Manual de Procedimientos de Hematologicos PDF

Manual de Procedimientos de
Laboratorio Clnico del H.G.Z. c/U.M.F.

No. 2 "Salina Cruz, Oax"
Seccin de Hematologa
Actualizacin 2012
Instituto Mexicano del Seguro Social
Actualizado por: Q.F.B. Mara de Jess Sosa/ Jefe de Laboratorio

Q.C. Jessica Tello Pomposo/Qumico Clnico 80
Manual de Procedimientos de Laboratorio de anlisis Clnicos
INDICE
Manual de Procedimientos Hematolgicos 2

HEMATOLOGA
La sangre es un lquido viscoso ms denso que el agua que circula por todo el cuerpo
humano a travs de vasos cerrados y contiene como pigmento respiratorio la
hemoglobina.
La sangre est formada por:
El plasma, es la porcin lquida de la sangre en la que estn inmersos los elementos

formes. Es salado y de color amarillento traslcido y es ms denso que el agua. El
volumen plasmtico total se considera como de 40-50 mL/kg peso; y por Clulas que
flotan en el plasma, comnmente llamados elementos figurados de la sangre: Glbulos
rojos, glbulos blancos y plaquetas.
El plasma sanguneo es esencialmente una solucin acuosa de composicin compleja
conteniendo 91% agua, y las protenas el 8% y algunos rastros de otros materiales
(hormonas, electrolitos, etc). Estas protenas son: fibrgeno, globulinas, albminas y
lipoprotenas. Otras protenas plasmticas importantes actan como transportadores
hasta los tejidos de nutrientes esenciales como el cobre, el hierro, otros metales y
diversas hormonas. Los componentes del plasma se forman en el hgado (albmina y
fibrgeno), las glndulas endocrinas (hormonas), y otros en el intestino.
Cuando la sangre se coagula, el lquido que queda despus de separarse el coagulo, se

denomina Suero; es una suspensin acuosa de sustancias compatibles con
los organismos vivos debido a sus caractersticas definidas de osmoticidad, pH y fuerza
inica. Est compuesto de agua, electrolitos y, a veces, distintas sustancias, como por
ejemplo la glucosa, fuente de carbono y energa para el organismo, y de
algunos polisacridos expansores.
La diferencia fundamental entre el plasma y el suero consiste en que este pierde el

fibringeno proteico, que se convierte en filamentos insolubles de fibrina en el curso de
la coagulacin.
Las tcnicas hematolgicas tratan sobre todo los componentes celulares de la sangre,
su nmero o concentracin, la distribucin relativa de los diversos tipos de clulas y los
trastornos bioqumicos que pueden producir una enfermedad, as como tambin los
trastornos estructurales.

METODO DE EXTRACCION DE SANGRE
INTRODUCCIN:
La sangre para pruebas de laboratorio puede ser capilar o perifrica venosa.
OBJETIVO:
Establecer y uniformizar criterios en el procedimiento de obtencin de muestras

sanguneas con un adecuado control de calidad, ya que de ello depende que el
resultado del anlisis de la muestra sea el correcto. Se efectuar en ayunas o no,
dependiendo de la prueba a usar.
a) SANGRE CAPILAR
Introduccin:
Se dice que la sangre que solemos denominar sangre perifrica es ms bien arteriolar
que capilar.
Objetivos:
Para los recuentos de clulas y las determinaciones de concentracin de hemoglobina,

es mejor tomar la sangre de una vena. Pero para hacer determinaciones de grupo
sanguneo puede sacarse del dedo preferentemente de las yemas, de la mano izquierda
y del dedo anular, o tambin para realizar tcnicas micromtricas, del taln en casos
de nios, la puncin se realizar con decisin y despacio, pues duele, y deber
profundizarse hasta por 3 mm.
Zonas Adecuadas para Puncin Capilar
Material:
Lancetas
Torundas de alcohol
Paciente

Tcnica:
Se limpia primero con ayuda de las torunda de alcohol la zona de puncin para
hacer asepsia y aumentar la cantidad de sangre en el sitio.
Cuando la piel este seca y se haya reanudado la circulacin, se realiza la
puncin la cual ser de golpe y con rapidez.
La primera gota de sangre se deja perder, limpindola con una gasa o torunda
alcoholada sin tocar la zona pinchada.
Se espera a que caigan ms gotas, sin exprimir el rea pinchada porque eso
diluira la sangre con lquido extracelular. Se recogen las gotas de sangre
necesarias sobre el objeto donde se analizar o almacenar.
Tcnica en Adultos
Tcnica en Bebs
Notas:
Una puncin profunda es menos dolorosa que una puncin superficial y se evita la
necesidad de repetir la operacin.
Si las gotas no fluyen libremente aplicar una ligera presin sobre la zona, no se debe
exprimir ni forzar el flujo, esto puede hemolizar la muestra o incrementar la proporcin
de fluidos intersticiales en ella.
El precalentamiento de la zona de puncin puede favorecer su vascularizacin.
Utilizar siempre lancetas para realizar esta tcnica. El uso de agujas hipodrmicas o
I.V. est totalmente desaconsejado. (Una de las primeras causas de pinchazos
accidentales).

b) SANGRE VENOSA
Las venas han adquirido importancia en la clnica por dos razones:

Por ser fuentes de sangre por el nmero, cada vez mayor, de anlisis de sangre
Va de introduccin de diversos agentes teraputicos.
VENOPUNCIN
Introduccin:
Casi todas las muestras de sangre se obtienen por puncin venosa. Es el mtodo ms
fcil y adecuado para obtener un volumen de sangre suficiente para llevar a cabo gran
nmero de pruebas.
La venopuncin es la obtencin de una muestra de sangre, mediante una puncin

venosa perifrica o central, para realizar el posterior anlisis en el laboratorio clnico.
La muestra puede dividirse y tratarse conforme a las necesidades del caso, por ejemplo
parte puede mezclarse con anticoagulante para obtener plasma, sangre completa o
ambos, otra puede dejarse coagular para obtener suero.
La eleccin del lugar de realizacin de la puncin representa una parte vital del
diagnstico. Existen diversos lugares que pueden ser elegidos para la venopuncin. La zona ms
idnea para las venopunciones es la fosa antecubital, en la parte anterior del brazo, frente y bajo el
codo, donde se localiza un gran nmero de venas, relativamente prximas a la superficie de
la piel.
Cuando las venas de esta regin no estn disponibles o no son accesibles, las venas del
dorso de la mano tambin pueden ser utilizadas para la venopuncin. Las venas de la
parte inferior del puo no deben ser utilizadas porque, al igual que ellas, los nervios y
tendones estn prximos a la superficie de la piel en esa zona.
No se deben utilizar zonas alternativas como tobillos o extremidades inferiores sin la

autorizacin del mdico, debido al potencial significativo de complicaciones mdicas
que implican, por ejemplo: Flebitis, trombosis o necrosis tisular.

OBJETIVO:
- Obtener una muestra de sangre para exmenes de laboratorio.
- Ayudar al diagnstico mdico.
- Indicar tratamiento especfico.
- Controlar la evolucin de una enfermedad.
- Investigacin clnica.
- Evaluar el efecto al tratamiento y ajustar dosis teraputica.
OBTENCIN DE SANGRE VENOSA CON JERINGA
Materiales y equipos requeridos

Algodn.
Alcohol al 70%.
Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo.
Jeringas de 5 mL.
Tubos con anticoagulante EDTA y CITRATO DE SODIO.
Etiquetas del paciente.
Contenedor de RPBI
Tcnica:
a) Verificar que los elementos por utilizar estn listos, y que el paciente se sienta
cmodo. Rotular con sus respectivas etiquetas los tubos antes de realizar la
puncin.
b) Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de la flexin
del codo o a 10 cm del codo, sujetar con un medio nudo. El paciente deber
tener el brazo apoyado sobre una base de una forma cmoda.
c) Las venas del pacientes debern ser evaluadas o examinadas antes de realizar
la puncin.

d) El paciente deber abrir y cerrar la mano durante unos segundos y despus la

mantendr cerrada, esto ayudar a visualizar las venas superficiales.
e) Limpiar la zona con alcohol al 70% o alcohol yodado, en un rea de 2 pulgadas.
f) Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de tal manera que

el bisel se encuentre hacia arriba.
g) Se coloca la aguja en direccin paralela a la vena, se perfora la piel haciendo
avanzar la aguja 0,5-1 cm en el tejido subcutneo, luego se perfora la vena.
h) Se aspira la jeringa hasta el volumen requerido.

i) Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puo. Se coloca el

algodn seco encima de la puncin y se retira la aguja.
j) Retirar la aguja de la jeringa. Verter la muestra lentamente por las paredes
del tubo con anticoagulante.
k) Agitar el tubo en forma de 8 para homogeneizar la muestra con el
anticoagulante.
l) Desechar el material utilizado de manera adecuada como se indica en el
Manual de Residuos Peligrosos Biolgico Infecciosos.
OBTENCIN DE SANGRE VENOSA CON SISTEMA DE VACIO (VACUTAINER)
Materiales y equipos requeridos

Algodn.
Alcohol al 70%.
Ligadura o torniquete de 25 a 30 cm de largo.
Holder, Camisa o Maneral
Agujas Vacutainer (aguja de 2 puntas)
Tubos con anticoagulante EDTA y CITRATO DE SODIO.
Etiquetas del paciente
Contenedor de RPBI
Tcnica:
a) Verificar que los elementos por utilizar estn listos, y que el paciente se sienta
cmodo.
b) Aplicar el torniquete aproximadamente cuatro dedos por encima de la flexin
del codo o a 10 cm del codo, sujetar con un medio nudo.
c) Se retira el estuche protector de la aguja y ste se enrosca al maneral.
d) Colocar la ligadura cuatro dedos por encima de la flexin del codo o 10 cm por
encima de ste y pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para
favorecer la dilatacin de las venas.
e) Una vez escogida la vena, desinfectarla con una pieza de algodn con alcohol al
70%.

f) Se coloca la aguja en direccin paralela a la vena, se perfora la piel haciendo

avanzar la aguja entre 0,5 cm y 1 cm en el tejido subcutneo, se inserta el tubo
al vaco por la parte posterior y no preocuparse por la cantidad de sangre
extrada ya que el mismo sonido del vaco avisar que la extraccin termin.
g) Retirar la ligadura tirando del extremo doblado.

h) Colocar un pedazo de algodn seco sobre la parte donde se encuentra oculta la
aguja. Sacar la aguja con un movimiento rpido y depositarla en el contenedor
de residuos de RPBI.
i) Pedir al paciente que presione firmemente el algodn durante 3 minutos, con el

brazo extendido. No se recomienda que se flexione el brazo a causa del riesgo
que se forme un hematoma.

j) Mezclar por inmersin suave la sangre con el anticoagulante contenido en el

tubo. No agitar el contenido.
Notas:
Por dos motivos determinantes, recomienda realizar las extracciones sanguneas SIEMPRE
CON SISTEMA DE VACO:
Aporta medidas de seguridad para el profesional con el fin de evitar la exposicin
accidental por inoculacin.
Evita dos de los errores preanalticos ms frecuentes, la hemlisis de las clulas y el
incorrecto llenado del tubo (error crtico para las muestras de los estudios de
coagulacin).

ANTICOAGULANTES
Introduccin:
Los anticoagulantes se utilizan para obtener plasma o muestras de sangre total para
estudiar las caractersticas morfolgicas y realizar los recuentos celulares. Deben
intentar que las clulas sanguneas a estudiar se encuentren en el estado ms
parecido al fisiolgico, como cuando se encuentran circulando por el torrente
sanguneo. Para ello los anticoagulantes no deben alterar la morfologa de los
leucocitos, el tamao eritrocitario, no producir hemlisis e impedir la agregacin
plaquetaria, posibilitando al mismo tiempo el mximo perodo de conservacin de la
muestra (generalmente no ms de 24 horas incluso refrigerada a 4 C).
Una vez extrada la sangre, sta puede conservarse coagulada o mantenida

incoagulable mediante la adicin de un anticoagulante.
Objetivo:
Conocer los principales anticoagulantes utilizados en los procedimientos del
laboratorio clnico.
CARACTERSTICAS BSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MS USADOS

EN HEMATOLOGA
No alterar el tamao de los hemates.
No producir hemlisis.
Evitar al mximo la agregacin plaquetaria.
No alterar la morfologa de los leucocitos.
El tiempo mximo entre la extraccin de la sangre y su procesamiento depende del

coagulante de eleccin y no debe ser ms de 4 horas, a excepcin del anticoagulante
EDTA (etilendiaminotetractico) que puede ser hasta 24 horas (en refrigeracin a 4
C).
Los anticoagulantes pueden emplearse en forma slida o lquida. Los primeros estn
indicados para la determinacin de los parmetros hematolgicos, ya que no producen,
como los anticoagulantes lquidos, dilucin de la sangre.
Para la biometra hemtica y qumica sangunea. El anticoagulante de eleccin es la

sal disdica y dipotsica del cido etilendiaminotetractico EDTA, conocido como
versenato; produce cambios significativos en el tamao y forma de los eritrocitos.
Es bastante satisfactorio para la determinacin globular, previene la aglutinacin de

las plaquetas y puede ser usado en la mayor parte de las determinaciones qumicas.
Este anticoagulante impide la coagulacin sustrayendo calcio del plasma sanguneo

por precipitacin o fijacin en forma no ionizada.
Se utiliza en proporcin de 1 a 2 mg de sangre, o 0.1ml de solucin EDTA al 10%

contiene 10mg de sangre.

1) PREPARACIN DE SOLUCIN DE EDTA AL 5%

Introduccin:
Es la sal disdica o tripotsica del cido etilendiaminotetractico. La sal disdica
(Na2EDTA) es menos soluble que la sal tripotsica (K3EDTA). Estos compuestos
realizan su accin a travs de un efecto quelante sobre el calcio, al fijarlo impiden su
activacin y, por ende, la coagulacin sangunea.
1. Pesar 5grs de sal disdica o dipotsica de EDTA y se colocan en un vaso de

precipitado de 250ml.
2. Aadir aproximadamente 75ml de agua destilada por ligero calentamiento y
agitacin se obtiene la disolucin de la sal.
3. Pasar a un matraz volumtrico de 100ml y aforar hasta la marca con agua
destilada.
4. Preparar los tubos de toma de muestra para (Biometra Hemtica) y colocar
2ml de solucin en cada tubo.
Notas:
Esta solucin es estable a temperatura ambiente, es conveniente preparar los tubos de toma con
varios das de anticipacin a su uso, con el fin de que se evaporen lentamente, ya que no es
recomendable el calor intenso por formarse una pasta a veces difcil de disolver.
La concentracin recomendada de EDTA es de 1,5 mg/mL. de sangre. Una mayor cantidad de
anticoagulante puede producir retraccin celular, con disminucin del hematocrito, y un aumento
de la concentracin media de la hemoglobina. Un exceso de sangre con relacin al anticoagulante
produce formacin de microagregados que pueden alterar los resultados. El empleo de tubos al
vaco con una gota (50mL) de EDTA tripotsica comercial para 5 mL de sangre es de inters
prctico dado que es cien veces ms soluble facilitando la mezcla de sangre con anticoagulante.

2) PREPARACIN DE ANTICOAGULANTES PARA PROTROMBINA
Solucin de Citrato de Sodio al 3.8%
1. En un matraz volumtrico de 100ml se ponen 3,81 grs de citrato de sodio y se

afora a la marca con agua destilada.
2. Colocar en los tubos .25ml de esta solucin para impedir la coagulacin de
2.25ml de sangre.
Mezcla de Oxalatos de Paul-Heller
1. En un matraz volumtrico de 100ml se ponen 1.2 grs de oxalato amnico

anhidro y .8grs de oxalato de potasio anhidro y se afora a la marca con agua
destilada.
2. Colocar en tubos para biometra y se evapora hasta sequedad durante 15
minutos a 110C
Anticoagulante de Oxalato de Potasio
1. En un matraz volumtrico de 100ml se ponen 2 grs de oxalato de potasio y se

afora a la marca con agua destilada.
2. Colocar en tubos para qumica sangunea 5ml y evaporar a sequedad durante 15
minutos a 110C
Nota:
Cuando no se dispone de la sal del cido de EDTA puede utilizarse para biometras hemticas la mezca de
oxalatos de Paul Heller y para Qumicas Sanguneas el anticoagulante de oxalato de potasio.

ANTICOAGULANTES EN SISTEMA DE VACIO

PREPARACIN Y TINCIN DE LAS EXTENSIONES DE SANGRE
Introduccin:
La prctica del frotis sanguneo, tambin llamado extendido, es de gran importancia

en hematologa ya que el diagnstico de muchas enfermedades hematolgicas puede
realizarse con slo observar las caractersticas morfolgicas de las clulas sanguneas,
de manera que ste no debe ser excesivamente grueso ni excesivamente fino. Todas las
lminas por usar, sobre todo nuevas, deben ser limpiadas con algodn y alcohol al 70%
para eliminar la grasa que viene adherida.
La informacin que se obtiene al examinar las extensiones de sangre es sumamente

importante. Pueden sugerir el diagnostico, as como orientar el tratamiento, indicar los
efectos nocivos de la quimioterapia en gran parte, de la calidad de las extensiones,
estas necesitan estar bien niveladas.
Objetivos:
Realizar frotis sanguneos
Realizar las tinciones hematolgicas
A. MTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

Fundamento:
Consiste en la extensin de una gota de sangre sobre un portaobjeto (25 x 75mm),
empleando el canto biselado de otro portaobjeto de igual dimensin.
Materiales:
Alcohol al 70%.
Algodn.
Gasas.
Portaobjetos de vidrios limpios y desgrasados (25 x 75 mm).
Tcnica:
1. Una vez extrada la sangre con cualquiera de las metodologas, se coloca una
pequea gota de sangre (.5mL) (aprox. 3 mm de dimetro) sobre un portaobjeto
a 2 cm aproximadamente de uno de los extremos.

2. Colocar el canto de otro portaobjeto esmerilado sobre la superficie del primer

portaobjeto (en la que se encuentra la gota de sangre) formando un ngulo de
45.
3. Deslizar hasta alcanzar la gota y dejar que se extienda la sangre a todo lo

ancho del portaobjetos que se encuentra a 45
4. Deslizar suavemente y a velocidad moderada el portaobjeto sobre el otro en

sentido longitudinal, hasta que la gota de sangre quede bien extendida sobre la
superficie del primer portaobjeto.
5. El grosor del frotis sanguneo puede variar segn sea el ngulo que formen
entre s ambos portaobjetos. As, si es superior a 45, la extensin obtenida ser
gruesa y corta, si es inferior a 45 ser larga y fina. El secado del frotis es a
temperatura ambiente y en posicin horizontal.

Notas:
Zonas de un Extendido Sanguneo (Frotis):

El extendido sanguneo est dividido en 3 regiones, las cuales en el momento de hacer la
observacin en el microscopio nos revelan cierto tipo de informacin:
Zona excesivamente gruesa o Cabeza: Se halla en la regin inmediata al punto de

partida de la extensin. En ella se aprecia siempre un aumento de linfocitos.
Zona excesivamente fina o Cola: Corresponde al final del extendido y termina en un
rea donde las clulas adoptan una posicin acartonada. En esta regin existe un
exceso de granulocitos y monocitos.
Zona ideal o Cuerpo: Corresponde a la regin intermedia del frotis y en ella existe un
reparto equilibrado de clulas.
Defectos en la Tcnica que provocan Extendidos Inadecuados

Excesiva longitud y escaso grosor o escasa longitud y excesivo grosor. Esto se
debe a un inadecuado tamao de la gota de sangre o/y a un error en la velocidad o/y a
un fallo en el ngulo de extensin de la misma.
Presencia de escalones o estras. Esto est ocasionado por una falta de uniformidad
en el deslizamiento de la gota.
Existencia de abundantes zonas redondeadas que carecen de sangre. Esto se

produce por la presencia de restos de grasa o de suciedad en el porta.
Extremo final excesivamente dentado.

B.- GOTA GRUESA
Fundamento:
Son tiles los frotis espesos (Gota Gruesa) en la bsqueda de parasitos (plasmodium,
filarias, tripanosomos, espironemas), pero para el trabajo hematolgico son preferibles
los frotis delgados.
La gota gruesa es una tcnica de concentracin para bsqueda de parsitos sanguneos;
se fundamenta en el hecho de que al laquear los glbulos rojos, pierden toda la
hemoglobina, lo que hace que los eritrocitos que estn acumulados no impiden la
observacin de los parsitos.
Objetivo:
Conocer y aplicar la tcnica de gota gruesa para la identificacin de parsitos en
muestra sangunea.
Tcnica:
1. Colocar tres gotas de sangre muy prximas una a la otra en un extremo del
portaobjetos; cada gota del tamao aproximado al que se utiliza para hacer un
frotis.
2. Con una esquina de otro portaobjetos completamente limpio, agitar la sangre
mezclando las tres gotas sobre una zona de unos 2 cm de dimetro, como se
muestra en el esquema.
3. Continuar agitando durante al menos medio minuto, esto evita la formacin de
hebras de fibrina, que de otro modo tienden a ocultar a los parsitos.
4. Llevar la extensin a secarse normalmente, y no calentar, porque esto fijara la
sangre.
5. Una vez que las preparaciones se han secado por completo, deben enjuagarse
para eliminar la hemoglobina. Esto puede hacerse por inmersin en solucin
tampn antes de teirse, o en la misma solucin del colorante Giemsa.

Las gotas gruesas que no van a teirse inmediatamente deben enjuagarse en solucin
tampn antes de guardarlas, pues la eliminacin de hemoglobina se va haciendo ms
difcil con el paso del tiempo.
Cuando se utiliza colorante Giemsa para la gota gruesa, el procedimiento es
exactamente el mismo que el utilizado para el frotis fino, excepto que se omite la
fijacin en alcohol metlico. Las preparaciones se dejan secar y se colorean con la
tcnica de Giemsa.

TINCIONES HEMATOLOGICAS
Introduccin:
Las tinciones hematolgicas son un conjunto de procesos que conducen a la coloracin
de las estructuras que componen las clulas sanguneas. Esto tiene por objeto
el aumentar el contraste entre esas estructuras y el medio que las rodea,
y permite por tanto que las clulas sean visualizadas microscpicamente con mayor
facilidad.
TIPOS DE TINCIONES
Las tinciones hematolgicas pueden clasificarse segn distintos criterios:
Atendiendo al nivel de vitalidad de las clulas que se pretenden colorear, se dividen
en tinciones vitales y no vitales.
Atendiendo a su frecuencia de realizacin en el diagnosticohematolgico cotidiano, se
dividen en tinciones habituales y especiales.
1. Tinciones vitales y no vitales

Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se practican sobre clulas que
estn vivas. Son colorantes vitales, por ejemplo, las sales de tetrazolio y el verde Jano.
Las tinciones no vitales se realizan sobre clulas muertas. La coloracin de clulas
muertas requiere un proceso previo de fijacin, que tiene por objeto el conservar
inalterada la estructura de las clulas y el adherir a stas firmemente a la superficie
del porta. La fijacin puede realizarse mediante calor, aunque habitualmente se
realiza con etanol o metanol.
2. Tinciones habituales y especiales

Las tinciones habituales se logran generalmente mediante el uso decolorantes
derivados de la anilina. Estos se renen en 4 grupos:
Colorantes cidos: tienen una especial afinidad con las estructuras alcalinas de las
clulas, como por ejemplo la hemoglobina. El principal de ellos es la eosina.
Colorantes bsicos: tienen una especial afinidad con las estructuras cidas de las
clulas, como por ejemplo los cidos nucleicos. Uno de ellos es el azul de metileno.
Colorantes neutros: son sales de un cido y de una base coloreados. Tien el ncleo
de un color y el citoplasma de otro. Uno de ellos es el eosinato de azul de metileno.
Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad con estructuras cidas o
bsicas. Son insolubles en el agua y tien a aquellas sustancias que tiene un poder de
disolucin superior al del lquido empleado para prepara la solucin colorante. Uno de
ellos es el Sudn III empleado para teir las grasas.
Tambin hay combinaciones de colorantes que dan lugar a tinciones

policromas. Una coloracin es panptica cuando se utilizan sucesivamente sustancias
colorantes neutras y es pancrmica se aplican todas las sustancias colorantes neutras
juntas.

El primero que tuvo la idea de realizar una de estas combinaciones fue Romanowsky, y
los colorantes hematolgicos utilizados en la actualidad suelen derivar del que l
prepar. Los colorantes de tipo Romanowsky constan de un colorante cido (eosina) y
de colorantes bsicos (tiacinas). Las tiacinas son el azul de metileno y sus derivados
obtenidos por desmetilacin oxidatiya (colorantes tipo azur).
Los colorantes de tipo Romanowsky, que ms frecuentemente se emplean, son la de

Wright y la de Giemsa (utilizada sola o en combinacin con la de May-Grnwald).
Tambin hay tinciones panptica rpidas que producen unacoloracion fcil y rpida de
las estructuras celulares.
Las tinciones especiales slo se usan en circunstancias especificas. Son de dos

clases.
Tinciones fluorescentes: emplean colorantes (fluorocromos) que se fijan a las clulas y

que, cuando son estimulados por una luz ultravioleta, emiten una radiacin visible, de
un color caracterstico. Los fluorocromos ms utilizados en esta clase de tinciones con
el naranja de acridina y el rojo neutro.
Tinciones citoqumicas: demuestran la presencia, ms o menos abundante, o la

ausencia de determinadas sustancias, localizadas en el interior de los grnulos
citoplasmticos de los leucocitos.
Sirven para reconocer clulas leucocitarias (normales o anmalas)y, por tanto, para
diferenciar unas clases de leucemias de otras. Por ejemplo, un colorante preparado a
base de diaminobenzidina y de agua oxigenada, descubre la presencia de peroxidas
endocelular, y por consiguiente permite atribuir el origen de unas
clulas leucocitarias inmaduras a la lnea granuloctica o a la monoltica.
Objetivos:
Aumentar el contraste entre las estructuras y el medio que los rodea,
permitiendo que las clulas sean visualizadas con mayor facilidad.
Mediante este tipo de colorantes distinguir los aspectos morfolgicos de las
clulas:
1. Forma, dimensiones y contorno de las clulas sanguneas.
2. Ncleo celular y restos de cromatina: color prpura.
3. Citoplasma de linfocitos: color azul.
4. Citoplasma de monocitos: color grisceo.
5. Granulaciones polinucleares:
a. Eosinfilos: color naranja.
b. Basfilos: color azul oscuro.
c. Neutrfilos: color pardo.
6. Hemates: color rosa plido.
7. Reticulocitos: color azulado.

PREPARACIN DE COLORANTES
1. Colorante de Giemsa
Las tinciones hematolgicas tipo Romanowsky utilizan azul de metileno y sus

productos de oxidacin (azur A, azur B y azur C) como colorantes bsicos,
combinndolos con la eosina como colorante cido.
De este modo, obtenemos una tincin diferencial, es decir, una tincin que es capaz de
discriminar entre las distintas estructuras celulares segn se tian stas con el
colorante cido, con el bsico o con la mezcla de ambos.
Segn la proporcin de azul de metileno y de eosina que compongan el colorante
tendremos distintos mtodos de tincin. Entre ellos, los ms conocidos son el mtodo
de Giemsa, el de Wright, el de Leishman y el pan ptico de Pappenheim.
Material:
Giemsa (polvo) 1g.
Glicerina pura 60ml.
Alcohol metlico absoluto y totalmente libre de acetona 66 ml
Procedimiento:
1. A un frasco de vidrio de color mbar conteniendo perlas de vidrio de dimetro
no mayor de 5 mm, se agrega la glicerina; luego se adiciona el colorante
Giemsa, se va agitando. Finalmente, se adiciona el alcohol metlico.
2. Agitar el frasco intensamente varias veces al da, durante tres das como
mnimo.
3. Extraer diariamente una pequea muestra del colorante preparado, filtrarla a

travs de papel filtro # 2, y probar con frotis sanguneos recin preparados.
4. Cuando los elementos de la sangre aparezcan con sus colores apropiados,

entonces el colorante est listo para ser utilizado.
Preparacin del diluyente (solucin amortiguadora)

El diluyente es una solucin amortiguadora y se usa en la preparacin del colorante
diluido o solucin de trabajo.
Las sustancias amortiguadoras actan como un adaptador que inactiva dentro de un
margen limitado cantidades variables de cido o lcali.
Formula:
4g Ortofosfato disodico anhidro (Na2HPO4)
5g Ortofosfato monopotsico (KH2PO4)
Preparacin:
1. Mezclar bien, y disolver 1g de la mezcla en un litro de agua destilada y ajustar
el pH a 7,2.

Preparacin del Colorante Diluido o Solucin de Trabajo
Frmula:
Solucin madre Giemsa 0.05ml
Solucin amortiguadora o diluyente 0.95ml
Preparacin:
1. En una probeta de vidrio se aade la solucin madre Giemsa al 5% con la
solucin amortiguadora.
2. Una forma ms rpida de preparar el colorante diluido es agregando una gota
de solucin madre por mL de solucin amortiguadora.
3. Despus de preparado el colorante madre, se debe determinar el tiempo de
coloracin que puede ser entre 15 - 20 minutos y la dilucin en la que se debe
preparar el colorante diluido, estas dos caractersticas se deben ajustar en
funcin al estado del colorante madre.
TINCIN GIEMSA
Material:
1. Frotis sanguneo.
2. Colorante de Giemsa constituido por una mezcla de azul de metileno, eosina y varios
azures en solucin acuosa.
3. Alcohol metlico absoluto (libre de acetona)
4. Microscopio con objetivo de inmersin.
5. Aceite de inmersin.
Mtodo:
1. Fijar el frotis con alcohol metlico absoluto durante 3 minutos. (Las extensiones de
mdula sea precisan unos 15 minutos)
2. Sumergirlo verticalmente en una solucin de giemsa preparada extemporalmente a
partir de 1 volumen en solucin colorante y 9 volmenes de solucin tampn (pH 6.8)
3. Esperar durante 10 minutos.
4. Lavar el frotis con abundante agua destilada y dejarlo secar al aire libre. Una vez
seco, est listo para ser observado al microscopio.
Recomendaciones:
Mantener el frasco de vidrio color mbar, que contiene la solucin madre de Giemsa bien cerrado
y en un lugar fresco, seco y protegido de la luz solar directa para evitar la volatilizacin del
solvente y la oxidacin del colorante.
El material de vidrio como probetas, pipetas, cubetas y embudos empleados en la preparacin de
los reactivos y colorantes deben estar limpios y secos.
El frasco de vidrio usado en la preparacin del colorante debe ser lavado con detergente y
enjuagado hasta que no queden residuos de ste, ya que puede alterar el pH del colorante y
estropearlo.
No se debe aadir agua a la solucin madre Giemsa, porque la mnima cantidad de sta deteriora
el colorante.
No agitar el frasco del colorante antes de utilizarlo porque se suspenden pequeos cristales de
ste que no han sido disueltos, y se quedan en los frotis sanguneos durante el proceso de
coloracin formando precipitados.
Debe descartarse el colorante diluido no utilizado.

2.- Colorante de May Grnwald
El tpico color de los ncleos celulares, mayoritariamente rojo prpura, se basa en la

interaccin molecular entre eosina amarilla y un complejo azur B ADN. Ambos
colorantes forman el complejo. La intensidad de la coloracin depende del contenido de
azur B y de la relacin entre azur B y eosina amarilla. El resultado de tincin puede
ser influido por diferentes factores como el valor del pH de la solucin y de la solucin
tampn, las substancias tampn (amortiguadores), el tiempo de tincin y la fijacin.
Preparacin del Colorante:
a. May Grnwald seco (polvo) 0.3 g

b. Alcohol metlico absoluto y libre de acetona 600ml.
c. Calentar la mezcla a 56oC hasta la disolucin completa del colorante.
d. Dejar enfriar en nevera a 4oC durante 24 horas agitando de vez en cuando.
e. Filtrar antes de su empleo.
TINCION DE MAY GRNWALD- GIEMSA
Es el resultado de combinar la tincin de Giemsa con la de May Grnwald y se conoce

con el nombre de tincin panptica. Esta tincin resalta de manera especial las
granulaciones leucocitarias y mejora la coloracin de los hemates.
Material
1. Frotis sanguneo seco.
2. Colorante de Giemsa.
3. Colorante de May Grnwald. Est constituido por una solucin alcohlica de azul de
metileno y eosina. Al igual que el colorante de Giemsa puede adquirirse en solucin
preparada comercialmente.
Mtodo
1. Fijar el frotis sobre el portaobjetos, sumergindolo en solucin de May Grnwald

durante 2 minutos.
2. Transferirlo a una solucin de May Grnwald diluida en agua y dejarlo durante 2 a
3 minutos.
3. Sin lavar, sumergir el frotis en la solucin de Giemsa, preparada extemporalmente
segn lo especificado en el apartado anterior durante 20 minutos.
4. Lavar el frotis con abundante agua destilada y sumergirlo en tampn, de pH 6.8
durante 2 a 5 minutos.
5. Secar el frotis al aire. Una vez fresco, est listo para su observacin mediante el
microscopio.

Colorante de Wright
Esta coloracin es conocida como policromtica debido a que produce varios colores. Es
una solucin de alcohol metlico de un colorante cido (eosina) y otro bsico (azul de
metileno).
Preparacin:
Colorante:
Para 100 mL se requiere de colorante:
Wright (0.3g) + Metanol (97.0 mL) + Glicerol (3.0 mL)
Disolver en un mortero el colorante con el glicerol. Una vez disuelto se adiciona el

metanol trasvasndolo a un frasco oscuro. Agitar. Filtrar antes de usar.
Solucin amortiguadora tamponada:

En un litro de agua destilada se agregan 3.76 g de hidrofosfato disdico
(Na2HPO4* 2H20) y 2.10g de fosfato de potasio dihidrogenado (KH2PO4).
Mezclar todos los reactivos y guardar en frasco de vidrio color mbar en lugar
fresco. Ajustar el pH a 7.2.
TINCIN CON COLORANTE DE WRIGHT
Fundamento:
El colorante de Wright va a permitir suministrar un medio para estudiar la sangre y

determinar las variaciones y anormalidades de estructura, forma y tamao de los
eritrocitos, su contenido de hemoglobina y sus propiedades de coloracin. La
informacin obtenida de un frotis de sangre perifrica depende en gran parte de la
calidad del extendido y la coloracin.
Materiales:
Frotis Sanguineo.
Colorante de Wright.
Solucin amortiguada tamponada.
Procedimiento:
1. Una vez obtenido el frotis sanguneo, se le dejar secar entre 15 y 20 minutos.
2. Luego se coloca la preparacin en un soporte y se cubre con el colorante de
Wright, dejndolo por espacio de 5-7 minutos.
3. Posteriormente se aade solucin amortiguada tamponada (buffer) en partes
iguales hasta obtener un brillo metlico, dejando 6-8 minutos adicionales.
4. Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar.
5. Se coloca en el microscopio y, con pequeo aumento, se revisa la calidad de la
coloracin, la cantidad aproximada de glbulos blancos y se escoge el sitio para
iniciar el recuento. Se coloca una gota de aceite de inmersin y se enfoca a un
aumento de 100x

6. La forma de los glbulos rojos se examinar detenidamente observando adems

del color (cantidad de hemoglobina), presencia de plaquetas, su agrupacin y
distribucin
7. Posteriormente, se hace el recuento diferencial de glbulos blancos en 100
clulas, para lo cual se deber conocer las diferencias entre neutrfilos,
eosinfilos, linfocitos y monocitos.
NOTAS:
Una extensin de sangre bien teida debe caracterizarse por una buena diferenciacin de las estructuras
subcelulares en los leucocitos, una coloracin rosada de los hemates y la ausencia de precipitados. Los
defectos ms frecuentes observados en la tincin del frotis sanguneo son:
Coloracin excesivamente azul, debido a:
Frotis excesivamente grueso.
Lavado insuficiente.
Tincin muy prolongada.
Empleo de colorante excesivamente alcalino.
Coloracin con una tonalidad rosada:
El colorante, el buffer o el agua de lavado tienen un pH demasiado cido.
Presencia de precipitados:
Obedecen a una accin excesiva del colorante. Esto se puede evitar con la filtracin.

LEUCOCITOS
Los leucocitos o glbulos blancos son clulas que se hallan en la sangre, el sistema
linftico y tejidos y constituyen un pilar importante del sistema de defensa del
organismo. Confieren proteccin frente a infecciones y juegan un papel
en inflamaciones, respuestas alrgicas y en la proteccin frente al cncer. Mediante el
recuento de leucocitos se contabiliza el nmero total de glbulos blancos en una
muestra de sangre.
En la sangre existen distintos tipos celulares que se encuentran en suspensin en un

fluido conocido como plasma. Adems de existir leucocitos, existen tambin eritrocitos
o hemates y plaquetas. Existen cinco tipos de clulas blancas de la sangre, con
diferentes funciones.
Tres tipos de leucocitos se agrupan en una categora conocida como granulocitos,

debido a los grnulos que se hallan en el citoplasma celular. En el curso de la
respuesta inmune, estos grnulos liberan diversas sustancias y elementos. Los
granulocitos incluyen neutrfilos, que normalmente representan el tipo mayoritario de
leucocitos circulantes, eosinfilos y basfilos. Los otros dos tipos de leucocitos son los
monocitos y los linfocitos. Los linfocitos se subclasifican a su vez en tres tipos:
linfocitos B productores de anticuerpos (o inmunoglobulinas), linfocitos T y clulas NK
o asesinas (del ingls, natural killer).
El recuento total de glbulos se efecta en la cmara de recuento. El porcentaje de la

distribucin de los distintos tipos de leucocitos y el examen cualitativo se realizan en
una extensin teida, obtenindose as la llamada formula leucocitaria. La
informacin que esta da es probablemente ms til que la de cualquier otro
procedimiento empleado en el examen de la sangre.
Primero se observa la preparacin en su totalidad para darse cuenta de la tonalidad

general de leucocitos.
Para hacer la formula leucocitaria se examina minuciosamente la extensin con un

objetivo de inmersin en aceite y una platina. Se clasifica cada leucocito observado y se
calcula el porcentaje de cada tipo de clulas para que sea exacto.
Debern contarse entre 500 y 1000 leucocitos pero para razones prcticas se clasifica
un nmero ms pequeo, es indispensable contar los leucocitos en toda la zona de la
extensin ya que las diferentes clases pueden estar desigualmente distribuidas, se
emplea un contador con teclas de cada tipo de clulas hemticas y en los cuales el
porcentaje se lee directamente ya que el instrumento indica de modo automtico
cuando se ha contado 100 clulas.
El nmero efectivo de cada variedad de leucocitos en 1 ml de sangre se calcula

fcilmente a partir de estos porcentajes y del recuento total de leucocitos.
De manera semejante se examinan las plaquetas y se anotara si su nmero es normal.
Aumentando o disminuyendo se anota sus anormalidades.

RECUENTO DE LEUCOCITOS
Fundamento:
Se hace una dilucin 1:20 utilizando un solvente hipotnico que sea capaz de destruir a
los eritrocitos para evitar que interfieran en el recuento. Generalmente, se adiciona un
colorante para resaltar a los leucocitos y facilitar su recuento, el cual se hacer en la
cmara de Neubauer, cuya capacidad conocemos. El reporte se realiza como nmero de
leucocitos por mm3 de sangre. Para realizar la dilucin, se usa una pipeta de Thoma
para leucocitos, que es parecida a la de glbulos rojos, pero con un bulbo menor y por lo
tanto, de capacidad diferente. Se distingue por tener en el bulbo un pequeo artefacto
de color blanco, en tanto que la de eritrocitos lo tiene rojo. Este, sirve adicionalmente
para homogeneizar la mezcla cuando se pone en el agitador.
Los leucocitos o glbulos blancos son clulas que estn principalmente en la sangre y
circulan por ella con la funcin de combatir las infecciones o cuerpos extraos; pero en
ocasiones pueden atacar los tejidos normales del propio cuerpo. Es una parte de las
defensas inmunitarias del cuerpo humano.
Se llaman glbulos blancos, ya que ste color es el de su aspecto al microscopio. Hay

diferentes grupos de glbulos blancos: los llamados polimorfonucleares (neutrfilos,
eosinfilos y los basfilos) y los mononucleares (los linfocitos y los monocitos).
La modificacin de la cantidad de leucocitos puede orientar al diagnstico de

enfermedades infecciosas, inflamatorias, cncer y leucemias, y otros procesos. Por ello
el recuento es muy orientativo en diferentes enfermedades. Adems el porcentaje de
cada grupo de leucocitos nos ofrecer una mayor informacin para precisar un
diagnstico.
El estudio de los leucocitos se realiza habitualmente en un estudio de hematimetra y
recuento leucocitario completo.
El conteo de glbulos blancos es un examen de sangre para medir el nmero de estos
glbulos.
Los glbulos blancos ayudan a combatir infecciones y tambin se denominan
leucocitos.
Existen cinco grandes tipos de estos glbulos:

* Basfilos
* Eosinfilos
* Linfocitos (clulas T y clulas B)
* Monocitos
* Neutrfilos
Objetivos:
Ejecutar correctamente el recuento de leucocitos.
Identificar la utilidad clnica del recuento de leucocitos.

Equipo y Material:
Microscopio
Agitador elctrico de pipetas de Thoma.
Sangre obtenida con EDTA
Pipetas de Thoma para leucocitos, con boquilla.
Cmara de Neubauer
Solucin diluyente de Trck
Gradilla
Tubos de ensaye de 13 x 100 mm
Pipetas serolgicas de 5 ml
Procedimiento:
1. Mezclar la sangre por lo menos 5 minutos.
2. Con la pipeta de Thoma para leucocitos, aspirar sangre hasta la marca 0.5.
3. Con la misma pipeta y cuidando que no s salga la sangre, aspirar lquido de
Trck hasta la marca 11. Es recomendable rotar la pipeta al aspirar y hacerlo
mantenindola en posicin vertical para evitar la formacin de burbujas, que
afectaran la dilucin, que en este caso es de 1:20.
4. Eliminar el exceso de diluyente secando la punta con papel absorbente.
5. Agitar la pipeta durante 60 segundos en el agitador elctrico para conseguir
una suspensin uniforme.
6. Desechar las tres o cuatro primeras gotas de la pipeta, limpiar la punta con
papel absorbente y llenar la cmara de Neubauer.
7. Dejar reposar durante 2 minutos para permitir la sedimentacin de los
leucocitos.
8. Contar los leucocitos encontrados en los cuadros grandes angulares, que
contienen cada uno 16 cuadros medianos. Verificar que la distribucin de las
clulas sea homognea, de lo contrario repetir el procedimiento.
9. La frmula utilizada para realizar los clculos es la siguiente:

DETERMINACIN DE RETICULOCITOS
Introduccin:
Los reticulocitos, eritrocitos inmaduros, existen en la sangre en una proporcin de

cinco a diez por mil hemates. Su tamao es el de los dems hemates y se caracteriza
por contener una pequea cantidad de ARN (ribosomas) formando un retculo
granulofilamentoso observable al ser teido con colorantes llamados vitales como son
el azul brillante de cresilo o el azul de metileno nuevo. La cantidad de ARN es tanto
menor cuanto ms madura es la clula.
El recuento de reticulocitos es la tcnica ms simple actualmente disponible para

valorar la actividad eritropoytica de la mdula sea. Cuando una anemia se
acompaa de un elevado nmero de reticulocitos circulantes (reticulocitosis) se
considera regenerativa, mientras que cuando el nmero es normal o disminuido se
denomina arregenerativa.
En condiciones normales, los reticulocitos permanecen en la mdula durante 2-3 das y

terminan su maduracin en 24 horas, aproximadamente, una vez ya en la sangre
perifrica.
El recuento de reticulocitos debe realizarse a partir de sangre total con anticoagulante

(EDTA)y a ser posible, dentro de las 24 primeras horas de la extraccin cuando la
sangre se conserva a temperatura ambiente. Si se mantiene a 4 C, el recuento puede
realizarse hasta 48 horas despus de la extraccin. El recuento puede efectuarse por
dos procedimientos:
A. Tincin vital y microscopio ptico.

B. Citometra de flujo.
El mtodo manual adolece de muy escasa fiabilidad (coeficientes de variacin >20%),

lo que limita su empleo para valorar la capacidad de respuesta medular frente a
teraputicas agresivas, pero sobre todo a los errores de ndole subjetiva debidos al
diferente criterio que cada observador tiene de lo que es un reticulocito.
A. MTODO DE LA TINCIN VITAL
Fundamento:
Los reticulocitos contienen una fina red de ARN y protoporfirina que se puede teir
con el azul de cresil brillante. Este colorante en combinacin con una misma cantidad
de sangre anticoagulada se mezcla y con la ayuda de la temperatura (bao mara) se
produce la coloracin de estos eritrocitos jvenes visualizndose en los frotis
sanguneos por microscopa.

Materiales
Portaobjetos.
Tubos de ensayos de 12 x 75 mm.
Embudo.
Filtro de papel.
Pipetas Pasteur con chupones.
Contador manual
Solucin saturada de azul de cresil brillante (filtrada).
Procedimiento
1. En el tubo de ensayo colocar tres gotas de sangre total con anticoagulante.
2. Inmediatamente adicionar con la ayuda de una pipeta Pasteur la misma
cantidad de colorante.
3. Mezclar la solucin.
4. Colocar en bao mara por espacio de 10 a 15 minutos.
5. Realizar 2 frotis sanguneos.
6. Leer con objetivo de 100x.
Es necesario realizar el recuento sobre un mnimo de 100 eritrocitos. El recuento se

efecta contando en donde los eritrocitos estn distribuidos homogneamente. Por
ello, cuando disminuye el nmero de eritrocitos como suele suceder en la anemia, el
valor porcentual debe corregirse segn el hematocrito empleando la siguiente frmula:
El recuento se ha venido haciendo clsicamente de forma manual mediante la

observacin en el microscopio ptico. El resultado se da en porcentaje sobre cada 100
hemates. Es ms til calcular el nmero de reticulocitos por litro, mediante la
frmula:
% Reticulocitos = n de reticulocitos observados X 100
n de hemates contados
Cuando existe anemia, con disminucin del nmero de hemates. Su valor deber ser
corregido de acuerdo a la intensidad de la anemia, aplicndose la siguiente frmula:
Hto del paciente

Reticulocitos corregidos (%) = reticulocitos observados (%) x
Hto normal
(El hematocrito normal es el que le corresponde segn edad y sexo).

DETERMIANCIN DE HEMOGLOBINA
Introduccin:
La hemoglobina es una protena conjugada que sirve para el transporte de oxgeno y

dixido de carbono. La masa total de eritrocitos de un adulto contiene unos 600gr. De
hemoglobina capaces de transportar 800ml de oxgeno.
Una molcula de hemoglobina consta de 2 pares de cadenas polipepticas (unin de

aminocidos) (globina) y 4 grupos proteicos HEM que contienen cada uno un tomo de
fe en estado ferroso. Cada punto HEM se localiza en una zona determinada de una de
las cadenas de polipepticos. Localizando cerca la superficie de la molcula, el HEM se
combina de forma reversible con una molcula de oxigeno y dixido de carbono. Este
grupo HEM es el responsable del del color rojo de la hemoglobina (hb).
La parte proteica o globina tiene 4 cadenas polipeptidicas que se denominan con las
letras , , , . Existe una cadena ms la que est presente durante los 3 primeros
meses de vida se diferencian unas de las otras en el numero o posicin (de los
aminocidos de los que estn compuestas). Por lo tanto existen varios tipos de hb en el
ser humano se pueden encontrar las siguientes hemoglobinas normales:
Hemoglobina A: consta de 2 cadenas y 2 cadenas en un adulto normal corresponde

a mas del 95% del total.
Hemoglobina A: consta de 2 cadenas y 2 cadenas en un adulto sano esta en porcin

menor de 3%.
Hemoglobina F (fetal): consta de 2 cadenas y 2 cadenas . Es la hemoglobina

principal en el feto desde el 4 mes del embarazo hasta aproximadamente los 6 meses
de edad. La Hb F tiene mayor afinaidad por el oxigeno.
Hemoglobina Gower: consta de 2 cadenas y 2 cadenas . Desaparece casi por

completo en el tercer mes de embarazo y empieza a aparecer la Hb fetal.
La sangre tiene un color rojo cereza brillante cuando el pigmento es carboxi-

hemoglobina en la intoxicacin por CO. El color es chocolate en la
metahemoglobulemia y lavanda malva en alsulfohemoglobulemia.
Las distintas Hb tienen espectros de absorcin caractersticas a las que determina en

un espectrofotmetro. La identificacin de diferentes formas de la Hb con la
determinacin de sus espectros de absorcin puede hacerse de una manera sencilla

Fundamento:
La sangre se diluye en lquido de Drabkin, el cual hemoliza los hemates y convierte la

hemoglobina en cianometahemoglobina (cianuro de hemiglobina). La solucin que se
produce se lee por medio de un espectrofotmetro o fotocolormetro. Su grado de
absorbancia es proporcional a la cantidad de hemoglobina que contenga la sangre.
Materiales y reactivos
Un colormetro fotoelctrico o un espectrofotmetro.
Pipetas:
Una pipeta para sangre (pipeta de Sahli) graduada hasta 0,02 mL, con
tubo de goma y boquilla.
Una pipeta de vidrio graduada de 5 mL.
Tubos de ensayo.
Reactivo de Drabkin para dilucin.*
*Este reactivo se puede adquirir en tabletas o polvos para disolver en 1 litro de agua destilada. Si se
dispone de una balanza analtica la preparacin se puede hacer en el laboratorio. Esta solucin se puede
conservar durante un mes en un frasco de vidrio oscuro. Deschese si se enturbia.
El lquido de Drabkin no debe enfriarse demasiado, pues puede causar una

decoloracin con reduccin del ferrocianuro.
Referencia para cianometahemoglobina (estandarizada):

En las soluciones de referencia comerciales casi siempre indica la concentracin en
miligramos por 100 mL (generalmente en mg%).
Se preparan diluciones con reactivo de Drabkin de tal manera que los patrones
contengan concentraciones de 60 mg, 40 mg, 20 mg de CNHi.
Leer los tubos en absorbancia con filtro verde a 540 nm, llevando el fotmetro a cero
con el reactivo de Drabkin.
Para calcular la concentracin de hemoglobina en cada tubo, realizar el siguiente
clculo:
Hb en g/100 mL = P x D/ 1000
P = Concentracin del patrn.

D = Dilucin de la muestra de sangre, que es 251 veces.
Para una concentracin de patrn de :

60 mg 15 g/100 mL
40 mg 10 g/100 mL
20 mg 5 g/100 mL
Luego graficar una curva patrn colocando en el eje de las ordenadas las lecturas en
absorbancia y en la abcisa la concentracin de hemoglobina en g/100 mL.

Procedimiento
1. En un tubo de 13 x 100 colocar exactamente 5 mL de reactivo de Drabkin.
2. Con una pipeta automtica o pipeta de Salhi se toma exactamente 0,02 mL (20
mL) de sangre total, limpiar luego la punta de la pipeta y se vierte en el tubo
que contenga reactivo de Drabkin. Se enjuaga 3 veces y se mezcla.
3. Dejar en reposo por espacio de 5 a 15 minutos.
4. Leer en absorbancia con filtro verde a 540 nm llevando a cero el fotmetro con
agua destilada / Drabkin.
Resultados
La lectura en absorbancia del problema debe ser comparada en la curva patrn para
encontrar a que concentracin de hemoglobina corresponde expresndose en g/100 mL.
B) CONCENTRACIN MEDIA DE HEMOGLOBINA
Valores bajos de glbulos rojos, hematocrito o hemoglobina pueden ser indicativos de

anemia. (lo que induce un descenso en la capacidad sangunea de transporte de
oxgeno). Hay muchas causas que pueden generar una anemia: hemorragia,
enfermedad de la funcin de la mdula sea, deficiencia de hierro, deficiencia de
vitamina B12, deficiencia de cido flico, etc.) y muchas de estas se caracterizan por
cambios en el volumen corpuscular de los glbulos rojos y/o descensos en el contenido
de hemoglobina celular. Por tanto es de gran utilidad en el diagnstico de estas
anemias el recuento de glbulos rojos y la determinacin del hematocrito y la
hemoglobina, para a partir de ellos conocer el volumen corpuscular
medio (VCM) y la concentracin de hemoglobina corpuscular media (CHCM).
CCMH: La concentracin media de hemoglobina por 100ml de eritrocitos concentrados

en %
CCMH= HEMOGLOBINA (gr /100ml) x 100

HEMATOCRITO (%)
C) VOLUMEN CORPUSCULAR MEDIO
VCM: El volumen corpuscular medio de los eritrocitos individuales en micras cubicas

(U3)
Para calcular el VCM, expresado in fentolitros (fl, 10E-15L), se aplica la siguiente

frmula:
VCM= Hematocrito (%)x10

# de eritrocitos (millones/mm3 de
sangre)

HEMATOCRITO
Introduccin:
El hematocrito de la sangre es el porcentaje de la misma constituido por clulas. Mide
la fraccin que comprende a los glbulos rojos (masa globular), respecto al volumen
total de la muestra de sangre venosa o capilar. Puede expresarse en porcentaje o como
valor decimal.
Hematocrito= altura de la columna de glbulos rojos

altura de la columna de sangre total
(glbulos rojos ms plasma)
Mtodo de Wintrobe o Macromtodo:
Materiales requeridos:
Tubo de Wintrobe graduado de 0 - 100 mm.
Pipetas Pasteur o pipetas de transferencia.
Tapn de goma.
Procedimiento:
1. Llenar la sangre extrada con anticoagulante con una pipeta pasteur,
comenzando desde el fondo hasta la marca superior de 100 mm, teniendo
cuidado de no provocar espuma.
2. Tapar el tubo con un tapn de goma para evitar la evaporacin.
3. Centrifugar a 3000 rpm por 30 minutos.
Resultados (lectura):
Del tubo graduado se mide directamente el nivel de la columna de glbulos rojos.
Mtodo de microhematocrito
Materiales requeridos:
Capilares rojos y azules (75 mm x 1,5 mm).
Plastilina.
Procedimiento:
1. Tomar la muestra en capilares rojos heparinizados directamente del pulpejo del
dedo, o utilizar capilares azules sin heparina para sangre venosa con
anticoagulante de Wintrobe o EDTA. Debe llenarse aproximadamente 70% -
80% del capilar.
2. Tapar un extremo del capilar con plastilina.
3. Colocar el capilar sobre la plataforma del cabezal de una centrfuga de
microhematocrito, con el extremo ocluido adherido al reborde externo de la
plataforma.
4. Centrifugar por 5 minutos entre 10 000 - 12 000 rpm.

Resultados (lectura)
La lectura se realiza con una escala estandarizada que expenden en el comercio.
Uso de la escala:
Sostenga el tubo frente a la escala de manera que el fondo de la columna de
eritrocitos (no el extremo inferior del tubo) quede exactamente al mismo nivel
de la lnea horizontal correspondiente al cero.
Desplace el tubo a travs de la escala hasta que la lnea marcada con el nmero
1,0 quede al nivel del tope de la columna de plasma. Vigile que el fondo de la
columna de eritrocitos contine sobre la lnea cero. El tubo debe encontrarse
completamente en posicin vertical.
La lnea que pase al nivel del tope de la columna de eritrocitos indicar la
fraccin de volumen de stos.

VELOCIDAD DE SEDIMENTACIN
Fundamento:
La medicin de la velocidad de sedimentacin globular (VSG) es una prueba para
evaluar la respuesta inflamatoria durante la fase aguda de diversos padecimientos
infecciosos y no infecciosos. Su historia se remonta a la observacin de Fahraeus en
1918, de una rpida sedimentacin de los eritrocitos en el plasma de una mujer
gestante que no ocurra en otra mujer no embarazada. Sin embargo, fue hasta 1941
cuando MacLeod describi la VSG como reactante de fase aguda.
La velocidad de sedimentacin es un examen hematolgico que no est incluido en el

desarrollo de un hemograma; sin embargo, es una prueba muy importante por su gran
sensibilidad, pues resulta normal en las enfermedades funcionales, as como en los
procesos inactivos o estrictamente locales.
El fenmeno se debe a la tendencia de los eritrocitos de agregarse en forma de

columnas de monedas (fenmeno de Rouleaux) como resultado de un proceso
electroqumico reversible. En la sangre normal, los eritrocitos tienen una carga
negativa (potencial zeta) en su superficie, que hace que se repelan entre s, lo cual da
por resultado una velocidad de sedimentacin de menos de 10 milmetros (mm) por
hora. Por el contrario, todas las condiciones asociadas con procesos inflamatorios que
cambian el potencial zeta favorecen el fenmeno de Rouleaux e incrementan la VSG.
La VSG se incrementa en infecciones agudas y crnicas, necrosis tisular, lesiones

malignas, enfermedades de la colgena y reumticas, niveles sricos anormales de
protenas y embarazo, as como en pacientes con falla renal crnica en hemodilisis y
pacientes con insuficiencia cardiaca congestiva, entre otras.
Para medir la VSG hay diversos procedimientos; en 1974, Wintrobe describi el

mtodo que es an la regla de oro y requiere 1 ml de sangre venosa anticoagulada con
EDTA. Otra tcnica es la de Westergreen, validada y aceptada por el Comit
Internacional de Estandarizacin en Hematologa y descrita en 1988. sta consiste en
extraer sangre venosa y mezclarla con citrato trisdico al 3.8% como anticoagulante. y
la tcnica en capilares llamada velocidad de microeritrosedimentacin se utiliza de
manera emprica desde la dcada de 1930 hasta nuestros das, como un procedimiento
sencillo y til para apoyar el diagnstico de sepsis.
MTODO DE WESTERGREN
Fundamento
Este examen mide la tendencia de los eritrocitos a sedimentar, al colocar sangre
anticoagulada en un tubo en posicin vertical. Se lee macroscpicamente la columna
de plasma al cabo de una hora de reposo.
Materiales
Tubos de Westergren.
Soporte para tubos de Westergren.

Procedimiento
1. En un tubo que contiene 0,5 ml de anticoagulante citrato de sodio al 3,8% se
extrae sangre venosa, se mezcla mediante movimientos rotatorios sobre una
superficie lisa.
2. Se vierte mediante una pipeta Pasteur o una jeringa de metal en el tubo de
Westergren, el cual tiene una graduacin de 0 a 200 mm de arriba hacia abajo y
presenta ambos extremos abiertos.
3. La sangre debe llenarse hasta la marca cero, se coloca en posicin vertical sobre
una gradilla especial que obtura ambos extremos.

MTODO DE WINTROBE
Fundamento
Al igual que el mtodo de Westergren, este mtodo mide la tendencia de los eritrocitos
a la sedimentacin al colocar sangre anticoagulada en un tubo pequeo. Se lee la
columna de plasma al cabo de una hora de reposo.
Procedimiento
1. Extraer sangre venosa y mezclarla bien con el anticoagulante
2. A partir de la muestra bien homogeneizada, se llena la pipeta mediante una
pipeta pasteur hasta que alcance la marca de 0 mm.
3. Colocar la pipeta en el soporte procurando que quede estrictamente vertical.
La pipeta debe permanecer en dicha posicin durante un tiempo exacto de 60
minutos.
4. Una vez transcurrido este tiempo, se lee la distancia entre la superficie del
menisco de la columna eritrocitaria y la parte superior de la columna de
situada a nivel de la marca cero de la escala graduada.
Resultados
Medir los milmetros descendidos de glbulos rojos mediante la columna de plasma por
encima del paquete globular.
Valores de referencia
Hombres : 0 - 5 mm/hora
Mujeres : 0 - 10 mm/hora

DETERMINACION DE CELULAS L.E.
Fundamento:
Una sustancia presente en la fraccin gamma globulina del plasma o el suero de

pacientes con lupus eritematoso diseminado, es el llamado factor L.E., que reacciona
con la nucleoproteina de los nucleos de los leucocitos, el cual parece ser un anticuerpo.
El lupus eritematoso diseminado es una enfermedad inflamatoria crnica del tejido

conectivo que ocasiona cambios bioqumicos y estructurales en la piel, articulaciones y
msculo, por lo general con ataque de mltiples rganos. A la postre puede causar la
muerte por insuficiencia de rganos vitales especialmente los riones.
En el lupus eritematoso se produce un anticuerpo de carcter antinuclear. Este

anticuerpo puede atacar a los neutrfilos. La clula se rompe y queda en libertad el
ncleo, convertido en una masa eosinoflica amorfa y de gran tamao. Esta masa es
fagocitada por otro neutrfilo el cual ocupa casi todo el espacio celular. La imagen que
se presenta una vez hecha la tincin, es inconfundible y recibe el nombre de clulas
LE.
La tcnica que se presenta a continuacin intenta provocar el fenmeno celular LE in

vitro, lo que favorece su produccin machacando el cogulo a travs de una fina malla.
Sin embargo, ocasionalmente pueden presentarse las clulas LE en otra enfermedad
en la que tambin se producen anticuerpos antinucleares, particularmente en las
llamadas colagenopatas.
Objetivo:
Facilitar el diagnstico de LE.
Material:
Sangre venosa tomada sin anticoagulante.

Incubadora.
Colador de malla fina o gasas
Vaso de precipitado de 250 ml.
Mortero con mazo.
Pipeta Pasteur.
2 Tubos de Wintrobe.
Centrfuga.
Coloracin de Wright.
Portaobjetos.

Procedimiento:
1. Una vez coagulada la sangre incbela a 37C por 2 horas o el tiempo necesario para
que el cogulo se retraiga.
2. Colocar la malla fina sobre el mortero, verter el contenido del tubo previamente
incubado sobre la malla y con el mazo machacar el cogulo, recogiendo el colado en el
mortero.
3. Con la pipeta Pasteur recoger el colado y llenar los tubos de Wintrobe tratando que
ambos queden bien calibrados. Centrifugar por 5 15 minutos.
4. Tomar del tubo de Wintrobe la capa de leucocitos y hacer una extensin sobre un
portaobjetos, ayudndose con otro.
5. Teir con la coloracin de Wright.
6. Revisar la preparacin con el objetivo de inmersin.
Interpretacin de los resultados

Reporta como positivo si se observan dos o ms clulas LE.
Reporta como negativo si no se observan dichas clulas.
Nota:
Esta prueba se confirma con otros estudios como la presencia de anticuerpos antinucleares o anticuerpos
contra ADN.
Factores que interfieren en los resultados

- Hemlisis.
- Frmacos como la Isoniacida pueden dar falsos positivos.
- Algunos pacientes con artritis reumatoidea, con esclerodermia y con sensibilidad a los medicamentos
tambin muestran un examen de clulas de lupus eritematoso positivo.

DETERMINACION DE GRUPOS SANGUINEOS Y RH
Introduccin:
Un grupo sanguneo es una forma de agrupar ciertas caractersticas de la sangre que

dependen de los antgenos presentes en la superficie de los glbulos rojos y en el suero
de la sangre.
Esta ha sido la base para que se pueda clasificar a la sangre en cuatro grupos en
cuanto al sistema ABO: grupo A, grupo AB, grupo B y grupo O; y en dos con respecto
al sistema Rh: Rh negativo o Rh positivo. Lo que a la postre trae ocho grupos posibles
por las combinaciones posibles entre ambos sistemas.
Las transfusiones de sangre entre grupos incompatibles pueden provocar una reaccin
inmunolgica que puede desembocar en muerte.
Las personas con sangre del tipo A tienen glbulos rojos que expresan antgenos de
tipo A en su superficie y anticuerpos contra los antgenos B en el suero de su sangre.
Las personas con sangre del tipo B tiene la combinacin contraria, glbulos rojos con
antgenos de tipo B en su superficie y anticuerpos contra los antgenos A en el suero de
su sangre.
Los individuos con sangre del tipo O no expresan ninguna de los dos antgenos (A o B)
en la superficie de sus glbulos rojos pero pueden fabricar anticuerpos contra ambos
tipos, mientras que las personas con tipo AB expresan ambos antgenos en su
superficie y no fabrican ninguno de los dos anticuerpos.
A causa de estas combinaciones, el tipo O puede ser transfundido sin ningn problema
a cualquier persona con cualquier tipo ABO y el tipo AB puede recibir de cualquier
tipo ABO.
Material y equipo:
Antisuero Anti-A, Anti-AB, Anti-B y Anti-D *
Sangre Total
Placa de porcelana
Tubos de ensaye
Agitadores

TECNICA EN PLACA:
Preparar una suspensin de glbulos rojos al 10%. Como alternativa puede emplearse
una suspensin al 35-45% en plasma del mismo paciente o sangre entera.
1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en una

placa limpia, agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos.
2) Mezclar el Reactivo y los glbulos con un palillo descartable cubriendo un rea
circular de 2 cm de dimetro y balancear la placa continuamente durante 2
minutos. Observar aglutinacin visible microscpicamente hasta los 2 minutos. No
debe emplearse microscopio.
TECNICA EN TUBO (por centrifugacin):
1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en un tubo

de hemlisis, agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos al 3-5%.
TECNICA EN TUBO (por sedimentacin):
1) A una gota de Reactivo Anti-A, Anti-B o Anti-A,B monoclonal colocada en un tubo

de hemlisis, agregar 1 gota de suspensin de glbulos rojos al 3-5%.
2) Mezclar e incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente.
3) Agitar el tubo para despegar las clulas y examinar macroscpicamente la
aglutinacin.

Pruebas Cruzadas de Compatibilidad Sangunea
Fundamento:
En todo banco de sangre y ante la inminencia de transfundir sangre a un individuo, es

obligatorio efectuar la determinacin del tipo sanguneo y el factor Rh del receptor; al
seleccionar la sangre a transfundir, deber ser del mismo tipo sanguneo y factor Rh
del paciente, cumpliendo con esta premisa, se efectuar en el laboratorio un anlisis
que nos permita en vitro detectar si en ellas, tenga un anticuerpo anormal, que
pueda causar aglutinacin o hemlisis de los glbulos rojos en la circulacin sangunea
del receptor. La identificacin correcta de la sangre elegida para la donacin, la del
paciente que ha de recibir la transfusin, la exactitud, velocidad, prevencin y de
control de calidad y omisin de errores, son aspectos que al realizar las pruebas
cruzadas, revisten gran importancia, pues errores humanos descubiertos despus de
iniciada una transfusin son imposibles de corregir y ponen en peligro la vida del
paciente.
Las pruebas cruzadas deben:

a) Detectar anticuerpos IgM de carcter aglutinante o hemolizante que fijan
complemento, por lo que se debe trabajar con sangre recin extraidas y coaguladas.
b) Investigar Anticuerpos IgG que por su naturaleza no producen aglutinacin y se

deben utilizar distintos medios que permitan demostrar su presencia, produciendo
aglutinacin o hemlisis.
Objetivo:
Determinar si dos sangres; del donador y del receptor, son compatibles, para practicar
la transfusin sangunea.
Material y equipo:
1 gradilla
4 tubos 13x 100
12 tubos 10 x 75
pipetas Pasteur con bulbo
centrifugas Serofuge
Bao mara a 37C
Slucion salina en pizetas
Albmina bovina al 22%
Suero Antiglobulina Humana (Coombs)

Tcnica:
1. Separar los sueros de los globulos rojos

2. Realizar una suspensin de globulos rojos del disponente y del receptor al 5%
previamente lavados
3. Se colocan 7 tubos en lnea recta y se marcan:
1 2 3 4 5 6 7
Er Sr Ed Sd FM fm AC
4. A la Fase mayor se le pone una gota de suero del receptor ms una gota de glbulos
rojos al 5% del disponente
5. A la fase menor se le pone una gota de suero del disponente ms una gota de
globulos rojos al 5% del receptor
6. Al tubo control se le pone una gota de suero del receptor ms una gota de glbulos
rojos al 5% del receptor
7. Se centrifugan a 2500 rpm por 30 y se lee desprendiendo suavemente el sedimento

en busca de aglutinacion de no existir aglutinacin, se continuar
8. Se agregan dos gotas de Albmina Bovina al 22% y se centrifuga a 2500 rpm por 30
y se lee
9. Se incuban a 37C durante 30 minutos, se extrae los tubos
10. Se centrifuga a 2500 rpm por 30 y se leen
11.Se llenan con solucin salina 3/4 de ambos tubos (fase mayor y menor) se mezclan y
se centrifugan a 2500 rpm por 30, se sacan de la centrfuga y se decantan y se vuelve
a aplicar solucin salina (sta operacin se repite tres veces) en el ltimo lavado, se
decantan completamente el tubo
12.Al sedimento residual se le agregan dos gotas de reactivo de Coombs a ambos tubos
y se centrifugan a 2500 rpm por 30, se leen cuidadosamente para buscar que no haya
hemlisis ni aglutinacin
13.Se le agrega a cada tubo una gota de clulas control se centrifuga a 2500 rpm por
30 y se leen en busca de aglutinacin.

Interpretacin:
La prueba mayor, menor y control contienen:
Prueba mayor: suero del receptor con globulos rojos del disponente (2 gotas de
suero del receptor ms 1 gota de suspencin de eritrocitos del disponente)
Prueba menor: suero del disponente con globulos rojos del receptor (2 gotas de
suero del disponente ms 1 gota de suspencin de eritrocitos del receptor)
Control: suero del recpetor y globulos rojos del receptor (2 gotas del suero del
receptor ms 1 gota de suspencin de e ritrocitos del receptor )
Si en todos los pasos no existi aglutinacin o hemlisis, las pruebas son 100%
compatibles y la sangre puede transfundirse, en caso de existir aglutinacin o
hemlisis, en cualquiera de los pasos se considera incompatibilidad, las pruebas se
suspenden y se comienza a investigar otra bolsa de sangre del mismo tipo
sanguneo y factor Rh, siguiendo los mismos pasos.
Si la incompatibilidad, se encuentra en los tubos con salina (1 y 2) probablemente

se trata de una IgM y hay una equivocacin en el tipo sanguneo, por lo tanto se
debe ratificar el tipo del donador.
Si la aglutinacin es en el tubo menor en salina se trata de una IgM del donante y

es de esperarse, en el caso de emplearse sangre O.
Cuandose efectua el cruce con receptores de tipo sanguneo distinto esta sangre
puede emplearse, de preferencia el paquete globular. Es de hacerse notar que
tanto la aglutinacin como la hemlisis son macroscpicas y que en muy pocos
casos es necesario utilizar el microscopio.
Este mtodo por los numerosos pasos que hay que efectuar, al parecer es
complicado, pero la prctica continua del mismo se vuelve simple y automatizado y en
muchas ocasiones de acuerdo con la urgencia se puede reducir la incubacin, con
primera lectura a los 20 minutos, si se reporta negativo, enviar la sangre a
transfundir, continuando con el mtodo hasta cumplir con los tiempos sealados.

PRUEBAS DE COOMBS
Fundamento:
El suero de Coombs permite establecer la presencia de globulina y por lo tanto de

anticuerpos, ya que son de la misma naturaleza, los anticuerpos incompletos como son
los que producen la eritroblastosis fetal y la anemia hemoltica adquirida, se absorben
sobre la superficie del glbulo rojo; pero no los aglutinan, el suero Antiglobulina
permite reconocer estos glbulos sensibilizados al combinarse con los anticuerpos
globulnicos que ya cubren.
Es util reconocer estos globu1os sensibilizados al combinarse con los anticuerpos

globulnicos que ya cubren su superficie el suero de coombs es ideal pues tiene
anticuerpos contra las globulinas sricas humanas que abarcan cuatro grandes alfa1,
alfa2, beta y gamma, y dentro de estos grupos se en cuentran anticuerpos Anti Rh
incompletos, Anti-Duffi, Anti Kell el suero de Coombs se obtiene por inyecciones
repetidas de sueros humanos del grupo O a conejos el animal sensibilizado de esta
manera produce anticuerpos contra la fraccin globulinica de las proteinas sricas y
contra anticuerpos incompletos que pueden encontrarse revistiendo a los hemates o
bien es suspensin en el plasma, por lo que se llama Antiglobulina Humana, se
preparan reactivos de amplio espectro mediante la mezcla de sueros obtenidos de
distintos animales.
La IgG no produce aglutinacin de los eritrocitos, pero se fijan sobre ellos y

permanecen sin soltarse, al agregar el suero de Coombs se forman puentes entre los
fragmentos cercanos y es posible ver la aglutinacin, revelando que esos eritrocitos
estaban en realidad cubiertos de anticuerpos.
Objetivo:
Conocer los eritrocitos sensibilizados por anticuerpos incompletos, que son capaces de
ser aglutinados por la Antiglobulina Humana.
Prueba de Coombs Directa.
Fundamento:
La prueba directa se realiza cuando el Antiuerpo se ha fijado sobre el eritrocito in

vivo, permite establecer la sensibilizaci6n de los glbulos rojos que tuvo lugar en el
organismo. Se usa para el diagnstico de eritroblastosis fetal, anemia hemoltica y
reacciones hemolticas postrasfusionales por sangre incompatible

Material y equipo
1 gradilla
4 tubos de 13 x 100
2 tubos de 10 x 75
2 pipetas Pasteur c/bulbo
1 centrifuga Serofuge
1 bao mara 37C
Solucin salina en pizetas
Suero de coombs
Globulos rojos problema
Globulos rojos O Rh negativos
Procedimiento:
1. Para identificar los glbulos rojos sensibilizados es necesario remover la totalidad

del suero de los eritrocitos, mediante lavadas repetidas con suero salino. Este
proceso es importante, pues si se dejan residuos proteicos se neutraliza el suero de
Coombs y se obtendrn falsos negativos
2. Se prepara una suspensin de glbulos rojos al 5% de la cual se colocan dos gotas
en un tubo de ensaye y se procede al lavado por tres ocasiones
3. Despus del ltimo lavado se resuspenden los glbulos rojos nuevamente con una
gota de solucin salina, agregar dos gotas de suero de coombs y mezclar
4. Incubar por 30 minutos a 37C, extraer el tubo cuidadosamente y observar si
existe aglutinacin en el fondo del tubo con leves movimientos de inclinacin,
5. Se aconseja como testigo utilizar hemates de adulto no sensibilizados del mismo
grupo del paciente. El testigo se prepara en un tubo poniendo una gota de
sangre O Rh negativa y cuatro gotas de solucin salina ms una gota de suero
anti Rh, incubar media hora, lavar por tres veces estos glbulos y despus se
adiciona una gota de suero de Coombs
Interpretacin de resultados:
1. La aglutinacin en el tubo testigo no debe existir,

2. Si el tubo problema presenta aglutinacin, los glbulosrojos estn sensibilizados
por algn anticuerpo incompleto

Prueba de Coombs Indirecta
Fundamento:
En esta prueba la sensibilizacin se realiza in vitro, en la primera etapa se

sensibilizan los glbulos rojos testigos con el anticuerpo que se desea investigar (Rh
negativo, factor Kell, Diego, etc.) y en la segunda etapa por medio de reactivo de
Coombs se hace visible la sensibilizacin por medio del fenmeno de aglutinacin
macroscpica.
Procedimiento:
1. En tubo poner cuatro gotas del suero problema y una gota de glbulos rojos
sensibilizados, suspendidos en solucin salina al 5%, si se investigan anticuerpos
Rh se usan glbulos rojos tipoO Rh positivos
2. Se incuba a 37C por una hora, se centrifuga el tubo a baja velocidad 2500 rpm x 1
minuto
3. Se lavan los glbulos rojos sensibilizados tres veces con solucin salina,
desechando el sobrenadante completamente en el ltimo lavado, dejando solo el
boton de eritrocitos en el fondo
4. Agregar dos gotas de suero de Coombs, mezclar perfectamente y poner en bao
Mara a 37C, durante cinco minutos,
5. Centrifugar a baja velocidad 2500 rpm y buscar aglutinacin en el fondo del tubo
Interpretacin de resultados.
1. Si se encontr aglutinacin despus del paso nmero 2, indica la presencia de

aglutininas anti Rh en el suero problema
2. Si la prueba es negativa, se puede presumir la existencia de anticuerpos
incompletos o bloqueadores, y se comprueba prosiguiendo con la tcnica.
3. Se puede realizar diluciones del suero problema para conocer el titulo del
aglutininas anti-Rh que existen en el paciente

TIEMPO DE PROTROMBINA (PT)
Fundamento:
Esta prueba refleja la eficacia global de la va extrnseca. Es sensible a cambios en los

factores V, VII y X y menos para el factor II (protrombina). Es tambin poco apropiado
para detectar pequeos cambios en los niveles de fibringeno, pero adems puede ser
anormal si los niveles de fibringeno son muy bajos o si est presente un inhibidor. La
sensibilidad de la prueba se ve influenciada por el reactivo y la tcnica utilizada, por lo
que es importante establecer un rango de referencia local. El reactivo de PT, a menudo
llamado tromboplastina, contiene factor tisular y fosfolpidos.
Equipo:
Tubos de ensayo
Cronmetro
Pipetas
Bao Mara
Coagulmetro
Reactivos:
Tromboplastina (que puede contener cloruro clcico)
Cloruro clcico 25 mM (slo es necesario si el reactivo de tromboplastina no contiene calcio)
Procedimiento:
1. En los primeros dos tubos: Colocar 0,1 ml de plasma normal y calentar a 37C
durante 2 minutos. Aadir 0,2 ml de reactivo de tromboplastina (si hay calcio en el
reactivo) precalentado (a 37C), poner en marcha el cronmetro, mezclar agitando
suavemente el tubo y registrarlos tiempos de coagulacin.
2. Repetirlo por cada muestra de prueba.
3. Anotar el tiempo de coagulacin del paciente, en segundos.
Resultados/Interpretacin
Los tiempos de coagulacin duplicados no deben diferir entre s en ms del 10 %.
Notas Importantes:
Si el reactivo de tromboplastina no contiene calcio, el procedimiento de la prueba se har con 0,1ml de
plasma, 0,1 ml de tromboplastina y coagular con 0,1 ml de cloruro clcico 25 mMprecalentado.
La activacin del factor IX, mediante el factor tisular factor VII se produce in vivo. Bajo las condiciones
de la mayora de las pruebas de PT, el factor X es activado tan fuertemente, que el ensayo es insensible al
dficit del factor IX u VIII.
La tromboplastina/cloruro clcico deben ser precalentados durante los 5-30 minutos previos a su uso.
Los tiempos de coagulacin estn normalmente influenciados por el uso de diferentes coagulmetros,
dependiendo de cmo y cundo se detecte el punto final. Esto subraya la importancia de establecer rangos
normales para los mtodos habitualmente usados en el laboratorio

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA (APTT)
Fundamento:
Es una prueba no especfica de la va intrnseca. Medido junto con un PT normal, es la

prueba de rastreo ms til para detectar deficiencias en los factores VIII, IX, XI y
XII.El APTT estar prolongado en cualquier deficiencia que implique a las vas
comunes(deficiencias en factores V, X, II y en menor grado el fibringeno) y en
presencia de inhibidores. La presencia de algunos inhibidores teraputicos de la
coagulacin, como la heparina, prolongarn tambin el APTT. Esto es importante para
rechazar estos tratamientos como causa de la prolongacin del APTT antes de
continuar con otras pruebas.
Equipo
Pipetas
Cronmetros
Bao
Tubos de ensayo
Reactivos
Reactivo de APTT (hay muchos reactivos comerciales adecuados, que pueden diferir en su
sensibilidad).
Cloruro clcico 25 mM.
Procedimiento:
1. Colocar un tubo con cloruro clcico a 37C, durante 5 minutos, antes de su
utilizacin.
2. Pipetear 0,1 ml de reactivo de APTT en dos tubos de coagulacin de cristal a 37C.
3. Pipetear 0,1 ml de plasma control en el primer tubo. Poner en marcha el cronmetro
principal. Mezclar. Aadir 0,1 ml de plasma control al segundo tubo. Mezclar.
4. A los 5 minutos, aadir 0,1 ml de cloruro clcico a cada tubo y seguidamente poner
en marcha un cronmetro para cada tubo. Mezclar. Anotar el tiempo de formacin del
cogulo.
5. Realizar todas las pruebas por duplicado.
Resultados/Interpretacin
Un APTT alargado con un PT normal, indica una posible deficiencia de factores VIII,
IX, XI,XII, quiningeno de alto peso molecular, precalicreina, o la presencia de un
inhibidor. En casos con APTT alargado, una mezcla igual, de plasma normal y plasma
de prueba debe ser probada(es decir, una mezcla de 1 parte de plasma de prueba y 1
parte de plasma normal, lo que se conoce como una mezcla 50:50, ver ms abajo). Si el
APTT corrige en ms del 50% la diferencia existente entre los tiempos de coagulacin
del plasma normal y el plasma de prueba, indica la deficiencia de un factor. Una mala
correccin sugiere la presencia de un inhibidor, posiblemente en uno de los factores de
la coagulacin del sistema, o de tipo no especfico, como el anticoagulante lpico.

Referencias:
Bennington James L. (1991) Diccionario Enciclopdico del Laboratorio

Clnico. Editorial Mdica Panamericana S.A. Buenos Aires, Argentina.
Bernard Henry John. (2005) Diagnstico y Tratamiento Clnico por el

Laboratorio. Espaa. 4ta. Edicin
DiMichele Donna M. (1997) Inhibidores en hemofilia informacin bsica.

Publicado por la Federacin Mundial de Hemofilia 007: 1-5
Mackenzie Shirlyn B. (2000) Hematologa Clnica. 2da edicin. Editorial El

Manual Moderno. S.A. de CV, Mxico.
Manual de Procedimientos de Laboratorio Clnico, Seccin Hematologia, HGZ

No. 2 Salina Cruz, Oax.

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Laboratorio Clnico del H.G.Z. c/U.M.F.

Actualizado por: Q.F.B. Mara de Jess Sosa/ Jefe de Laboratorio

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La sangre est formada por:

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Cuando la sangre se coagula, el lquido que queda despus de separarse el coagulo, se

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f) Se retira el estuche protector de la aguja y se coge la jeringa de tal manera que

Manual de Procedimientos Hematolgicos 8

i) Retirar el torniquete e indicar al paciente que deje de hacer puo. Se coloca el

OBTENCIN DE SANGRE VENOSA CON SISTEMA DE VACIO (VACUTAINER)

Materiales y equipos requeridos

Manual de Procedimientos Hematolgicos 9

f) Se coloca la aguja en direccin paralela a la vena, se perfora la piel haciendo

g) Retirar la ligadura tirando del extremo doblado.

i) Pedir al paciente que presione firmemente el algodn durante 3 minutos, con el

Manual de Procedimientos Hematolgicos 10

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Manual de Procedimientos Hematolgicos 11

Una vez extrada la sangre, sta puede conservarse coagulada o mantenida

CARACTERSTICAS BSICAS DE LOS ANTICOAGULANTES MS USADOS

El tiempo mximo entre la extraccin de la sangre y su procesamiento depende del

Para la biometra hemtica y qumica sangunea. El anticoagulante de eleccin es la

Es bastante satisfactorio para la determinacin globular, previene la aglutinacin de

Este anticoagulante impide la coagulacin sustrayendo calcio del plasma sanguneo

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Manual de Procedimientos Hematolgicos 12

1) PREPARACIN DE SOLUCIN DE EDTA AL 5%

1. Pesar 5grs de sal disdica o dipotsica de EDTA y se colocan en un vaso de

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2) PREPARACIN DE ANTICOAGULANTES PARA PROTROMBINA

Solucin de Citrato de Sodio al 3.8%

1. En un matraz volumtrico de 100ml se ponen 3,81 grs de citrato de sodio y se

Mezcla de Oxalatos de Paul-Heller

1. En un matraz volumtrico de 100ml se ponen 1.2 grs de oxalato amnico

Anticoagulante de Oxalato de Potasio

1. En un matraz volumtrico de 100ml se ponen 2 grs de oxalato de potasio y se

Manual de Procedimientos Hematolgicos 14

ANTICOAGULANTES EN SISTEMA DE VACIO

Manual de Procedimientos Hematolgicos 15

PREPARACIN Y TINCIN DE LAS EXTENSIONES DE SANGRE

La prctica del frotis sanguneo, tambin llamado extendido, es de gran importancia

La informacin que se obtiene al examinar las extensiones de sangre es sumamente

A. MTODO DE LOS DOS PORTAOBJETOS

Manual de Procedimientos Hematolgicos 16