LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR

PRCTICA NRO 3 CALIFICACIN:

ESTUDIANTE: Bryan Alexis Coello Nez Cdigo de estudiante: L00368466

1 TTULO DE LA PRCTICA

Identificacin morfolgica y clasificacin de bacterias segn tincin Gram a partir

de muestras de mucosa bucal, superficies, soluciones y placas preparadas
previamente.

2 OBJETIVOS
Identificar morfolgicamente y clasificar bacterias segn tincin diferencial: Gram,
a partir de muestras fciles de obtener en base a bibliografa confiable

3 HIPTESIS
Los tipos de bacterias pueden ser distinguidos de mejor manera mediante la tincin
diferencial Gram.

4 INTRODUCCIN
Las bacterias son clulas procariotas, las cuales presentan pequeo tamao y carecen
de ncleo definido, son seres unicelulares conocidos tambin como microbios o
grmenes (Leeuwenhoek, 1683).

El principal obstculo al momento de observar bacterias en el microscopio ptico se

da por la falta de contraste que existe entre la clula en observacin y el medio que
la rodea, la manera ms simple de corregir esta falencia es mediante el uso de
colorantes, estos van a revelar la presencia de determinados constituyentes celulares,
tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, etctera. (Buritica
Ahumad, Castaeda Torres, Medina Daz, & Vargas Corredor, 2012, pg. 23)

Con la tincin de Gram, una proporcin importante de bacterias puede dividirse en

dos grandes grupos: grampositivas (se observan de color azul - debido al colorante
cristal violeta) y gramnegativas (pierden el cristal violeta y conservan la safranina -
se aprecian de color rojo o rosado). La tcnica se basa en las diferencias fsicas
fundamentales de la pared celular y emplea colorantes catinicos (cristal violeta y
safranina), que se combinan con elementos cargados negativamente. (Lpez &
Berrueta, 2015)

La tincin de Gram requiere cuatro soluciones:

1. Primer colorante: El ms utilizado es el cristal violeta; este tipo de colorante se
distingue por ser una tintura bsica que en contacto con las clulas cargadas
negativamente, reacciona con ellas colorendolas.
2. Solucin mordiente: Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y
las clulas. Los mordientes empleados suelen ser sales metlicas, cidos o bases.
3. Agente decolorante: es un disolvente orgnico.
 4. Colorante de contraste: Es un colorante bsico de distinto color que el primer
colorante.
(Buritica Ahumad, Castaeda Torres, Medina Daz, & Vargas Corredor, 2012, pg.
3)
El objetivo de la prctica nos permite diferenciar fcilmente los grupos bacterianos
para mejorar su observacin y estudio.

5 MATERIALES, REACTIVOS, INSUMOS O EQUIPOS

Materiales de proteccin personal: Mandil, guantes, mascarillas.
Reactivos: Reactivos para tincin Gram: (Cristal violeta, lugol, alcohol-
cetona y safranina), aceite de inmersin, agua destilada, alcohol antisptico,
alcohol potable para mecheros.
Materiales e insumos: Placas portaobjetos, pipetas desechables, mecheros
de alcohol, papel especial para limpieza de microscopios, algodn, fsforos
o fosforera, palillos de dientes estriles, hisopos de madera estriles, picetas
con agua destilada, vaso de precipitacin 500mL, vasos de precipitacin
50mL, papel toalla, bandeja para tinciones.
Organismos: Bacterias presentes en flora normal, superficies, soluciones,
placas preparadas previamente.
Procedimiento: Toma de muestras, fijacin de muestras, tincin Gram y
observacin microscpica.

6 METODOLOGIA
La metodologa se encuentra en la gua de laboratorio 2-3-3 de la prctica 3.
Realizado por la ingeniera Karina Ponce, catedrtica de laboratorio en la universidad
de las fuerzas armadas ESPE

7 RESULTADOS Y OBSERVACIONES
Primera placa
40X

Ilustracin 1 - Primera muestra

40x
Las clulas son muy fciles de reconocer
gracias al primer colorante. Tienen un color morado oscuro y todas se encuentran
juntas. El color del ncleo es mucho ms oscuro que el de la membrana celular.

100x

Ilustracin 2 - Primera muestra 100x

Las partes de la clula se reconocen muy claramente. Se logra identificar pequeos
puntos en la membrana celular y muy pequeos microorganismos alrededor de la
clula.

Segunda placa
40x

Al aplicar el mordiente el color de las

Ilustracin 3 - Segunda muestra 40x
clulas se fija con ms claridad. Se nota
que las clulas redujeron un tono de color. En la primera placa, stas tenan un
morado oscuro, ahora con el mordiente el color morado se redujo hasta casi parecer
rosa.

100x

Ilustracin 4 - Segunda muestra 100x

Se llegan a distinguir ya las bacterias como pequeos puntos de diferente color que
resaltan ante el rosa de la clula. Pocos se distinguen perfectamente y otros se
confunden con el color de la clula. Podemos reconocer varios cocos ya que stos se
encuentran siempre en pareja.

Tercera placa
10x

Para este lente al aplicar el

Ilustracin 5 - Tercera muestra 10x
decolorante automticamente
todo el color de las clulas ha desaparecido. El rosa caracterstico de las clulas es
muy leve. Algunas se ven transparentes, sin tincin alguna. Muchas de las clulas se
distinguen solo por la membrana celular que es de color negro y el ncleo ovalado.

40x

Ilustracin 6 - Tercera muestra 40x

El color rosa de la tincin en las clulas empieza a notarse un poco mejor. Y las
bacterias que estn de color morado resaltan entre las clulas. Se puede visualizar
mejor las bacterias que las clulas.

100x

En este lente Ilustracin 7 - Tercera muestra 100x se notan claramente

las bacterias. El color
rosa desaparece de las clulas y se notan solo las formas de las bacterias que en la
mayora son cocos y bacilos. Estas se las
reconoce por la forma en que estn
agrupadas.

Cuarta placa
10x

Ilustracin 8 - Cuarta muestra 10x

 Para la tincin final (safranina), en este
lente se observa y se reconoce cada
clula. Todas las clulas vuelven a
tener el color rosado
caracterstico, pero no se nota el resalte
del ncleo. ste se pierde y no se logra
diferenciar los ncleos de las clulas. Por el contrario las bacterias se notan solo
como puntos dispersos en la clula.

40x

Ilustracin 9 - Cuarta muestra 40x

Ahora se puede notar el ncleo. ste tiene

color rosa oscuro totalmente. La
membrana que lo recubre es un rosa ms
claro. Se empiezan a diferenciar los tipos
de bacterias existentes en la
muestra.

100x

Ilustracin 10 - Cuarta muestra100x

 Se distingue con claridad las clulas Gram negativas, tienen la membrana celular y
el citoplasma definida por un color rosado claro y su ncleo con un rosado ms
oscuro. Se puede reconocer fcilmente su forma y tamao. Para las clulas Gram
positivas el color morado es oscuro y resalta totalmente ante el
rosado de las Gram
negativas. Ahora se
pueden distinguir la
forma, el tamao y su
estructura. Se observan
pequeos puntos morados
de diferentes estructuras y
formas, algunos solos, otros estn en
parejas, otros formando cadenas y algunos
todos juntos.

Muestra de queso

Muestra de yogurt

Muestra de jugo de frutas

8 DISCUSIN DE RESULTADOS
 Las bacterias Gram positivas se observan de color morado y las bacterias Gram
negativas de color rosado.

La pared de la clulas Gram positivas es gruesa y consiste en varias capas

interconectadas de peptidoglicano (cadenas lineales de un polisacrido formado por
residuos alternativos de N-acetil glucosamina y N-acetilmurmico unidos mediante
un enlace) y un poco de cido teicoico (forman parte de la gruesa capa de
peptidoglicano que rodea a la membrana plasmtica y estn directamente unidos a l
mediante un enlace fosfodister. De este modo pueden conectar varias capas de
peptidoglicano), mientras que las bacterias Gram negativas se componen de una
capa delgada de peptidoglicano y est rodeada por una capa exterior de
lipopolisacridos (forma parte de la pared celular de las bacterias Gram-negativas.

Tienen carcter anfiptico, presentan carga negativa, y repelen molculas

hidrofbicas. Son txicos para el hombre, y tambin se llaman endotoxinas) lo que
explica cmo estos dos tipos de bacterias logran teirse de diferente color y es
posible identificarlas como Gram positiva o Gram negativa. (Buritica Ahumad,
Castaeda Torres, Medina Daz, & Vargas Corredor, 2012)

Cabe recalcar que el paso determinante de esta tincin es la decoloracin, ya que si

se deja por mucho tiempo la solucin podra quitar la tonalidad a las bacterias
Gram+, obteniendo una placa inservible para el objetivo principal de la prctica. Por
lo tanto si las clulas presentan una tonalidad muy rosada significa que se utiliz una
cantidad elevada de decolorante en la muestra. (WikiHow)

Para la ltima placa podemos concluir que la tincin se realiz con total xito, ya
que se logr diferenciar las bacterias Gram positivas y negativas. En las bacterias
Gram positivas se haba observado diferentes puntos con diferentes estructuras. Para
los llamados puntos se concluye que son cocos, y se identificaron varios tipos en
la muestra. Como son: diplococos, estafilococos, estreptococos, sarcinas.
En algunas estructuras se pudieron identificar tambin bacilos.

9 CONCLUSIONES

Fijacin e identificacin bacteriana segn tincin Gram, al realizar la tincin

de Gram se identific como las Gram positivas se tien de color violeta
mientras que las Gram negativas se tien de color rosado.

Las bacterias Gram positivas y Gram negativas se presentan

morfolgicamente como cocos o bacilos respectivamente.
La tincin de Gram permite conocer la morfologa celular, el tamao, la
forma y la clasificacin taxonmica de las bacterias.

10 CUESTIONARIO
a) En qu hbitat se pueden encontrar las bacterias?
Son los organismos ms abundantes del planeta. Son ubicuas, encontrndose en
todo hbitat de la tierra, creciendo en el suelo, en manantiales calientes y cidos,
en desechos radioactivos, en las profundidades del mar y de la corteza terrestre.
Algunas bacterias pueden incluso sobrevivir en las condiciones extremas del
espacio exterior. Se estima que hay en torno a 40 millones de clulas bacterianas
en un gramo de tierra y un milln de clulas bacterianas en un mililitro de agua
dulce. En total, se calcula que hay aproximadamente 51030 bacterias en el
mundo. (Biologaliga, 2010)

b) Cul es la forma correcta de tomar muestras, respetando normas de

bioseguridad?
Para tomar una muestra es necesario comprender que el tipo de muestra que se
vaya a tomar puede representar un riesgo biolgico para el grupo de personas
que ayudan en la prctica. Al momento de tomar una muestra bucal se debe
realizar lo siguiente:
1. Realizar un frotis con un hisopo esterilizado o palillo de dientes, evitando
provocar alguna lesin dentro de la mejilla.

Es importante recordar que se deber adoptar un sistema de identicacin y

separacin del material infeccioso y sus recipientes. Se seguirn las normas
nacionales e internacionales y se tendrn en cuenta las siguientes categoras:
1. Desechos no contaminados (no infecciosos) que puedan reutilizarse o
reciclarse o eliminarse como si fueran basura en general.
2. Objetos cortantes y punzantes contaminados (infecciosos): agujas
hipodrmicas, bisturs, cuchillas, vidrio roto; se recogern siempre en
recipientes a prueba de perforacin dotados de tapaderas y sern tratados
como material infeccioso.
3. Material contaminado destinado al tratamiento en autoclave que despus
pueda lavarse y volverse a utilizar o reciclarse.
4. Material contaminado destinado al tratamiento en autoclave y a la
eliminacin.
5. Material contaminado destinado a la incineracin directa. (Organizacin
Mundial de la Salud, 2005)

c) Cmo se utilizan los materiales para fijacin y tincin de muestras?

Al momento de fijar una muestra es importante comprender que la placa no
siempre se va a fijar de manera fsica, sin embargo, cuando se usa el mechero de
alcohol hay que tener presente que no se debe sobrecalentar la placa ya que se
 puede quemar la muestra, se hacen mximo unas 3 pasadas y la placa no se debe
mantener dentro de la llama, es suficiente con pasarla por la mitad.
Al momento de teir la muestra se debe tener muy en cuenta que las placas
deben estar en la bandejas de tincin, se deben poner los colorantes con pipetas o
goteros y el uso de agua destilada es indispensable para el lavado de los
portaobjetos. (Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE, 2012)

d) Cul es el propsito de teir las bacterias?

El propsito ms comn es revelar detalles de la citoestructura que no resultaran
evidentes a la vista del ojo humano ni con la ayuda del microscopio, sin
embargo, la tincin supravital puede revelar adems donde aparece un
determinado producto qumico o donde se lleva a cabo una determinada reaccin
qumica dentro de las clulas o tejidos.

e) Cuntos y cules son los reactivos que se utilizan para la tincin Gram?
1. Primer colorante: El ms utilizado es el cristal violeta
2. Solucin mordiente: Para esta prctica se us Lugol.
3. Agente decolorante: Alcohol - Cetona (50:50) o (1:1).
4. Colorante de contraste: Safranina.
(Buritica Ahumad, Castaeda Torres, Medina Daz, & Vargas Corredor, 2012, pg.
3)
f) Cul es la funcin de cada uno de los reactivos de la tincin Gram?
La tincin de Gram requiere cuatro soluciones:
1. Primer colorante: El ms utilizado es el cristal violeta; este tipo de colorante
se distingue por ser una tintura bsica que en contacto con las clulas
cargadas negativamente, reacciona con ellas colorendolas.
2. Solucin mordiente: Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante
y las clulas. Los mordientes empleados suelen ser sales metlicas, cidos o
bases.
3. Agente decolorante: es un disolvente orgnico.
4. Colorante de contraste: Es un colorante bsico de distinto color que el primer
colorante.
(Buritica Ahumad, Castaeda Torres, Medina Daz, & Vargas Corredor, 2012, pg.
3)
g) Cules son los pasos determinantes en la tincin Gram?
El paso determinante de esta tincin es la decoloracin, ya que si se deja por
mucho tiempo la solucin podra quitar la tonalidad a las bacterias Gram+,
obteniendo una placa inservible para el objetivo principal de la prctica.
(WikiHow)

h) Qu forma tienen las bacterias?

Las bacterias se clasifican ms a fondo por su forma bajo el microscopio, ms
comnmente como cocos (esfricas) o varas (cilndricas).
 Las bacterias Gram positivas (teidas de violeta) se clasifican por forma en:

Los cocos Gram positivos generalmente son ya sea estafilococos (que

significa cocos en grupos) o estreptococos (que significa cocos en cadenas).
Las varas Gram positivas incluyen los bacilos y las bacterias Clostridium,
Corynebacterium y Listeria. Las varas de la especie Actinomyces a menudo
tienen ramas o filamentos.

Las bacterias Gram negativas (teidas de rosado) a menudo se clasifican en tres

grupos:

Los cocos son las bacterias esfricas, son ms comunes en la especie

Neisseria.
Las varas son las bacterias largas y delgadas, incluyen a las bacterias E. coli,
Enterobacter, Klebsiella.
Las varas cocoides estn en un punto intermedio, incluyen la Bordetella,
Brucella, Haemophilus y Pasteurella.
(WikiHow)

i) Por qu y cmo las bacterias se identifican y clasifican con tincin Gram?

La pared de la clula bacteriana sirve para definir su tamao y su forma al
organismo as como para prevenir la lisis osmtica. Las bacterias Gram positiva
y Gram negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas
en la estructura de sus paredes celulares. (Buritica Ahumad, Castaeda Torres,
Medina Daz, & Vargas Corredor, 2012)

j) Cundo se utiliza el lente objetivo 100x con aceite de inmersin?

Cuando la refraccin de la luz es alta en el aire, lo que provoca alteraciones en la
imagen que se ponen de manifiesto con objetivos con esta capacidad de
aumento. El aceite de inmersin reduce enormemente esta refraccin
permitiendo imgenes mucho ms ntidas. (Megas Pacheco, Molist Garca, &
Pompal, 2016)

11 BIBLIOGRAFIA

Biologaliga. (11 de octubre de 2010). Biologaliga. Recuperado el 03 de

diciembre de 2016, de Biologaliga:
https://biologialiga.files.wordpress.com/2008/08/bacteria2010.pdf

Buritica Ahumad, B. A., Castaeda Torres, M. ., Medina Daz, H. L., & Vargas
Corredor, Y. A. (11 de octubre de 2012). ACADEMIA. Recuperado el 3
 de diciembre de 2016, de ACADEMIA:
https://www.academia.edu/6245506/TINCI
%C3%93N_DE_GRAM_Y_OBSERVACI%C3%93N_MICROSC%C3%93PICA

Lpez, J. M., & Berrueta, T. U. (1 de Octubre de 2015). Departamento de

microbiologa y parasitologa - recursos bacteriologa. Obtenido de
Generalidades de Bacterias:
http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/bacteriologia/gene
ralidades.html

Megas Pacheco, M., Molist Garca, P., & Pompal, M. . (20 de mayo de 2016).
ATLAS de HISTOLOGA VEGETAL y ANIMAL. Obtenido de ATLAS de
HISTOLOGA VEGETAL y ANIMAL: http://mmegias.webs.uvigo.es/6-
tecnicas/6-optico.php

Organizacin Mundial de la Salud. (2005). MANUAL DE BIOSEGURIDAD EN

EL LABORATORIO (Tercera ed.). Ginebra: Organizacin Mundial de la
Salud.

Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE. (2012). Manual de laboratorio de

biotecnologa docencia. Quito, Pichincha, Ecuador. Recuperado el 03
de diciebre de 2016

WikiHow. (s.f.). WikiHow. Recuperado el 03 de diciembre de 2016, de

WikiHow: http://es.wikihow.com/hacer-una-tinci%C3%B3n-de-Gram