INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BILGICAS

SECCIN DE ESTUDIOS DE POSGRADOS E INVESTIGACIN
DEPARTAMENTO DE INMUNUNOLOGA

DETECCIN DE MUTACIONES QUE CONDUCEN AL

DESARROLLO DE INFECCIONES MICOBACTERIANAS POR
SUSCEPTIBILIDAD MENDELIANA.

T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:

MAESTRA EN CIENCIAS

EN INMUNOLOGA

P R E S E N T A :
Q.F.B. No Ramrez Alejo

DIRECTORES: DRA. IRIS ESTRADA GARCA

DR. FRANCISCO J. ESPINOSA ROSALES

Mxico, D.F. 2010

 NDICE

NDICE DE FIGURAS Y TABLAS I

ABREVIATURAS II

RESUMEN VI

ABSTRACT VII

INTRODUCCIN 1

RESPUESTA INMUNE CONTRA M. tuberculosis 3

CITOCINAS Y RECEPTORES CLAVE EN EL CONTROL
DE PATGENOS INTRACELULARES: MICOBACTERIAS
Y SALMONELLA 9
SUSCEPTIBILIDAD MENDELIANA A
INFECCIONES MICOBACTERIANAS 11
JUSTIFICACIN 36
HIPTESIS 36
OBJETIVO GENERAL 37
OBJETIVOS PARTICULARES 37
MATERIAL Y MTODOS 38
RESULTADOS 51
DISCUSIN 71
CONCLUSIONES 75
PERSPECTIVAS 75
BIBLIOGRAFA 76
 NDICE DE FIGURAS Y TABLAS

FIGURA 1. ESPECIES DEL COMPLEJO Mycobacterium tuberculosis (MTC) 2

FIGURA 2. GRANULOMA 2

FIGURA 3. ESTRUCTURA DEL GRANULOMA 3

FIGURA 4. RECONOCIMIENTO POR PRRs 4

FIGURA 5. DIFERENCIACIN DE LOS LINFOCITOS TH1. 5

FIGURA 6. SEALIZACIN DE IFN-. 7

FIGURA 7. ACTIVACIN DE LOS LINFOCITOS T CD4+ 8

FIGURA 8. CITOTOXICIDAD DE LOS LNFOCITOS T CD8+ 8

FIGURA 9. ESTRUCTURA DE LA IL-12 10

FIGURA 10. PREVALENCIA DE DEFECTOS EN MOLCULAS

DEL EJE IL12/23-IFN 13

FIGURA 11. RECEPTOR DE IFN- 14

FIGURA 12. PRIMER MUTACIN REPORTADA 15

FIGURA 13. SEGUNDA MUTACIN REPORTADA 15

FIGURA 14. TERCERA MUTACIN REPORTADA 16

FIGURA 15. CUARTA MUTACIN 17

FIGURA 16. QUINTA MUTACIN 18

FIGURA 17. DEFECTO EN IFNGR1 18

FIGURA 18. PRIMERA MUTACIN 19

FIGURA 19. SEGUNDA MUTACIN 20

FIGURA 20. TERCERA MUTACIN 21

FIGURA 21. CUARTA MUTACIN 22

FIGURA 22. DEFECTOS EN IFNGR2 22

I

FIGURA 23. PRIMERA MUTACIN 24

FIGURA 25. TERCERA Y CUARTA MUTACIONES 25

FIGURA 26. DEFECTOS EN IL12B 26

FIGURA 27. RECEPTOR DE IL12 27

FIGURA 28. PRIMER MUTACIN REPORTADA 28

FIGURA 29. TOTAL DE MUTACIONES REPORTADAS PARA IL12R1 28

FIGURA 30. DEFECTOS EN IL12R1 30

FIGURA 31. ORGANIZACIN DE Stat-1 31

FIGURA 32. PRIMER MUTACIN EN Stat-1 32

FIGURA 33. MUTACIONES EN Stat-1 32

FIGURA 34. MUTACIONES EN Stat-1 33

FIGURA 35. ORGANIZACIN DE NEMO 34

FIGURA 36. MUTACIONES EN NEMO 34

FIGURA 37. ESTIMULACION DE SANGRE PERIFRICA CON rhIL-12 39

FIGURA 38. ESTIMULACION DE SANGRE PERIFRICA CON rhIFN- 40

FIGURA 39. DIAGRAMA PARA LA PRUEBA TAMIZ 40

FIGURA 40. MAPA DEL VECTOR pJET1.2/blunt 48

FIGURA 41. PRODUCCIN DE IFN- EN SANGRE TOTAL DEL P1 52

FIGURA 42. PRODUCCIN DE IFN- EN PBMCs DEL P1 52

FIGURA 43. PRODUCCIN DE IL-12 P40 EN SANGRE TOTAL DEL P1 53

FIGURA 44. PRODUCCIN DE IL-12 p40 EN PBMCs DEL P1 53

FIGURA 45. EXPRESIN DE RECEPTORES EN MEMBRANA DEL P1 54

FIGURA 46. ESQUEMA QUE MUESTRA LA SECUENCIA DE cDNA DEL GEN 55

IL12R1

FIGURA 47. AMPLIFICACIN DE LA SECUENCIA CORRESPONDIENTE AL 55

DOMINIO CITOPLSMICO de IL12R1

II

FIGURA 48. PCR DE COLONIA 56

FIGURA 49. DIGESTIN DEL PLSMIDO PURIFICADO A PARTIR DE 57

BACTERIAS

FIGURA 50. SECUENCIA DE LA REGIN CITOPLSMICA DE IL12R1 58

FIGURA 51. PRODUCCIN DE IFN- EN CLULAS DE SANGRE TOTAL 59

DEL P2

FIGURA 52. PRODUCCIN DE IL-12p40 DEL P2 60

FIGURA 53. EXPRESIN DE CD119 E IL12R1 61

FIGURA 54. PRODUCCIN DE IL-12 p70 EN EL P3 64

FIGURA 55. PRODUCCIN DE IL-12 p40 EN EL P3 64

FIGURA 57. EXPRESIN DE RECEPTORES EN LA SUPERFICIE CELULAR 65

FIGURA 58. EXPRESIN DE Stat-1 FOSFORILADO 66

FIGURA 59. EXPRESIN DE HLA-DR EN LA SUPERFICIE CELULAR 67

FIGURA 60. PRODUCCIN DE IL-12 p70 EN EL P4 68

FIGURA 61. EXPRESIN DE LOS RECEPTORES DE IFN- E IL-12 69

FIGURA 62. EXPRESIN DE Stat-1 FOSFORILADO 70

TABLA 1 PACIENTES 18

TABLA 2. SECUENCIAS DE INICIADORES 46

III

 ABREVIATURAS

BCG Bacilo de Calmette y Gurin (Mycobacterium bovis cepa BCG)

cDNA DNA complementario

DCs Clulas dendrticas

ELISA Ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas

FITC Isotiocianato de fluorescena

HLA-DR Molcula DR del complejo principal de histocompatibilidad clase II

IFN- Interfern gamma

IFNGR1 Subunidad 1 del receptor de interfern gamma

IFNGR2 Subunidad 2 del receptor de interfern gamma

IL-12 Interleucina 12

IL-12 p35 Subunidad p35 de la interleucina 12

IL-12 p40 Subunidad p40 subunidad B de la interleucina 12

IL12R1 Subunudad 1 del receptor de IL-12

IL-17 Interleucina 17

IL-23 Interleucina 23

Jak Janus cinasa

LB Luria-Bertani

MOI Multiplicidad de infeccin

MSMD Susceptibilidad mendeliana a infecciones micobacterianas

MTC Complejo Mycobacterium tuberculosis

mRNA RNA mensajero

NBT Nitroazul de tetrazoilo

NEMO Modulador esencial del factor nuclear B

IV

NK Natural killer

NOS2 xido ntrico sintasa 2

PBS Regulador de fosfatos

PBA Regulador de fosfatos-albmina bovina-azida de sodio

PE Ficoeritrina

PerCP Clorofilperhidrina

PHA Fitohemaglutinina

PMA Forbol miristato acetato

rh IFN- Interfern gamma humano recombinante

rh IL-12 Interleucina 12 humano recombinante

Stat-1 Transductor de seal y activador de la transcripcin-1

TB Tuberculosis

TLR Receptores tipo Toll

TNF- Factor de necrosis tumoral alfa

V

 RESUMEN

La respuesta inmune contra bacterias intracelulares como Mycobacterium sp y

Salmonella sp est dada principalmente por la interaccin entre los macrfagos que
albergan al microorganismo y los linfocitos T CD4+ que coopera con ste para lograr su
eliminacin. Dicha comunicacin se realiza a travs de la secrecin de citocinas,
principalmente IL-12 e IFN-. El papel principal de la IL-12 en esta interaccin es el de
polarizar la respuesta hacia TH1 y as incrementar la produccin de IFN-. ste ltimo
genera diferentes efectos en el macrfago, mismos que le permiten eliminar al
patgeno o al menos controlar la infeccin por medio de la formacin de un granuloma.

Han sido descritos defectos en estas molculas as como en sus receptores o vas de
sealizacin, los cuales condicionan a una susceptibilidad para desarrollar infecciones
diseminadas por micobacterias y Salmonella. En el presente trabajo nos enfocamos a
generar una metodologa que permitiera diferenciar los casos en los que existe un
defecto en los efectores de la respuesta IL-12/IFN-, de aquellos en los que la causa de
la infeccin tiene una etiologa diferente. Se midi, por el mtodo de ELISA, la
produccin de IL-12 e IFN- en clulas de sangre total de los pacientes, tras la
estimulacin con BCG, BCG+rhIL-12 BCG+ rhIFN-. La expresin en la superficie
celular de los receptores de IFN- (IFNGR) e IL-12 (IL-12R) se realiz por citometra de
flujo.

Los ensayos funcionales para evaluar la actividad de ambos receptores se

establecieron utilizando: clulas mononucleares de sangre perifrica (PBMCs) se
estimularon especficamente con rhIL-12 y se incubaron durante 48 horas, despus del
cual se cuantific la produccin de IFN- por ELISA. Para el receptor de IFN-, las
PBMCs se estimularon con rhIFN- y se determin por citometra de flujo la
fosforilacin del transductor de seal y activador de la transcripcin-1 (STAT-1) y el
incremento de molculas de clase II (HLA-DR) en la superficie celular.

En el caso en el que se consider necesario se secuenci el gen correspondiente a una

molcula candidato en busca de la mutacin que condujera a una alteracin en su
funcin.

VI

 ABSTRACT

The immune response against intracellular bacteria such as Salmonella sp and

Mycobacterium sp is governed mainly by the interaction between macrophages that
harbor the organism and a CD4+ T cell that cooperate with it to achieve its elimination.
This communication is done through the secretion of cytokines, especially IL-12 and IFN
gamma. The main role of IL-12 in this interaction is to polarize the response toward TH1
and thus increase the production of IFN gamma. This produces different effects on the
macrophage, which allows it to eliminate the pathogen or at least control the infection
through the formation of a granuloma.

Defects have been described in these molecules and their receptors or signaling
pathways, which lead to a susceptibility to develop disseminated mycobacterial and
salmonella infections. In this paper we aim to create a methodology that would
distinguish those cases where a defect on these molecules causes severe infection.
Therefore IL-12 and IFN- production was measured by ELISA in patients whole blood
cells, following stimulation with BCG, BCG + rhIL-12 or BCG + rhIFN-. Cell surface
expression of IFN- (IFNGR) and IL-12 receptors (IL-12R) was performed by flow
cytometry.

Functional assays to evaluate the activity of both receptors were made as follows:
peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were stimulated specifically with rhIL-12
and incubated for 48 hours, after this time IFN - production was quantified by ELISA.
For IFN- receptor, PBMCs were stimulated with rhIFN- and its activity was determined
by flow cytometry phosphorylation of Signal Transducer and Activator of Transcription-1
(STAT-1) and increased expression of cell surface class II molecules (HLA-DR).

Only in that case where it was considered necessary was sequenced a candidate gene
to identify a defect that could generate any alteration in protein function.

VII

 Introduccin

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa que afecta principalmente a los

pulmones, aunque tambin puede afectar pleura, articulaciones, piel, intestinos, laringe
y ojos. El agente causal es Mycobacterium tuberculosis el cual es un bacilo cido
alcohol resistente con complejos lipdicos en su pared celular (cidos miclicos,
lipoarabinomananas, lipomananas y mansidos con foSTATidil inositol) que lo hacen
resistente a algunos antibiticos, a agentes qumicos y a la desecacin. Otras bacterias
responsables de tuberculosis en humanos y animales son las pertenecientes al
complejo Mycobacterium tuberculosis (MTC) las cuales se mencionan en la Figura 1
(Brooks GF, 2005).

La TB se caracteriza por una lesin primaria en el parnquima pulmonar seguida de la

acumulacin de macrfagos y la proliferacin de clulas epiteloides para formar el
tpico tubrculo o granuloma (Figura 2). Toda el rea est rodeada por linfocitos y
clulas gigantes multinucleadas) (Figura 3). El tubrculo incrementa el reclutamiento de
2 a 10 semanas por la reaccin de hipersensibilidad del sistema inmune contra el
microorganismo (Flynn JL, 2001).

Es una enfermedad que ataca principalmente a personas con estado nutricional

deficiente, con inmunosupresin o enfermedades crnicas. As mismo, las infecciones
vrales como el sarampin y la varicela, la tosferina, el estrs, la infeccin por el virus
de inmunodeficiencia humana (VIH), las infecciones pulmonares virales graves y el uso
de esteroides puede activar un foco tuberculoso antiguo (reactivacin endgena)
(http://portal.iner.gob.mx).

En el mundo se calcula que hay ms de 8 millones de casos y 2.5 millones de muertes

al ao. En Mxico, en 2008, se identificaron 15,000 casos nuevos y 2,000 muertes en
el ao. El 10% de estos casos se asociaron a VIH/SIDA, mientras que en el 15% de los
casos los pacientes tenan diabetes confirmada (http://portal.iner.gob.mx).

1

 Mycobacterium tuberculosis

Complejo Mycobacterium bovis

Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium africanum

(MTC) Mycobacterium canettii

Mycobacterium microti

Mycobacterium pinnipedii

Mycobacterium caprae

Figura 1. Especies de micobacterias pertenecientes al MTC.

Figura 2. Granuloma formado por la acumulacin de macrfagos (al centro) y linfocitos (clulas de prpura
ms intenso en la periferia) (http:// db.doyma.es).

2

 Linfocitos

Clula gigante Macrfago

Figura 3. Corte histolgico de un granuloma tuberculoso. Se aprecian los linfocitos rodeando a los macrfagos y
resalta la presencia de una clula gigante multinucleada (al centro) (http:// db.doyma.es).

Respuesta inmune contra M. tuberculosis

La respuesta inmune a M. tuberculosis es multifactica y compleja. Las clulas T son

un componente esencial de la respuesta protectora y su interaccin con macrfagos
infectados es crucial para el control de la infeccin50. Dicha respuesta se inicia cuando
M. tuberculosis llega al espacio alveolar donde se encuentran con los macrfagos
residentes, los cuales interactan con los componentes bacterianos a travs de los
receptores tipo Toll (TLR) (Means TK, 1999). El TLR-2 interacta con la protena de 19
kDa, y con la lipoarabinomanana. El TLR-4 reconoce por su parte a la protena de
choque trmico de 65 kDa, mientras que el TLR-9 (presente en los endosomas y los
fagolisosomas) reconoce DNA micobacteriano (Reiling N, 2002). Una vez habiendo
reconocido sus ligandos, los TLRs sealizan a travs de la protena 88 de respuesta
primaria de diferenciacin mieloide (MyD88), la cual es una molcula adaptadora
3

presente en el citoplasma. Esto tiene como resultado la activacin y traslocacin al
ncleo del factor nuclear kappa B (NFB), que activa la transcripcin de genes que
codifican para citocinas proinflamatorias, tales como el TNF- (Figura 4) (Tufariello J,
2003). El TNF- acta en el control de la infeccin activando de manera autcrina a los
macrfagos al estimular la produccin de intermediarios reactivos del nitrgeno, va la
induccin de la xido ntrico sintasa 2 (NOS2), as como de intermediarios reactivos del
oxgeno. Participa tambin en el reclutamiento de clulas del sistema inmune
relevantes para el control de la infeccin (efecto sobre molculas de adhesin,
quimiocinas y sus receptores), lo cual permite la organizacin y dinmica del granuloma
al favorecer el recambio de clulas que mantengan restringida la zona y de esta
manera evitar la diseminacin de la bacteria (Kindt JT, 2007).

HSP 65 TNF-

Figura 4. Reconocimiento de los componentes micobacterianos por parte de los TLRs y sealizacin que termina
con la transcripcin de citocinas proinflamatorias (TNF-) (Abbas KA, 2004).

4

Estas seales resultan en la migracin de monocitos y clulas dendrticas (DC) al sitio
de la infeccin. Una vez ah las DC interactan con la micobacteria a travs de sus
receptores de reconocimiento de patrones (PRR), como los TLRs, para despus
fagocitar y procesar a la bacteria. Las DCs viajan al ganglio linftico regional y maduran
durante el trayecto. Una vez ah realizan la presentacin de antgenos micobacterianos
a las clulas T CD8+ y CD4+, en el contexto de molculas del complejo principal de
histocompatibilidad clase I (MHCI) y clase II (MHCII) respectivamente. Las clulas T
CD4+ TH0 interactan mediante su receptor de clulas T (TCR) con pptidos
presentados en MHC II y se diferencian a T cooperadoras 1 (TH1) bajo la influencia de
la IL-12 secretada por las DCs, regresando a los pulmones donde secretan IFN- e IL-2
(Cooper AM, 2008) (Figura 5).

Figura 5. Diferenciacin de los linfocitos TH1. Tras la presentacin antignica por parte de las clulas
dendrticas, los linfocitos TH0 se diferencian a linfocitos TH1 por accin de la IL-12, produciendo a su vez
IFN-. (Boisson-Dupuis,2008)

5

El IFN- se une a su receptor en el macrfago y su sealizacin involucra unas enzimas
denominadas Janus cinasas (Jak) y factores de transcripcin conocidos como
transductores de seales y activadores de la transcripcin (STAT). Las vas de
transmisin de seales Jak/STAT son utilizadas por todos los receptores tipo I (IL-6, IL-
12, IL-23) y tipo II (IFN-/, IFN-) de citocinas . Las enzimas Jak inactivas estn unidas
dbilmente a los dominios citoplsmicos de los receptores de las citoicinas (IFN-, IFN
/, IL-6, IL-10, IL-12). Cuando se asocian dos receptores por interaccin con su
citocina, las molculas Jak se activan por transfosforilacin de sus residuos de tirosina.
Una vez fosforiladas son reconocidas por monmeros de STAT en el citosol las cuales
se fosforilan al asociarse a las protenas Jak. Cuando se fosforilan los dos monmeros
de STAT son capaces de reconocerse a travs de una regin de homologa a la cinasa
2 del sarcoma de Rous (SH2) y formar un dmero que es capaz de migrar al ncleo y
unirse a secuencias de DNA en las regiones promotoras de los genes regulados por
citocinas y activar su transcripcin (Schreiber RD, 1998) (Figura 6). De esta manera
estimula a los macrfagos para que produzcan varias sustancias microbicidas
(intermediarios reactivos del oxgeno, xido ntrico y enzimas lisosmicas). La IL-2
tambin sealiza a travs de Jak/STAT y tiene una actividad autcrina favoreciendo la
proliferacin de las clulas T (Abbas KA, 2004) (Figura 7). Las clulas T CD8+, por su
parte, tambin son reclutadas al sitio de la infeccin donde secretan IFN- y llevan a
cabo su actividad citotxica eliminando a los macrfagos infectados. Esto lo realizan a
travs de su interaccin con el macrfago infectado, el cual le presenta antgenos
micobacterianos cargados en MHC-I. Una vez reconocidos los antgenos, el linfocito
secreta sus grnulos lticos los cuales contienen perforinas, granzimas y granulisinas
(Figura 8), todas ellas capaces de inducir diferentes eventos en el macrfago que lo
lleven a apoptosis (Stenger S, 1998) (dao a la membrana, activacin de caspasas y
nucleasas). La migracin de monocitos y clulas T al sitio de la infeccin culmina con la
formacin de un granuloma, el cual es un rasgo caracterstico de la TB. El granuloma
contiene algunos linfocitos pequeos y una acumulacin compacta de macrfagos que
se diferencian hasta clulas epiteloides o clulas gigantes multinucleadas. La
activacin masiva de macrfagos que ocurre dentro del tubrculo suele ocasionar la
liberacin de cantidades elevadas de enzimas lticas. Estas enzimas destruyen las

6

clulas sanas vecinas, lo que da por resultado regiones circulares de tejido necrtico
que por ltimo se convierten en lesiones de consistencia caseosa (Kindt JT, 2007). Al
cicatrizar, estas lesiones se calcifican y se tornan visibles en las radiografias, en las
que se denominan complejos de Ghon. Es factible suponer que la necrosis elimina los
macrfagos infectados y proporciona un ambiente anxico en el que los bacilos vean
reducida su proliferacin (latencia).

Figura 6. Sealizacin de IFN-. A. Ensamble del complejo de receptores tras la unin al IFN-. B.
Activacin de Jak y formacin de los sitios de acoplamiento de STAT-1.C. Reclutamiento de STAT-1,
activacin y formacin del homodmero. D. Traslocacin al ncleo de STAT-1 y reconocimiento de las
secuencias activadas por gamma (GAS) (Schreiber RD, 1998).

7

 A B C

Figura 7. A. Activacin de una clula TH1 y su correspondiente cooperacin con el macrfago. B. Se observan las
citocinas que participan en la respuesta as como las molculas responsables de la sealizacin: Jak 1 y 2/ STAT1
para el caso del IFN; Jak 1 y 3/STAT5 para IL-2.C. Expansin clonal de los linfocitos antgeno especfico y produccin
de TNF- por el macrfago el cual tiene un efecto autcrino al favorecer la produccin de molculas bactericidas,
adems del efecto sobre otras clulas (Regueiro GJ, 2002)

A B

+
Figura 8. A. Citotoxicidad por parte de los linfocitos T CD8 sobre los macrfagos luego de la interaccin entre su
TCR y el MHC I del macrfago infectado, el cual presenta pptidos micobacterianos. La citotoxicidad puede darse a
+
travs la interaccin Fas-Fas ligando por granzimas y perforina secretada por el CD8 (http:// redalyc.uaemex.mx)
B. Actividad de granzima y perforina sobre el bacilo (Stenger S, 1998).

8

Citocinas y receptores que participa en el control de patgenos intracelulares:
micobacterias y salmonelas

Las micobacterias, al igual que otros patgenos intracelulares, viven y se multiplican

dentro de los macrfagos. Una vez que han sido interiorizados, estos patgenos
intracelulares evaden los mecanismos de las clulas fagocticas, evitando as su
eliminacin. Sin embargo, los macrfagos son capaces de reconocer PAMPS (patrones
moleculares asociados a patgenos) de estos microorganismos y activarse,
consecuentemente tambin activan a los linfocitos T, quienes a su vez cooperan con
stos a travs de mecanismos que incluyen la interaccin clula-clula y la secrecin
de citocinas, lo cual culmina con la eliminacin de los patgenos por parte de los
macrfagos. La comunicacin celular entre la respuesta inmune innata y la adaptativa,
mediada por IFN- e IL12 ha mostrado jugar un papel imprescindible en el control de
las micobacterias y de otras bacterias intracelulares como la salmonela, listeria y otros
patgenos intracelulares (Al-Muhsen SA, 2008).

IFN-

El IFN-, tambin conocido como interfern tipo II, es una citocina pleiotrpica producida
por los linfocitos T y las clulas NK primordialmente. Su papel principal es el de
estimular, en el macrfago, la transcripcin de genes que codifican para las molculas
de MHC-II, para molculas coestimuladoras como CD80, a enzimas que sintetizan
sustancias microbicidas, como el xido ntrico; y las subunidades p40 y p35 de la IL12
(Schreiber RD, 1998). Nairz et al. mostraron en el 2008, que el IFN- no slo participa
en la induccin de los mecanismos para la eliminacin de la Salmonella, sino que
tambin modifica la homeostasis del hierro en los macrfagos, para restringir la
adquisicin de este elemento por parte de la bacteria. Lo anterior es posible debido a
que el IFN- reduce la expresin del receptor 1 de la transferrina (CD71) y aumenta la
expresin de una protena exportadora de hierro, la ferroportina 1.

9

IL-12

La IL-12 es un heterodmero de 70 kDa, formado por las subunidades p35 (35 kDa) y
p40 (40 kDa), la cuales estn unidas por puentes disulfuro. La subunidad p35 tiene un
dominio globular de cuatro hlices alfa, mientras que la subunidad p40 contiene un
dominio de Ig (Figura 9). Esta subunidad se comparte con la IL-23. Esta citocina se
sintetiza en los macrfagos infectados con bacterias intracelulares y virus, as como en
respuesta a componentes microbianos como el LPS. Su papel principal es la activacin
del factor de transcripcin Tbet, el cual favorece la diferenciacin de los linfocitos T a
TH1 y estimula la sntesis de IFN- en estos y en las clulas NK (Trinchieri G, 2003). El
IFN- activa a los macrfagos para que destruyan a los microorganismos fagocitados.
Por consiguiente, la inmunidad contra muchos microorganismos intracelulares est
mediada por citocinas que actan en la siguiente secuencia de eventos:

Figura 9. Estructura de la IL-12. En rojo se muestra la subunidad p35, formada por hlices alfa, mientras
que en la subunidad p40 predomina la estructura de beta plegada y posee un dominio de inmunoglobulina.

10

IL-17/IL-23

La exposicin de DCs a las micobacterias induce en stas la secrecin de IL-12 e IL-

23. Los linfocitos T CD4+ que reconocen pptidos que les son presentados por las DCs
infectadas se diferencian a clulas TH17 si en el microambiente estn presentes IL-6 y
TGF- (Khader SA, ).

La IL-23 tambin es capaz de inducir en los linfocitos TH1 la secrecin de IFN- en

ausencia de la IL-12 p70, como ha sido demostrado en los ratones deficientes de la
subunidad p35. Sin embargo, como la subunidad p40 es compartida por la IL12 y la
IL23, los ratones deficientes del gen que codifique para la subunidad p40 son incapaces
de producir IFN- por esta va. Pero su papel fundamental es el de mantener a la
poblacin de linfocitos TH17 (MacLennan C, 2004)

Otra subpoblacin clulas T asociadas a la respuesta primaria contra tuberculosis son

las clulas TH17. De manera particular, la poblacin de clulas T son una fuente
primaria de produccin de IL-17 en modelos murinos de infeccin con M. tuberculosis.
En uno de estos modelos, en el cual se inocula el bacilo de Calmette-Gurain (BCG)
por va intratraqueal a ratones, el mRNA para IL-17 se detecta apenas un da despus
de la infeccin. En ratones deficientes del gen para IL-17, la induccin de quimiocinas y
la acumulacin temprana de neutrfilos se ve reducida. Lo anterior ha llevado a
proponer la participacin de otros mediadores solubles, diferentes a los que participan
en el eje IL-12/IFN-, abriendo un panorama ms completo sobre el tipo de molculas y
mecanismos involucrados, especficamente, en el control y eliminacin de las
micobacterias y salmonelas (Khader SA, 2008).

Susceptibilidad mendeliana a infecciones micobacterianas (del ingls Mendelian

susceptibility to mycobacterial disease)

La susceptibilidad mendeliana a infecciones por micobacterias (MSMD) es un sndrome

congnito raro que probablemente fue descrito por primera vez en 1951, en nios que
haban sido vacunados con BCG y presentaban una infeccin diseminada. El

11

padecimiento se define como una enfermedad con un cuadro clnico severo con
infeccin diseminada o recurrente por micobacterias ambientales, y en algunos casos
con una co-infeccin severa con Salmonella no typhi. La infeccin con Salmonella, sin
co-infeccin por micobacterias, tambin ha sido reportada (Al-Muhsen SA, 2008).

Debido a que los primeros casos reportados fueron con pacientes que presentaban
infeccin por BCG o con micobacterias ambientales, el padecimiento recibi el nombre
de susceptibilidad mendeliana a infecciones micobacterianas. Sin embargo este
nombre resulta inexacto debido a que se han reportado casos en los cuales no
necesariamente hay una infeccin por micobacterias sino por otro tipo de patgenos
intracelulares (p.ej. Nocardia y Paracoccidioides). De manera que actualmente se ha
propuesto el nombre de defectos innatos del eje IL-12/IFN-.

La causa etiolgica es una mutacin en un gen que codifique para alguna de las
molculas involucradas en el eje IL-12/IFN- (citocinas, sus receptores o molculas
involucradas en la sealizacin de estas citocinas). Hasta la fecha se han descrito
mutaciones en cinco genes autosmicos (IFNGR1, IFNGR2, IL12B, IL12BR1 y STAT-1) y un
gen ligado al cromosoma X (NEMO: modulador esencial de NFB), todos ellos
involucrados en la MSMD. Este sndrome presenta un alto grado de heterogeneidad
allica, siendo los defectos del receptor de IL-12 la causa principal del padecimiento
(40%), seguido por defectos en la subunidad 1 del receptor de IFN (39%). El resto se
reparte en defectos en otras molculas (IFNR2, 4%), (IL12-p40, 9%), (STAT-1, 5%) y
(NEMO, 3%) (Ver Figura 10).

12

 Figura 10. Prevalencia de defectos en molculas del eje IL12/23-IFN. El diagrama de pastel muestra que el
principal porcentaje de defectos reportados para este eje se distribuyen entre la subunidad 1 del receptor de IL-12 y la
subunidad 1 del receptor de IFN-. En menor porcentaje se encuentran defectos en la otras molculas
involucradas (Filipe-Santos O, 2006)

El nmero de mutaciones reportadas hasta la fecha es de 86, las cuales se encuentran

distribuidas de la siguiente manera: 41 en IL12BR1, 30 en IFNGR1, 5 en IFNGR2, 5 en
IL12B, 3 en STAT-1 y 2 en NEMO.

IFN-R1 (IFNGR1)

El receptor de IFN- es un heterodmero formada por las subunidades R1 y R2 (Figura

11). Se expresa en monocitos y clulas dendrticas. El homodmero de IFN- se une a
la subunidad 1 del receptor, la cual a su vez recluta a la subunidad 2, siendo esta
ltima quien sealiza mediante la va Jak/STAT-1 (Figura 17).

13

 Figura 11. Receptor de IFN-. Distribucin de las subunidades 1 y 2 del receptor de IFN-. Se muestran las
Janus cinasas a las cuales se encuentran asociadas.

En 1996, Newport et al. reportaron dos casos de infecciones diseminadas causadas por
M. bovis cepa BCG. El primero se trataba de una nia (hija de padres tunecinos, que
eran primos en primer grado) quien fue vacunada con BCG subcepa Pasteur al mes de
edad. Un mes despus se aislaron micobacterias de los pulmones y de la mdula sea.
Considerando que los casos raros de infeccin con BCG se asociaban a tasas
elevadas de consanguineidad (30%), formas familiares (17%) y la misma distribucin
respecto al sexo, se propuso la existencia de una nueva inmunodeficiencia primaria con
un patrn de herencia autosmico recesivo. Trabajos anteriores haban reportado que
los ratones deficientes del monmero R1, del receptor de IFN-, son altamente
susceptibles a infeccin por BCG. La formacin del granuloma, en estos ratones, es
defectuosa. Por lo tanto, se analizaron cuatro genes, los cuales codifican para el IFN-
, el IFN- R1, el TNF- y el TNF-R1 (estas ltimas debido a la participacin del TNF- en
la formacin del granuloma, ya que en estos pacientes la formacin del granuloma era
defectuosa) en nios con infeccin idioptica fatal por BCG. Los resultados de estos
anlisis demostraron la existencia de una mutacin que consiste en la eliminacin del

14

nucletido 131 (C) en el exn 2 del gen IFN- R1 y que genera la formacin de un codn
prematuro de paro. La mutacin est localizada en la regin que codifica para una
parte del dominio extracelular del receptor (extremo N-
terminal).

Figura 12. Primer mutacin reportada. Eliminacin del nucletido 131 que genera un codn prematuro de
paro (Filipe-Santos O, 2006).

El segundo caso estaba representado por 4 nios provenientes de Malta, los cuales
presentaban una infeccin micobacteriana diseminada atpica. Cada nio estaba
infectado con diferentes especies de micobacterias (M. fortuitum, M. chelonae y dos
cepas de M. avium) lo cual sugera un defecto en la respuesta inmune de los pacientes,
ya que estas micobacterias no son virulentas. Adems, uno de los nios presentaba un
cuadro de salmonelosis. De esta manera se logr detectar una mutacin diferente, que
consiste en una sustitucin en la posicin 395 de A por C. Esta mutacin trae como
consecuencia un codn de paro prematuro en la secuencia del IFN- R1. Esto genera un
receptor que carece de los dominios transmembranal e intracelular requeridos para la
presencia del receptor en membrana y la transduccin de seales respectivamente,
causando la deficiencia completa de la subunidad R1 (Jouanguy E, 1996).

Figura 13. Segunda mutacin reportada. Cambio de la adenina 395 por una citosina que conduce a un
codn prematuro de paro (Filipe-Santos O, 2006).

15

Un ao despus (1997) Casanova et al. describieron una nueva mutacin en el gen
que codifica para el IFN-R1, la cual se detect en dos nios hijos de padres
consanguneos portugueses. El nio fue vacunado con BCG cuando tena un mes de
edad y desarroll rpidamente una infeccin diseminada. Su hermana menor no fue
vacunada con BCG, pero fue diagnosticada con tuberculosis a los tres aos de edad. A
diferencia de los dos casos anteriores, en los cuales no haba receptor en la superficie
celular, se detect la expresin del IFN- R1 en la membrana de las clulas, por
citometra de flujo. En dicho alelo encontraron una nueva mutacin localizada en el
exn tres del gen, la cual se trata de una sustitucin del nucletido de la posicin 260
(T por C), que conduce al cambio del aminocido isoleucina (I) por treonina (T) y esto a
su vez altera la estructura y funcin del receptor. Debido a que la mutacin no afecta la
presencia del receptor en membrana, se denomin deficiencia parcial del IFN-R1. El
receptor con la mutacin I87T poda ser funcional a concentraciones altas de IFN-.

Figura 14. Tercera mutacin reportada. Cambio de la timina 260 por una citosina que genera un cambio
de una isoleucina por una treonina la cual no impide la expresin del receptor en membrana pero si abaten
su funcin (Filipe-Santos O, 2006).

En 1999, el grupo de Jouanguy et al., encontraron una regin de alta mutacin

(hotspot) en la que ocurre la eliminacin de 4 nucletidos a partir del nucletido 818
(818del4). Ellos analizaron dos familias no relacionadas que en tres generaciones
presentaron varios casos de infecciones por BCG y M. avium. El anlisis del receptor
por citometra mostr un incremento en la intensidad media de fluorescencia respecto
al control, aunque estas clulas eran incapaces de responder al estmulo con IFN-. En

16

ambas familias se encontr que todos los individuos eran portadores del alelo 818del4
que se localiza en la regin que codifica para el dominio citoplsmico del receptor y
genera un codn prematuro de paro. En los individuos heterocigotos para el alelo hay
una mayor proporcin de receptores truncados respecto a los receptores completos
(dominancia negativa).

Figura 15. Cuarta mutacin. Prdida de 4 nucletidos a partir del nucletido 818, lo cual genera
receptores sin dominio citoplsmico. ste alelo tiene un efecto dominante negativo sobre el alelo silvestre
(Filipe-Santos O, 2006).

El grupo de Kobayashi et al. report en el 2007 la caracterizaron de una mutacin en

una nia japonesa de 12 aos, quien fue vacunada con BCG a los 4 meses de edad.
La paciente desarroll inflamacin del ganglio linftico regional dos meses despus de
la aplicacin de la vacuna. El diagnstico fue de linfadenitis por BCG. El anlisis
molecular mostr una mutacin, de carcter dominante, en el gen de la subunidad 1 del
receptor de IFN gamma (IFNGR1). La mutacin consiste en la prdida de 4 nucletidos
a partir del nucletido 774 (774del4), generando un codn de paro generando una
protena truncada. Dicha mutacin afecta la porcin citoplsmica del receptor, aunque
no afecta su presencia en la superficie celular.

17

 Figura 16. Quinta mutacin. Prdida de 4 nucletidos a partir del nucletido 774, lo cual genera un codn
de paro prematuro. A expresin del receptor no se ve abatida pero s su funcin (Filipe-Santos O, 2006).

Figura 17. Defecto en IFNGR1. Cualquier defecto en IFNGR1 afecta la respuesta del macrfago al IFN-
incluyendo la produccin de IL-12 (Filipe-Santos O, 2006).

18

IFN-R2 (IFNGR2)

Esta subunidad se expresa constitutivamente en los monocitos y en las clulas

dendrticas, aunque en niveles menores respecto a la subunidad 1. Ambas
subunidades son sintetizadas en el retculo endoplsmico (ER) y modificadas
postraduccionalmente al ser N-glicosiladas en su paso del ER al aparato de Golgi (Ver
Figura 22).

Despus de ser plenamente caracterizadas las mutaciones para IFN- R1, Holland y
Dorman en 1998, describieron un caso de infeccin por micobacterias, pero ahora
relacionado con alteracin de la otra subunidad encargada de la sealizacin de
receptor de IFN-, el IFN-R2.

Esta alteracin gentica apareci en un nio que no fue vacunado con BCG, pero que
a los dos aos de edad desarroll una infeccin diseminada ocasionada por M.
fortuitum y M. avium. La secuencia de DNA correspondiente a la subunidad R2 mostr
una eliminacin de los nucletidos 278 y 279. Esta modificacin provoc un corrimiento
en el marco de lectura, conduciendo a un codn de paro prematuro (TGA) que
corresponde a los nucletidos 282, 283 y 284. La eliminacin y el codn de paro se
localizan en el exn III, el cual comprende la porcin extracelular de la protena. El
resultado por citometra de flujo mostr una distribucin normal para el caso de la
subunidad R1, pero la ausencia total de la subunidad R2.

Figura 18. Primera mutacin. Eliminacin de dos nucletidos a partir del nucletido 278, lo cual genera un
codn de paro prematuro (Filipe-Santos O, 2006).

19

Dos nuevas mutaciones en IFN- R2 fueron descritas por Vogt et al. en 2005. Ambas
conducen a una deficiencia completa y se detectaron en 4 nios no relacionados. El
paciente 1 tena una infeccin con M. avium; el paciente 2 una infeccin por BCG; y los
pacientes 3 y 4 presentaban una infeccin por M. fortuitum. La mutacin encontrada en
el P1 consiste en una eliminacin de los nucletidos 663-689 (663del27) que conduce a
la prdida de los aminocidos 222-230 en la protena, por lo que sta cambia su
conformacin y no se une a la subunidad 1. Los pacientes 2, 3 y 4 eran homocigotos
para una mutacin con sentido equivocado, que genera un cambio de aminocido en la
posicin 503 (503 C por A; cambio de codn ACC por AAC). El cambio de codn
genera un cambio de los aminocidos treonina por asparagina en la posicin 168
(T168N). Este cambio modifica la secuencia de aminocidos, dando lugar a un nuevo
sitio de N-glicosilacin que impide el reclutamiento de la subunidad 2 por la subunidad
1 para la posterior sealizacin.

Figura 19. Segunda mutacin. Cambio de una citosina por una adenina la cual genera un cambio de
treonina por asparagina. Esto crea un nuevo sitio de N-glicosilacin en el receptor, lo que lo hace
disfuncional (Filipe-Santos O, 2006).

20

En otra familia, Dffinger et al. identificaron, en un nio con infeccin diseminada por
BCG, un cambio de C por T en la posicin 340, que genera un cambio de aminocido
en el residuo 114 (R114C). El fenotipo de este defecto no es muy grave, ya que la
protena se expresa en la membrana y aunque la respuesta a IFN- se ve disminuida,
puede restablecerse al incrementar la concentracin del IFN- teraputico.

Figura 20. Tercera mutacin. Cambio de la citosina 340 por una timina, lo cual altera el reclutamiento de
la subunidad 2 por parte de la subunidad 1 y disminuye la respuesta a IFN- (Filipe-Santos O, 2006).

Otra mutacin para este gen fue detectada en el ao 2004 por Rosenzweig et al. la cual
consiste en una eliminacin de una G en la posicin 791 (791delG) y genera un efecto
dominante negativo en las clulas heterocigotas. El caso reportado por este grupo
consista en una nia de 15 meses cuyos padres eran consanguneos y que fue
vacunada a las 3 semanas de nacida con la BCG desarrollando una linfadenitis cervical
con presencia de bacilos cido alcohol resistentes, la cual evolucion a hepatomegalia
y osteomielitis en el fmur derecho. El anlisis funcional mostr ausencia de
fosforilacin de STAT 1 tras la activacin con IFN-, y el anlisis molecular evidenci la
ausencia de 2 guaninas en la posicin 791-792, misma que se localiza en la regin que
codifica para el dominio transmembranal y genera un codn prematuro de paro, el cual
se traduce en una protena anclada a membrana pero sin dominio intracitoplsmico.
Los padres de la paciente eran heterocigotos para el alelo 791delG. In vitro, sus clulas

21

mostraron una reduccin en la fosoforilacin de STAT-1 tras el estmulo con IFN-. Al
analizar la distribucin del IFNGR2 en tales clulas se mostr que exista una mayor
proporcin de receptores truncados respecto a los receptores con dominio
intacitoplsmico, lo que sugiere un efecto dominante negativo por parte de este alelo.

Figura 21. Cuarta mutacin. Eliminacin de dos guaninas, lo cual genera un codn prematuro de paro. El
receptor se expresa en membrana pero no sealiza. Esta mutacin ejerce un efecto dominante negativo
sobre el alelo silvestre (Filipe-Santos O, 2006).

Figura 22. Defectos en IFNGR2. Mutaciones presentes en IFNGR2 impiden la sealizacin y la respuesta
al IFN- (Filipe-Santos O, 2006).

22

IL12 p40

Como se mencion anteriormente la forma madura y funcional de la IL-12 es un

heterodmero formado por la subunidad p40, la cual se comparte con la IL-23, y la
subunidad p35. No obstante, se ha propuesto que la subunidad p40 puede formar un
homodmero con actividad en el control de patgenos intracelulares. En los ltimos 10
aos se han identificado 20 pacientes, con 5 diferentes mutaciones, de las cuales
solamente 4 han sido publicadas (Ver Figura 26). Todas las mutaciones son recesivas
y generan deficiencia completa de IL-12 p40.

El primer caso de un defecto en esta molcula fue descrito en 1998 por parte de Altare
et al. en una nia que fue inmunizada despus de su nacimiento con BCG, quien a los
tres meses desarroll un cuadro de tuberculosis con caractersticas clnicas bien
definidas3. A los 3.5 meses de edad, la nia desarroll tambin un cuadro de
gastroenteritis severa, con diarrea sanguinolenta, ocasionado por Salmonella
enteritidis. Mediante el anlisis molecular de los genes que codifican para las
subunidades p40 y p35 del dmero de lL-12, se encontr una eliminacin de 373
nucletidos (4.4kb) entre las posiciones 482 y 854 (482+82_856-854del). El gen de la
subunidad p40 consiste en siete exones y la eliminacin de 4.4kb abarca los exones
cuatro y cinco. Esta eliminacin da origen a una protena de 184 aminocidos, mientras
que la protena nativa consiste en 328 aminocidos.

Figura 23. Primera mutacin. Eliminacin de 4.4 kb, lo que genera una subunidad p40 ms corta (Filipe-
Santos O, 2006).

23

La segunda se detect en una familia de Arabia Saudita. Se analizaron tres pacientes
no relacionados, los cuales haban sufrido de infeccin diseminada por BCG y dos de
ellos presentaron co-infeccin por salmonela. La mutacin encontrada en estos
pacientes consiste en la insercin de una A en el nucletido 315 (315insA) la cual
genera un codn prematuro de paro (Figura 23). No obstante, se ha encontrado que los
haplotipos 482+82_856-854del y 315insA estn muy conservados. Los estudios
poblacionales han permitido rastrear las mutaciones y encontrar que el primer haplotipo
surgi en el subcontinente Indio hace 700 aos, mientras que el segundo haplotipo se
origin hace 1100 aos en la Pennsula arbiga.

Figura 24. Segunda mutacin. La insercin de adenina despus del nucletido 315 genera un cod
prematuro de paro (Filipe-Santos O, 2006).

Tres pacientes de origen tunecino, los cuales haban sufrido infecciones diseminadas
por M. bovis BCG y por salmonela, presentaron una eliminacin de 8 nucletidos a
partir del nucletido 278 (278del8) la cual produce una protena ms pequea y
disfuncional. En un paciente iran se detect otra eliminacin, solo que ahora de 2
nucletidos, en la posicin 526 (526del2) lo que genera un codn prematuro de paro.

24

 Figura 25. Tercera y cuarta mutaciones. La mutacin 297del 8 genera una protena ms pequea y por lo
tanto disfuncional, mientras que la mutacin 526del2 produce un codn prematuro de paro (Filipe-Santos O,
2006).

Otra relacin interesante es aquella que guarda la aparicin de infecciones

diseminadas por parte de Salmonella y defectos en IL-12 p40, as como en su receptor.
Aproximadamente en ms de la mitad de los casos reportados, se ha presentado una
co-infeccin de micobacterias y Salmonella sugiriendo una participacin relevante de la
IL-12 en el control de estas dos bacterias. No obstante no se ha encontrado la misma
relacin entre la susceptibilidad a la infeccin por Salmonella y los defectos en la va de
sealizacin del IFN- (aproximadamente 6%).

25

 Figura 26. Defectos en IL12B. Mutaciones presentes la subunidad p40 de IL-12 impide la produccin de
IFN- (Filipe-Santos O, 2006).

IL12R1

El receptor de IL-12 est formado por dos subunidades: IL12R1 e IL12R2 y se

expresa en linfocitos T y clulas NK. La subunidad 1 est expresada constitutivamente,
mientras que la subunidad 2 se expresa luego de la activacin. La expresin de ambas
subunidades es crucial para tener una interaccin de alta afinidad con la citocina. El
receptor sealiza a travs de las protenas Janus cinasa 2 (Jak2) y Tyk2 quienes
reclutan y fosforilan a monmeros de la protena STAT 4 (Ver Figura 30). Los
monmeros fosforilados forma un homodmero que se traslada al ncleo y acta como
activador de la transcripcin. El gen IL12RB1 est formado de 17 exones los cuales
codifican para una protena de 662 aminocidos y de un peso aproximado de 100 kDa
(Figura 27).

26

 Figura 27. Receptor de IL12. Subunidades 1 y 2 del receptor de IL-12, las cuales se unen a las subunidades
p35 y p40 respectivamente (Trinchieri G, 2003).

En 1998, Altare et al. describieron la deficiencia del receptor de IL12 y su participacin

en la MSDM4. En ese estudio se investigaron cuatro pacientes no relacionados que
presentaron una infeccin diseminada por BCG y dos de ellos adems presentaron
infecciones por Salmonella no tiphy. Se investigaron mutaciones en las subunidades
del receptor de IL-12 en clulas T encontrando una sustitucin de A por T en la
posicin 913 (Figura 28) del gen que codifica para la subunidad 1 (IL-12R1). Como en
los casos anteriores, los pacientes eran homocigotos para esta mutacin, la cual fue
heredada de manera autosmica recesiva. Sin embargo, los pacientes respondieron de
manera adecuada al tratamiento con IFN-.

27

 Figura 28. Primer mutacin reportada. La sustitucin de una timina por una timina en el nucletido 913
genera un codn prematuro de paro (Filipe-Santos O, 2006).

Hasta la fecha se han reportado 89 casos de pacientes con defectos en IL12RB1 y 62

de ellos han sido publicados. Los defectos en esta molcula resultan ser la causa
etiolgica principal del MSMD. La mayora de las mutaciones reportadas causan
ausencia del receptor en la superficie celular (Figura 29).

Figura 29. Total de mutaciones reportadas para IL12R1. La mutaciones en rojo son aquellas que
generan prdida de la funcin con ausencia de la protena en la membrana celular, mientras que la
mutacin en azul genera prdida de la funcin pero con presencia de la protena en la superficie celular
(Filipe-Santos O, 2006).

La susceptibilidad generada por este padecimiento gentico solo haba sido reportada
en infecciones por micobacterias atpicas o poco virulentas y salmonela, sin embargo,
en 2005, Moraes-Vasconcelos et al. reportaron el caso de un varn de 24 aos, de

28

ascendencia portuguesa, quien fue vacunado al nacer con BCG y fue trasladado al
hospital a los 7 meses debido a que presentaba una adenopata cervical causada por
M. bovis BCG. A la edad de 6 aos sufri una infeccin diseminada por Salmonella
enterica que le ocasion una linfadenitis mltiple, artritis en el lado derecho de la
cadera, y osteomielitis en el leon y fmur del lado derecho. A los 20 aos present
fiebre persistente, dolor abdominal, linfadenopata diseminada y hepatoesplenomegalia.
La biopsia de un ganglio linftico abdominal revel una forma aguda de infeccin por
Paracoccidioides brasiliensis. Una mutacin con sentido equivocado en el gen de la
subunidad 1 del receptor de IL-12 (IL12R1) fue encontrada y consiste en una cambio
de leucina por fenilalanina en el residuo 77. El patrn de herencia es recesivo y no hay
presencia del receptor en la superficie celular.

Al igual que los pacientes con defectos en la subunidad p40 de IL-12, un poco ms de
la mitad de los pacientes diagnosticados con defectos en la subunidad 1 presentaron
infecciones por Salmonella. A pesar de la severidad de los defectos a este nivel, el
pronstico es alentador ya que slo el 17% de los pacientes han fallecido. El resto han
logrado mejorar y sobrevivir hasta la adultez con un largo tratamiento con antibiticos e
IFN- recombinante.

La penetrancia de los defectos en IL12RB1 es de alrededor del 40%. Un estudio en el

2004, realizado por Remus et al. que incluy 101 familias, en las cuales se haba
presentado al menos un caso de tuberculosis pulmonar activa, y 78 individuos sanos,
detect la presencia de 19 mutaciones puntuales, 9 de las cuales ya haban sido
descritas, siendo las otras 10 desconocidas. Dentro de estas mutaciones se detectaron
13 polimorfismos de un solo nucletido (SNPs) los cuales podran ser utilizados como
marcadores de poblacin (el estudio comprendi una poblacin dividida en dos grupos
tnicos: rabes y marroques) en futuros estudios de asociacin de estos polimorfismos
y la susceptibilidad a desarrollar tuberculosis pulmonar.

En un estudio ms reciente (2009), Yancoski et al. rastrearon el haplotipo

1623_1624delinsTT en el gen IL12BR1, mismo que fue detectado en 5 familias
argentinas de ascendencia europea. Al realizar el anlisis se estim que la variante
gentica tena aproximadamente 475 aos de haber sido acarreada. Este tiempo

29

corresponde con el inicio de la colonizacin de Amrica por parte de los espaoles. Lo
anterior permite suponer que algunas variantes genticas en este gen tienen tanto un
componente ancestral como tnico.

Figura 30. Defectos en IL12R1. Las mutaciones en el gen de IL12R1 impiden la produccin de IFN (Filipe-
Santos O, 2006).

STAT-1

El transductor de seal y activador de la transcripcin-1 (STAT1) es crtico para la

activacin de los genes inducidos por IFN- (ver Figura 34). El homodmero de STAT-1
recibe el nombre de GAF (factor activador de gamma) y es en esa forma en la que se
traslada al ncleo para unirse a secuencias reguladoras discretas llamadas GAS
(secuencias activadas por gamma). El gen STAT1 se compone de 25 exones y codifica
para una protena que posee cuatro dominios: el dominio SH2, el cual interacta con la
subunidad 1 del receptor de IFN-; el sitio de unin al DNA (DNA-B), el segmento Tail
(TS) y el dominio transactivador (TA) (Figura 31).

30

 Figura 31. Organizacin de STAT-1. Esquema que muestra cada uno de los segmentos de STAT-1: CC
muestra el coil colied, DNA-B es el sitio de unin al DNA, SH2, es el sitio que interacta con el receptor de
IFN-, TS es el segmento Tail y TA es el dominio transactivador (Dupuis S, 2001).

En 2001, Dupois et al. investigaron alteraciones en la sealizacin de los receptores de

esta va. El caso fue de una mujer francesa de 33 aos de edad que desarroll
infeccin diseminada por BCG en su infancia y continuaba sufriendo infecciones
recurrentes de tipo viral. La sealizacin mediada por IFN y su receptor fueron
evaluadas por lo que se analizaron los niveles de activacin de genes dependientes de
IFN-. Se identific en la secuencia de STAT-1 una sustitucin heterocigota (T por C)
en el nucletido 2116 que se traduca en una sustitucin de serina por leucina en el
residuo de la posicin 706 (L706S) (Figura 32). La disfuncionalidad en STAT 1 estaba
dada por la ausencia de fosforilacin de su residuo de tirosina 701, de manera que no
se puede formar el homodmero y por tanto no se puede trasladar al ncleo para llevar
a cabo su funcin.

Figura 32. Primer mutacin en STAT-1. El cambio de timina por citosina en el nucletido 2116 genera un
cambio de leucina por serina en el segmento tail, lo que impide la formacin del homodmero (Filipe-Santos
O, 2006).

En 2006, Chapgier et al. encontraron dos mutaciones a nivel de STAT 1, caracterizadas

en dos nios no relacionados. La primera de ellas consiste en una sustitucin
nucleotdica en la posicin 958 (G por C) del exn 11 de uno de los nios. Esta

31

mutacin provoca un cambio de cido glutmico por glutamina en la posicin 320
(E320Q). El cido glutmico forma un enlace inico con residuos de histidina y lisina, lo
que forma una estructura de asa que le permite al STAT 1 interactuar con los surcos
del DNA. En el segundo nio se encontr una sustitucin heterocigota en la posicin
1389 (G por T) en el exn 17. El resultado es un cambio de glutamina por histidina en
la posicin 463 (Q463H). La glutamina forma puentes de hidrgeno con las bases
nitrogenadas, mientras que la histidina lo hace con los grupos fosfato al exterior de la
molcula de DNA, evitando la interaccin con las bases (Figura 33).

Figura 33. Mutaciones en STAT-1. A. La segunda y tercera mutaciones generan un cambio de aminocido
en la protena lo cual afecta directamente la interaccin con el DNA (Filipe-Santos O, 2006). B. La mutacin
que genera el cambio Q463H impide la formacin del asa que interacta con los surcos del DNA. El cambio
E329Q impide la interaccin directa con las bases y en cambio lo hace con el esqueleto de fosfatos
(Chapgier A, 2006).

32

 Figura 34. Mutaciones en STAT-1. Los defectos en STAT-1 bloquean la sealizacin de IFN impidiendo la
transcripcin de genes, como por ejemplo, los genes de IL-12 (Filipe-Santos O, 2006).

NEMO

NEMO es un gen que codifica para el modulador esencial del factor nuclear B (NFB).
Formado por 10 exones, este gen se localiza en el cromosoma X. Varias familias de
receptores culminan su sealizacin con la activacin de NFB y NEMO, por lo que
este factor transcripcional participa en los procesos celulares de diferenciacin, de
activacin, de proliferacin y de muerte. NEMO posee la estructura siguiente: motivos
de coil coiled (CC1 y CC2), un dominio de zipper de leucina (LZ) y un motivo de dedos
de zinc (ZF) (Figura 35).

33

 Figura 35. Organizacin de NEMO. Esquema que muestra los dominios de NEMO, CC 1 y 2 muestran los
dominios coil coiled, LZ representa el dominio de zipper de leucina mientras que ZF representa el dominio
de dedos de zinc (Filipe-Santos O, 2002).

Las mutaciones amrficas en NEMO (mutaciones que impiden la funcionalidad del

alelo) resultan ser letales in utero en fetos varones. Las mutaciones hipomrficas (en
estas se reduce, pero no se elimina la expresin del gen o la actividad del producto
gnico) se asocian con el sndrome de displasia ectodrmica anhidrtica con
inmunodeficiencia. Dos mutaciones especficas (E315A y R319Q) han sido descritas en
el dominio de cierre de leucina de NEMO (Figura 36). Estos defectos son la causa ms
infrecuente de MSMD. Las infecciones por micobaterias en pacientes con displasia
ectodrmica anhidrtica ha sido ampliamente documentada. En las clulas de
pacientes con defectos en NEMO se ha observado una produccin pobre de IL-12 e
IFN- tras la estimulacin con PHA y anticuerpos anti-CD3. Los aminocidos E315 y
R319 son estructuralmente similares y forman puentes de sal altamente conservados
dentro del dominio de cierre de leucina de NEMO, sugiriendo que mutaciones en esos
aminocidos pueden perturbar la plasticidad local de la estructura de LZ interfiriendo en
la sealizacin de NFB.

Figura 36. Mutaciones en NEMO. Ambas mutaciones se reportaron en pacientes con infecciones
micobacterianas e displasia ectodrmica anhidrtica(Filipe-Santos O, 2006).

34

Se han descrito siete pacientes en los cuales las infecciones micobacterianas haban
sido identificadas en seis de los pacientes caracterizados, mientras que el paciente
restante presentaba una infeccin diseminada por Haemophilus influenzae b. Esta
infeccin sugiere que las mutaciones en NEMO no deben estar exclusivamente
asociadas a la susceptibilidad a infecciones por micobacterias. No obstante, la
ausencia de otras infecciones en esos pacientes indica una correcta activacin de
NFB por otras vas (TLR, IL-1). La infeccin ms comn es por M. avium, aunque uno
de los pacientes tena una co-infeccin con M. tuberculosis, implicando a NEMO,
adems de IL12RB1 en tuberculosis. Esta observacin resulta interesante debido a la
alta incidencia de tuberculosis en hombres y nios respecto a las mujeres y nias.

35

 JUSTIFICACIN

Debido a reportes clnicos en Mxico de casos con infeccin diseminada por

micobacterias atpicas y a la ausencia de la caracterizacin de posibles mutaciones en
estos pacientes, en el presente trabajo se propone una metodologa de diagnstico
para corroborar o descartar defectos en otros pacientes en los que se sospecha esta
entidad.

HIPTESIS

Los pacientes que presentan infeccin diseminada por micobacterias ambientales y/o
Salmonella, presentan alguna alteracin gentica en las molculas que participan en el
control de dichas infecciones, especficamente en el eje IL12/IL23-IFN.

36

 OBJETIVO GENERAL

Implementar la metodologa que permita detectar las alteraciones en el eje IL12/23-IFN,

que condicionan al desarrollo de la susceptibilidad y persistencia de enfermedades
micobacterianas (MSMD).

OBJETIVOS PARTICULARES

Apoyar el diagnstico clnico de MSMD en pacientes con infecciones por

micobacterias atpicas y/o Salmonella.

Generar los antecedentes experimentales para estudios moleculares posteriores

en los pacientes analizados.

37

 MATERIALES Y MTODOS

Pacientes

Criterios de inclusin: Pacientes peditricos o adultos que padezcan infecciones

recurrentes o severas por micobacterias y/o Salmonella, clnicamente o
bacteriolgicamente, sin que se haya diagnosticado una inmunodeficiencia (Tabla 1).

Criterios de exclusin: Pacientes que presenten infecciones micobacterianas a causa

de una inmunodeficiencia primaria ya diagnosticada, secundaria a la infeccin por virus
de inmunodeficiencia humana o a otras inmunodeficiencias secundarias como por
ejemplo desnutricin. Pacientes con otras infecciones severas y recurrentes.

Tabla 1. Pacientes analizados y diagnstico clnico de cada uno de ellos

Pacientes Diagnstico clnico

1 Meningitis por Salmonella enterica
2 Tuberculosis ganglionar
3 BCGosis
4 Infeccin intestinal por M. bovis
.

Sujetos sanos

Como controles se incluyeron sujetos clnicamente sanos. Tanto para los pacientes
como para los donadores sanos se emplearon cartas de consentimiento informado.

Obtencin de muestras

Se obtuvieron muestras de 14 mL de sangre perifrica de los pacientes y de los

sujetos sanos, utilizando el sistema Vacutainer con tubos heparinizados (Becton
Dickinson, San Jose, CA). Se utilizaron 0.5 mL de las muestras para la cuantificacin
de citocinas por el mtodo de ELISA. Se emplearon 50 L para la determinacin de la
expresin de los receptores de IFN- (CD119) e IL-12 (IL12R1). El resto de la muestra

38

se utiliz para la obtencin de clulas mononucleares mediante un gradiente de Ficoll
(Histopaque, Sigma, Chemical Co.) las cuales se utilizaron para la extraccin del RNA y
para evaluar la funcionalidad de los receptores para IFN- (IFNGR) e IL-12 (IL12R).

Activacin de las clulas de sangre total con BCG y con citocinas recombinantes.

El anlisis de la produccin de IFN- se realiz colocando 0.5 mL de sangre perifrica

del sujeto sano y de los pacientes en una placa de 48 pozos. Cada pozo se incub de
la siguiente manera: Los primeros pozos para el testigo y el paciente nicamente con
medio de cultivo RPMI 1640 (GibcoBRL) suplementado con glutamina al 10% y en
ausencia de SFB; los segundos pozos, para ambos, con una proporcin de 20
BCG/leucocito (diluir 49 L del stock que est a 5x108 BCG/mL en 51 L de PBS estril
y adicionar los 100 L finales a cada pozo); y los siguientes pozos con BCG (MOI de
20/leucocito) ms IL-12 humana recombinante (rhIL-12) (R&D Systems) a una
concentracin final de 20 ng/mL (diluir 4.5 L del stock de rhIL-12, que est a una
concentracin de 5 g/mL, en 50 l de PBS estril y adicionar los 54.5 L a cada pozo)
(Figura 33). Todos los pozos se llevaron a un volumen final de 1 mL con medio RPMI
1640 suplementado con glutamina. La placa se incub a 37C en una atmsfera con
5% de CO2 durante 48 horas. Al cabo de este tiempo se recolect el sobrenadante por
centrifugacin de las muestras y ste se almacen a -70C para su posterior anlisis.

Medio BCG BCG

T
RPMI
rhIL-12
1640 20:1

P Medio BCG BCG

RPMI rhIL-12
1640 20:1


Figura 37. Activacin celular en placas de 48 pozos para la determinacin de IFN-. La fila superior de pozos
corresponde a las muestras del sujeto sano (T), mientras que la fila inferior corresponde al paciente (P).

39

La estimulacin de las muestras para la deteccin de IL-12 se realiz de manera similar
a la descrita anteriormente, con la diferencia de que el estmulo consisti en BCG (MOI
de 20/leucocito) ms IFN- humano recombinante (rhIFN-) (R&D Systems) a una
concentracin de 5000 UI/mL (diluir 1.2 L del stock de rhIFN-, que est a una
concentracin de 5 g/mL, en 50 l de PBS estril y adicionar los 51.2 L a cada pozo)
y las muestras se incubaron durante 48 horas. Posteriormente los sobrenadantes
recolectados se almacenaron a -70C.

Medio BCG BCG

T
RPMI
rh IFN-
1640 20:1

P Medio BCG BCG
RPMI
20:1 rh IFN-
1640


Figura 38. Activacin celular para la determinacin de IL-12. La fila superior de pozos corresponde a las
muestras del sujeto sano (T), mientras que la fila inferior corresponde al paciente (P).

Anlisis de citocinas por ELISA

Los sobrenadantes de las muestras estimuladas se analizaron para cuantificar la

produccin de citocinas (Ver Figura 39).Se utilizaron estuches comerciales para IFN-
(BioLegend), IL-12 p70 e IL-12p40 (R&D Systems), de acuerdo a las instrucciones del
fabricante.

40

 Figura 39. Diagrama para la prueba tamiz. Se muestra la metodologa empleada en el procesamiento de
las muestras para evaluar la produccin de citocinas.

Evaluacin de la expresin de receptores para las citocinas IL-12 e IFN-.

Para evaluar la expresin de los receptores de las citocinas en cuestin se realizaron

dobles tinciones de superficie a partir de clulas de sangre total. Debido a que los
receptores para ambas citocinas se expresan constitutivamente no se requiri
activacin celular previa para esta tincin. Se rotularon tubos para citometra de la
siguiente manera: control de isotipo (1), anti-CD14 (2), anti-CD3 (3), anti-CD119 (4),
anti-CD212 (5), testigo + anti-CD14 + anti-CD119 (6), testigo + anti-CD3 + anti-CD212
(7), paciente + anti-CD14 + anti-CD119 (8) y paciente + anti-CD3 + anti-CD212 (9). Una
vez recolectadas las muestras se procesaron del modo siguiente: a los tubos 1, 2, 3, 4,
5, 6 y 7 se le adicionaron 100 L de sangre total del testigo, mientras que a los tubos 8
y 9 se les agregaron 100L de sangre del paciente. Se realizaron las siguientes
mezclas de anticuerpos comerciales: 10 L de anti-CD14 PE (Becton Dickinson) y
20 L de anti-CD119 (IFNGR) FITC (Serotec); 20 L de anti-IL12R1 (CD212) PE
(Becton Dickinson) y 10 L de anti-CD3 PerCP (Becton Dickinson). A los tubos 6 y 8 se
les agregaron 15 L de la mezcla de anti-CD14 y anti-CD119. A los tubos 7 y 9 se les
agregaron 15 L de la mezcla de anti-CD3 y anti-CD212. Al tubo 1 se le agregaron 5 L
de la mezcla 2aFITC/1PE (Becton Dickinson) como control de isotipo. Al tubo 2 se le
agregaron 5 L de anti-CD14 PE. Al tubo 3 se le agregaron 5 L de anti-CD3 PerCP.

41

Al tubo 4 se le agregaron 10 L de anti-CD119 FITC. Al tubo 4 se le agregaron 10 L
de anti-IL12R1 PE. Luego de 30 minutos de incubacin a temperatura ambiente los
eritrocitos presentes en las muestras fueron lisados con 1 mL de una solucin de lisis
comercial (FACS lysing solution-Becton Dickinson), la cual estaba diluida 1:10.
Finalmente las muestras se lavaron con 3 mL de PBS y se fijaron con 250 L de una
solucin de formaldehido al 4%. Estas clulas se adquirieron en un citmetro de flujo
FACSort (Becton Dickinson) y su anlisis se realiz en el programa Flowjo ,
estableciendo ventanas en las poblaciones CD3+ para definir la poblacin de linfocitos,
o CD14+ para definir la poblacin de monocitos.

Evaluacin de la funcionalidad de los receptores para las citocinas IL-12 e IFN-

Para evaluar la funcionalidad de ambos receptores, las muestras se incubaron con la

citocina humana recombinante correspondiente y posteriormente se midi su efecto
biolgico.

Funcionalidad del receptor de IFN-. Se midi la funcionalidad del receptor de IFN- a

partir de 2x106 PBMCs del testigo y del paciente, las cuales se colocaron en tubos de
polipropileno de la siguiente manera: se etiquetaron los tubos (testigo sin activar,
testigo activado, paciente sin activar y paciente activado) y en cada uno se colocaron
1x106 PBMCs. Posteriormente se aadi 1 mL de medio de cultivo AIM-V y se dejaron
reposar por 2 horas a 37C en una atmsfera con 5% de CO2. Al cabo de este tiempo,
las clulas de cada tubo se colocaron en tubos de poliestireno rotulados (testigo sin
activar, testigo activado, paciente sin activar y paciente activado) y a los tubos
marcados testigo activado y paciente activado se le agregaron 1.2 L de rhIFN
(concentracin final 50 ng/mL) (R&D Systems). Los tubos se incubaron a 37C y en una
atmsfera de 5% de CO2 durante15 minutos. Posteriormente se les aadieron a los
cuatro tubos 100 L de una solucin de formaldehdo al 16% (concentracin final de
formaldehdo en cada tubo: 1.6%) y se agitaron con vrtex dejndose incubar por 10
minutos a temperatura ambiente. Luego los tubos se centrifugaron a 1500 rpm durante

42

5 minutos, a 4C y se descart el sobrenadante. A los cuatro tubos se les agreg 1 mL
de metanol absoluto fro (4C) y los tubos se incubaron a 4C durante 20 minutos. Las
clulas se lavaron con 3 ml de PBS por centrifugacin a 1500 rpm por 5 minutos. Se
descart el sobrenadante y el botn celular de cada tubo se resuspendi en el volumen
restante (aproximadamente 100 l). Se rotularon tubos para citometra del modo
siguiente: control de isotipo (1), anti-CD14 (2), anti-STAT1 (3), testigo activado + anti-
CD14 + anti-STAT1 (4), testigo sin activar + anti-CD14 + anti-STAT1 (5), paciente
activado + anti-CD14 + anti-STAT1 (6) y paciente sin activar + anti-CD14 + anti-STAT1
(7). A los tubos 1 y 2 se le agregaron 50 L de clulas del testigo sin activar. A los
tubos 3 y 4 se les agregaron 50 L de clulas del testigo activado. Al tubo 6 se le
agregaron 50L de clulas del paciente activado y al tubo 7 se la agregaron 50 L de
clulas del paciente sin activar. Se prepar la siguiente mezcla de anticuerpos
comerciales: 20 L de anti-CD14 PE (Becton Dickinson) y 20 L de anti Phospho
STAT1 Alexa 488 (Becton Dickinson). Se colocaron 10 L de esta mezcla a los tubos 4,
5, 6 y 7. Al tubo 1 se le aadieron 5 L de 2aFITC/1PE (Becton Dickinson) como
control de isotipo. Al tubo 2 se le aadieron 5 L de anti-CD14 PE (Becton Dickinson) y
finalmente al tubo 3 se le aadieron 5 L de anti Phospho STAT1 Alexa 488 (Becton
Dickinson). Las muestras se incubaron a temperatura ambiente por 30 minutos en
oscuridad, al cabo de los cuales las clulas se lavaron con 3 mL PBA y se fijaron con
250 L de una solucin de formaldehdo al 4%. La adquisicin y el anlisis se
realizaron como se describi anteriormente (Ver Evaluacin de la expresin de
receptores de las citocinas IL-12 e IFN-).

Funcionalidad del receptor de IL-12. Para evaluar la funcionalidad del receptor de IL-12,
se midi la capacidad de produccin de IFN- en la poblacin de linfocitos despus de
su incubacin con rhIL-12 durante 48 horas. Primero se colocaron aproximadamente
1x106 PBMCs del testigo en 2 tubos de poliestireno rotulados del modo siguiente:
testigo sin activar, testigo activado; y 1x106 PBMCs del paciente en 2 tubos de
poliestireno rotulados del modo siguiente: paciente sin activar y paciente activado. A
cada tubo se les agregaron 1 mL de medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con 10
% de suero fetal bovino y a los tubos marcados como activados se les agregaron 10 L
fitohemaglutinina (PHA) (SIGMA) (concentracin final 10 g/mL) durante 24 horas a

43

37C y 5% de CO2; lo anterior para inducir la expresin de la subunidad 2 del receptor
de IL-12. Al cabo de este tiempo las clulas se lavaron con 3 mL de medio base RPMI
1640 por centrifugacin a 1500 rpm y 5 minutos, y los tubos rotulados como testigo
activado y paciente activado se re-estimularon con 10 ng/mL de rhIL-12 por otras 48
horas. Finalmente de recolectaron los sobrenadantes de los 4 tubos por centrifugacin
a 1500 rpm durante 5 minutos y se analizaron mediante un estuche de ELISA para
cuantificar la concentracin de IFN-.

Extraccin de RNA

Se utilizaron 5x106 PBMCs del paciente previamente activadas con 10 L de PHA

(SIGMA) (concentracin final 10 g/mL) durante 6 horas a 37C y 5% de CO2.
Posteriormente, las clulas se centrifugaron a 2500 rpm por 5 minutos y se descart el
sobrenadante. El botn celular se lis con 1mL de Trizol (Gibco-BRL) y se incub en
hielo por 5 minutos. La extraccin del RNA se realiz adicionando 200 L de una
mezcla de cloroformo-alcohol isoamlico en proporcin 49:1 y agitando por inversin.
Las muestras se incubaron a temperatura ambiente por 3 minutos. Posteriormente se
centrifugaron a 14 000 rpm durante 10 minutos a 4C, recuperando la fase acuosa en
un tubo nuevo y estril. El RNA se precipit con 500 L de isopropanol fro. Las
muestras se incubaron a 4C por 10 minutos y posteriormente se centrifugaron a 14
000 rpm, 10 minutos y 4C. La pastilla de RNA se lav dos veces con 1 mL de etanol
fro al 75% por centrifugacin en las mismas condiciones. Finalmente se dej secar a
temperatura ambiente. El RNA se resuspendi en 15 L de agua inyectable estril.

La determinacin de concentracin y pureza del RNA se realiz determinando la

absorbancia a 260 y 280 nm. El cociente de la absorbancia a 260 entre la absorbancia
a 280 deba ser mayor a 1.8 para considerar puro el RNA.

Sntesis de cDNA

La sntesis del DNA complementario (cDNA) se realiz utilizando 2 g de RNA total

realizando la siguiente mezcla de reaccin en un volumen final de 20 L.

44

 Reactivo Volumen Concentracin final
Oligo (dT) (0.5 g/L) 1L 0.025 g/L
dNTPs (10 mM) 1 L 0.5 g/L
RNA Volumen variable 2 g
Agua inyectable c.b.p. 13 L -

Los tubos de reaccin se corrieron en el termociclador a 65C durante 5 minutos y

posteriormente se enfriaron para permitir el alineamiento del oligo (dT) con el molde.
Luego se adicionaron los siguientes reactivos por tubo:

Reactivo Volumen Concentracin final

Regulador de reaccin 5X 4 L 1X
DTT 0.1 M 2 L 0.01M
Transcriptasa reversa 2 L 200 unidades
(SuperScriptTM) (Invitrogen)

Las muestras se corrieron nuevamente al termociclador a 50C durante 60 minutos

(sntesis de cDNA) Finalmente las muestras se sometieron a un ciclo de 85C por 5
minutos para terminar la reaccin.

Amplificacin de los genes candidatos para secuenciacin.

La seleccin del gen que se secuenci del paciente, se realiz en funcin de los
resultados obtenidos por las pruebas de ELISA, los ensayos funcionales y la expresin
de los receptores en la superficie celular. De modo tal que en este trabajo se
seleccion la subunidad 1 del receptor de IL-12 (IL12RB1) para ser secuenciada.

45

La amplificacin de la regin correspondiente al dominio citoplsmico de IL12RB1 se
llev a partir de muestras de cDNA, para lo cual se emple la siguiente mezcla de
reaccin con un volumen final de 12.5 L:

Reactivo Volumen Concentracin final

Regulador de reaccin 10X 1.25 L 1X
dNTPs 25 mM 0.4 L 0.8mM
Iniciador sentido10 M 1.25 L 1 M
Iniciador antisentido 10 M 1.25 L 1 M
Deep Vent polimerasa 0.5 L 0.2 U/L
(New England Biolabs) 5 U/L
cDNA molde 1 L -
Agua inyectable c.b.p. 12.5 L -

Las condiciones de la reaccin fueron las siguientes:

1 ciclo 95C 5 minutos

35 ciclos 95C 30 segundos

55C 30 segundos

72C 1 minuto por cada 1000 pb

1 ciclo 72C 7 minutos

Para amplificar la regin citoplsmica de IL12RB1 se utilizaron un par de iniciadores

que cubren la secuencia correspondiente a esta regin de la protena (Tabla 2).

46

 Iniciador Sentido Antisentido Tm Tamao
(C) del
producto
esperado
IL-12R1-III CGGCTGGAATGGCAACCTA GAGTCACTCACCCTCTCTG 55 841 pb
Tabla 2. Secuencias de iniciadores. Se muestran las secuencias de los iniciadores empleados
en la amplificacin de la regin correspondiente al dominio citoplsmico IL12R1, as como la
temperatura de alineamiento de los mismos (Tm) y el peso molecular del producto esperado.

Electroforesis de los productos de la PCR en geles de agarosa.

El producto de PCR se preparar con regulador de carga para DNA y se utilizaron 10

L de cada muestra para realizar la electroforesis en geles de agarosa al 1%
preparados en TAE 1X (Tris-cido actico-EDTA) conteniendo de 0.1 a 0.5 g/mL de
bromuro de etidio. La electroforesis se realiz a 100 voltios durante 30 minutos, para
finalmente visualizar el amplificado en un transiluminador de luz ultravioleta (Kodak). El
tamao del amplificado obtenido se determin por medio del uso de marcadores de
tamao de DNA de 1 kb (Fermentas).

Purificacin de productos de la PCR a partir de gel

Los productos de PCR amplificados se purificaron a partir del gel de electroforesis

utilizando el kit QIAquik Spin de la siguiente manera:

Se escindi el fragmento de DNA del gel de agarosa con ayuda de un escalpelo.

Posteriormente, se pes dicho fragmento y se coloc en un tubo eppendorf de 1.5 mL y
se adicionaron 3 volmenes de regulador QG por cada volumen de gel. El tubo se
incub a 50C por 10 minutos hasta que la agarosa quede completamente disuelta.
Posterior a la completa disolucin de la agarosa, se agreg un volumen de 1 mL de
isopropanol y el contenido de la mezcla se colect en una columna de 2 mL y se
centrifug por 1 minuto a 13 000 rpm. Se descart el sobrenadante y se adicionaron
750 L de Buffer PE a la columna. Se centrifug en las mismas condiciones anteriores.
La columna se coloc en un tubo eppendorf de 1.5 mL y se para eluir se utilizaron 50
L de Buffer EB o agua y se centrifug el tubo por 1 minuto a 13000 rpm.

47

Clonacin del producto de la PCR

Para clonar los productos de la PCR se utiliz el plsmido pJET1.2/blunt (Fermentas)

como vector de clonacin (Figura 40).

Figura 40. Mapa del vector pJET1.2/blunt. La figura muestra la secuencia de los genes que forman al
vector. El gen eco47IR codifica para una enzima letal, adems de que en medio de su secuencia est el
R
sitio de clonacin. bla (Ap ) es el gen de la -lactamasa, la cual confiere resistencia a ampicilina. rep (pMB1) es el
replicn que permite la replicacin del plsmido. PlacUV5 es el promotor para la expresin de eco47IR y
permitir la seleccin positiva.

El procedimiento se realiz de acuerdo al protocolo descrito para el kit de clonacin

CloneJETTM PCR Cloning kit (Fermentas) en las siguientes condiciones:

Solucin reguladora de reaccin 2X 10 L

Producto de la PCR 2 L

Plsmido pJET1.2/blunt 0.5 L

48

 DNA Ligasa T4 1 L

Agua libre de nucleasas c.b.p. 20 L

La mezcla se agit en un vrtex y se incub a temperatura ambiente por 10 minutos.

Transformacin de los productos de ligacin en Escherichia coli DH5

Los productos de ligacin obtenidos se utilizaron para transformar bacterias

competentes. La transformacin se realiz utilizando 5 L de la mezcla de ligacin con
200 L de una suspensin de bacterias competentes (proporcionadas en el kit),
incubndolas en hielo, seguido de un choque trmico a 42C por dos minutos y
nuevamente en hielo por un minuto ms. Las bacterias transformadas se cultivaron por
una hora en 1 mL de medio Luria-Bertani (LB) a 37C en agitacin, para finalmente
centrifugarlas a 1000xg por 5 minutos y resembrar por espatulado el botn bacteriano
en una placa de agar LB con una concentracin de 150 g/mL de ampicilina (SIGMA).

Las placas se incubaron a 37C toda la noche y posteriormente se realiz la seleccin

de colonias positivas para el producto de la PCR clonado.

Seleccin de colonias positivas por PCR

Para esto se seleccionaron 10 colonias de la placa de agar, las cuales se resembraron

en una placa de agar LB con ampicilina y al mismo tiempo se resuspendieron en 6 L
de agua inyectable con el fin de montar una reaccin de PCR utilizando los iniciadores
que reconocen la regin que codifica para el dominio citoplsmico de IL12R1 (ver Tabla
2). La reaccin se realiz bajo las siguientes condiciones:

Reactivo Volumen Concentracin

Regulador de reaccin 10X 1.25 L 1X
dNTPs 25 mM 0.4 L 0.8mM
Iniciador sentido10 M 1.25 L 1 M
Iniciador antisentido 10 M 1.25 L 1 M
Deep Vent polimerasa 0.5 L 0.2 U/L
(New England Biolabs)
5 U/L
Suspensin bacteriana 6 L -
Agua inyectable c.b.p. 12.5 L -

49

Las condiciones de reaccin fueron las siguientes:

95C por 3 min; 94C por 30 segundos; 60C por 30 segundos; 72, 1 min/kb; 25 ciclos.

Purificacin del plsmido

Una vez seleccionadas las colonias positivas para el inserto, se crecieron en 10 mL de

medio LB con ampicilina por 24 horas a 37C. Posteriormente se purificaron utilizando
el protocolo de QIAGEN Plasmid Purification de la siguiente manera:

Los tubos se centrifugaron a 2500 rpm por 5 minutos, se descart el sobrenadante y el

botn bacteriano se transfiri a un tubo para microcentrfuga de 1.5 mL. Se adicionaron
300 L de regulador P1 con RNAsa, 300 L de regulador P2 y se agit por inversin 6
veces y para dejar reposar el tubo a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se
adicionaron 300 L de regulador P3 y se agit vigorosamente por inversin 6 veces
para dejar reposar 5 minutos en hielo. Pasado el tiempo, los tubos se centrifugaron a
13000 rpm por 10 minutos. Se recolect el sobrenadante y se coloc en una columna,
dejndola reposar 1 minuto. El DNA se precipit con 250 L de isopropanol. Se
centrifugaron los tubos a 13000 rpm por 10 minutos y se lav el sobrenadante con 220
L de regulador QC. Al final se eluy el DNA con 50 L de agua libre de DNAsas.

Secuenciacin y anlisis

La secuenciacin se realiz a partir de los vectores purificados y empleando los

iniciadores pJET 1.2 sentido y antisentido. La secueciacin se realiz en la unidad de
secuenciacin del Instituto de Fisiologa Celular, UNAM en un secuenciador
automatizado (ABI PRISM 310 Genetic analyzer, Perkin-Elmer Applied Biosystems,
Foster City CA). Los resultados de la secuencia se analizaron empleando el programa
Vector NTI (Invitrogen) y comparando las secuencias obtenidas con las secuencias
reportadas en el GenBank.

50

RESULTADOS

Pacientes

Se analizaron un total de 4 pacientes a los cuales se les descart previamente el

diagnstico de enfermedad granulomatosa crnica, por la prueba de reduccin de
nitroazul de tetrazolio (NBT). A continuacin se describe la historia clnica de cada
paciente as como los resultados obtenidos para cada uno de ellos.

Paciente 1

Varn de 5 meses de edad cuyos padres son consanguneos. No hay antecedentes

de hospitalizaciones previas, ni de muertes tempranas en la familia u otros
antecedentes heredofamiliares de importancia. Recibi la vacuna BCG a los 5 meses
de edad y tres das despus de sto present fiebre de 39.5 C y crisis convulsivas
tnico clnicas generalizadas en dos ocasiones y con una duracin de 30 minutos. Se
solicit anlisis de lquido cefalorraqudeo el cual se report turbio y con presencia de
bacilos Gram negativos, los cuales se identificaron posteriormente como Salmonella
enterica del grupo D.

Resultados de la activacin de clulas de sangre perifrica con BCG y citocinas

recombinantes

Produccin de IFN-
Las clulas del paciente 1 mostraron una aparente disminucin en la produccin de
IFN- respecto al control luego de ser estimuladas con BCG + IL-12 (Figura 41). Para
corroborar este resultado se realiz un experimento en el cual se utilizaron 1x106 de
PBMCs, las cuales se estimularon con 100 ng/ mL de rhIL-12. La aparente disminucin
en la produccin de IFN- en el paciente se mantuvo cuando se estimularon sus clulas
mononucleares (Figura 42).

51



Figura 41. Produccin de IFN- en sangre total. Se cuantific la produccin de IFN- en clulas de sangre
perifrica de un testigo sano (C) y del paciente (P1) tras ser incubadas con medio, BCG y BCG + IL-12

6
Figura 42. Produccin de IFN- en PBMCs. Se estimularon 1 x 10 clulas mononucleares de sangre
perifrica de un donador sano (C) y del paciente (P1) con 100 ng/mL de IL-12 recombinante.

52

 Produccin de IL-12 p40

La produccin de IL-12 p40 mostr ser normal en el paciente (Figura 43). El mismo
resultado se observ cuando se estimularon 1 x 106 PBMCs del paciente con
1000 IU/mL de rh IFN- (Figura 44). Lo anterior permite descartar un defecto tanto a
nivel del receptor de IFN- y su sealizacin, como en IL-12 p40.

Figura 43. Produccin de IL-12 p40 en clulas de sangre total. Se cuantific la produccin de IL-12 p40
en clulas de un donador sano (C) y del paciente (P1) luego de incubarse con medio, BCG y BCG + IFN-.

Figura 44. Produccin de IL-12 p40 en PBMCs. La produccin de IL-12 p40 del paciente (P1) muestra
6
ser similar a la del donador sano (C) luego de estimular 1 x 10 de PBMCs con 1000 IU/mL de rh IFN-.

53

Anlisis de la expresin de receptores en la superficie celular.

Luego de los resultados obtenidos a partir de sangre total, se analiz por Citometra de
Flujo la expresin superficial de los receptores para IFN- e IL-12. La expresin para
ambos receptores mostr ser la misma tanto en el donador sano como en el paciente
(Figura 45). No obstante no se descart una posible alteracin en el dominio
citoplsmico de la subunidad 1 del receptor de IL-12, la cual pudiera ser la causa de la
aparente disminucin en la produccin de IFN- en las clulas del paciente luego del
estmulo con rhIL-12.

Figura 45. Expresin de receptores en membrana. El receptor de IFN- (CD119) y la cadena 1 del receptor de IL-12
(IL12R1) se expresan en las clulas del paciente en la misma proporcin que en las clulas del donador sano,
descartando un posible defecto por disminucin en la expresin pero no un defecto funcional.

Amplificacin y secuenciacin del dominio citoplsmico de IL12R1

Para descartar un defecto a nivel de la sealizacin del receptor de IL-12 se secuenci

la regin correspondiente al dominio citoplsmico de IL-12R1 (Figura 46), la cual se

54

encarga de reclutar a STAT 4 e iniciar la cascada de sealizacin que genera la
produccin de IFN-.

IL12RB1-III

Figura 46. Esquema que muestra la secuencia de cDNA del gen IL12R1. En la parte inferior se
presenta el par de oligos utilizados para amplificar la secuencia correspondiente al dominio citoplsmico del
gen. El peso molecular esperado para dicho producto es de 841 pb.

La amplificacin y posterior electroforesis descartaron alguna mutacin a nivel de

prdida o insercin de grandes fragmentos de material gentico, debido a que no hubo
variacin en el peso molecular al compararlo con un testigo sano (Figura 47), lo cual
nos indic que de existir un defecto, ste sera una mutacin puntual.

841 pb

Figura 47. Amplificacin de la secuencia correspondiente al dominio citoplsmico de IL12R1.

Electroforesis en un gel de agarosa al 0.8% de los productos amplificados a partir de un testigo sano y del
paciente1. En el primer carril se muestra el marcador de pero molecular de 1 kb. En el segundo carril el
amplificado del testigo sano y en el tercer carril el amplificado correspondiente al paciente. Como se
observa no hay variacin en el peso molecular del amplificado del paciente y ambos corresponden al
tamao esperado (841 pb).

55

Posteriormente se clon dicho fragmento en bacterias E. coli para su posterior
secuenciacin. Las colonias que crecieron en agar LB con ampicilina fueron picadas y
se realiz con ellas una PCR de colonia (Figura 48) para seleccionar aquellas que
tuvieran el inserto de inters.

Figura 48. PCR de colonia. Se prepar un gel de agarosa al 1 % para la electroforesis de la PCR de
colonia. En el primer carril se observa el marcador de peso molecular de 1 kb; en el segundo y tercer carril
el amplificado de inters correspondiente a dos colonias picadas.

56

Una vez que se seleccionaron las colonias positivas para el inserto, se aisl y purific el
plsmido (ver Materiales y Mtodos) y se digirieron aproximadamente 10 L de ste
para liberar el inserto (Figura 49) y comprobar que realmente se est secuenciando el
producto de inters.

Figura 49. Digestin del plsmido purificado a partir de bacterias. Se prepar un gel de agarosa al 1 %
para la electroforesis de la digestin del plsmido. En el primer carril se observa el marcador de peso
molecular de 1 kb, mientras que en el segundo carril se coloc el producto de la digestin. La primera
banda, a arriba hacia abajo, corresponde a plmido parcialmente digerido, la segunda a plsmido digerido y
la tercera, como indica la flecha, al inserto de inters.

57

Las clonas positivas para la PCR y para la liberacin de inserto se enviaron a
secuenciar. La secuencia correspondiente al dominio citoplsmico de la subunidad 1
del receptor de IL-12 no mostr alteracin alguna (Figura 50) al ser comparada con la
secuencia consenso reportada en la base de datos del GenBank.

Figura 50. Secuencia de la regin citoplsmica de IL12R1. La secuencia del paciente (IL12RB1-3)
muestra tener 100% de identidad con la secuencia consenso (F). Lo que descarta cualquier posible
mutacin que afecte el reclutamiento de STAT-4 para la posterior sealizacin de IL-12.

Conclusin del paciente 1

Los resultados del paciente 1 muestran que no existe defecto en el receptor de

IL-12R1.

58

Paciente 2

Nia de 4 aos de edad cuyos padres no son consanguneos. No hay antecedentes de

hospitalizaciones previas, as como de muertes tempranas en la familia u otros
antecedentes heredofamiliares de importancia. No recibi la vacuna BCG. Inici su
padecimiento en el 2008, presentando inflamacin en el ganglio axilar derecho. Se
realiz aislamiento a partir de la lesin y se identific una micobacteria perteneciente al
complejo tuberculosis, sin identificar la especie. Luego del tratamiento con antifmicos
mostr mejora y curacin de la lesin. Sin embargo, en Julio del 2009 apareci
nuevamente la lesin axilar y se someti al protocolo para buscar defectos en el eje
IL12/23-IFN.

Resultados de la activacin de clulas de sangre perifrica con BCG y citocinas

recombinantes

Produccin de IFN-
La produccin de IFN- muestra ser normal en la paciente 2, inclusive es ligeramente
mayor que en el testigo sano (Figura 51), lo cual descarta la posibilidad de defectos en
el receptor de IL-12.

Figura 51. Produccin de IFN- en clulas de sangre total. Las clulas del paciente (P) muestran una
produccin normal de IFN- respecto a las de un donador sano (T) al ser estimuladas con BCG. sta
resulta ser superior a la del donador sano cuando se aade IL-12.

59

 Produccin de IL-12 p40

El incremento en la produccin de IL-12 p40 en la paciente muestra que no existe

defecto alguno en el receptor de IFN- ni en su sealizacin, ya que se observa el
efecto sinrgico en la respuesta luego de la adicin de IFN- (Figura 52), respecto a la
produccin cuando se estimula con BCG. La diferencia respecto al donador sano no
puede considerarse significativa ya que debe tenerse en cuenta la variacin entre
individuos y que la reduccin es tan solo de 200 pg/mL.

Figura 52. Produccin de IL-12p40. La produccin de IL-12 p40 muestra ser normal en la paciente (P) al
comparar el estmulo con BCG y el de BCG+IFN-. No hay una diferencia considerable respecto al donador
sano (T)

60

Anlisis de la expresin de receptores en la superficie celular.

Para completar los resultados obtenidos a partir de sangre total y tener as el perfil
completo de la paciente, se analiz por citometra de flujo la expresin superficial de los
receptores para IFN- e IL-12. La expresin para ambos receptores mostr ser la misma
tanto en el donador sano como en el paciente (Figura 53).

Figura 53. Expresin de CD119 e IL12R1. La expresin de los receptores de IFN- (CD119) y de IL-
12R1 muestra ser normal en el paciente, luego de compararse con un individuo sano.

Conclusin de la paciente 2.

La produccin normal de citocinas bajo estmulos especficos, as como la misma

expresin de los receptores en la superficie de las clulas del paciente respecto al
control permiten descartar un defecto en el eje IL-12/23-IFN gamma.

61

Paciente 3.

Varn de 4 aos de edad cuyos padres no son consanguneos. Niegan antecedentes

de muertes prematuras en la familia. Le aplican la vacuna BCG al nacer y tres meses
despus inicia su padecimiento presentando un incremento en el ganglio axilar.
Posterior a esto inicia tratamiento con isoniazida sin mostrar mejora. Las lesiones
avanzan a nivel del cuello presentando lesiones papulares eritematosas que se
extienden tambin hacia la parte superior del trax. El tratamiento fue cambiado por
Imukin, prednisolona y etambutol. Posterior a esto mostr mejora ya que disminuy la
lesin del brazo aunque el ganglio axilar permanece igual. Las lesiones en cuello y
trax desaparecieron. Se descart enfermedad granulomatosa crnica por reduccin
de nitro azul de tetrazolio (NBT) y por la tcnica de reduccin de citocromo C; ambas
pruebas fueron normales para el paciente. Deja el tratamiento con Imukin por 1 mes y
recae, por lo que es seleccionado para participar en este estudio.

Resultados de la activacin de clulas de sangre perifrica con BCG y citocinas

recombinantes

Produccin de IL-12 p70

Debido a que la cantidad de muestra obtenida en la primera sangra no fue suficiente

para realizar el anlisis tanto de IFN- como de IL-12, nicamente se realizaron las
pruebas para la cuantificacin de IL-12 p70 y p40. Los resultados obtenidos son muy
interesantes, ya que hay abatimiento total en la produccin de IL-12 p70 en el paciente
(Figura 54), luego del estmulo con rh IFN-. Mientras que la produccin de IL-12 p40,
aunque est disminuida en comparacin con el donador sano (Figura 55), est
presente y en las clulas del paciente se observa el incremento de p40 al aadir rh IFN-
respecto al estmulo nico con BCG (Figura 56).

62

 Figura 54. Produccin de IL-12 p70. Luego de incubar las clulas del paciente (P) con rh IFN-, la
produccin de Il-12 p70 se encuentra abolida. El estmulo con BCG no es suficiente para activar la
trascripcin del gen de la subunidad p35 de IL-12 por lo que no se observa produccin de sta ni en el
donador sano (T).

63

 Figura 55. Produccin de IL-12 p40. La concentracin de IL-12 p40 producida por las clulas del paciente
(P) se encuentra disminuida respecto a la produccin del donador sano (T).

Figura 56. Produccin de IL-12 p40 en clulas del paciente. La concentracin de IL-12 p40 en las
clulas del paciente s (P) e incrementa tras la adicin de rh IFN-.

64

Anlisis de la expresin de receptores en la superficie celular.

Se realiz el anlisis de la expresin de los receptores de IFN- e IL-12 en la superficie de

las clulas del paciente. La expresin result ser normal al ser comparada con la de un
donador sano (Figura 57), descartando un posible defecto por ausencia del receptor.
No obstante faltaba evaluar la funcionalidad del receptor de IFN-

Figura 57. Expresin de receptores en la superficie celular. La expresin del receptor de IFN- (CD119)
y de la cadena 1 del receptor de IL-12 muestra ser la misma en el paciente que en el donador sano.

Ensayo Funcional del receptor de IFN-

Para evaluar la funcionalidad del receptor de IFN- que impidieran el reconocimiento del
ligando el inicio de la sealizacin; se realiz una tincin para STAT-1, el cual luego
de la unin al IFN- es reclutado por el receptor para ser fosforilado por la cinasa JAK en la
tirosina 701 y formar el homodmero que se trasloca al ncleo y activa la transcripcin de
algunos genes. La tincin muestra la misma expresin de STAT-1 fosforilado en el
paciente que en el donador sano (Figura 58), descartando alguna alteracin en el
receptor de IFN-.

65

 Figura 58. Expresin de STAT-1 fosforilado. La expresin de STAT-1 en las clulas del paciente result
ser la misma que en el donador sano tras el estmulo con rh IFN-, lo que elimina la posibilidad de un
defecto en el receptor de IFN-.

Ensayo funcional de STAT-1

La falta de expresin de IL-12 p70 poda deberse a una falla en la activacin de la

transcripcin de genes regulados por IFN-, entre ellos la subunidad p35 de IL-12. Por tanto
se evalu la actividad de STAT-1 por citometra de flujo al realizar una tincin para
HLA-DR (Figura 59), molcula que incrementa su expresin en la superficie celular tras
la activacin con IFN-. El incremento registrado para el paciente fue el mismo que
para el donador sano, lo que permiti descartar un defecto en la funcionalidad de
STAT-1 y por tanto en la sealizacin del receptor de IFN-.

66

 Figura 59. Expresin de HLA-DR en la superficie celular. Luego de estimular clulas del paciente y del
donador sano con rh IFN- se midi el incremento en la expresin de HLA-DR, el cual fue igual para
ambos.

Conclusin del paciente 3.

Los resultados permiten descartar un defecto a nivel del receptor de IFN-, as como
de su sealizacin. Tambin se elimin la posibilidad de un defecto a nivel de la
subunidad p40 de IL-12. No obstante debe explorarse la posibilidad de un defecto a
nivel de la subunidad p35 de IL-12, debido a que si no se detecta la forma madura de
esta citocina y se descart cualquier posible defecto en la va que activa su produccin,
debe evaluarse la ausencia o presencia de la otra subunidad.

67

Paciente 4

Varn de 3 aos hijo de padres no consanguneos. Tiene dos hermanos de 7 y 5 aos

aparentemente sanos y sin antecedentes de infecciones persistentes. Recibi vacuna
BCG. Inicia su padecimiento en julio del 2009 con dolor abdominal generalizado e
intenso que cede de manera intermitente sin tratamiento. Dos meses posteriores se
aade fiebre vespertina y nocturna, adems de presentar tumoracin cervical blanda
del lado izquierdo. Se detectan mltiples granulomas en la cavidad peritoneal. En el
tumor del cuello hay drenaje caseoso. Cultivo positivo para Mycobacterium bovis. Se
descart Enfermedad granulomatosa crnica. Ante sospecha de un defecto en el eje
IL12/23-IFN se incluye en el presente trabajo.

Resultados de la activacin de clulas de sangre perifrica con BCG y citocinas

recombinantes

Produccin de IL-12 p70

Se inici el anlisis de la muestra de este paciente con la medicin de la produccin de
IL-12 p70 tras la activacin con rh IFN-, y el resultado obtenido muestra ausencia de la
produccin de sta citocina en el paciente (Figura 60).

Figura 60. Produccin de IL-12 p70. La nula produccin de IL-12 p70 en clulas del paciente (P) respecto
a las clulas del donador sano (T) tras la estimulacin con rh IFN- sugiere un probable defecto en el
receptor de IFN- o en su sealizacin.

68

Anlisis de la expresin de receptores en la superficie celular.

Para descartar que el defecto en la produccin de IL-12 p70 se debiera a ausencia del
receptor de IFN- se analiz la expresin de ste por citometra de flujo (Figura 61). La
distribucin en el paciente mostr ser la misma que en el donador sano, lo que permite
descartar un defecto en cuanto a la expresin del receptor en membrana. Tambin se
evalu la expresin de la subunidad 1 del receptor de IL-12, la cual fue normal.

Figura 61. Expresin de los receptores de IFN- e IL-12. La expresin de ambos receptores en las
clulas del paciente muestra ser la misma que en donador sano, mostrando que no existe en ste ningn
defecto que altere su expresin superficial.

69

Ensayo para evaluar la funcionalidad del receptor de IFN-

Para descartar un defecto funcional del receptor de IFN-, se estimularon PBMCs del
paciente y de un donador sano con rh IFN- y se realiz una tincin para Citometra de
STAT-1 fosforilado. El resultado fue el mismo para el paciente y para el donador sano
(Figura 62), mostrando que no existe un defecto en el receptor de IFN- que altere la
unin al IFN-, y el consecuente reclutamiento de STAT-1.

Figura 62. Expresin de STAT-1 fosforilado. Luego de estimular PBMCs del paciente y de un donador sano con
rh IFN la tincin de STAT-1 fosforilado muestra el mismo desplazamiento para ambos, lo que permite descartar un
defecto a nivel del receptor de IFN-.

Anlisis faltantes en el Paciente 4.

A pesar de que se ha demostrado que no existe un defecto a nivel del receptor de

IFN-, an resta descartar un defecto a nivel de la sealizacin de ste (STAT-1), as
como descartar un defecto a nivel de la subunidad p40 de IL-12, cualquiera de los dos
como probables responsable de la ausencia de IL-12 p70 en las clulas del paciente. A
lo anterior se le dar seguimiento en cuanto se cuente nuevamente con muestra del
paciente, quin tiene programada consulta en el Instituto Nacional de Pediatra para el
mes de septiembre del presente ao.
70

DISCUSIN

La tuberculosis tiene un impacto mundial importante, y el trabajo de diferentes grupos

por encontrar una vacuna efectiva an continua. A pesar del papel protector que se le
ha dado a la vacuna BCG para evitar casos de tuberculosis miliar, en los aos
recientes grupos como el de Cooper et al. (Cooper AM, 2008) Kaufmann et al.
(Kaufmann SHE, 2002) y el de Flynn et al. (Flynn JL, 2001) por mencionar algunos, han
replanteado el papel protector de la vacuna BCG. Grupos como los de Casanova et al
(Casanova JL, 2002). Ottenhoff et al.(Van de Vosse E, 2010) y Holland et al. (Dorman
SE, 1998) han contribuido enormemente a la documentacin de casos en los cuales la
inoculacin con BCG genera infecciones diseminadas en nios que presentan
mutaciones que afectan a los principales mecanismos de control contra patgenos
intracelulares. Si bien su contribucin ha sido importante por la generacin de
respuestas en aquellos pacientes donde ningn tratamiento haba dado resultados, su
contribucin tambin se extiende hacia la generacin de preguntas acerca de qu
mecanismos diferentes a los descritos convencionalmente participan en el control de
los microorganismos intracelulares. Por tanto la descripcin y diseccin de la relacin
hospedero-patgeno a penas inicia su largo camino, permitiendo generar nuevas lneas
de investigacin y desarrollo cientfico. En un pas como Mxico, donde el pobre
conocimiento por parte de los mdicos de primer contacto en zonas rurales y en
algunas zonas urbanas para tratar a pacientes como los descritos en este trabajo, los
cuales generalmente mueren a edades tempranas, as como la falta de un centro de
concentracin donde se revisen todos estos casos, han impedido dar un diagnstico y
un tratamiento adecuados a los pacientes que probablemente sufren de este tipo de
afeccin. En conjunto con el recientemente inaugurado Centro de diagnstico y
referencia Jeffey-Modell del Instituto Nacional de Pediatra de la Secretara de Salud, el
objetivo del presente trabajo es contribuir metodolgicamente a la bsqueda y
descripcin de defectos genticos que predispongan a algunos pacientes a sufrir
infecciones diseminadas, ya sea por la aplicacin de la vacuna BCG o por
micobacterias y salmonelas ambientales. A continuacin se abordar el anlisis
individual de los pacientes, no sin antes recordar que forman parte de un estudio
descriptivo.

71

Paciente 1.

Los resultados en el Paciente 1 son contundentes y muestran que no existe un defecto

en el eje IL-12/23-IFN, por lo que se desconoce la causa por la cual el paciente sufri
la infeccin en meninge por Salmonella enterica. Si bien la historia clnica, as como la
consanguinidad de sus padres y el resultado de la aparentemente disminuida
produccin de IFN- pareca apuntar a un defecto parcial en el receptor de IL-12,
tambin es cierto que dicha disminucin no es considerable y se podra apelar a la
variacin entre individuos como la explicacin ms viable. Lo anterior considerando los
resultados que se han observado en los otros pacientes, donde tambin existen
diferencias, las cuales no necesariamente implican un defecto funcional de cualquiera
de los receptores involucrados. Por otro lado la literatura reporta que para que una
diferencia en la produccin de estas citocinas sea considerable, tal diferencia debe ser
de al menos 1 logaritmo (comunicacin personal con la Dra. Jacinta Bustamante),
situacin que no se presenta en este paciente. Esto es consistente con el resto de los
experimentos: No hay disminucin en la expresin superficial del receptor de IL-12 y la
secuencia de la regin citoplsmica descarta un defecto a nivel del inicio de la
sealizacin. Tambin se deben ampliar los resultados en donadores sanos para tener
conocimiento del intervalo de variacin en cual podran moverse los diferentes
pacientes que continuemos estudiando y cundo estos podran estar fuera de dicho
intervalo.

Paciente 2.

El caso de la paciente 2 permiti descartar rpidamente cualquier posible alteracin del

eje, porque los resultados de produccin de IFN- son inclusive superiores a los del
donador sano (nuevamente variacin entre individuos), mientras que la produccin de
IL-12 es similar a la del donador sano. El anlisis se complet con la evaluacin de la
expresin de receptores y el resultado esperado se corrobor. Seguramente existe
alguna otra explicacin del por qu reincidi en la tuberculosis ganglionar, sin embargo
con esta metodologa excluimos la participacin del eje en dicha etiologa.

72

Paciente 3.

Este caso resulta ser muy interesante ya que el resultado de sangre total muestra lo
que la literatura reporta como un claro defecto en el eje, ya que la produccin de IL-12
est abolida. Si bien la produccin de una de las subunidades (p40) est presente, no
se considera disminuida bajo el criterio de que no hay diferencia de 1 logartmo entre la
produccin del paciente y del donador sano. Entonces lo ms lgico sera pensar en un
defecto en la produccin de la otra subunidad: p35, la cual se encuentra regulada por la
actividad de IFN-, a diferencia de p40 cuya produccin es constitutiva. Por esta razn,
se evalu la funcionalidad del receptor de IFN- y de STAT-1. Si bien la literatura
reporta que el anlisis de STAT-1 por medicin del incremento en la expresin de HLA-
DR resulta insuficiente para detectar alteraciones parciales en STAT-1 (Jouanguy et al.
1999), la respuesta que se observa con el tratamiento de Imukin que el paciente recibe
es notable, pues las lesiones han disminuido y no ha presentado recadas. Por tanto si
se analizan tanto los resultados de laboratorio como la parte clnica, lo primero que
salta a la vista es que existe un defecto en la produccin de IFN- por parte de las
clulas del paciente, el cual puede deberse a una falla en la produccin de la
subunidad p35 de IL-12 y por tanto no se secreta la forma madura de sta citocina.
Para corroborar lo anterior lo que se continuar haciendo ser evaluar la presencia del
RNA mensajero de IL-12 p35 y cuantificarlo para saber si el defecto est a nivel de
secuencia codificante o probablemente en el promotor de dicho gen.

Paciente 4.

El paciente 4 resulta ser al igual que los anteriores muy interesante, ya que en l se
encuentra abolida la produccin de IL-12. En este paciente los estudios funcionales
estn inconclusos ya que an falta evaluar la produccin de la subunidad p40 de IL-12,
as como descartar un defecto en STAT-1. Por tanto es prematuro concluir algo de l
hasta no tener un anlisis completo. Se le dar el seguimiento correspondiente en la
siguiente sangra del paciente.

73

La complejidad de los mecanismos inmunolgicos involucrados en el control de la
tuberculosis, as como los mecanismos de la micobacteria para evadirlos y la
susceptibilidad de ciertos individuos a desarrollar la enfermedad, nos han hecho pensar
en la participacin de un factor inherente al individuo, esto es: un componente gentico.
Con esta hiptesis en la mira se han analizado algunas variantes genticas en
diferentes molculas, las cuales participan en mecanismos de control, pero sin
resultados contundentes. Hasta hace 13 aos que se comenz a describir la
participacin de factores genticos en las infecciones diseminadas por parte de
micobacterias no patgenas, se empez a generar evidencia experimental de la
participacin de estas alteraciones en la capacidad de un individuo a desarrollar o no
un cuadro diseminado de tuberculosis. No obstante los casos y los defectos hallados se
han circunscrito al eje IL12/23-IFN y se ha dejado de lado a aquellos pacientes que no
presentan alguna alteracin del mencionado eje. Sin embargo es importante considerar
que si bien el eje es importante en el control de la tuberculosis y de patgenos
intracelulares en general, hay tambin otra serie de mecanismos inmunolgicos cuyo
papel no est del todo claro pero tampoco su participacin est descartada; como
ocurre en el caso de IL-23, IL-17, IL-18, iNOS , IL-27 e IL-22 . Al igual que los
componentes que favorecen la eliminacin de microorganismos intracelulares, hay
mecanismos de regulacin negativa que se han asociado a enfermedades infecciosas
crnicas, como es el caso de PD-1, PD-2, PDL-1 y CTLA-4. Seguramente seguirn
apareciendo nuevas asociaciones con nuevas molculas, generando as muchas
posibilidades ms que explorar en aquellos pacientes donde lo experimentalmente
reportado no permite explicar el fenmeno observado.

74

CONCLUSIONES

La metodologa presentada en este trabajo ha mostrado ser consistente y robusta, ya

que ha permitido separar a los pacientes que presentan un claro defecto en el eje
IL12/23-IFN de aquellos cuya etiologa se encuentra desconocida por el momento.

PERSPECTIVAS

Entre los experimentos a realizar estn la secuenciacin del gen IL-12 p35 en el
paciente 3, mientras que para el paciente 4 se deber evaluar la funcionalidad de
STAT-1 y la produccin de IL-12 p40.

Por otro lado se debern analizar ms muestras de donadores sanos para ampliar los
valores para la produccin de citocinas.

Se espera poder continuar analizando pacientes de los cuales se sospeche presentan

este sndrome.

75

BIBLIOGRAFA

1. Abbas K A, Lichtman A H. Inmunologa celular y molecular .5a ed. Elsevier. 2004. Pp. 351-354.

1. Al-Muhsen SA, Casanova JL. The Genetic heterogeneity of mendelian susceptibility to
mycobacterial diseases. J Allergy Clin Immunol. 2008; 122; 6; 1043-1051.

2. Altare F, Lammas D, Revy P. Inherited interleukin 12 deficiency in a child with bacilli Calmette-
Gurin and Salmonella enteritidis disseminated infection. J Clin Invest 1998;102: 203540.

3. Altare F, Durandy A, Lammas D. Impairment of Mycobacterial Immunity in Human Interleukin-

12 Receptor Deficiency. Science. 1998:280:1432-1435.

4. Awasthi A, Kuchroo VK. TH17 cells: from precursors to players in inflammation and infection.
Internat Immunol. 2009; 21 (5); 489-498.

5. Bafica A, Scanga CA, Feng CG. TLR9 regulates Th1 responses and cooperates with TLR2 in
mediating optimal resistance to Mycobacterium tuberculosis. J Exp Med 2005; 202; 1715-1724.

6. Brooks GF, Butel JS, Morse SA. Microbiologa mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. 18 Ed.
Manual Moderno. Mxico 2005. 313-315.

7. Bustamante J, Picard C, Fieschi C. A novel X-linked recessive form of Mendelian susceptibility
to mycobacterial disease.J Med Genet. 2007:44:1-8.

8. Byrd, T. F. and Horwitz, M. A., Interferon gamma-activated human monocytes downregulate
transferrin receptors and inhibit the intracellular multiplication of Legionella pneumophila by
limiting the availability of iron. J. Clin. Invest. 1989. 83: 14571465.

9. Casanova JL, Abel L, Genetic Dissection of immunity to mycobacteria: The human model. Ann
Rev Immunol. 2002; 20; 581-620.

10. Chapgier A, Boisson-Dupuis S, Jouanguy E. Novel STAT1 alleles in otherwise healthy patients
with mycobacterial disease. PLoS Genet 2006;2:e131.

11. Cooper AM, Khader SA. The role of cytokines in the initiation, expansion, and control of
cellular immunity to tuberculosis. Immun.Rev. 2008:226:191-204.

12. Cooper AM, Solache A, Khader SA. Interleukin-12 and tuberculosis: an old story revisited. Curr
Opin Immunol. 2007; 19 (4); 441-447.

13. Dorman SE, Holland SM. Mutation in the signal-transducing chain of the interferon gamma
receptor and susceptibility to mycobacterial infection. J Clin Invest 1998;101:23649.

76

 14. Dupuis S, Dargemont C, Fieschi C. Impairment of mycobacterial but not viral immunity by a
germline human STAT1 mutation. Science 2001;293:3003.

15. De Jong R. Severe mycobacterial and Salmonella infections in Interleukin-12 receptor-

Deficient patients. 1998. Science. 280; 1435-1438.


16. Dffinger R, Jouanguy E, Dupuis S, Fondaneche MC, Stephan JL, Emile JF. Partial interferon
gamma receptor signalling chain deficiency in a patient with bacille Calmette-Gurin and
Mycobacterium abscessus infection. J Infect Dis 2000;181:37984.


17. Dorman SE, Holland SM. Mutation in the signal-transducing chain of the interferon gamma
receptor and susceptibility to mycobacterial infection. J Clin Invest 1998;101:23649.

18. Filipe-Santos O, Bustamante J, Chapgier A. Inborn errors of IL-12/23 and IFN- mediated
immunity : molecular, cellular, and clinical features. Semin. Immun. 2006; 18; 347-361.

19. Filipe-Santos O, Bustamante J, Haverkamp MH. X-linked susceptibility to micobacteria is
caused by mutations in NEMO impairing CD40-dependent IL-12 production. JEM 2006 ;. 203; 7
:17451759

20. Flynn JL, Chan J, Tuberculosis: Latency and reactivation. Infect Immun 2001; 69; 4195-4201.

21. Fieschi C, Bosticardo M, Beaucodrey L. A novel form of complete IL-12/IL-23 receptor 1

deficiency with cellsurface-expressed nonfunctional receptors. Imnumobiol. 2004. 104;7;
2095-2101.


22. Fieschi C, Dupuis S, Catherinot E. Low penetrance, broad resistance, and favorable outcome of
interleukin 12 receptor 1 deficiency: Medical and Immunological implications. J. Exp. Med.
2003. 194;4; 527-535.

23. Golby P, Hatch AK, Bacon J. Comparative transcriptomics reveals key gene expression
differences between the human and bovine pathogens of the Mycobacterium tuberculosis
complex. Microbiol 2007; 153; 3323-3336.

24. Djelouadji Z, Raoult D, Daffe M, Drancourt M. A Single-Step Sequencing Method for the
Identification of Mycobacterium tuberculosis Complex Species. Plos 2008; 2; e253.

25. Hava LD, van der Wel N, Cohen N. Evasion of peptide, but not lipid antigen presentation,
through pathogen-induced dendritic cell maturation. PNAS 2008; 105;11281-11286.

77


26. http://portal.iner.gob.mx

27. http:// db.doyma.es

28. http:// redalyc.uaemex.mx

29. Janakiraman, A. and Slauch, J. M., The putative iron transport system SitABCD encoded on
SPI1 is required for full virulence of Salmonella typhimurium. Mol. Microbiol. 2000. 35: 1146
1155


30. Jouanguy E, Altare F, Lamhamedi S. Interferon-gamma-receptor deficiency in an infant with
fatal bacille Calmette-Guerin infection. N Engl J Med 1996;335: 195661.

31. Jouanguy E, Lamhamedi-Cherradi S, Altare F. Partial interferon-gamma receptor 1 deficiency in

a child with tuberculoid bacillus Calmette-Guerin infection and a sibling with clinical
tuberculosis. J Clin Invest 1997;100:265864.

32. Jouanguy E, Lamhamedi-Cherradi S, Lammas D. A human IFNGR1 small deletion hotspot
associated with dominant susceptibility to mycobacterial infection. Nat Gen 1999;21:370-378


33. Kaufmann SHE. Protection against tuberculosis: cytokines, T cells, and macrophages. Ann
Rheum Dis 2002;61:5458.

34. Khader SA, Cooper AM, IL-23 and IL-17 in tuberculosis. Cytokine. 2008; 41; 79-83.

35. Kindt JT, Goldsby AR, Osborne AB. Inmunologa de Kuby. 6a ed. McGraw-Hill. 2007. Pp 344-346
y 458-460.

36. MacLennan C, Fieschi C, Lammas DA, Picard C, Dorman SE, Sanal O. Interleukin (IL)-12 and IL-
23 are key cytokines for immunity against Salmonella in humans. J Infect Dis 2004;190:17557.


37. Moraes-Vasconcelos D, Grumach AS, Yamaguti A, Andrade ME, Fieschi C, Beaucoudrey L.
Paracoccidioides brasiliensis disseminated disease in a patient with inherited deficiency in the
beta1 subunit of the interleukin (IL)-12/IL-23 receptor. Clin Infect Dis 2005;41: e317

38. Means TK, Wang S, Lien E, Yoshimura A. Human Toll-Like Receptors Mediate Cellular
Activation by Mycobacterium tuberculosis. J Immunol 1999; 99; 3920-3927.

39. Nairz M, Fritsche G, Brunner P. Interferon- limits the availability of iron for intramacrophage
Salmonella typhimurium. Eur J Immunol. 2008; 38; 1923-1936.

78

 40. Newport MJ, Huxley CM, Huston S. A mutation in the interferon-gamma-receptor gene and
susceptibility to mycobacterial infection. N Engl J Med 1996;335:19419.


41. Oexle, H., Kaser, A., Most, J., Bellmann-Weiler, R., Werner, E. R., Werner-Felmayer, G. and
Weiss, G., Pathways for the regulation of interferon-gamma-inducible genes by iron in human
monocytic cells. J. Leukoc. Biol. 2003. 74: 287294.

42. Orange JS, Levy O, Brodeur SR, Krzewski K, Roy RM, Niemela JE. Human nuclear factor kappa B
essential modulator mutation canresult in immunodeficiency without ectodermal dysplasia. J
Allergy Clin Immunol 2004;114:6506.

43. Okada S, Ishikawa N, Shirao K, et al. The novel IFNGR1 mutation 774del4 produces a truncated
for of interferon- receptor1 and has a dominant negative effect on interferon- signal
transduction. J Med Genet,2007; 44; 485-491.

44. Picard C, Casanova J, Abel L. Mendelian traits that confer predisposition or resistance to
specific infections in humans. Curr Opin Immunol 2006;18:38390.

45. Reguerio G J, Lpez LC, Gonzlez RS, Martnez NE. Inmunologa. Biologa y patologa del
sistema inmune. 3a ed. Mdica Panamericana. 2002. 111-119.

46. Reichenbach J, Rosenzweig S, Doffinger R, Dupuis S, Holland SM,Casanova JL. Mycobacterial
diseases in primary immunodeficiencies. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2001;1:50311.

47. Reiling N, lscher CH, Fehrenbach A. Cutting Edge: Toll-Like Receptor (TLR)2- and TLR4-
Mediated Pathogen Recognition in Resistance to Airborne Infection with Mycobacterium
tuberculosis. J Immunol 2002; 2; 3480-3484.

48. Remus N, Baghdadi JE, Fieschi C. Association of IL12RB1 Polymorphisms with Pulmonary
Tuberculosis in Adults in Morocco. J Infect Dis 2004; 190:5807

49. Rosenzweig SD, Dorman SE, Uzel G, Shaw S, Scurlock A, Brown MR. A novel mutation in IFN-
gamma receptor 2 with dominant negative activity: biological consequences of homozygous
and heterozygous STATes. J Immunol 2004;173:40004008.

50. Sanal O, Turul T, De Boer T, Van de Vosse E, Yalcin I, Tezcan I. Presentation of interleukin-12/-
23 receptor beta1 deficiency with various clinical symptoms of Salmonella infections. J Clin
Immunol 2006;26:16.

51. Schreiber RD, Silverman RH. How cells respond to interferons. Annu. Rev. Biochem. 1998.
67:22764

52. Serbina NV, Lazarevic V, Flynn JL. CD4_ T Cells Are Required for the Development of Cytotoxic
CD8_ T Cells During Mycobacterium tuberculosis Infection. J Immunol 2001, 167: 69917000.

79

 53. Serbina NV, Flynn JL. Early Emergence of CD81 T Cells Primed for Production of Type 1
Cytokines in the Lungs of Mycobacterium tuberculosis-Infected Mice. Infect Immun. 1999, 67
;3980-3988.

54. Serbina NV, Flynn JL. CD8 T Cells Participate in the Memory Immune Response to
Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun. 2001, 69; 4320-4328.


55. Stenger S, Hanson DA, Teitelbaum R, Dewan P. An antimicrobial activity of cytolytic T cells
mediated by granulysin. Science. 1998, 282, 121; 121-125.


56. Sweet L, Zhang W, Torres-Fewell H. Mycobacterium avium glycopeptidolipids require specific
acetylation and methylation patterns for signaling through TLR2. J Biol Chem 2008; 1-23.

57. Trinchieri G, Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity.
Nat Rev Imm. 2003; 3: 133-146.

58. Tufariello J, Chan J, Flynn J. Latent tuberculosis: mechanisms of host and bacillus that
contribute to persistent infection. Infect. Dis. 2003:3:578-590.

59. Van de Vosse E, Ottenhoff T.H.M., de Paus R.A, Verhard E.M., de Boer T., van Dissel J.T.,
Kuijpers T.W. Mycobacterium bovis BCG-itis and Cervical Lymphadenitis due to Salmonella
enteritidis in a Patient with Complete Interleukin-12/-23 Receptor b1 Deficiency. Infection.
2010; 41: e31-e37.

60. Vogt G, Chapgier A, Yang K. Gains of glycosylation comprise an unexpectedly large group of
pathogenic mutations. Nature Genet. 2005. 37 (7); 692-700.

61. Weiss, G., Fuchs, D., Hausen, A., Reibnegger, G., Werner, E. R., Werner-Felmayer, G. and
Wachter, H., Iron modulates interferon-gamma effects in the human myelomonocytic cell line
THP-1. Exp. Hematol. 1992. 20: 605610.


62. Yancoski J, Rocco C, Bernasconi A. A 475 years-old founder effect involving IL12RB1: A high
prevalent mutation conferring Mendelian Susceptibility to micobacterial diseases in European
descendants. Infect, Genet, Evol. 2009;9; 574-580.

63. Zerbe CS, Holland SM. Disseminated histoplasmosis in persons with interferon-gamma
receptor 1 deficiency. Clin Infect Dis 2005;41:e3841.

64. Zhan SY, Bustamante J, von Bernuth H, Casanova JL, From Infectious Diseases to Primary
Immunodeficiencies. Immun Aller 2008; 28; 235-258.

80