Microbiologa General y Bucal

Prctica 4: Diagnstico microbiolgico directo

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En el Laboratorio de Microbiologa el microorganismo o sus productos pueden detectarse a travs de:

1.- Visualizacin
Uno de los procedimientos bsicos y no por ello menos importante es la visualizacin del microorganismo en las muestras.

El microscopio ptico es el ms utilizado en los laboratorios de microbiologa de forma rutinaria. Tambin pueden emplearse el de campo oscuro,
contraste de fases, fluorescencia o electrnico.

El examen microscpico requiere la utilizacin del microscopio. Puede hacerse una visualizacin microscpica en 2 momentos: a)
directamente de la muestra clnica y b) a partir de los microorganismos obtenidos por cultivo como primer escaln en la identificacin.
Cmo se pueden ver los microorganismos?

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Puede realizarse

1-Directamente: examen en fresco. Se estudian las bacterias "al natural", sin teir. Tiene el inconveniente de que las bacterias tienen una densidad
ptica similar a la del agua (transparentes) por lo que es difcil examinarlas.

2-Mediante una tcnica denominada gota pendiente que se utiliza para observar la movilidad.
3-Tinciones negativas (Tinta china). No son una verdadera tincin. Se llaman as porque lo que realmente se tie es el fondo sobre el que estn
los microorganismos apareciendo los microorganismos sin teir. Se emplea para ver la cpsula de S. pneumoniae y Cryptococcus neoformans en
LCR.

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4-Tinciones. Existen muchas y en general se pueden clasificar en:
4.1. simples (utilizan un solo colorante). Por ejemplo: azul de metileno para observacin de levaduras y protozoos intestinales
4.2. diferenciales (utilizan ms de un colorante y permiten la agrupacin de las bacterias de acuerdo a su diferente afinidad tintorial). Destacan la
tincin de Gram que agrupa a las bacterias en dos grandes bloques, bacterias grampositivas y bacterias gramnegativas, y la de Ziehl-Neelsen
utilizada, entre otros, para la tincin de micobacterias.

4.3. especiales: tinciones fluorescentes, tinciones de determinadas estructuras como la tincin del esporo, tincin de flagelos...

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Tincin de Gram:

PASOS GRAMPOSITIVAS GRAMNEGATIVAS

Colorante principal: cristal Violeta Violeta
violeta
Mordiente: Lugol Violeta Violeta
Decolorante: alcohol-acetona Violeta Transparente
Colorante de contraste: Violeta Rojo
safranina

Cmo se ven las bacterias tras realizar una tincin de Gram?

A travs de la tincin de Gram pueden valorarse la afinidad tintorial, forma y agrupaciones de las bacterias.
-Afinidad tintorial. Permite dividir a las bacterias en 1) grampositivas (violetas) que retienen el colorante principal tras la decoloracin con
alcohol o alcohol-acetona y 2) gramnegativas (rojas) que pierden el colorante principal tras la decoloracin por lo que es necesario aplicar un
colorante de contraste para visualizarlas. Esta diferencia de coloracin est basada en la diferencia estructural de la pared. En las grampositivas el
colorante se fija fuertemente al peptidoglicano que lo "retiene" e impide que "salga" con el decolorante. En las gramnegativas el colorante es retenido
con menos fuerza al ser ms delgada la capa de peptidoglicano. Adems la mayor cantidad de lpidos presentes hace que el colorante se elimine al
solubiliarse los lpidos en el alcohol.

- Pueden tener diferentes formas:

- esfricas: cocos (Streptococcus spp., Staphylococcus spp., etc)
- cilndricas: bacilos (enterobacterias, Pseudomonasspp., etc...)
- espiroquetas: Treponema pallidum, Borrelia burgdorferi
- Pueden aparecer aisladas o asociarse en parejas [diplococcos: (Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae)], cadenas
(estreptococcos), tetradas, sarcinas, racimos (estafilococos), "letras chinas" (corinebacterias), etc
- Tamao: las bacterias se miden en metros (1metro = 10-3 mm) y, en general y como ejemplo, las bacterias esfricas tienen un dimetro de 1m
y las bacterias alargadas 1.5-8 m de longitud, aunque este parmetro vara en funcin de los diferentes gneros bacterianos.

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 Cocos grampositivos

Bacilos grampositivos Bacilos gramnegativos

Visualizacin de la tincin de Gram

2.- Aislamiento en cultivo y posterior identificacin por sus caractersticas fenotpicas (morfologa, caractersticas metablicas -pruebas
bioqumicas y enzimticas-, etc.)
Cmo se cultivan en el laboratorio?
Se utilizan medios de cultivo compuestos por una mezcla de nutrientes (protenas, hidratos de carbono, minerales, oligoelementos...) que
permiten el crecimiento de las bacterias en el laboratorio, in vitro.
Los medios de cultivo pueden clasificarse atendiendo a varios parmetros:
a) Segn su origen pueden ser 1) naturales: constituidos por sustancias naturales de composicin compleja y en ocasiones variable (extracto de
carne, extracto de levadura, patata...), 2) sintticos o qumicamente definidos en los que se conoce la participacin exacta de hidratos de carbono,
aminocidos.... y 3) semisintticos.
b) Segn su consistencia pueden ser 1) lquidos, 2) slidos: son medios lquidos a los que se les aade para darles consistencia una sustancia
gelificante (agar-agar) obtenida de algas marinas y 3) semislidos: lquidos a los que se les aade menor concentracin de agar que a los slidos.
Cada uno tiene sus finalidades. En la superficie de los medios slidos es posible ver las colonias resultantes de la multiplicacin bacteriana.
Los medios lquidos facilitan el crecimiento de las bacterias pero en ellos no se ven colonias, el crecimiento suele detectarse por turbidez. Los medios
semislidos suelen utilizarse para valorar la movilidad de los microorganismos.
c) De acuerdo a su finalidad y aplicacin pueden ser:
1.- Bsicos: aquellos que llevan todos los elementos bsicos para el desarrollo de los microorganismos no exigentes.
2.- Enriquecidos: incorporan diferentes sustancias para permitir el crecimiento de microorganismos ms exigentes. Ej.: agar sangre, agar chocolate,...

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3.- Selectivos: medios a los que se aaden diferentes sustancias (colorantes, sales biliares, antibiticos...) que son capaces de inhibir a determinados
microorganismos y permitir el crecimiento de otros. En general se utilizan para inhibir el crecimiento de la flora acompaante y permitir el crecimiento
del patgeno. Tambin colaboran en la identificacin pues proporcionan un parmetro ms: no se inhibe por...
4.- Diferenciales: se les aade un hidrato de carbono y un indicados de pH de forma que si el microorganismo es capaz de utilizar ese hidrato de
carbono se produce un cambio de pH que hace que el indicador cambie de color y evidencie la reaccin. As las colonias son fcilmente
reconocibles por su color.

5.- Otros medios: de enriquecimiento (son medios lquidos a los que se les aades sustancias que inhiben el crecimiento de microorganismos
acompaantes favoreciendo el crecimiento de otros (los patgenos buscados), de transporte, etc.

Siembra de los medios de cultivo

Lo primero que hay que hacer es sembrar la muestra en los medios de cultivo reseados. Una vez cultivada se procede al aislamiento en
cultivo y posterior identificacin por sus caractersticas fenotpicas (morfologa, caractersticas metablicas -pruebas bioqumicas y enzimticas-,
etc.).
Prodecimientos de siembra 1
Procedimientos de siembra 2
Esquemas

Cuando la siembra se realiza a partir de un cultivo debe obtenerse una pequea porcin del mismo.
Condiciones de cultivo

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-Temperatura: la mayora crecen bien a temperaturas entre 35-37C aunque hay excepciones
-Tiempo de incubacin: depende del tiempo de generacin (tiempo requerido para que el nmero de bacterias se duplique) de cada
microorganismo. Generalmente 18-24 h. Otros requieren ms tiempo de incubacin: Brucella spp. , M. tuberculosis.
-Atmsfera de incubacin. Los microorganismos respecto al tipo de respiracin pueden ser:
1.- Aerobios: requieren la presencia de oxgeno molecular.
2.- Anaerobios facultativos: pueden vivir y multiplicarse en presencia o en ausencia de oxgeno.
3.- Anaerobios: el oxgeno libre es txico para ellos (algunos son aerotolerantes).
4.- Microaerofilos: necesitan la presencia de oxgeno libre pero a una concentracin menor que la atmosfrica (2-10%).
Este hecho tiene como consecuencia que haya que incubarlos en estas condiciones. Otros hay que incubarlos en una atmsfera con un 5-
10% de CO2 (no es tipo de respiracin sino un requerimiento): se denominan capnfilos

Identificacin
Se valoran entre otros parmetros:
1) morfologa y aspecto de las colonias (masa constituida por bacterias que es visible a simple viste en la superficie de los medios slidos).

2) capacidad de crecer a una determinada temperatura

3) crecimiento en medios selectivos y diferenciales

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 4) presencia de hemlisis que en los medios con sangre da lugar a la aparicin de un halo alrededor de la colonia. Puede ser transparente
(hemlisis total o -hemlisis), verdoso (hemlisis parcial o -hemlisis o no aparecer (no hemolticas o hemlisis)

5) pruebas bioqumicas y enzimticas adecuadas para la bacteria que se sospeche por las pruebas preliminares

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 6) movilidad

3.- deteccin de productos estructurales: antgenos (reacciones antgeno-anticuerpo), cidos nucleicos (hibridacin, PCR, etc)

3.1. deteccin de antgenos se vern con ms detalle al estudiar las reacciones antgeno-anticuerpo

3.2. tcnicas genticas de deteccin de cidos nucleicos: hibridacin, Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR), etc.

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3.2.1. Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR):
En 1983, Kary Mullis dio a conocer la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa que es una tcnica para la sntesis in vitro de secuencias
especficas de DNA evitandop de esta forma uno de los principales problemas que se planteaban que era la insuficiente cantidad de ADN para
realizar ciualquier procedimiento de laboratorio.
La tcnica se basa en la replicacin del ADN inducida por la DNA polimerasa, enzima que es capaz de real9izar una sntesis de una cadena
complementaria de ADN en el sentido 5-> 3 usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una regin de doble cadena. Para crear esta
regin doble cadena se usan los denominados iniciadores (primers). Son una pareja de oligonucletidos sintetizados de manera que sean
complementarios a cada uno de los extremos 3 del fragmento de ADN que se desea amplificar.
Partiendo de este principio, la PCR se basa en la repeticin de ciclos que estn formados por tres etapas:
1.- Desnaturalizacin del ADN doble cadena: la doble hlice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubacin de la muestra a
altas temperaturas (93-97C). La renaturalizacin se producir cuando la temperatura disminuya.
2.- Hibridacin de los iniciadores a la zona 3 especfica de cada una de las hebras: los cebadores, iniciadores o primers se unen a las zonas 3
complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la temperatura (50-65 C).
3.- Extensin del cebador por actuacin de la DNA polimerasa (elongacin): se produce la sntesis de una cadena sencilla (producindose un
fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la direccin 5-> 3 mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los
desoxinucletidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde.
Este proceso se lleva a cabo en un equipo llamado termociclador que realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas.

Esquemas de trabajo

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Elementos qumicos necesarios para realizar la PCR

Termociclador

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 Carga de un gel de agarosa

Lectura de un gel de agarosa, teido con bromuro de etidio, bajo la luz ultravioleta

3.2.2. Hibridacin
La hibridacin o renaturalizacin de cidos nucleicos (ARN o ADN) es un proceso por el cual secombinan dos cadenas de cidos nucleicos
antiparalelas y con secuencia de bases complementarias, en una nica molcula de doble cadena, que toma la estructura de doble hlice, donde las
bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior.
Se utiliza una cadena sencilla de ADN marcada por un mtodo fsico-qumico, bien sea radiactivo o con un fluorocromo. Esta cadena tiene una
secuencia de nucletidos conocida y se utiliza como sonda para detectar otras molculas de ARN o ADN de cadena sencilla de secuencia parecida.
En el esquema est representado el fundamento de la tcnica.

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 Para saber ms

4.- deteccin de productos metablicos: Cromatografa (anaerobios, micobacterias), ATP bacteriano (bioluminiscencia), toxinas, etc.
4.1. cromatografa se basa en la identificacin de microorganismos a partir de productos de su metabolismo (alcoholes, cidos grasos) o de
componentes de la pared celular. Se emplea sobre todo para la identificacin de micobacterias y anaerobios.

Algunas de estas tcnicas como la PCR pueden utilizarsepara realizar el diagnstico directamente sobre la muestra clnica sin necesidad de
hacer un cultivo previo.

REACCIONES ANTGENO ANTICUERPO

Son estrategias de laboratorio que permiten detectar que una reaccin antgeno-anticuerpo producida en el laboratorio ha tenido lugar. Se
basan en la especificidad de la reaccin, es decir, en que un anticuerpo slo reaccionar con el antgeno que haya dado lugar a su formacin.
Pueden utilizarse para realizar tanto diagnstico directo como indirecto. Si conocemos el anticuerpo (estn disponibles en el laboratorio, por
ej. anticuerpos monoclonales) podremos identificar el antgeno (en la muestra clnica) que reacciona especficamente con l: diagnstico directo.
Ejemplo de identificacin serolgica de estreptococos del grupo A (parte 1)
Ejemplo de identificacin serolgica de estreptococos del grupo A (parte 2)

La inmunofluorescencia es una tcnica que emplea anticuerpos conjugados a fluorocromos. Los fluorocromos son molculas que al ser excitadas con
la energa de una determinada longitud de onda son capaces de emitir energa de una longitud de onda mayor.
Una de las tcnicas ms utilizadas es la Inmunofluorescencia Directa que permite la deteccin de antgenos en un paso. Utiliza anticuerpos
conjugados a isotiocianato de fluorescena. La lectura se realiza en un microscopio de fluorescencia, que emite luz ultravioleta de una determinada
longitud de onda.
Reaccin positiva

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 Reaccin negativa
La inmunofluorescencia indirecta permite la deteccin de anticuerpos circulantes. Si el antgeno es conocido (disponible en el laboratorio),
detectaremos los anticuerpos que se encuentran en la muestra clnica y por tanto son desconocidos y que reaccionan especficamente con ellos:
diagnstico indirecto.

Otras tcnicas que se emplean en el diagnstico microbiolgico directo son: deteccin de antgeno capsular mediante tcnicas de aglutinacin con
anticuerpos unido a partculas de ltex, CIE, RIA y EIA. La descripcin de estas tcnicas se vern en la prctica 5.

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