaz rapid la - 25C, apoi are loc uscarea n vacuum timp de trei
ore n recipiente de sticl care se nchid ermetic i culturile se pot menine
10 ani [1].

55
 BIBLIOGRAFIE
1. Dan, V., Microbiologia produselor alimentare, Volumul I, Editura
Alma, Galai, 1999, 201 p.
2. Duca, E., Curs de microbiologie, vol. I, Iai, 1973, 29 p.
3. Fiziologia microorganismelor procariotestr.
calificativ.ro/referate/.../tema_3_6489.doc
4. Gheteu, D., Virusologie, microbiologie, parazitologie. Lucrri practice.
http://www.justmed.eu/fisiere/xCox3APOLLONIA_materiale_l
5. Grebenian, I., Microbiologie. Note de curs. http://www.eco-
research.eu/Note%20de%20curs.pdf
6. Ivana S., . a., Microbiologia alimentelor, Volumul I, Editura Asclepius,
Bucureti, 2011. www.bibliotecafmvb.ro/doc-site/ma1bib.pdf
7. Jelea, M., Microbiologie general. Note de curs, CEPA II.
http://chimie-biologie.ubm.ro/Cursuri%20on-line/JELEA%
8. Ordeanu, V., Microbiologie general i farmaceutic. Note de curs,
2012. https://ru.scribd.com/doc/81599955/12/CURS-16-Micete-levuri-
si-fungi-micotoxine
9. Vidican, R., Curs Microbiologie. Anul II.
http://ru.scribd.com/doc/129615173/Curs-Microbiologie
10. Zarnea, G., Tratat de microbiologie general, Bucureti, 1984.
11. Burows, W., Textbook of Microbiology, 18 th, Ed.W.B.Saunders
Company, Philadelphia London, 1964, 32 p.
12. Elements of Microbial Nutrition and Growth
https://sites.google.com/.../chapter-7-elements
13. Microbial physiology. Microbial metabolism.
microbio.ucoz.com/Prelegeri/.../Lecture_3.ppt
14. Main principles and methods of pure cultures isolation.
http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/micbio/class
15. Neusely, S., et al. Microbiological examination methods of food and
water. Laboratory Manual, CRC Pres, 2013, 484 p.
16. .
http://intranet.tdmu.edu.ua/data/kafedra/internal/micbio/classes
17. http://atlas.microumftgm.ro/bacteriologie/bactgen/cc.php
18. https://www.google.md/search?q=Elements+of+Microbial+Nutrition&b
iw=1280&bih=709&source
19. http://www.scritub.com/biologie/NUTRIIAMICROORGANISMELR
20. http://www.bio.unibuc.ro/pdf/licenta_2014/biochimie/Microbiologie
21. https://www.google.md/search?q=temperature+influence+on+the+dev

56
 ANEXE
Anexa 1
Medii folosite i aspectul coloniilor la principalele genuri
de enterobacteriacee [6]
Mediul Salmonella Shigella Escherichia Proteus
Wilson Blair colonii umede nu se dezvolt nu crete sau colonii verzi,
negre pentru (n afar de d colonii rare, neinvadante
S. typhimurium: S. flexneri i mici, gri
colonii plate, S. Sonnei care
S. sudpestifer , dau colonii
S. typhimurium brune)
Leifson colonii incolore colonii colonii roii colonii cu
incolore centrul negru
Christensen colonii netede, colonii netede colonii groase, colonii izolate,
Lester i roii sau roz roii, galben-verzui mucoase,
Jurgens strlucitoare strlucitoare strlucitoare galbene sau roz
SS colonii colonii rare colonii roz colonii rare
incolore, incolore sau rou aprins neinvadante
cu centrul
negru
pentru
Salmonelele
ce dau H2S
Istrati Meitert colonii verzi, colonii verzi colonii colonii izolate,
albstrui sau verzui- galbene opace central opace,
albstrui devenind negre
Geloza verde colonii roii nu crete colonii verzui uneori colonii
briliant rare roii,
(Christensen) neinvadante
Mac Conkey colonii incolore colonii colonii roii cu invadeaz
incolore inele periferice
de bil
precipitat
Levin colonii incolore colonii colonii negre invadeaz
(E.M.B.) incolore sau cu centrul
negru, cu reflex
metalic
Geloz colonii albastre colonii colonii roii invadeaz
lactozat albastre
turnesolat
(Drigalski)
Endo colonii incolore colonii colonii roii invadeaz
incolore

57
 Anexa 2

Identificarea bacteriilor [16]

Proprieti morfologice i tinctoriale

Producerea de toxine

Proprieti culturale

Fagotipire

Proprieti fermentative

Proprieti antigenice Sensibilitate la antibiotici

58
 Anexa 3
Caractere culturale ale microorganismelor [17]

Colonii tip ,,S (smouth)

Caracteristici: colonii rotunde, margini regulate, bombate, suprafa
neted, uneori translucid, suspensioneaz omogen n serul fiziologic,
caracteristice n general germenilor cu potenial patogen.

Cultur mixt Colonie de tip S,

de colonii S i R geloz-snge, 4x

Colonii ,,R (rough)

Caracteristici: colonii de forme diverse, margini neregulate, plate,
uscate, suprafa zbrcit, uneori reprezint o form de degradare a
coloniilor S, caracteristice n general germenilor fr potenial
patogen.

Colonie de tip R, Colonie de tip R,

geloz-snge, 4x geloz-snge, 4x
59
 Continuarea anexei 3

Colonii ,,M (colonii mucoase)

Caracteristici: aspect mucos, foarte mari, foarte bombate, foarte
lucioase, cu tendin de curgere i de confluare caracteristice bacteriilor
care posed capsul.

Cultur Klebsiella, Colonii mucoase de Klebsiella,

CLED agar CLED agar, 4x

Colonii ,,U (colonii untoase)

Caracteristici: colonii mari, rotunde, suprafa mat, aspect untos,
caracteristice levurilor.

Cultur de Candida albicans, Colonii untoase de Candida

mediu Sabouraud albicans, mediu Sabouraud, 4x

60
 Continuarea anexei 3

Colonii tip ,,pufos (colonii cu aspect pufos)

Caracteristici: aspect pufos datorit miceliilor, forme i mrimi diverse,
caracteristice fungilor filamentoi (mucegaiuri).

Cultur cu o colonie pufoas, Colonie pufoas,

mediu PDA mediu PDA, 4x

Colonii ,,cu fenomen de crare (colonii migratoare)

Caracteristici: colonii cu cretere rapid, se ntind pe mediu sub form
de valuri, invadeaz mediile de cultur neselective, caracteristice pentru
germeni extrem de mobili (Proteus spp.).

Cultur Proteus 24h, Cultur Proteus 72h,

geloz-snge geloz-snge

61
 CUPRINS

INTRODUCERE.................................................................. 3
1. COMPOZIIA CHIMIC A MICROORGANISMELOR........... 4
1.1. Compoziia chimic a microorganismelor............................. 4
1.2. Setul enzimatic al microorganismelor................................... 12
2. NUTRIIA MICROORGANISMELOR....................................... 13
2.1. Condiiile de desfurare a procesului de nutriie................. 14
2.2. Modaliti de transport al nutrienilor............................. 15
2.3. Tipuri de nutriie.......................................................... 19
2.4. Surse de carbon....................................................................... 24
2.5. Surse de azot, fosfor, sulf........................................................ 26
2.6. Nutriia mineral..................................................................... 26
2.7. Factorii de cretere.................................................................. 27
3. MEDII DE CULTUR.......................... 29
3.1. Clasificarea mediilor de cultur.. 30
3.2. Manifestarea creterii i multiplicrii microorganismelor.. 33
4. DINAMICA PROCESULUI DE MULTIPLICARE A
BACTERIILOR.. 38
4.1. Creterea i multiplicarea bacteriilor... 38
4.2. Dinamica procesului de multiplicare a bacteriilor.. 38
5. METODE DE IZOLARE I OBINERE A
CULTURILOR PURE........ 46
5.1. Metode fizice de izolare i de obinere a culturilor pure........ 46
5.2. Metode biologice de izolare i de obinere a culturilor pure... 52
5.3. Importana practic a culturilor pure...................................... 54
5.4. Procedee de conservare a culturilor pure....... 55
BIBLIOGRAFIE............................................................................ 56
ANEXE........................................................................................... 57

62
 MICROBIOLOGIA GENERAL

Note de curs
Partea II

Autori: Luiza SANDULACHI

Liliana POPESCU
Viorica BULGARU

Redactor: Eugenia BALAN

_____________________________________________________
Bun de tipar 01.07.15 Formatul 60 x 84 1/16
Hrtie ofset.Tipar ofset Tirajul 50 ex.
Coli de tipar 4,0 Comanda nr. 71

2004, UTM, Chiinu, bd. tefan cel Matre, 168

Editura Tehnica-UTM
2068, Chiinu, str. Studenilor, 9/9

63