TDT

ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE INGENIERA EN BIOTECNOLOGA AMBIENTAL
CARACTERIZACIN Y EVALUACIN DE BACTERIAS PARA

PRODUCCIN DE BIOPLSTICO DE ORIGEN MICROBIANO
UTILIZANDO COMO SUSTRATO AGUA RESIDUAL DE LA
INDUSTRIA LACTEA, 2015
Trabajo de titulacin para optar por el ttulo de:

INGENIERO EN BIOTECNOLOGA AMBIENTAL
AUTOR: CHRISTIAN ORLANDO CAMACHO LPEZ

TUTOR: PhD. Gerardo Emilio Medina
Riobamba, Ecuador
Marzo 2016
2016, Christian Orlando Camacho Lpez
Se autoriza la reproduccin total o parcial, con fines acadmicos, por cualquier medio o
procedimiento, incluyendo la cita bibliogrfica del documento, siempre y cuando se reconozca el
Derecho de Autor.
ii
ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE CIENCIAS QUMICAS
El Tribunal de Trabajo de Titulacin certifica que: El trabajo de investigacin:

CARACTERIZACIN Y EVALUACIN DE BACTERIAS PARA PRODUCCIN DE
BIOPLSTICO DE ORIGEN MICROBIANO UTILIZANDO COMO SUSTRATO AGUA
RESIDUAL DE LA INDUSTRIA LACTEA, 2015, de responsabilidad del seor Christian
Orlando Camacho Lpez, ha sido cuidadosamente revisado por los Miembros del Tribunal de
Trabajo de Titulacin, quedando autorizada su presentacin:
PhD. Gerardo Emilio Medina

DIRECTOR DE TRABAJO _____________________ _________________________
DE TITULACIN
MSc. Paola Argello

MIEMBRO DEL TRIBUNAL _____________________ _________________________
iii
DECLARACIN DE AUTENTICIDAD
Yo, Christian Orlando Camacho Lpez, declaro que el presente trabajo de titulacin es de mi
autora y que los resultados del mismo son autnticos y originales. Los textos constantes en el
documento que provienen de otra fuente estn debidamente citados y referenciados.
Como autor, asumo la responsabilidad legal y acadmica de los contenidos de este trabajo de
titulacin.
Riobamba, 12 de abril de 2016
Christian Orlando Camacho Lpez

180463989-4
iv
DEDICATORIA
A Dios por ser mi gua y bendecir cada instante de mi vida, a mis abuelos pues es el fruto del
cuidado y la educacin que me brindaron, a mi padre por su amor, sacrificio y apoyo
incondicional, as como a mi familia por su paciencia y altruismo.
v
AGRADECIMIENTOS
A mis abuelitos por su apoyo y consejo permanente

A mi padre por su sacrificio y soporte constante
A mi familia por brindarme nimo y fortaleza
A mi tutor Emilio Medina y mi asesora Paola Argello por su constante apoyo, conocimiento,
paciencia y estoicismo.
A la Empresa Lcteos Santilln por abrir las puertas de su industria colaborando en la presente
investigacin, especialmente a la Dra. Mery Oleas Jefa de Produccin.
A Fausto Tapia y Aida Fierro por su colaboracin, as como a todos los docentes, tcnicos, amigos
y colegas que colaboraron durante el transcurso de esta investigacin.
vi
RESUMEN
Los polihidroxialcanoatos son bioplsticos sintetizados por algunas bacterias como material de
reserva de carbono y energa. La presente investigacin analiz la produccin del biopolmero en
52 clones estabilizados provenientes de aguas residuales lcteas, as como, produccin de
exopolmeros, tolerancia a medios salinos, crecimiento en medios cidos, resistencia a metales
pesados y produccin de enzimas. La seleccin de los clones fue realizada bajo dos criterios, los
clones del grupo A (21 clones) fueron obtenidos del medio especfico para produccin de
polihidroxialcanoatos (ADP) considerando su crecimiento y caractersticas macroscpicas,
mientras que los clones del grupo B (31 clones) obtenidos de muestras sometidas a refrigeracin
fueron no fermentadores de lactosa, oxidasa positivo. El anlisis de produccin de
polihidroxialcanoatos fue realizado utilizando diferentes sustratos y condiciones de estrs
mediante tincin con Sudan Black y espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier. Los
resultados obtenidos demostraron que ninguno de los clones aislados fue capaz de producir
polihidroxialcanoatos, sin embargo, fueron capaces de producir exopolimeros, tolerar
concentraciones entre 5 y 7.5% de cloruro de sodio, adaptarse a plomo y cadmio en
concentraciones mayores a 50mg/ml, y a mercurio, arsnico y cobre en concentraciones entre 5-
50 mg/ml, un 16.13% de clones del Grupo B fue tolerante a pH cido, la mayora de los clones
del Grupo B fueron capaces de producir proteasas y lipasas, mientras que un 14.29% del Grupo
A sintetiz amilasas. Durante la investigacin se concluye que la refrigeracin de las muestras
ayud a seleccionar clones con mayor adaptacin a medios hostiles de crecimiento,
recomendando realizar nuevas investigaciones sobre el tema, as como de otros relacionados a la
produccin de polihidroxialcanoatos, al considerarse campos de estudio nuevos a nivel local
cuyos resultados pueden brindar mecanismos de produccin ambientalmente sostenibles.
Palabras clave: <BIOPOLMEROS> <BIOPLSTICOS> <POLIHIDROXIALCANOATOS>

<AGUA RESIDUAL> <EXOPOLMEROS> <HALOTOLERANCIA> <METALES
PESADOS> <ENZIMAS>
vii
ABSTRACT
Polyhydroxyalkanoates are bioplastics synthesized by some bacteria as reserve of carbon and

energy. This research analyzed the production of biopolymer stabilized by 52 clones from dairy
wastewater, as well as production of Exopolymers, tolerance to saline environments, growth in
acidic media, resistance to heavy metals and enzyme production. The clone choice was performed
under two criteria, clones of group A (21 clones) were obtained from specific means in order to
produce polyhydroxyalkanoates (ADP) considering their growth and macroscopic characteristics,
whereas clones of group B (31 clones) were obtained from samples subjected to cooling, these
were not fermenters of lactose, positive oxidase. The analysis of polyhydroxyalkanoates
production was performed using different substrates and stress conditions by staining with Sudan
Black and infrared spectroscopy processed with Fourier. The results showed that none of the
isolated clones was able to produce polyhydroxyalkanoates, however, they were able to produce
exopolymers, tolerate concentrations between 5 and 7.5 % of sodium chloride, adapted to
cadmium and lead in higher concentrations to 50mg/ml, and mercury, arsenic and copper
concentrations between 5-50 mg/ml; 16.13% of clones from group B was tolerant to acidic pH,
so most group B clones were capable of producing lipases and proteases, while a 14.29% from
group A synthesized amylases. During the research it concludes that the cooling of samples helped
to select clones with higher suit on hostile environments, that is why it recommends further
research on the topic, as well as related to the production of polyhydroxyalkanoates, considering
new local study whose results can provide mechanisms of environmentally sustainable
production.
Keywords: <BIOPOLYMERS> <BIOPLASTICS> <POLYHYDROXYALKANOATES>

<WASTEWATER> <EXOPOLYMERS> <HALOTOLERANCE> <HEAVY METALS>
<ENZYMES>.
viii
TABLA DE CONTENIDOS
PORTADA i
DECLARACIN DE AUTENTICIDAD .... iv
DEDICATORIA.. v
AGRADECIMIENTOS. vi
RESUMEN. vii
ABSTRACT...... viii
INDICE DE FIGURAS..... xii
INDICE DE TABLAS.. xiv
CAPTULO I
1. INTRODUCCIN ......................................................................................................1
1.1 Identificacin del problema ..........................................................................................1

1.2 Justificacin de la investigacin ....................................................................................3
1.3 Objetivos .......................................................................................................................5
1.3.1 Objetivo General ..........................................................................................................5
1.3.2 Objetivos Especficos ...................................................................................................5
CAPTULO II
2. MARCO TERICO ...................................................................................................6
2.1 Antecedentes de la Investigacin ..................................................................................6

2.2 Bases Tericas ..............................................................................................................8
2.2.1 Contaminacin .............................................................................................................8
2.2.1.1 Contaminacin del agua ...............................................................................................9
2.2.1.2 Agua residual de la industria lctea ..............................................................................9
2.2.1.3 Microbiota en aguas residuales lcteas ....................................................................... 10
2.2.2 Tcnicas de anlisis microbiolgico ........................................................................... 10
2.2.2.1 Inoculacin ................................................................................................................. 10
2.2.2.2 Aislamiento ................................................................................................................ 11
2.2.2.3 Identificacin morfolgica y bioqumica .................................................................... 11
2.2.3 Las bacterias y su alcance biolgico e industrial ........................................................ 13
2.2.3.1 Las bacterias en el sistema ecolgico ......................................................................... 13
2.2.3.2 Las bacterias en la salud y la industria........................................................................ 13
2.2.3.3 Las bacterias y el medio ambiente .............................................................................. 13
2.2.4 Polmeros ................................................................................................................... 13
ix
2.2.4.1 Polmeros sintticos .................................................................................................... 14
2.2.4.2 Polmeros naturales o Biopolmeros ........................................................................... 15
2.2.4.3 Polmeros extracelulares ............................................................................................. 16
2.2.4.4 Polmeros intracelulares ............................................................................................. 17
2.2.5 Polihidroxialcanoatos ................................................................................................. 18
2.2.5.1 Tipos de Polihidroxialcanoatos................................................................................... 18
2.2.5.2 Propiedades y aplicaciones de polihidroxialcanoatos ................................................. 20
2.2.5.3 Bacterias y mecanismos de produccin de polihidroxialcanoatos .............................. 21
2.2.5.4 Mtodos de Identificacin de polihidroxialcanoatos .................................................. 22
CAPTULO III
3. METODOLOGA ..................................................................................................... 24
3.1 Metodologa de la Investigacin ................................................................................. 24

3.2 Diseo de la investigacin .......................................................................................... 24
3.3 Unidad de Anlisis ...................................................................................................... 24
3.4 Etapas de la investigacin ........................................................................................... 24
3.4.1 Obtencin de clones bacterianos ................................................................................ 24
3.4.1.1 Recoleccin de las muestras de anlisis...................................................................... 24
3.4.1.2 Criterios para la seleccin de los clones analizados .................................................... 25
3.4.1.3 Recuento bacteriolgico ............................................................................................. 25
3.4.1.4 Aislamiento de los clones de las muestras .................................................................. 26
3.4.1.5 Tincin Gram ............................................................................................................. 26
3.4.2 Anlisis de produccin de polihidroxialcanoatos ....................................................... 26
3.4.2.1 Cultivo de clones en medios especficos para produccin de polihidroxialcanoatos .. 26
3.4.2.2 Cultivo de clones en medios suplementados con diferentes azcares ......................... 27
3.4.2.3 Cultivo de clones en medios salinos ........................................................................... 27
3.4.2.4 Cultivo de clones en medios con diferentes concentraciones de lactosa. .................... 27
3.4.2.5 Cultivo de clones a pH cido. ..................................................................................... 27
3.4.2.6 Prueba de produccin de grnulos de PHA con Tincin Negro Sudn ....................... 28
3.4.2.7 Determinacin de polihidroxialcanoatos mediante espectroscopia Infrarrojo ............. 28
3.4.3 Caracterizacin de bacterias ....................................................................................... 29
3.4.3.1 Prueba de resistencia a metales pesados ..................................................................... 29
3.4.3.2 Prueba de produccin de proteasas ............................................................................. 30
3.4.3.3 Prueba de produccin de lipasas ................................................................................. 30
3.4.3.4 Prueba de produccin de amilasas .............................................................................. 31
3.4.3.5 Pruebas Bioqumicas para identificacin bacteriana ................................................... 31
x
CAPTULO IV
4. RESULTADOS Y DISCUSIN............................................................................... 33
4.1 Obtencin de los clones bacterianos ........................................................................... 33

4.1.1 Recoleccin de las muestras ....................................................................................... 33
4.1.2 Recuento Bacteriolgico Inicial ................................................................................. 33
4.1.3 Anlisis del tipo de bacteria segn el metabolismo de lactosa .................................... 34
4.1.4 Inhibicin del crecimiento bacteriano en el medio especfico ADP............................ 35
4.1.5 Crecimiento bacteriano post-refrigeracin.................................................................. 36
4.1.6 Seleccin de clones bacterianos.................................................................................. 37
4.1.7 Estabilizacin de clones bacterianos........................................................................... 38
4.2 Caractersticas Macroscpicas, microscpicas y tincin Gram de los clones aislados 38
4.2.1 Forma ......................................................................................................................... 38
4.2.2 Superficie ................................................................................................................... 39
4.2.3 Borde .......................................................................................................................... 40
4.2.4 Color .......................................................................................................................... 41
4.2.5 Presencia de Gas......................................................................................................... 42
4.2.6 Segregacin de pigmento en el medio ........................................................................ 43
4.2.7 Tincin Gram ............................................................................................................. 45
4.3 Anlisis de produccin de polihidroxialcanoatos ........................................................ 46
4.4 Caracterizacin bacteriana .......................................................................................... 48
4.4.1 Produccin de Exopolmeros ...................................................................................... 48
4.4.2 Crecimiento en medios cidos .................................................................................... 49
4.4.3 Halotolerancia ............................................................................................................ 50
4.4.4 Resistencia a metales pesados .................................................................................... 51
4.4.4.1 Plomo ......................................................................................................................... 51
4.4.4.2 Mercurio ..................................................................................................................... 52
4.4.4.3 Cobre .......................................................................................................................... 54
4.4.4.4 Cadmio ....................................................................................................................... 55
4.4.4.5 Arsnico ..................................................................................................................... 56
4.4.5 Produccin de enzimas ............................................................................................... 57
4.4.6 Identificacin bacteriana ............................................................................................ 59
CONCLUSIONES .................................................................................................................... 60
RECOMENDACIONES .......................................................................................................... 62
BIBLIOGRAFA
ANEXOS
xi
INDICE DE FIGURAS
Figura 2-1 Contaminacin segn el agente contaminante ......................................................8

Figura 2-2 Representacin de los diferentes tipos de cadenas polimricas ........................... 14
Figura 2-3 Sntesis de dextrano por Leucostonoc mesenteroides ......................................... 16
Figura 2-4 Micrografa de transmisin electrnica de bacterias productoras de PHB .......... 18
Figura 2-5 Frmula General de Polihidroxialcanoatos ......................................................... 19
Figura 2-6 Lminas de PHB extrado de cultivo bacteriano. ................................................ 20
Figura 2-7 Vas metablicas usuales de biosntesis de polihidroxialcanoatos. ..................... 22
Figura 2-8 Tincin de los grnulos de PHAs utilizando Azul de Nilo ................................ 23
Figura 2-9 Espectro FT-IR de una lmina de PHB ............................................................... 23
Figura 4-1 Identificacin de los puntos de muestreo ............................................................ 33
Figura 4-2 Tipo de bacteria segn el metabolismo de lactosa .............................................. 35
Figura 4-3 Diferencia de crecimiento bacteriano en medio nutritivo y ADP ........................ 36
Figura 4-4 Decrecimiento bacteriano post-refrigeracin ...................................................... 37
Figura 4-5 Tipo de forma macroscpica de los clones aislados ............................................ 39
Figura 4-6 Tipo de superficie presentada por las colonias bacterianas ................................. 40
Figura 4-7 Tipo de borde de las colonias bacterianas ........................................................... 41
Figura 4-8 Color macroscpico de las colonias bacterianas ................................................. 42
Figura 4-9 Formacin gas en el clon A17 ............................................................................ 42
Figura 4-10 Presencia de gas en las colonias bacterianas ....................................................... 43
Figura 4-11 Produccin de exopigmento................................................................................ 44
Figura 4-12 Presencia de exopolmeros en clones del Grupo A y B ....................................... 45
Figura 4-13 Tincin Gram del Clon A12 ............................................................................... 46
Figura 4-14 Tincin con Sudan Black del Clon B1 ................................................................ 47
Figura 4-15 Espectro infrarrojo por transformada de Fourier del Clon B1 ............................. 47
Figura 4-16 Formacin de exopolmeros en medio suplementado con D-Glucosa ................. 49
Figura 4-17 Cantidad de clones capaces de producir exopolmeros ....................................... 49
Figura 4-18 Cantidad de clones capaces de crecer en pH cido ............................................. 50
Figura 4-19 Capacidad de halotolerancia a diferentes concentraciones .................................. 51
Figura 4-20 Resistencia a diferentes concentraciones de plomo ............................................. 52
Figura 4-21 Resistencia a diferentes concentraciones de mercurio ........................................ 53
Figura 4-22 Resistencia a diferentes concentraciones de cobre .............................................. 54
Figura 4-23 Resistencia a diferentes concentraciones de cadmio ........................................... 55
Figura 4-24 Resistencia a diferentes concentraciones de arsnico.......................................... 56
xii
Figura 4-25 Produccin de diferentes tipos de enzimas ......................................................... 58
Figura 4-26 Identificacin bacteriana de los clones aislados .................................................. 59
xiii
INDICE DE TABLAS
Tabla 2-1 Mtodos de aislamiento frecuentes......................................................................... 11

Tabla 2-2 Caractersticas ms importantes para identificacin bacteriana. ............................. 12
Tabla 2-3 Principales polmeros sintticos ............................................................................. 15
Tabla 2-4 Tipos de polmeros naturales .................................................................................. 15
Tabla 2-5 Tipos de exopolmeros bacterianos ........................................................................ 17
Tabla 2-6 Principales monmeros constituyentes de polihidroxialcanoatos ........................... 19
Tabla 3-1 Composicin de medio agar para deteccin de polihidroxialcanoatos (ADP) ........ 25
Tabla 3-2 Longitudes de onda caractersticas de la estructura de polihidroxialcanoatos ........ 29
Tabla 3-3 Composicin de medio para analizar resistencia a metales pesados ....................... 30
Tabla 3-4 Composicin de medio para produccin de lipasas ................................................ 31
Tabla 3-5 Pruebas bioqumicas de identificacin ................................................................... 32
Tabla 4-1 Conteo microbiolgico inicial en medio nutritivo .................................................. 34
Tabla 4-2 Cantidad de clones seleccionados por muestra ....................................................... 37
Tabla 4-3 Cantidad de clones aislados por muestra ................................................................ 38
xiv
CAPTULO I
1. INTRODUCCIN
1.1 Identificacin del problema
El principal problema ambiental de la industria lctea es la generacin de aguas residuales

originadas durante la etapa de produccin, las cuales son habitualmente eliminadas sin tratamiento
previo y con alta carga contaminante, en gran parte de carcter orgnico. (Escuela de Organizacin
Industrial de Sevilla, 2008, pp. 9-12)
Las centrales lecheras segn el tipo de planta producen diariamente entre 4 y 10 litros de aguas
residuales por cada litro de leche procesada, procedentes principalmente de la limpieza de
aparatos, mquinas y salas de tratamiento que contienen restos de lcteos y qumicos como cidos,
detergentes, desinfectantes entre otros. (Instituto de Academias de Andaluca, 1995, pp. 14-18).
En Ecuador, segn el Sistema Estadstico Agropecuario Nacional la produccin nacional de leche

en el ao 2011 fue de 6.375 metros cbicos, el mayor aporte de produccin se registra en la regin
sierra con el 75,9%, con el consiguiente impacto ambiental y tendencia de crecimiento. (Instituto
Nacional de Estadsticas y Censos, 2011)
Los envases de plsticos derivados del petrleo, tambin constituyen un impacto ambiental, a
nivel mundial se calcula que aproximadamente 25 millones de toneladas de plsticos se acumulan
en el ambiente cada ao y pueden permanecer inalterables por un periodo comprendido entre 100
y 500 aos, debido a su lenta degradacin que consiste principalmente en la fragmentacin en
partculas ms pequeas. (Ortiz, 2013)
El plstico constituye uno de los materiales ms utilizados en todo el mundo y su disposicin

genera un peligro constante para el medio ambiente, especialmente en el mar donde cada ao se
desechan grandes cantidades de residuos plsticos procedentes de vertederos mal gestionados,
aguas residuales y pluviales, as como actividades comerciales cercanas. (PNUMA-DEAT, 2011,
pp. 21-26)
Un ejemplo representativo del dao ecolgico del plstico se evidencia durante la descarga
indiscriminada de desperdicios plsticos en el mar, que ocasionan daos de nivel letal o subletal
a ms de 260 especies marinas, como consecuencia de su enmaraamiento o enredamiento por el
1
tamao y complejidad del residuo plstico, e igualmente por problemas gastrointestinales
causados por su ingestin al confundirlos con alimento debido a la fragmentacin y reduccin de
su tamao. (PNUMA-DEAT, 2011, pp. 21-26)
Otro problema de los residuos plsticos es el indeseable aspecto que otorgan al medio ambiente,
creando un importante impacto visual negativo. (PNUMA-DEAT, 2011, pp. 21-26)
En el periodo de enero a julio de 2012 las importaciones de materias primas para la industria de
la manufactura de plsticos registradas por el Banco Central del Ecuador, fueron de 236.274
toneladas mtricas con un costo de 386,77 millones de dlares, cuyas mayores importaciones en
valor incluyen polietileno (PE), polietilentereftalato (PET), polipropileno (PP) y policloruro de
vinilo (PVC), materiales que pueden ser reemplazados por polmeros amigables ambientalmente
producidos de manera local, fortaleciendo la produccin nacional y generando una considerable
disminucin a la salida de divisas. (Cmara de Industrias de Guayaquil, 2012)
Bajo este contexto, la presente investigacin pretende aislar, caracterizar e identificar bacterias
de aguas residuales de la industria lctea, capaces de aprovechar dichos fluidos para la produccin
de bioplstico, generando con ello una alternativa ambientalmente amigable y econmicamente
viable a la utilizacin de plsticos derivados de petrleo.
2
1.2 Justificacin de la investigacin
La bsqueda e identificacin de microorganismos en ambientes extremos o poco frecuentes

permite a los investigadores conocer diferentes especies microbiolgicas capaces de producir
nuevos metabolitos de inters industrial, que posteriormente se pueden optimizar mejorando su
capacidad de produccin. (Piero, 2013, pp. 298-306)
El presente estudio busca asilar, caracterizar e identificar bacterias en aguas residuales de la

industria lctea, considerando dichos fluidos como un potencial recurso microbiolgico para la
produccin de biopolmeros, especficamente polihidroxialcanoatos (PHAs), un tipo de
bioplstico cuyo tiempo de degradacin puede ser inferior a los seis meses. (AIMPLAS, 2011)
La identificacin de bacterias capaces de sintetizar polihidroxialcanoatos (PHAs) a partir de

fuentes de carbono renovables, baratas y reproducibles a gran escala, representa una alternativa
ambiental potencialmente viable a la fabricacin de plsticos derivados del petrleo, reduciendo
la contaminacin asociada a su produccin y desecho. (Gonzlez, et al., 2013, pp. 78,79)
La produccin de biopolmeros a partir de bacterias permite el aprovechamiento de grandes

cantidades de residuos de la industria lctea, constituidos mayormente por grasas, protenas,
carbohidratos, calcio y minerales, que sin tratamiento previo se convierten en sustancias
contaminantes. (Valencia & Ramrez, 2009, p. 28)
El aprovechamiento a nivel industrial de biopolmeros hace imprescindible identificar las

bacterias sintetizadoras necesarias para su obtencin, constituyendo la base para cualquier etapa
de produccin a nivel piloto e industrial.
Este proyecto propone la bsqueda, identificacin y utilizacin de microorganismos no

explotados, como una alternativa para solucionar el impacto ambiental que generan las aguas
residuales de la industria lctea, al considerar que la biotecnologa concierne toda aplicacin
tecnolgica que utilice sistemas, organismos o derivados biolgicos con el fin de crear o modificar
productos o procesos. (United Nations, 1992, p. 3)
3
A su vez, el proyecto se fundamenta en el perfil de egreso de la carrera de Ingeniera en
Biotecnologa Ambiental que otorga al estudiante la misin de investigar los impactos
ambientales generados por acciones antropognicas con el fin de proponer soluciones
innovadoras al servicio del entorno bio-social respondiendo a leyes y normativas vigentes.
(ESPOCH, 2013)
El presente proyecto de investigacin se enmarca en las leyes y reglamentos que promueven el

cuidado del ambiente, el desarrollo productivo y la generacin de la ciencia y la tecnologa, que
se dictaminan desde la Carta Magna de la Repblica hasta diversas Nomas Tcnicas.
De forma concreta, la investigacin se enmarca en el Acuerdo 019 del Ministerio del Ambiente
denominado Polticas Generales para la Gestin Integral de Plsticos que dispone en su artculo
4 fomentar la investigacin, transferencia de tecnologa y desarrollo de bioplsticos y plsticos
degradables, en el artculo 11 promover la generacin de incentivos en el uso de plsticos
degradables y finalmente impulsar la produccin de productos degradables y el reemplazo del
plstico tradicional (Ministerio del Ambiente Ecuador, 2014)
Adems, de manera complementaria la investigacin impulsa el cumplimiento de los objetivos

sptimo y dcimo del Plan Nacional del Buen Vivir 2013- 2017, que promueven la prevencin,
control y mitigacin de la contaminacin ambiental, el manejo sustentable y corresponsable de
los recursos, la transformacin de la matriz productiva y el desarrollo del bioconocimiento.
(Secretara Nacional de Planificacin y Desarrollo, 2013) .
4
1.3 Objetivos
1.3.1 Objetivo General
Evaluar bacterias procedentes del agua residual de la industria lctea potencialmente utilizables
para la produccin de biopolmeros (polihidroxialcanoatos).
1.3.2 Objetivos Especficos
Aislar y estabilizar bacterias del agua residual de la industria lctea.
Analizar la produccin de polihidroxialcanoatos de las bacterias aisladas del agua residual

lctea.
Caracterizar las bacterias aisladas mediante pruebas adaptativas, enzimticas y metablicas.
5
CAPTULO II
2. MARCO TERICO
2.1 Antecedentes de la Investigacin
La primera observacin de inclusiones citoplasmticas de reserva en clulas bacterianas fue

realizada por Martinus Beijerinck en el ao de 1888, mientras que en 1925 Maurice Lemoigne
realiz el primer aislamiento de este tipo de compuestos de la bacteria Bacillus megaterium
descubriendo un homopolister de 3-hidroxibutirato, o poli-3-hidroxibutirato (P3HB), cuya
funcin principal era constituir un material de reserva de carbono y energa para impedir el
proceso de autolisis y muerte celular. (Braunegg, et al., 1998, pp. 129, 130) (Belgacem & Gandini,
2011, pp. 452, 453)
Desde 1958, luego de tres dcadas de escaso inters sobre el biopolmero P3HB, algunos
bioqumicos y microbilogos realizaron un extenso proceso de investigacin sobre su produccin
en microorganismos fuera del gnero Bacillus incluyendo a Pseudomonas, Azotobacter,
Hydrogenomonas, Chromatium, Cyanobacterium, entre otros, as como, estudios sobre sus
propiedades qumicas y fsicas, destacando entre las ms importantes el peso molecular, la
temperatura de fusin, el grado de cristalinidad y la morfologa del grnulo, adems se analizaron
algunos mtodos de extraccin, identificacin y cuantificacin del polmero, su metabolismo,
enzimologa, degradacin y funcin fisiolgica. (Babel & Steinbchel, 2001, pp. 52-55)
En el ao de 1974 Wallen y Davis registraron el aislamiento de otro biopolister generado por

Bacillus megaterium con propiedades fsico-qumicas similares al poli-3-hidroxibutirato y cuya
composicin era una combinacin de los monmeros 3-hidroxivalerato (3HV), 3-hidroxibutirato,
3-hidroxihexanoato (3HHx) y 3-hidroxiheptanoato (3HHp), definindose dicho compuesto como
un heteropolmero, razn por la cual, todos los compuestos similares a P3HB posteriormente
fueron denominados como polihidroxialcanoatos (PHAs). (Braunegg, et al., 1998, pp. 130, 131)
Los polihidroxialcanoatos fueron producidos de manera comercial desde inicios de la dcada de

1990 por las empresas Chemie Linz, ICI, Metabolix, ADM, Meredian, Bio on entre otras
procedentes de China, Estados Unidos, Austria y Japn, mientras que nuevos sistemas de
produccin a escala piloto son ampliamente estudiados utilizando nuevos sustratos, por ejemplo,
en 2010 Chakravarty, et al., propusieron un sistema de produccin continua a escala piloto
utilizando como sustrato agua residual de la industria lctea, el cual alcanz una produccin de
6
43 gramos de polihidroxialcanoatos por cada 100 gramos de peso seco del lodo (Braunegg, et al.,
1998, p. 131) (Chen, 2010, pp. 122-129)
Las nuevas investigaciones relacionadas a polihidroxialcanoatos en el presente siglo se basan
fundamentalmente en la utilizacin de diferentes residuos como sustrato para la sntesis de dichos
compuestos, por ejemplo, en 2008 Bengtsson utilizando aguas residuales eliminadas durante la
fabricacin de papel report un rendimiento de 0,10 kilogramo de PHA por kilogramo de
demanda qumica de oxgeno (DQO) del efluente tratado, mientras que en 2010 Bosco &
Chiampo usando lodos activados de aguas residuales lcteas reportaron un rendimiento de 13,82
gramos de PHA por gramo de biomasa luego de 92 horas de experimentacin.
Actualmente existe gran informacin de microorganismos y substratos utilizados para la sntesis

de polihidroxialcanoatos con el fin de identificar cepas microbianas ms productivas y que puedan
utilizar sustratos de bajo costo, dentro de los cuales prevalecen los gneros microbianos
Aeromonas, Alcaligenes, Azotobacter, Bacillus, Pseudomonas y Ralstonia. (Gonzlez, et al., 2013,
pp. 83, 84)
7
2.2 Bases Tericas
2.2.1 Contaminacin
La contaminacin se puede definir como una alteracin del ambiente natural debido a la
introduccin de factores biticos o abiticos de origen natural o antropognico, considerados
perjudiciales para el hombre, la flora y la fauna, provocando problemas de salud pblica, dao
ecolgico, deterioro en la calidad de vida, as como riesgos mutagnicos y genticos. (Snchez,
2005, pp. 162, 163)
En la actualidad, los diferentes enfoques de estudio exhiben diversos tipos de contaminacin,

siendo la clasificacin ms importante la vinculada al agente contaminante, conformada por los
agentes fsicos, qumicos y biolgicos (Figura 2-1) e igualmente la relacionada al sistema
ambiental contaminado, es decir, los recursos abiticos agua, aire y suelo. (Snchez, 2005, pp. 162-
182)
Contaminacin
Fsica Qumica Biolgica
* xidos de Carbono, *Metabolitos biolgicos

* Radiacin azufre y nitrgeno *Polen
* Ruido * Ozono *Organismos patgenos
* Polvo * Plaguicidas y herbicidas causantes de diversas
* Calor enfermedades o reacciones:
* Detergentes y fertilizantes
- Clera
* Metales pesados
(Mercurio, Plomo) - Fiebre tifoidea y
paratifoidea
* Compuesto aromticos
- Parasitosis intestinal
*Nitratos, sulfatos, etc.
- Tricocefalosis
*Hidrocarburos
- Ascaridiasis
* Entre otros
- Virosis
Figura 2-1 Contaminacin segn el agente contaminante

Fuente: CAMACHO, Christian, 2015
8
2.2.1.1 Contaminacin del agua
La contaminacin hdrica es causada fundamentalmente por la actividad humana, a travs, de la

formacin de aguas residuales o negras como resultado de la acumulacin de gran cantidad de
materia orgnica, txica y microorganismos, debido a la descarga de materia fecal, detergentes,
plaguicidas, herbicidas, fertilizantes, desechos industriales y urbanos que generan inconvenientes
de carcter superficial, subterrneo y ocenico. (Snchez, 2005, pp. 168-172)
Algunos de los contaminantes ms comunes en el agua son celulosa, sulfatos, nitratos,

detergentes, plaguicidas, hidrocarburos y metales pesados, adems de otros residuos vertidos por
refineras, termoelctricas, cerveceras, ingenios, curtiduras, petroqumicas, plantas nucleares
entre otras industrias qumicas, cuya combinacin genera un mayor impacto ambiental. (Snchez,
2005, pp. 168-172)
2.2.1.2 Agua residual de la industria lctea
El agua residual producida por la industria de lcteos es de composicin variable y aunque

generalmente est constituida por restos de los productos procesados y de limpieza, depende en
gran medida del tipo de productos elaborados, la capacidad de produccin y la eficiencia de los
procesos de la planta, encontrndose en su conformacin residuos de leche, mantequilla, queso,
casena, as como productos qumicos. (Nemerow & Dasgupta, 1998, pp. 448, 449)
La limpieza con detergentes alcalinos compuestos por hidrxidos y carbonatos, generan aguas
neutras o ligeramente alcalinas, que se tornan cidas rpidamente en medios anaerobios por la
presencia de cido lctico producido durante la fermentacin microbiana de la lactosa, el bajo
nivel de pH originado durante la fermentacin precipita la casena de la leche, la cual durante su
descomposicin forma fangos negros con fuerte olor a cido butrico. (Nemerow & Dasgupta, 1998,
pp. 448, 449)
As mismo, la elaboracin de queso produce aguas residuales cidas debido a la descomposicin

microbiolgica del suero de leche, cuya materia suspendida genera una demanda de oxigeno
considerablemente alta, existiendo de manera general una relacin de 0,1 kilogramo de demanda
bioqumica de oxgeno (DBO) por cada kilogramo de leche cruda. (Nemerow & Dasgupta, 1998,
pp. 448, 449)
9
2.2.1.3 Microbiota en aguas residuales lcteas
Los microorganismos ms abundantes en el agua residual de la industria de lcteos son las

bacterias, destacando entre las ms comunes las acido-lcticas y coliformes, que pueden
desarrollarse durante el proceso de produccin de derivados lcteos o por contaminacin
ambiental, generando un gran aporte de microorganismos al sistema hdrico durante su vertido.
(Celis & Jurez, 2009, pp. 4-16)
Los restos de leche no procesada y de algunos productos lcteos, as como la limpieza de equipos
de produccin sucios o en mal estado, aportan un gran nmero de microorganismos a los vertidos
de agua residual, entre ellos, bacterias pertenecientes a los gneros Streptococcus Lactococcus
Leuconostoc Propionibacterium, Lactobacillus, Enterobacter, Aerogenes, Salmonella,
Alcaligenes y Flavobacterium, as como, hongos de los gneros Candida y Penicillium, formando
una gran diversidad microbiolgica en el vertido residual. (Celis & Jurez, 2009, pp. 4-16)
Existe otro tipo de microorganismos denominados microorganismos ambientales, como las

bacterias del gnero Pseudomonas, que pueden ingresar al vertido residual por la contaminacin
ambiental del aire, superficies de contacto, polvo o insectos, originando una contaminacin
microbiolgica importante durante la generacin de lquidos residuales. (Ellner & Schulz, 2000, pp.
37-40)
La presencia de una alta carga microbiolgica y la composicin rica en nutrientes de la leche y

sus derivados, permiten que los microorganismos se reproduzcan rpidamente en condiciones
ambientales normales, generando una contaminacin microbiolgica promedio de 100.000
unidades formadoras de colonia por mililitro. (Hernndez, 2003, pp. 65-67)
2.2.2 Tcnicas de anlisis microbiolgico
Las tcnicas de anlisis microbiolgico son metodologas utilizadas para detectar, cuantificar e
identificar diferentes especies de microorganismos en una muestra, las tcnicas ms relevantes se
detallan a continuacin. (Gamazo, et al., 2005, p. 1)
2.2.2.1 Inoculacin
La inoculacin es un mtodo de laboratorio que permite establecer microorganismos de una

muestra en soluciones nutritivas o selectivas (medios de cultivo), existen ms de 10.000 medios
de cultivo diferentes y su utilizacin depende exclusivamente del propsito de la investigacin,
10
adems las bacterias deben poseer las condiciones ideales para su crecimiento como temperatura,
humedad, pH, entre otros especficos de cada microorganismo para un adecuado desarrollo.
(Alarcn & Olivas, 2001, pp. 17, 18) (Espinal, 2005, p. 20)
2.2.2.2 Aislamiento
El aislamiento bacteriano es una tcnica que permite separar distintos tipos de colonias
provenientes de una muestra o cultivo y tiene como finalidad obtener una poblacin de
microorganismos procedentes de una misma clula (cultivo puro), existen diversas tcnicas de
aislamiento como se describe en la Tabla 2-1, sin embargo, en todas es necesario utilizar un medio
de cultivo slido que permita la separacin de las colonias. (Hernndez, 2003, pp. 16, 17) (Negroni,
2009, pp. 557, 558)
Tabla 2-1 Mtodos de aislamiento frecuentes
Tipo de Siembra Mecanismo Tcnica

Agotamiento por Agotamiento progresivo y Consiste en realizar mltiples estriados
estras continuo del inculo. en el medio slido en diferentes
secciones, tomando en cada rayado solo
la muestra de la seccin anterior.
Diseminacin en Extensin mltiple del Se extiende con una esptula de
superficie inculo. siembra una mnima cantidad de
muestra (50L) rotando mltiples
veces el medio slido.
Diluciones seriadas Dilucin sucesiva del Consiste en realizar diluciones
inoculo. graduales de la muestra con la finalidad
de sembrar la menor cantidad de
colonias en el medio slido.
2.2.2.3 Identificacin morfolgica y bioqumica
La identificacin microbiolgica permite conocer las categoras taxonmicas de un

microorganismo, al detallar y comparar varias de sus caractersticas, como condiciones de
crecimiento, morfologa, tincin diferencial o pruebas bioqumicas, con otras de microorganismos
conocidos descritos con anterioridad, la Tabla 2-2 detalla las caractersticas ms importantes
utilizadas para la identificacin bacteriana. (Tortora, et al., 2007, pp. 292-297)
11
Tabla 2-2 Caractersticas ms importantes para identificacin bacteriana.
Caracterstica Clasificacin Detalle o Tipo

Puntiforme
Circular
Forma
Filamentosa
Fusiforme
Lisa/Rugosa
Mate/Brillante
Superficie
Seca/Cremosa
Invasiva/Superficial
Morfologa Colonial Plano
Convexo
Elevacin Acuminada
Papilada
Umbilicada
Redondeado
Ondulado
Borde
Filamentoso
Rizoide
Coco
Diplococo
Cocos
Estafilococo
Estreptococo
Bacilo
Morfologa Microscpica
Diplobacilo
Bacilos
Estreptobacilo
Cocobacilo
Espirilos
Vibrio
Conformacin de su membrana
Tincin Gram
plasmtica.
Tincin Diferencial
Propiedades cido alcohol
Ziehl Neelsen
resistentes.
- D - Galactosidasa Metabolizacin de la lactosa.
Degradacin de triptfano con
Indol
produccin de Indol
Catalasa Presencia de enzima Catalasa
Utilizacin de citrato como nica
Citrato
fuente de carbono
Coagulasa Coagulacin de plasma
Pruebas bioqumicas
Descarboxilasas Descarboxilacin de aminocidos
Nitrato Reductasa Capacidad de reduccin de nitratos
Presencia de enzima citocromo c
Oxidasa
oxidasa
Rojo de metileno Fermentacin cido quinta
Ureasa Catlisis de la hidrlisis de la urea.
Voges Proskauer Fermentacin butanodilica.
12
2.2.3 Las bacterias y su alcance biolgico e industrial
Las bacterias tienen diversos campos de estudio y aplicacin, desde el rea de la salud hasta el
agrcola, las aplicaciones ms relevantes se detallan a continuacin
2.2.3.1 Las bacterias en el sistema ecolgico
Las bacterias son imprescindibles para el sistema ecolgico debido a que participan en
mecanismos de reciclaje de elementos vitales como oxgeno, nitrgeno y carbono, iniciando
cadenas trficas e integrando sistemas simbiticos que ayudan al desarrollo de macro-especies.
(Leonor, 2010, pp. 212, 213)
2.2.3.2 Las bacterias en la salud y la industria
El estudio de bacterias permite el tratamiento de infecciones y enfermedades graves o mortales,

la produccin de antibiticos, biopolmeros y protenas, as como, la obtencin de sustancias de
origen fermentativo como yogurt, queso, yakult, sauerkraut y cido actico. (Leonor, 2010, pp. 212,
213)
2.2.3.3 Las bacterias y el medio ambiente
Las bacterias son de gran inters en el rea ambiental siendo utilizadas en el tratamiento de
desechos slidos, degradacin de sustancias txicas, descontaminacin de residuos petroleros,
purificacin del agua y la produccin de energas alternativas. (Morcillo, et al., 2013, pp. 39, 40)
2.2.4 Polmeros
El trmino polmero es la unin de vocablos griegos, cuyo prefijo poli significa muchos y la raz
mero significa parte, es decir, un polmero es el resultado de la asociacin de una gran cantidad
de unidades individuales o partes denominadas monmeros, unidas a travs de un proceso
qumico llamado polimerizacin, formando una larga cadena monomrica. (Teegarden, 2004, pp.
13,15)
13
Un polmero puede estar constituido por la repeticin de un mismo monmero n veces formando
un compuesto llamado homopolmero, o a su vez puede estar conformado por diferentes tipos de
monmeros denominados genricamente copolimeros, cuya posicin, estructura y enlace pueden
cambiar notablemente las diferentes propiedades del polmero, la Figura 2-2 detalla las
configuraciones de las cadenas polimricas ms frecuentes. (Teegarden, 2004, pp. 13,15)
Figura 2-2 Representacin de los diferentes tipos de cadenas polimricas

Fuente: Teegarden, 2004, p. 14
2.2.4.1 Polmeros sintticos
Un polmero sinttico es un compuesto de carcter antropognico sintetizado mediante reacciones

y procesos qumicos conocidos, la mayora son de naturaleza orgnica y utilizan como materia
prima derivados de petrleo, sin embargo, existen algunos polmeros sintticos inorgnicos como
la silicona, la Tabla 2-3 describe los principales polmeros sintticos conocidos. (Teegarden, 2004,
pp. 5-8)
14
Tabla 2-3 Principales polmeros sintticos
Tipos de Descripcin Ejemplos Usos

polmero
Plsticos Compuestos cuya forma puede * Poliestireno * Botellas
ser modificada utilizando calor. * Policloruro de vinilo * Juguetes
Fibras Polmeros con alta resistencia * Nylon * Ropa
procesados en forma de hebras * Polister * Redes de pesca
largas.
Pelculas Polmeros con resistencia en * Polietileno * Fundas
dos dimensiones. * Polister * Pinturas
Elastmeros Polmeros con capacidad * Polibutadieno * Ltex
variable de estiramiento. * Poliisopreno * Llantas
Adhesivos Compuesto que proporciona la * Poliepxido *Pegamento
fuerza de atraccin fsica * Alcohol de polivinilo *Epoxi-cemento
necesaria para unir dos
superficies.
Fuente: Teegarden, 2004, pp. 6,7
Realizado por: CAMACHO, Christian, 2015
2.2.4.2 Polmeros naturales o Biopolmeros
Un polmero natural o biopolmero es una macromolcula sintetizada a travs de un proceso

biolgico dentro de las clulas, generalmente por una reaccin de condensacin catalizada por
enzimas, entre los biopolmeros ms importantes destacan las protenas, ADN y polisacridos,
como se detalla en la Tabla 2-4. (Garca, et al., 1993, pp. 423, 424)
Tabla 2-4 Tipos de polmeros naturales
Tipo de Biopolmeros Ejemplo

Polisacridos
Estructurales Celulosa
De reserva Amilopectina
Formadores de gel Mucopolisacridos
Protenas Enzimas
Polinucletidos ADN
Poliisoprenos Caucho natural
Polisteres Poli-3-hidroxibutirato
Ligninas Ligantes de pared celular
Fuente: Teegarden, 2004, p. 5
Las enzimas que participan en una reaccin de polimerizacin determinan de manera especfica
el tipo y cantidad de monmeros, as como la secuencia de distribucin y estereoqumica de cada
cadena polimrica. (Teegarden, 2004, pp. 27, 28)
15
2.2.4.3 Polmeros extracelulares
Los polmeros extracelulares son polmeros orgnicos que se depositan en el exterior de la pared
celular formando una capa laxa semi-amorfa, pueden permanecer adheridos a la pared celular
formando un revestimiento externo denominado cpsula, o formar acumulaciones ms dispersas
y separadas dependiendo de la abundancia y solubilidad del polmero. (Stanier, et al., 1996, pp. 176,
177)
Figura 2-3 Sntesis de dextrano por Leucostonoc mesenteroides

Fuente: Stanier, et al., 1996, p. 176
Los exopolmeros no son esenciales para las funciones vitales pero ayudan a inmovilizar virus,
facilitar las interacciones celulares, adems de mejorar la adhesin superficial, capacidad de
invasin y resistencia a fagocitos y agentes antibacterianos naturales. (Stanier, et al., 1996, pp. 176,
177)
La composicin variable de los exopolmeros detallada en la Tabla 2-5, depende de los nutrientes
externos, pudiendo estar constituidos por aminocidos (generalmente D-cido glutmico) y
polisacridos sintetizados a travs de precursores nucleotdicos de un azcar, habitualmente UDP-
glucosa, -galactosa, -fucosa, -manosa entre otros. (Stanier, et al., 1996, pp. 176, 177)
16
Tabla 2-5 Tipos de exopolmeros bacterianos
Tipo de Organismo
Polmero Subunidades Estructura
Exopolmeros productor
cido
cido glutmico Bacillus anthracs
poliglutmico -
Exopolipptidos Polipptido (Usualmente B. megaterium
glutamil--
ismero D)
glutamil-
Celulosa Glucosa -glu-14 -glu Acetobacter xylinum
Agrobacterium
Glicano Glucosa -glu-12 -glu
tumefaciens
Glucosa,
galactosa,
cido colnico fucosa, A. Bacterias entricas
glucurnico, A.
pirvico
Pseudomonas
cido
aeruginosa
Poliurnidos manurnico, A.
Azotobacter
glucurnico
Exopolisacridos vinelandii
sintetizados a Polisacaridos
partir de pneumoccicos:
nucletidos del Glucosa,
azcar Tipo II ramnosa, A.
glucurnico
Glucosa, A. -(-3--glucuronil Streptococcus
Tipo III
glucurnico 14 -glucosil)- pneumoniae
Glucosa,
ramnosa, N-
Tipo XIX acetil-
manosamina,
fosfato
Glucosa,
Tipo XXXIV galactosa,
ribitol, fosfato
Glucosa -fru--glu 16 Leuconostoc spp.
Dextranos
Exopolisacridos (fructosa) -glu Streptococcus spp.
sintetizados a Pseudomonas spp.
Fructosa -glu- -fru 26
partir de sacarona Levanos Xanthomonas spp.
(glucosa) -fru
Bacillus spp.
Fuente: Stanier, et al., 1996, p. 176
2.2.4.4 Polmeros intracelulares
Los polmeros intracelulares son macromolculas que se acumulan en el citoplasma celular, la

cantidad de produccin de estos compuestos se encuentra limitada por el espacio citoplasmtico
y su rendimiento es determinado por la densidad celular y la fraccin del polmero en la biomasa.
La obtencin de biopolmeros intracelulares puros requiere su separacin de la clula mediante
lisis celular, algunos ejemplos de polmeros intracelulares de importancia biotecnolgica son
polihidroxialcanoatos (PHAs), glicgeno, almidn y polifosfatos. (Steinbchel, 2001, p. 5)
17
2.2.5 Polihidroxialcanoatos
Los polihidroxialcanoatos son polmeros biodegradables compuestos por varios

hidroxialcanoatos y constituyen un material de reserva de energa y carbono para numerosos
microorganismos, generalmente son producidos cuando un nutriente esencial de crecimiento
como nitrgeno o fsforo est disponible en concentraciones limitadas y la concentracin de
carbono es elevada, formando inclusiones citoplasmticas denominadas grnulos de PHA.
(Khanna & Ashok, 2005, pp. 607, 608) (Reddy, et al., 2003, p. 138) (Steinbchel, 2001, p. 6).
Figura 2-4 Micrografa de transmisin electrnica de bacterias

productoras de PHB
Fuente: Berlanga, et al., 2006, p. 98
2.2.5.1 Tipos de Polihidroxialcanoatos
Los polihidroxialcanoatos pueden estar constituidos por ms de 100 diferentes unidades de

monmeros, cuya frmula general conformada por tomos de carbono, oxgeno e hidrgeno se
representa en la Figura 2-5. (Braunegg, et al., 1998, p. 132) (Reddy, et al., 2003, p. 138)
Cada polihidroxialcanoato contiene entre 100 y 30.000 monmeros iguales o diferentes, su

diferencia radica en el largo de la cadena carbonada, generalmente conformada entre 3 y 14
tomos de carbono, y el grupo radical que lo conforma normalmente hidrn, metil, etil, entre
otros, tal como se detalla en la Tabla 2-6. (Lee & Chang, 2006, p. 28). (Khanna & Ashok, 2005, p. 608)
(Braunegg, et al., 1998, p. 132)
18
H
O C (CH2)n C
R O X
Figura 2-5 Frmula General de Polihidroxialcanoatos

Fuente: Lee, 1996, p. 2
Los polihidroxialcanoatos generalmente se clasifican en tres grupos de acuerdo a sus monmeros

constituyentes, si la estructura est compuesta exclusivamente por monmeros iguales (homo-
polmeros) de 3 a 5 tomos de carbono son denominados de cadena corta (PHA-scl por sus siglas
en ingls), a su vez, si los monmeros que constituyen el polmero tienen de 6 a 14 tomos de
carbono son considerados de cadena media (PHA-mcl), mientras que la composicin estructural
por monmeros diferentes (hetero-polmeros) son denominados de cadena mixta (PHA MCM)
(Cardona, et al., 2013, p. 7129). (Khanna & Ashok, 2005, p. 608)
Tabla 2-6 Principales monmeros constituyentes de polihidroxialcanoatos
Longitud de
Smbolo Nombre Radical
cadena
3HP cido 3-hidroxi-propinico (CH2) H
3HB cido 3-hidroxi-butrico (CH2) CH3
3HV cido 3-hidroxi-valrico (CH2) CH2 - CH3
3HHx cido 3-hidroxi-hexanoico (CH2) (CH2)2 - CH3
3HHp cido 3-hidroxi-heptanoico (CH2) (CH2)3 - CH3
3HO cido 3-hidroxi-octanoico (CH2) (CH2)4 - CH3
3HN cido 3-hidroxi-nonanoico (CH2) (CH2)5 - CH3
3HD cido 3-hidroxi-decanoico (CH2) (CH2)6 - CH3
3HUD cido 3-hidroxi-undecanoico (CH2) (CH2)7 - CH3
3HDD cido 3-hidroxi-dodecanoico (CH2) (CH2)8 - CH3
3HTD cido 3-hidroxi-tetradecanoico (CH2) (CH2)10 - CH3
3HHxD cido 3-hidroxi-hexadecanoico (CH2) (CH2)12 - CH3
4HB cido 4-hidroxi-butrico (CH2)2 CH3
4HV cido 4-hidroxi-valrico (CH2)2 CH2 - CH3
4HHx cido 4-hidroxi-hexanoico (CH2)2 (CH2)2 - CH3
4HHp cido 4-hidroxi-heptanoico (CH2)2 (CH2)3 - CH3
4HO cido 4-hidroxi-octanoico (CH2)2 (CH2)4 - CH3
4HD cido 4-hidroxi-decanoico (CH2)2 (CH2)6 - CH3
5HV cido 5-hidroxi-valrico (CH2)3 CH2 - CH3
5HHx cido 5-hidroxi-hexanoico (CH2)3 (CH2)2 - CH3
6HHp cido 6-hidroxi-heptanoico (CH2)4 (CH2)3 - CH3
6HDD cido 6-hidroxi-dodecanoico (CH2)4 (CH2)8 - CH3
3HPE cido 3-hidroxi-4-pentenoico (CH2) CH=CH2
Fuente: Steinbchel, 2001, pp. 220 - 223
19
2.2.5.2 Propiedades y aplicaciones de polihidroxialcanoatos
Los polihidroxialcanoatos en general comparten ciertas caractersticas claves para su aplicacin

en el rea industrial, mdica, agrcola y farmacutica, destacando entre las ms importantes que
son compuestos termoplsticos parcialmente cristalinos, elastmeros biodegradables,
biocompatibles, enantiomricamente puros, insolubles en agua, no txicos, con alto grado de
polimerizacin por encima de 105 Da y que exhiben propiedades piezomtricas. (Steinbchel, 2001,
p. 7)
De forma especfica, dependiendo de su composicin monomrica tenemos PHAs de cadena

corta como el polihidroxibutirato (PHB) con peso molecular de 10 a 3.000 kDa, polidispersidad
cercana a 2, densidad de 1,18 a 1,26 g/cm 3, temperatura de transicin de 453 K, cristalidad de 55
a 80% y propiedades mecnicas similares al propileno (Mdulo de Young y resistencia a
traccin), mientras que los de cadena media son elsticos, semicristalinos con elevado
alargamiento de rotura, resistencia a la traccin y bajo punto de fusin. (Khanna & Ashok, 2005, pp.
613 - 615) (Sudesh, et al., 2000, pp. 1525 - 1531)
Figura 2-6 Lminas de PHB extrado de cultivo bacteriano.

Fuente: Bernldez, 2007
Los polihidroxialcanoatos pueden ser utilizados como materia prima para la fabricacin de
artculos desechables y de embalaje, materiales de osteosntesis (por su biocompatibilidad y
propiedades piezoelctricas), sistemas de liberacin controlada de medicamentos, fertilizantes y
biocidas y en ingeniera de tejidos para la produccin de parches pericrdicos, pulmonares e
injertos vasculares. (Khanna & Ashok, 2005, p. 615).
Actualmente, nuevas investigaciones analizan las propiedades farmacolgicas de los

polihidroxialcanoatos conformados por monmeros 4-hidroxibutirato para su uso en el
20
tratamiento del sndrome de abstinencia alcohlica y la narcolepsia, as como su potencial
aplicacin en esquizofrenia crnica y catatnica, psicosis atpicas, neurosis, sndrome cerebral
crnico, enfermedades neurofarmacolgicas, drogadiccin, hipertensin, Parkinson, exposicin a
radiacin, cncer e infarto de miocardio. (Rapra Technology, 2005, p. 240)
2.2.5.3 Bacterias y mecanismos de produccin de polihidroxialcanoatos
La ruta metablica para producir polihidroxialcanoatos depende en gran parte del sustrato de
partida y del tipo de enzima PHA sintasa utilizada como catalizador, que se clasifica de acuerdo
a su estructura primaria y al tipo de polihidroxialcanoato producido, el detalle de las rutas de
produccin de PHA se visualiza en la Figura 2-7, mientras que los tipos de PHA sintasa se
describen a continuacin. (Lee, 1996, pp. 2, 3)
La PHA Sintasa Clase I es una enzima de peso molecular entre 60 a 65 kDa, formada por la
subunidad phaC, genera polihidroxialcanoatos de cadena corta, es decir, conformados por una
nmero entre 3 y 5 tomos de carbono, algunas de las bacterias representativas de sintasa PHA
clase I son Ralstonia eutropha, bacterias prpuras de azufre y cianobacterias. (Khanna & Ashok,
2005, pp. 608-615)
La PHA Sintasa Clase II est conformada por la subunidad phaC pero produce
polihidroxialcanoatos de cadena mediana cuya cantidad de tomos de carbono vara entre 6 y 14,
presentando poca especificidad del grupo radical libre R, la especie bacteriana ms caracterstica
es Pseudomonas oleovorans. (Reddy, et al., 2003, pp. 139-141)
La PHA Sintasa Clase III est formado por las subunidades phaC y phaE, cada una con peso
aproximado de 40 kDa, forma polihidroxialcanoatos de cadena corta y su bacteria representativa
es Chromatium vinosum. (Rapra Technology, 2005, pp. 232-235)
21
Figura 2-7 Vas metablicas usuales de biosntesis de polihidroxialcanoatos.
Fuente: Rapra Technology, 2005, p. 232
2.2.5.4 Mtodos de Identificacin de polihidroxialcanoatos
Existen diversos mtodos de anlisis de polihidroxialcanoatos, entre ellos, las tcnicas de tincin
de los grnulos de PHAs son muy comunes, habitualmente la tincin por fluorescencia es
utilizada para anlisis In Vivo, a travs de colorantes especficos como Azul Nilo A y Rojo Nilo
que son oxazinas bsicas hidrfilas con gran afinidad al polmero y cuya reaccin expresa un
22
color naranja fluorescente en una longitud de onda de 460nm, tal como se visualiza en la Figura
2-8. (Anderson & Dawes, 1990, p. 453) (Braunegg, et al., 1998, p. 143)
Otra mtodo de tincin para la identificacin de polihidroxialcanoatos es utilizando el colorante

lipofilico Negro Sudan B que permite la coloracin en placa de los grnulos de PHA y que debido
al carcter lipdico de dichos polmeros forma inclusiones azul y negro dentro de la clula, siendo
una tcnica ampliamente utilizada por la fcil obtencin, manipulacin y bajo. (Anderson & Dawes,
1990, p. 453) (Braunegg, et al., 1998, p. 143)
Figura 2-8 Grnulos de PHAs utilizando Azul de Nilo

Fuente: Berlanga, et al., 2006, p. 97
Cabe destacar que nuevas investigaciones han analizado la utilizacin de espectroscopia de

infrarrojo por transformada de Fourier como mecanismo de anlisis cualitativo rpido para
identificar los polmeros PHA dentro de las clulas o purificados, mediante la deteccin de picos
de absorbancia caractersticos, principalmente los producidos por el grupo ster cuya excitacin
molecular se presenta en longitudes de onda cercanas a 1185 y 1724 cm-1 (Figura 2-9). (Hong, et
al., 1999, pp. 523-525)
Figura 2-9 Espectro FT-IR de una lmina de PHB

Fuente: Randriamahefa, et al., 2003, p. 1093
23
CAPTULO III
1. METODOLOGA
3.1 Metodologa de la Investigacin
La presente investigacin es de tipo Exploratoria-Descriptiva, pues el tema no ha sido abordado

anteriormente en nuestro pas, generando los resultados de manera descriptiva con la finalidad de
detallar los eventos registrados durante la investigacin.
3.2 Diseo de la investigacin
La investigacin tiene un diseo experimental pues ejecuta tcnicas de laboratorio y campo, por
lo cual ejerce influencia sobre diferentes variables con la finalidad de satisfacer las hiptesis de
la investigacin.
3.3 Unidad de Anlisis
El agua residual generada en la empresa Lcteos Santilln PRASOL, ubicada en la Parroquia

San Luis del cantn Riobamba, Provincia de Chimborazo, Ecuador.
3.4 Etapas de la investigacin

La investigacin se encuentra dividida en tres etapas detalladas a continuacin.
3.4.1 Obtencin de clones bacterianos

Para la obtencin de los clones de estudio se realizaron las siguientes tcnicas durante la
experimentacin:
3.4.1.1 Recoleccin de las muestras de anlisis
Para la recoleccin de las muestras de anlisis se reconoci la planta de produccin de la empresa

Lcteos Santilln, as como los puntos de descarga y estancamiento de agua residual utilizando
equipo de bioseguridad, con el fin de identificar los lugares que contenan agua residual con un
tiempo de estancamiento superior a 48 horas.
24
Posteriormente se recolectaron entre 25 y 50 ml de muestra de agua residual de los puntos
seleccionados en frascos plsticos estriles, siendo conservadas a una temperatura de 4C hasta
su anlisis microbiolgico. (Jover & Garca, 2004, pp. 242, 243)
3.4.1.2 Criterios para la seleccin de los clones analizados
La investigacin fue desarrollada utilizando dos criterios diferentes para la seleccin de los clones
evaluados para la produccin de PHA, el primero denominado Grupo A utiliza bacterias
inoculadas directamente en el medio especifico de produccin detallado en la Tabla 3-1 y el
segundo conjunto denominado Grupo B utiliza bacterias con caractersticas metablicas
especficas obtenidas de las muestras despus de ser sometidas a 45 das de refrigeracin,
utilizando pruebas de fermentacin con Agar MacConkey y oxidacin con tiras de oxidasa,
comprobando siempre su crecimiento en medio nutritivo para mtodos estndar. (Motamedi, et al.,
2015, p. 95) (Arroyave, et al., 2013, pp. 71, 72)
Tabla 1-1 Composicin de medio agar para deteccin de

polihidroxialcanoatos (ADP)
Componente Contenido (g/l)

Glucosa 20
KH2PO4 13.3
MgSO4 1.3
(NH4)2SO4 2
Ac. Ctrico 1.7
Bacto Agar 15
FeSO4.7H2O 0.1
ZnSO4.7H2O 0.0225
CuSO4.5H2O 0.01
MnSO4.5H2O 0.005
CaCl2.2H2O 0.02
Na2B4O7.10H2O 0.0023
(NH4)6Mo7O24 0.001
Fuente: Motamedi, et al., 2015, p. 95
3.4.1.3 Recuento bacteriolgico
Para el recuento de las bacterias presentes en las muestras se prepararon medios agarizados segn
cada criterio de seleccin, luego se realizaron diluciones seriadas de las muestras desde 10-1 hasta
10-4 utilizando agua de peptona estril, se inocularon por triplicado 25l de cada dilucin por
25
extensin en placa utilizando una esptula de Drigalski y finalmente se pusieron en incubacin a
una temperatura de 30 grados Celsius por 72 horas. (Negroni, 2009, pp. 557, 558)
Una vez transcurrido el periodo de incubacin se realiz el conteo de las unidades formadoras de
colonia presentes en cada caja, expresando el resultado en trminos de media aritmtica y
logartmica con sus principales parmetros estadsticos. (Negroni, 2009, pp. 557, 558)
3.4.1.4 Aislamiento de los clones de las muestras
Despus de realizar el conteo de microorganismos se clasificaron las bacterias segn el criterio

de seleccin, las bacterias del grupo A fueron obtenidas del medio especfico para produccin de
polihidroxialcanoatos considerando su crecimiento y caractersticas macroscpicas como color,
gas y forma, mientras que en el grupo B se escogieron bacterias no fermentadoras de lactosa
oxidasa positiva, dichas bacterias fueron repicadas a una nueva caja Petri con medio ADP.
(Arroyave, et al., 2013, pp. 71, 72)
Cada clon seleccionado fue estabilizado en el medio ADP mediante tres repiques sucesivos cada
72 horas. Posteriormente para asegurar el crecimiento de un solo tipo de colonia se realiz un
reaislamiento por agotamiento mediante tcnica de estriado. (Alarcn & Olivas, 2001, pp. 17, 18)
3.4.1.5 Tincin Gram
Cada clon luego de su aislamiento fue analizado mediante Tincin diferencial de Gram analizando
su morfologa microscpica y el tipo de reaccin. (Espinal, 2005, pp. 14-16)
3.4.2 Anlisis de produccin de polihidroxialcanoatos
Para el anlisis de la produccin de polihidroxialcanoatos en los clones aislados se establecieron

las siguientes tcnicas de laboratorio:
3.4.2.1 Cultivo de clones en medios especficos para produccin de polihidroxialcanoatos
Para estimular la produccin de polihidroxialcanoatos en los clones aislados se prepararon

diferentes variaciones del medio de cultivo ADP como se detalla a continuacin.
26
3.4.2.2 Cultivo de clones en medios suplementados con diferentes azcares
Con el fin de estudiar la produccin de PHA en medios suplementados con diferentes azcares se
prepararon medios slidos utilizando el medio de cultivo ADP y reemplazando el azcar de la
formulacin inicial por Glucosa, Lactosa y Sacarosa. (Samrot, et al., 2011, p. 197)
Posteriormente se realizaron repiques de cada clon dejando incubar a una temperatura de 30
grados Celsius por 72 horas y analizando la produccin de PHA cada 24 horas. Cada prueba fue
realizada por triplicado con su control de crecimiento.
3.4.2.3 Cultivo de clones en medios salinos
Algunas bacterias producen PHA como mecanismo de osmorregulacin en condiciones de

salinidad elevadas, con tal finalidad, se realizaron medios en placa utilizando una solucin de
medio ADP suplementado con porcentajes de cloruro de sodio al 2.5, 5, 7.5 y 10 % p/v.
(Quillaguamn, et al., 2009, pp. 1688,1689)
Posteriormente se realizaron repiques de cada clon en los diferentes medios, dejando incubar a
una temperatura de 30 grados Celsius por 120 horas, luego de comprobar su crecimiento se
analiz la produccin de PHA cada 24 horas, realizando la prueba por triplicado, as como
controles de crecimiento.
3.4.2.4 Cultivo de clones en medios con diferentes concentraciones de lactosa.
Considerando que la produccin de PHA se genera como resultado de una amplia diferencia entre
los niveles de carbono y nitrgeno durante el crecimiento bacteriano, se prepararon medios de
cultivo cuya relacin carbono/nitrgeno sea mayor a 20, utilizando el medio de cultivo ADP
suplementado con porcentajes de lactosa al 2, 4, 8 y 16 % p/v como nica fuente de carbono.
(Samrot, et al., 2011, p. 197)
Posteriormente se realizaron repiques de cada colonia, dejando las cajas inoculadas en incubacin
a una temperatura de 30 grados Celsius por 72 horas y analizando la produccin de PHA cada 24
horas. Cada prueba fue realizada por triplicado efectuando controles de crecimiento.
3.4.2.5 Cultivo de clones a pH cido.
Para inducir la produccin de PHA en los clones en condiciones cidas se utiliz medio de cultivo
ADP vertido en placa previamente ajustado a pH 4 con cido clorhdrico 2N. Posteriormente se
realizaron repiques de cada colonia y su incubacin a una temperatura de 30 grados Celsius por
27
120 horas, visualizando la produccin de PHA de las colonias cada 24 horas. (Naheed & Jamil,
2014, p. 418)
3.4.2.6 Prueba de produccin de grnulos de polihidroxialcanoatos con Tincin Negro Sudn
La tincin con Negro Sudan B permite analizar la produccin de polihidroxialcanoatos, para tal
finalidad a las colonias inoculadas en cada medio ADP se les realiz un frotis microbiolgico,
utilizando para su fijacin calor o llama permitiendo la coagulacin citoplasmtica celular.
Posteriormente se colocaron algunas gotas de la solucin Negro Sudn (0.3g en 100ml de etanol
al 70% en volumen) sobre el frotis, dejndolo reposar por 5 a 15 minutos (tiempo suficiente para
la absorcin del colorante y la evaporacin del alcohol) y se retir el exceso de solucin colorante
utilizando papel filtro. (Blanco, 2010, p. 23)
El frotis fue lavado con alcohol etlico al 96% eliminando el exceso de colorante Sudan Black,
para un mejor anlisis de la muestra se coloc un colorante de contraste (generalmente solucin
safranina 1% p/v), se lav el exceso con una corriente ligera de agua y se esper que la muestra
teida este totalmente seca. (Blanco, 2010, p. 23)
Secuencialmente se aadi una gota de aceite de inmersin sobre la extensin realizada y se

visualiz en el microscopio utilizando el lente de inmersin 100X, la observacin de
incrustaciones azules-oscuras dentro de las clulas teidas color rosa determina la presencia de
grnulos de PHAs. (Blanco, 2010, p. 23)
3.4.2.7 Determinacin de polihidroxialcanoatos mediante espectroscopia Infrarrojo
Para comprobar los resultados luego de la tincin con Negro Sudan B se realiz un anlisis de la
presencia de polihidroxialcanoatos por espectroscopia de infrarrojo, para ello se realiz un frotis
de cada clon inoculado, se coloc una pequea cantidad sobre el cristal de ATR y se realiz el
barrido de la muestra en una longitud de onda de 400 a 4000 cm -1, cuyos espectros fueron
procesados corrigiendo su lnea base y eliminando ruido, CO2 y H2O, finalmente se verific la
absorbancia en las longitudes de onda especficas del compuesto, tal como se detalla en la Tabla
3-2. (Randriamahefa, et al., 2003, pp. 1093-1095) (Hong, et al., 1999, pp. 524,525)
Cabe destacar que antes de analizar la muestra en el Espectrofotmetro de Infrarrojo por

transformada de Fourier, se limpi el cristal del ATR de Seleniuro de Zinc utilizando alcohol y
posteriormente se realiz la eliminacin de fondo sin la existencia de muestra.
28
Tabla 1-2 Longitudes de onda caractersticas de la estructura de polihidroxialcanoatos
Tipo de Tipo de Grupo Enlace Longitud de Intensidad

Muestra PHA Funcional Onda (cm-1)
Clulas PHB ster C=O 1724-1732 Fuerte y
Intactas C-O 1180-1185 Aguda
mcl PHA ster C=O 1731-1744 Fuerte y
C-O 1163 Aguda
PHA PHB ster C=O 1724-1728 Fuerte y
purificado C-O 1185 Aguda
mcl PHA ster C=O 1732-1742 Fuerte y
C-O 1165 Aguda
Fuentes: Randriamahefa, et al. 2003, pp. 1093-1095. Hong, et al, 1999, pp. 524,525.
3.4.3 Caracterizacin de bacterias

Con la finalidad de analizar las caractersticas adaptativas y metablicas de las bacterias aisladas
se realizaron las siguientes pruebas de laboratorio:
3.4.3.1 Prueba de resistencia a metales pesados
Para identificar los clones capaces crecer en presencia de metales pesados se prepararon medios
de cultivo utilizando una solucin de medio mnimo con la formulacin descrita en la Tabla 3-3
suplementado por los metales pesados Arsnico (NaAsO2), cadmio (Cd(NO3)2*4H2O), cobre
((Cu(NO3)2*3H2O)), mercurio (Hg(NO3)2*H2O) y plomo (Pb(CH3COO)23H2O) a una
concentracin de 0.5, 5 y 50 mg/ml. (Moraga, et al., 2003, pp. 92, 93)
29
Tabla 1-3 Composicin de medio para analizar resistencia a
metales pesados
Componente Contenido (g/l)

Levadura 0.005
KH2PO4 1.72
K2HPO4 4.45
NH4Cl 2.16
MgSO4 0.195
Bacto Agar 15
FeSO4.7H2O 0.01
MnSO4.9H2O 0.05
CaCl2.2H2O 0.003
Posteriormente se realizaron repiques de cada clon dejando las cajas inoculadas en incubacin a
una temperatura de 30 grados Celsius por 120 horas, comprobando su crecimiento cada 24 horas.
3.4.3.2 Prueba de produccin de proteasas
Para el anlisis de proteasas, se prepar el medio Agar Leche cuya preparacin se efecta
disolviendo 2 g de leche descremada en polvo en 10 mililitros de agua destilada y preparando 90
mililitros de una suspensin de medio nutritivo agarizado. (Malajovich, 2015)
Ambas soluciones se esterilizaron separadamente y fueron mezcladas cuando alcanzaron la

temperatura de 60 grados Celsius para posteriormente ser distribuidas en placas de Petri.
Se realiz la inoculacin de todas las colonias y se dej en incubacin a una temperatura de 30
grados Celsius por 72 horas, finalmente posterior al crecimiento del clon la formacin de un halo
transparente alrededor de la colonia permiti verificar la presencia de proteasas. (Malajovich, 2015)
3.4.3.3 Prueba de produccin de lipasas
Para analizar la presencia de lipasas en los clones estudiados se prepar un medio que estimule
su produccin utilizando una solucin de agar mnimo con la composicin detallada en la Tabla
3-4 para un volumen de 500 mililitros. (Universidad Central de Venezuela, 2009)
30
Tabla 1-4 Composicin de medio para produccin de lipasas
Componente Contenido (g)

Peptona 20
Na2HPO4 2.5
NaCl 1.0
Glucosa 1.0
Agar 12.5
MgSO4 0.0005
Posteriormente la solucin fue calentada, homogenizada y ajustada a pH de 7, as mismo se realiz

el lavado y desinfeccin de la cascara de huevo.
Luego de esterilizar y enfriar el medio a una temperatura de 60 grados Celsius, se aadi de forma
asptica la yema de huevo, agitando de forma constante hasta su homogenizacin y distribuyendo
el medio realizado en cajas Petri.
Las placas agarizadas fueron inoculadas y a continuacin incubadas por un periodo de 72 horas a
una temperatura de 30 grados Celsius, posterior a su crecimiento la presencia de una zona opaca
alrededor de la colonia microbiana demostraba la existencia de lipasas.
3.4.3.4 Prueba de produccin de amilasas
El medio utilizado para la prueba de amilasa es denominado Agar Almidn y fue preparado
disolviendo 0.1 g de almidn en 10 mililitros de agua destilada y realizando una suspensin de 90
mililitros de Agar medio nutritivo, ambas soluciones fueron mezcladas para posteriormente
esterilizar el resultado y distribuirlo en placas de Petri. (Malajovich, 2015)
Luego se realiz la inoculacin de todas las colonias y se dej en incubacin a una temperatura
de 30 grados Celsius por 72 horas, posterior al crecimiento de las colonias se adicion el reactivo
Lugol y se visualiz la formacin de un halo transparente alrededor de las colonias con resultado
positivo para presencia de amilasas (Malajovich, 2015)
3.4.3.5 Pruebas Bioqumicas para identificacin bacteriana
El anlisis bioqumico para la identificacin de los clones se realiz utilizando las pruebas
descritas en la Tabla 3-5.
31
Tabla 1-5 Pruebas bioqumicas de identificacin
Tipo de Agar o reactivo Prueba bioqumica

Agar MacConkey Fermentacin de lactosa
Presencia de citocromo
Tiras de Oxidasa
oxidasas
Movilidad
Produccin de indol
Agar SIM e Indol
Produccin de sulfuro de
hidrgeno
Fermentacin de glucosa
Fermentacin de lactosa
Kligler Hierro Agar
Produccin de cido
sulfhdrico.
Decarboxilacin de la lisina
Desaminacin de la lisina
Lisina Hierro Agar
Produccin de cido
sulfhdrico.
Agar Urea Deteccin de ureasa
Capacidad de utilizar
Agar Citrato
citrato
Posteriormente las caractersticas bioqumicas de los clones aislados fueron comparadas con una
base de datos preliminar para determinar el grupo taxonmico al que pertenecen. (Forbes, 2009, pp.
216-246)
32
CAPTULO IV
4. RESULTADOS Y DISCUSIN
4.1 Obtencin de los clones bacterianos
4.1.1 Recoleccin de las muestras
Las muestras seleccionadas durante el anlisis de las aguas residuales del sistema de vertido de la
Empresa Lcteos Santilln fueron obtenidas del sistema de trampa de grasas (Muestra 1), del
sistema de revisin (Muestra 2 y 4) y del pozo de almacenamiento de agua residual (Muestra 3),
como se representa en la Figura 4-1, las cuales tenan un tiempo de reposo estimado mayor a 48
horas, considerado un tiempo idneo para la adaptacin de los microorganismos a las condiciones
nutritivas del vertido.
Figura 4-1 Identificacin de los puntos de muestreo

Fuente: Camacho, Christian, 2015
4.1.2 Recuento Bacteriolgico Inicial
El recuento bacteriolgico inicial realizado a las muestras en medio nutritivo, tuvo como
resultados cantidades entre 1.3106 y 1.1109 unidades formadoras de colonia (UFC) por mililitro
como se detalla en la Tabla 4-1, estos resultados son similares a los datos reportados de lugares
cercanos a la zona de muestreo por Valencia (2013, p.92) durante el estudio de las aguas residuales
33
de la cabecera Parroquial de San Luis, sustentando los datos reportados durante el presente
anlisis.
Tabla 4-1 Conteo microbiolgico inicial en medio nutritivo
Log UFC/ml
Muestra UFCx10 /ml 6
CV
1 45 7.654 0.024 0.0004
2 530 8.728 0.030 0.0006
3 1.3 6.098 0.106 0.0074
4 1100 9.039 0.026 0.0004
La diferencia en la cantidad de clones presente entre las muestras analizadas, (Tabla 4-1) segn
Martnez & Garca (2003, p. 264) puede deberse fundamentalmente a la existencia en el punto de
muestreo de las condiciones ptimas para el crecimiento microbiolgico como temperatura,
nutrientes y oxgeno, as, las muestras provenientes de lugares con mejores condiciones de
crecimiento tendran una mayor cantidad de colonias, como sera el caso de la Muestra 4 que
presenta una mayor cantidad de UFC por mililitro.
4.1.3 Anlisis del tipo de bacteria segn el metabolismo de lactosa
El anlisis del metabolismo de lactosa realizado en Agar MacConkey permiti conocer el

porcentaje de bacterias fermentadoras y no fermentadoras existentes en las muestras, donde se
evidenci un mayor porcentaje de bacterias fermentadoras de lactosa en casi todas las muestras
como se indica en la Figura 4-2, adems, considerando que segn Arroyave, et al. (2013, pp. 71,
72) las bacterias no fermentadoras de lactosa son potenciales productoras de
polihidroxialcanoatos, estos resultados indicaran que solo un grupo limitado de bacterias sera
capaz de producir el biopolmero.
34
100%
Porcentaje de Bacterias
92.42%
80%
83.57%
60% 66.43%
57.45%
40%
42.55%
33.57%
20%
16.43%
7.58%
0%
Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 Muestra 4
Tipo de Bacterias
Fermentadoras No Fermentadoras
Figura 4-2 Tipo de bacteria segn el metabolismo de lactosa

El alto porcentaje de bacterias capaces de fermentar lactosa presentado en la mayora de las

muestras analizadas puede ser originada por la gran cantidad de lactosa presente en los vertidos
de la industria de lcteos y a la presencia de este tipo de microorganismos durante la elaboracin
de productos lcteos, especialmente quesos madurados, como lo explica Garca (1998, p. 145) en
sus estudios sobre la microbiologa de los productos lcteos.
4.1.4 Inhibicin del crecimiento bacteriano en el medio especfico ADP
Con el fin de comprobar si la relacin 20 a 1 de Carbono-Nitrgeno presente en el medio mnimo

para produccin de polihidroxialcanoatos (ADP) inhibe el desarrollo microbiano, se realiz una
comparacin entre el crecimiento presentado en el medio ADP y medio nutritivo, durante el
anlisis los resultados obtenidos mostraron que la cantidad de UFC por mililitro fue menor en el
medio mnimo ADP con un porcentaje entre 0.03 y 4.96% de diferencia en comparacin con la
cantidad de UFC presente el medio nutritivo, tal como se presenta en la Figura 4-4, demostrando
una mnima inhibicin, motivo por el cual las inoculaciones posteriores se realizaron en el medio
mnimo ADP.
35
10
- 0.03% -1.04%
8 - 4.96% 8.728 8.726 9.039 8.945
Log UFC/ml 7.654 7.274 - 1.70%
6
6.098 5.994
4
0
Tipo de Medio
Agar Estndar Mtodos Agar deteccin de PHA
Figura 4-3 Diferencia de crecimiento bacteriano en medio nutritivo y ADP

La similitud entre la cantidad de UFCs por mililitro presente en el medio mnimo ADP y en el
medio nutritivo para mtodos estndar, segn lo explicado por Prieto et al. (2011, pp. 15, 16)
durante su estudio de la relacin entre las necesidades metablicas y el crecimiento bacteriano,
podra deberse a que las bacterias presentes en las muestras analizadas necesitaron una mnima
cantidad de nutrientes para su desarrollo, razn por la cual demostraron un crecimiento similar en
ambos medios.
4.1.5 Crecimiento bacteriano post-refrigeracin
Las muestras seleccionadas posterior a su anlisis fueron sometidas a refrigeracin por un periodo
de 45 das con la finalidad de obtener bacterias potencialmente ms estables a condiciones
adversas de crecimiento, para comprobar la inhibicin microbiana por efecto de la baja
temperatura se realizaron recuentos microbiolgicos en medios nutritivos antes y despus de su
refrigeracin, demostrando una disminucin del 12.61 al 31.87 por ciento en el crecimiento de
los microorganismos como se detalla en la Figura 4-3, tal comportamiento demostrara que el
estrs microbiolgico generado sobre las bacterias permite la supervivencia de los
microrganismos ms aptos.
36
10
8 8.728 -19.14% 9.039
Log UFC/ml
-12.61%
7.654 -31.87%
6 6.688 7.057
6.098 -23.85% 6.158
4 4.643
2
0
Etapa de anlisis
Inicial Post-Refrigeracin
Figura 4-4 Decrecimiento bacteriano post-refrigeracin

El decrecimiento de la poblacin microbiana luego de exponer las muestras a bajas temperaturas

segn lo explicado por Martnez & Garca (2003, p. 264) durante su estudio de la relacin entre
la temperatura y el desarrollo bacteriano, pudo ser causado por la disminucin del metabolismo
de las bacterias y la reduccin de nutrientes durante el ensayo.
4.1.6 Seleccin de clones bacterianos
Los clones bacterianos utilizados durante la investigacin fueron seleccionados en dos grupos, el
primero obtenido al principio de la investigacin basado en las caractersticas macroscpicas
presentadas por los clones en el medio mnimo ADP, donde se seleccionaron 34 clones (Grupo
A) y el segundo proveniente de las muestras luego de un proceso de refrigeracin formado por
bacterias no fermentadoras de lactosa oxidasa positivo, donde se seleccionaron 33 clones (Grupo
B), como se describe en la Tabla 4-2, dando un total de 67 clones seleccionados para el anlisis
de produccin de polihidroxialcanoatos.
Tabla 4-2 Cantidad de clones seleccionados por muestra

Muestra Clones Seleccionados
Grupo A Porcentaje Grupo B Porcentaje
1 13 38.24% 10 30.30%
2 7 20.59% 15 45.45%
3 6 17.65% 5 15.15%
4 8 23.53% 3 9.09%
Total 34 100.00% 33 100.00%
37
4.1.7 Estabilizacin de clones bacterianos
Las fases de estabilizacin y reaislamiento realizadas sobre los 67 clones aislados inicialmente
permitieron obtener como resultado un total de 52 clones estabilizados en el medio mnimo de
produccin ADP como se indica en la Tabla 4-3, en donde, los clones del grupo A presentaron
menor adaptacin al medio mnimo ADP con el 38.24% de clones perdidos durante el ensayo,
mientras que en el Grupo B slo alcanz un 6.06% de clones no adaptados, demostrando que la
adaptacin de los clones que fueron obtenidos luego de la etapa de refrigeracin, fue mejor que
los clones obtenidos al principio de la investigacin.
Tabla 4-3 Cantidad de clones aislados por muestra
Muestra Clones Grupo A Clones Grupo B

Aislados Estabilizados Prdida Aislados Estabilizados Prdida
1 13 4 69.23% 10 8 20.00%
2 7 7 0.00% 15 15 0.00%
3 6 5 16.67% 5 5 0.00%
4 8 5 37.50% 3 3 0.00%
Total 34 21 38.24% 33 31 6.06%
La gran cantidad de clones no adaptados presentada en el Grupo A durante las etapas de

estabilizacin y reaislamiento podra ser causada por las necesidades metablicas y de
crecimiento necesarias para su desarrollo bacteriano, es decir, las bacterias para su desarrollo
necesitaron una mayor cantidad y tipo de nutrientes, demostrando un menor crecimiento en cada
repique realizado y su prdida al final de los ensayos, estos ensayos son muy importantes para
comenzar el anlisis de produccin de PHA, pues tal como menciona Stanier et al. (1996) no slo
es imperativo el aislamiento del microorganismo, sino tambin su mantenimiento en el ambiente
artificial seleccionado.
4.2 Caractersticas Macroscpicas, microscpicas y tincin Gram de los clones
4.2.1 Forma
Los clones estabilizados durante el anlisis de su forma, presentaron en el Grupo A un porcentaje

similar entre dos tipos de morfologas, circular y puntiforme, mientras que en el grupo B existi
mayor variacin entre las tres morfologas presentadas sobresaliendo la forma irregular con casi
el 90 por ciento de los clones analizados, como se detalla en la Figura 4-5.
38
Los resultados demostraron que durante el principio de la investigacin la mayora de los clones
aislados presentaron ms semejanza en su forma, mientras que posterior a la refrigeracin de las
muestras se desarrollaron bacterias con morfologas diferentes, generando una mayor
heterogeneidad bacteriana.
100%
87.10%
80%
Porcentaje de Clones
61.90%
60%
38.10%
40%
20%
6.45% 6.45%
0%
Grupo A Grupo B
Forma de la Colonia
Puntiforme Circular Irregular Filamentosa
Figura 4-5 Tipo de forma macroscpica de los clones aislados

4.2.2 Superficie
El anlisis de la superficie de las colonias bacterianas permiti conocer que los clones del Grupo
A mostraban una gran variedad de superficies destacando entre ellas la superficie plana y plano-
convexa, mientras que en el Grupo B existi menor variedad de superficies siendo la ms
expresada la plano convexa, como se indica en la Figura 4-6.
Los resultados obtenidos demostraron que durante el principio de la investigacin los clones
presentaron mayor variedad en su superficie, al contrario de los clones obtenidos posterior a la
refrigeracin de las muestras, donde se observ una mayor similitud en su forma.
39
100% 93.55%
80%
60%
40% 33.33% 33.33%

19.05% 14.29%
20%
6.45%
0%
Grupo A Grupo B
Supeficie de la Colonia
Plana Plano-convexa Convexa Acuminada
Figura 4-6 Tipo de superficie presentada por las colonias bacterianas

4.2.3 Borde
Al analizar el tipo de borde de cada colonia, los resultados mostraron que en el Grupo A exista
nicamente la presencia de bacterias con borde redondeado mientras que en el Grupo B existieron
dos bordes diferentes, de los cuales el lobulado fue el dominante, como se indica en la Figura 4-
7.
Los resultados obtenidos indican que el borde de las colonias bacterianas fue notablemente
diferente entre los grupos A y B, es decir, fue redondeado en los clones analizados al principio
del estudio, mientras que las bacterias obtenidas luego de la refrigeracin de muestras presentaron
una mnima cantidad de bordes redondeados siendo reemplazados por bacterias que presentaron
bordes de tipo lobulado, describiendo una diferenciacin notable durante el proceso de estrs.
40
100.00%
100% 93.55%
80%
60%
40%
20%
6.45%
0%
Grupo A Grupo B
Borde de la Colonia
Rodendeado Lobulado
Figura 4-7 Tipo de borde de las colonias bacterianas

4.2.4 Color
La observacin de la coloracin presentada por los clones durante su anlisis, permiti conocer
en el Grupo A la presencia de cuatro colores diferentes entre sus clones con mayor presencia de
color caramelo, mientras que en el Grupo B existieron colonias con tres colores diferentes de los
cuales el amarillo presentaba un mayor porcentaje, tal como se detalla en la Figura 4-8.
Los resultados encontrados demostraron que los clones aislados antes de la refrigeracin de las
muestras presentaron mayor variedad en su color, que aquellos obtenidos posterior a la etapa de
refrigeracin, los cuales presentaron mayor similitud, describiendo una disminucin de diversidad
durante el ensayo.
41
100%
83.87%
80%
60%
52.38%
40%
28.57%
20%
9.52% 9.52% 9.68% 6.45%
0%
Grupo A Grupo B
Color de la Colonia
Rosado Naranja Crema Caramelo Amarillo
Figura 4-8 Color macroscpico de las colonias bacterianas

4.2.5 Presencia de Gas
La presencia de gas en los clones fue determinado mediante la observacin de burbujas en la

superficie de las colonias, conforme a lo presentado en la Figura 4-9, tal observacin permiti
conocer que nicamente el 38% del total de los clones del Grupo A presentaron formacin de gas,
mientras que las bacterias del Grupo B no demostraron su presencia, tal como se visualiza en la
Figura 4-10
Figura 4-9 Formacin gas en el clon A17

42
Los resultados obtenidos indican que la formacin de gas presentada en el Grupo A podra deberse
a la seleccin al azar de sus clones, algunos de los cuales podran fermentar lactosa, pues como
seala Gonzlez (2014) un metabolismo comn en la leche es la fermentacin de lactosa, cuyos
productos ms usuales son cidos, alcoholes y gases, mientras que las bacterias no fermentadoras
obtenidas al final de la refrigeracin de las muestras, demostraron una posible disminucin o
ausencia de la expresin de esta caracterstica.
100%
90%
80%
70%
60%
50%
38%
40%
30%
20%
10%
0%
0%
Grupo A Grupo B
Presencia de gas
Figura 4-10 Presencia de gas en las colonias bacterianas

4.2.6 Segregacin de pigmento en el medio
La produccin de exopigmento fue examinada mediante la observacin de un cambio de

coloracin en el medio de crecimiento, dicho fenmeno fue expresado en ambos grupos (A y B),
como se detalla en la Figura 4-11, sin embargo los pigmentos fueron diferentes en cada grupo,
como se visualiza en la Figura 4-12, en donde un 14 % de los clones del Grupo A fueron capaces
de producir exopigmento de color amarillo, mientras que un 84% de los clones del Grupo B
produjeron exopigmento amarillo verdoso, demostrando con ello, la variabilidad de clones
seleccionados durante el anlisis microbiolgico.
43
100%
90%
83.87%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20% 14.29%
10%
0%
Grupo A Grupo B
Produccin de exopigmento
Amarillo Verde
Figura 4-11 Produccin de exopigmento

La liberacin de pigmentos diferentes entre los Grupos A y B segn lo analizado por Des Abbayes
(1989, pp. 9, 10) podra ser consecuencia de las diferentes rutas metablicas utilizadas por cada
clon para la produccin de pigmentos o de las funciones que el pigmento desempee en el
microorganismo, permitiendo obtener pigmentos con diferente composicin qumica y diferentes
funciones, entre ellas, de proteccin, vitamnicas, enzimticas, antibiticas, entre otras, que puede
ser de gran importancia para la clula.
44
F
Figura 4-12 Presencia de exopolmeros en clones del Grupo A y B

4.2.7 Tincin Gram
La tincin de Gram permiti analizar las morfologas microscpicas y la composicin de la

membrana celular de los 52 clones estabilizados, los resultados permitieron conocer que todos los
clones analizados pertenecieron al grupo de bacilos Gram negativos, demostrando caractersticas
similares a las presentadas en la Figura 4-13, es importante resaltar que algunos gneros
bacterianos como Aeromonas, Alcaligenes y Pseudomonas pertenecientes al grupo de bacilos
Gram negativos son productores de polihidroxialcanoatos, considerando a los clones aislados
como potenciales productores del biopolmero.
La presencia de bacilos Gram negativos observada durante la investigacin es normal

considerando que este tipo de microrganismos son comunes en productos lcteos y agua residual,
destacando entre ellos, el grupo de los coliformes y las bacterias lcticas capaces de producir
exoenzimas y antibiticos. (Henry & Heinke, 1999, pp. 273,274) (Rivero, et al., 1994, pp. 11,12)
45
Figura 4-13 Tincin Gram del Clon A12
4.3 Anlisis de produccin de polihidroxialcanoatos
El anlisis de la produccin de polihidroxialcanoatos en los clones estudiados se realiz en dos

etapas, la primera basada en la tincin de grnulos intracelulares de PHA utilizando el colorante
Sudan Black y la segunda mediante la excitacin de los grupos funcionales del biopolmero PHA
utilizando espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier, adems, se estimul la
produccin del biopolmero utilizando diferentes medios de cultivo entre ellos medio mnimo
suplementado con diferentes azcares (Glucosa y Sacarosa) y diferentes concentraciones de
lactosa, medio ADP suplementado con diferentes concentraciones cloruro de sodio y medio
mnimo ADP estabilizado a pH cido (pH 4).
Los resultados obtenidos durante la prueba realizada con Sudan Black no fueron concluyentes
pues los controles negativos en todos los ensayos presentaban la misma tincin que los clones
analizados, existiendo adems la formacin de precipitados del colorante, como se visualiza en la
Figura 4-14, mientras que el ensayo utilizando espectroscopia Infrarroja dio un resultado negativo
en todos casos, debido a que los espectros obtenidos durante el anlisis no demostraban niveles
de absorbancia en el rango entre 1724 y 1744 cm-1, perteneciente al grupo ster presente en los
grnulos intracelulares de PHAs, tal como se representa en la Figura 4-15.
46
Figura 4-14 Tincin con Sudan Black del Clon B1
La similitud entre la tincin con Sudan Black de los controles negativos y los clones analizados,
as como la formacin de precipitados del colorante, segn lo explicado por Shamala et al (2003)
podra deberse a la falta de especificidad de dicho compuesto, el cual puede teir grnulos de
PHA y cuerpos lipoflicos, formando tinciones inespecficas en las bacterias examinadas.
Figura 4-15 Espectro infrarrojo por transformada de Fourier del Clon B1

Los resultados negativos presentados al analizar la produccin de PHA segn Sudesh, et al.,
(2000) podra deberse a la inexistencia de PHA sintetasa considerada la enzima clave para la
47
polimerizacin del biopolmero PHA, los resultados expuestos son contrarios a los reportados por
Cardona et al. (2013), que lograron aislar 6 cepas productoras de polihidroxialcanoatos de
subproductos lcteos, pertenecientes a los gneros Bacillus megaterium, Pseudomonas
entomophila y Paracocus sp, lo cual sugerira que la cantidad de bacterias productoras del
biopolmero utilizando derivados lcteos es limitada. (Sudesh, et al., 2000, p. 1510)
4.4 Caracterizacin bacteriana
Las pruebas realizadas para determinar la produccin de PHA permitieron conocer otras
caractersticas importantes de las bacterias como produccin de exopolmeros (EPS),
halotolerancia y crecimiento en pH cido, cuyos resultados se reportan a continuacin.
4.4.1 Produccin de Exopolmeros
La produccin de exopolmeros fue identificada al observar la formacin de sustancias viscosas

alrededor de la colonia durante el crecimiento de las bacterias en medio minimo ADP
suplementado con diferentes azcares, tal como lo explica Stainer et al (1996, pp. 177, 178) y
como se presenta en la Figura 4-1.
Los resultados obtenidos durante el ensayo demostraron que el 42.86% de los clones aislados del
grupo A fueron capaces de producir exopolmeros en el medio ADP, manifestando una mayor
sntesis de dichos compuestos en medios suplementados con mayores concentraciones de lactosa,
mientras que en el grupo B ningn clon fue capaz de producirlo, como se indica en la Figura 4-
17, demostrando una diferencia notable en el mecanismo adaptativo de los clones aislados a
medios cuya relacin carbono/nitrgeno es superior a 20 .
48
Figura 4-16 Formacin de exopolmeros en medio suplementado
con D-Glucosa
100%
90%
80%
70%
Porcentaje de Clones 60%
50%
42.86%
40%
30%
20%
10%
0.00%
0%
Grupo A Grupo B
Figura 4-17 Cantidad de clones capaces de producir

exopolmeros
La produccin de polmeros extracelulares observada en algunos clones del Grupo A podra

deberse a que segn Stanier (1996) dichos polmeros pueden mejorar las interacciones
intercelulares de adherencia, invasin y resistencia en las bacterias, permitiendo un mejor
desarrollo microbiano en condiciones adversas.
4.4.2 Crecimiento en medios cidos
El crecimiento de los clones en medio cido demostr el efecto producido por la disminucin de
pH sobre el desarrollo bacteriano, los resultados obtenidos demostraron que solamente el 16.13%
de los clones del grupo B pudieron desarrollarse en pH cido, al contrario de los clones del grupo
A donde no existi ningn crecimiento, como se representa en la Figura 4-18, demostrando una
mayor adaptacin de los clones del Grupo B a medios con pH cido.
49
100%
90%
80%
Cantidad de Clones
70%
60%
50%
40%
30%
16.13%
20%
10%
0.00%
0%
Grupo A Grupo B
Figura 4-18 Cantidad de clones capaces de crecer en pH cido

Los clones del Grupo B pudieron haberse adaptado al pH cido del medio por diferentes
mecanismos como intercambio de cationes y aniones en la membrana, cambios en su metabolismo
que permita generar productos bsicos o neutros, as como regulacin del pH citoplasmtico por
accin enzimtica, mientras que los clones no desarrollados pudieron haber sufrido cambios en
su actividad enzimtica o daos en sus protenas, cidos nucleicos y otras molculas biolgicas
que limitaron su desarrollo, tal como lo describe Slonczewski et al. (2009) en su estudio sobre el
efecto del pH sobre el desarrollo microbiano.
4.4.3 Halotolerancia
El crecimiento de los clones en medios suplementados con diferentes concentraciones de cloruro

de sodio, fue realizado con la finalidad de estimular la produccin de polihidroxialcanoatos, sin
embargo, este ensayo permiti conocer la capacidad halotolerante de los clones, obteniendo como
resultado un 90.32% de clones del Grupo B tolerantes a medios suplementados con 5% de cloruro
de sodio, as como un 4.76% de clones del grupo A resistentes a medios suplementados con la
misma concentracin de sal, tal como se muestra en la Figura 4-19, tales resultados demostraron
una mayor adaptacin de los clones del Grupo B a medios suplementados con sales.
50
100% 100% 100%
90% 90.32%
80% 80.95%
Porcentaje de Tolerancia
70%
60%
50%
Grupo A
40%
Grupo B
30%
20%
10%
4.76%
0% 0%
0 2.5 5 7.5
Concentracin de Cloruro de Sodio (%)
Figura 4-19 Capacidad de halotolerancia a diferentes concentraciones

Los clones del Grupo B que resistieron mejor a medios suplementados con cloruro de sodio segn
lo explicado por Ramrez, et al. (2006) pudieron haber acumulado una gran cantidad de
compuestos en el citoplasma para compensar la presin osmtica del medio externo, entre ellos
compuestos orgnicos de bajo peso molecular, que se esperaba fueran polihidroxialcanoatos, sin
embargo, su presencia no se pudo demostrar en la presente investigacin mediante tcnicas de
tincin o espectrofotometra de infrarrojo.
4.4.4 Resistencia a metales pesados
El anlisis de la resistencia de los clones analizados a metales pesados fue realizado considerando
la constante liberacin de estos compuestos txicos en el ambiente y su potencial tratamiento
utilizando microorganismos.
4.4.4.1 Plomo
Las pruebas de crecimiento en medios suplementados con plomo demostraron un mayor

porcentaje de inhibicin celular en los clones del Grupo A, los cuales presentaron una disminucin
en su crecimiento desde bajas concentraciones del txico hasta alcanzar la mortalidad absoluta en
una concentracin de 50mg/ml del metal, mientras que los clones del Grupo B presentaron una
ligera disminucin en su desarrollo en concentraciones de plomo de 5mg/ml, disminuyendo
posteriormente su crecimiento de manera drstica hasta alcanzar un 13% de clones capaces de
tolerar una concentracin de 50mg/ml de plomo, como se visualiza en la Figura 4-20, tales
51
resultados demostraron que las condiciones de seleccin de los clones del Grupo B permitieron
aislar bacterias con una mejor adaptacin a medios suplementados con plomo
100% 100% 100.00%

90% 90.32%
80%
70%
60%
50% 52.38%
Grupo A
40%
Grupo B
30%
20%
10% 13%
10%
0% 0%
0 0.5 5 50
Concentracin de Plomo (mg/ml)
Figura 4-20 Resistencia a diferentes concentraciones de plomo

Los resultados obtenidos permitieron conocer que los clones analizados en el presente estudio
demostraron un mejor desarrollo en medios suplementados con plomo que los microorganismos
analizados por Prez et al. (2015), los cuales demostraron una notable disminucin de su
crecimiento en medios suplementados con concentraciones de plomo, en forma de nitrato de
plomo entre 0.0075 y 0.01 mg/ml.
El gran porcentaje de clones capaces de tolerar medios suplementados con plomo segn lo
explicado por Castillo (2005, pp. 227, 228) podra deberse a que este elemento txico no
interviene de manera directa en ninguna funcin biolgica del desarrollo celular, sin embargo, su
exceso en el medio de crecimiento provoca interferencias con algunas metaloprotenas
produciendo el reemplazo de metales de utilidad celular como calcio, a pesar de ello, se presume
que los clones del presente estudio adaptados a mayores concentraciones de plomo pudieron haber
desarrollado estrategias de excrecin celular o acumulacin en el interior del citoplasma en forma
de fosfato de plomo que permitieron su desarrollo en los medios con mayor concentracin del
txico.
4.4.4.2 Mercurio
Las pruebas de crecimiento en medios suplementados con mercurio demostraron una menor
adaptacin en los clones del Grupo A, presentando una gran disminucin en su crecimiento desde
52
bajas concentraciones del txico hasta alcanzar la mortalidad absoluta de sus clones en una
concentracin de 5mg/ml de mercurio, mientras que los clones del Grupo B presentaron una
importante disminucin en su crecimiento en medios suplementados con concentraciones entre
0,5 y 5 mg/ml de mercurio, posterior a lo cual se evidenci un 9.68% de bacterias capaces de
tolerar el txico, alcanzando la mortalidad absoluta en una concentracin de 50mg/ml, como se
visualiza en la Figura 4-21, tales resultados demostraron que las condiciones de seleccin de los
clones del Grupo B permitieron aislar bacterias con una mejor adaptacin a medios suplementados
con mercurio que aquellas del Grupo A.
100% 100%
90% 90.32%
80%
70%
60%
50%
Grupo A
40%
Grupo B
30%
20%
14.29%
10% 9.68%
0% 0% 0%
0 0.5 5 50
Concentracin de Mercurio (mg/ml)
Figura 4-21 Resistencia a diferentes concentraciones de mercurio

Los resultados obtenidos fueron similares a los reportados por Moraga et al. (2003) donde la
tolerancia mxima de los microorganismos a medios suplementados con cloruro de mercurio se
encontraba en concentraciones entre 5 y 10 mg/ml de mercurio, demostrando que los clones
analizados en el presente estudio tienen igual capacidad de adaptacin que otros microorganismos
aislados del agua.
El bajo porcentaje de clones capaces de tolerar medios suplementados con altas concentraciones
de mercurio segn lo explicado por Castillo (2005, pp. 221, 222) podra deberse a que este metal
txico desnaturaliza las protenas de los microorganismos, a travs de la formacin de complejos
con constituyentes protenicos como los grupos tiolticos e imnicos, interfiriendo de forma
directa en el desarrollo celular, sin embargo, se presume que los clones adaptados pertenecientes
al Grupo B pudieron desarrollar ciertos mecanismos adaptativos como la reduccin de mercurio
de Hg2+ a Hg0 por accin de la flavoproteinas, que permitieron una mayor adaptacin a este tipo
de medios.
53
4.4.4.3 Cobre
Las pruebas de crecimiento en medios suplementados con cobre demostraron una mayor
inhibicin en los clones del Grupo A, los cuales presentaron una disminucin en su crecimiento
desde bajas concentraciones del txico hasta alcanzar la mortalidad absoluta en una concentracin
de 50mg/ml del metal, mientras que los clones del Grupo B presentaron una mayor disminucin
en su crecimiento en medios suplementados con concentraciones entre 0,5 y 5 mg/ml de cobre
posterior a lo cual se evidenci un 9.68% de bacterias capaces de tolerar el txico, alcanzando la
mortalidad absoluta en una concentracin de 50mg/ml, como se visualiza en la Figura 4-22, tales
resultados demostraron que las condiciones de seleccin de los clones del Grupo B permitieron
aislar bacterias con una mejor adaptacin a medios suplementados con cobre.
100% 100% 96.77%

90%
80%
70%
60%
50%
Grupo A
40%
30% Grupo B
28.57%
20% 9.68%
10%
5%
0% 0%
0 0.5 5 50
Concentracin de Cobre (mg/ml)
Figura 4-22 Resistencia a diferentes concentraciones de cobre

Los resultados obtenidos demostraron que los clones analizados en el presente estudio posean
una menor tolerancia a altas concentraciones de cobre contrario a los datos reportados por Moraga
et al. (2003) donde la tolerancia mxima de los microorganismos a medios suplementados con
cobre en forma de sulfato de cobre se encontraba en concentraciones entre 1.600 y 3.200 mg/ml,
demostrando una menor capacidad adaptativa por los clones analizados en comparacin con otros
obtenidos de agua.
El alto porcentaje de clones capaces de tolerar medios suplementados con bajas concentraciones
de cobre segn lo explicado por Cervantes (2000) es normal debido a que dicho elemento es
considerado un micronutriente esencial para algunas funciones celulares, sin embargo, su alta
54
concentracin genera toxicidad celular causando en algunos casos la muerte del microorganismo,
como se presume fue el caso de algunos clones durante la presente investigacin, aunque los
clones pertenecientes al Grupo A y B adaptados a mayores concentraciones de cobre se cree
pudieron desarrollar mecanismos de expulsin de cobre o de transporte y almacenamiento
intracelular mediante protenas, con el fin de adaptarse a altas dosis de dicho metal.
4.4.4.4 Cadmio
Las pruebas de crecimiento en medios suplementados con cadmio demostraron una mayor
inhibicin en el desarrollo de los clones del Grupo A, los cuales presentaron una disminucin en
su crecimiento desde bajas concentraciones del txico hasta alcanzar la mortalidad absoluta en
una concentracin de 50mg/ml de cadmio, mientras que los clones del Grupo B presentaron leves
alteraciones en su desarrollo hasta concentraciones de cadmio de 5mg/ml, disminuyendo
posteriormente su crecimiento de manera drstica hasta alcanzar un 16.13% de clones capaces de
desarrollarse en una concentracin de 50mg/ml de cadmio, como se visualiza en la Figura 4-23,
tales resultados demostraron que las condiciones de seleccin de los clones del Grupo B
permitieron aislar bacterias con una mejor adaptacin a medios suplementados con cadmio.
100% 100% 100%

90% 87.10%
80%
70%
60%
50%
Grupo A
40%
Grupo B
30% 28.57%
20%
16.13%
10% 9.52%
0% 0%
0 0.5 5 50
Concentracin de Cadmio (mg/ml)
Figura 4-23 Resistencia a diferentes concentraciones de cadmio

Los resultados obtenidos demostraron una tolerancia a cadmio similar a la reportada por Moraga
et al. (2003), quienes encontraron una tolerancia mxima de los microorganismos a medios
suplementados con cadmio en concentraciones entre 50 y 100 mg/ml, demostrando que los clones
analizados en el presente estudio poseen una capacidad adaptativa similar a otros clones obtenidos
de una fuente de agua.
55
El alto porcentaje de clones capaces de tolerar medios suplementados con diferentes
concentraciones de cadmio segn lo explicado por Cervantes (2010) podra deberse a que el
cadmio es un metal txico que no interviene de forma directa en ninguna funcin biolgica del
microorganismo, sin embargo, su afinidad a grupos sulfhidrilos genera la inactivacin de ciertas
enzimas, as como, la desnaturalizacin de algunas protenas, generando dificultades en el
desarrollo de los microrganismos como se presenta en la presente investigacin, aunque se
presume que los clones pertenecientes al Grupo B adaptados a mayores concentraciones del metal
pudieron desarrollar mecanismos de expulsin o de almacenamiento intracelular de cadmio que
permitieron una mayor adaptacin de dichos microorganismos a altas dosis de cadmio.
4.4.4.5 Arsnico
Las pruebas de crecimiento en medios suplementados con arsnico demostraron una menor
adaptacin en los clones del Grupo A, presentando una gran disminucin en su crecimiento desde
bajas concentraciones del txico hasta alcanzar la mortalidad absoluta de sus clones en una
concentracin de 5mg/ml de arsnico, mientras que los clones del Grupo B presentaron una mayor
disminucin en su crecimiento en concentraciones entre 0,5 y 5 mg/ml del txico, posterior a lo
cual slo un 3.23% de clones se haba desarrollado, alcanzando la mortalidad absoluta en una
concentracin de 50mg/ml de arsnico, como se visualiza en la Figura 4-24, tales resultados
demostraron que las condiciones de seleccin de los clones del Grupo B permitieron aislar
bacterias con una mejor adaptacin a medios suplementados con arsnico.
100% 100%
90% 90%
80%
70%
60%
50%
Grupo A
40%
Grupo B
30% 28.57%
20%
10% 3.23%
0% 0% 0%
0 0.5 5 50
Concentracin de Arsnico (mg/ml)
Figura 4-24 Resistencia a diferentes concentraciones de arsnico

56
Los resultados obtenidos demostraron que los clones analizados en el presente estudio presentaron
una menor tolerancia a arsnico que los microorganismos analizados por Moraga et al. (2003) los
cuales se desarrollaron en medios suplementados con concentraciones de arsnico mayores a 3
g/ml.
El bajo porcentaje de clones capaces de tolerar medios suplementados con altas concentraciones
de arsnico segn lo explicado por Castillo (2005, pp. 239, 240) podra deberse a que el arsnico
al reaccionar con los grupos sulfhidrilo presentes en las protenas provoca su desnaturalizacin
dificultando las funciones celulares, sin embargo, se presume que los clones pertenecientes al
Grupo B tolerantes a mayores concentraciones de arsnico pudieron desarrollar mecanismos de
xido-reduccin o formacin de compuestos de destoxificacin como metilarsnico con el fin de
adaptarse mejor a mayores concentraciones de dicho metal.
Los clones analizados durante el ensayo de resistencia a metales pesados presentaron un mayor
nivel de adaptacin a medios suplementados con altas concentraciones de plomo y cadmio,
considerando el potencial tratamiento de dichos compuestos por los clones ms adaptados,
mientras que los metales mercurio, arsnico y cobre presentaron un mayor nivel de inhibicin
celular, considerndose compuestos txicos para las bacterias analizadas.
Cabe resaltar que la resistencia bacteriana a metales pesados segn Martnez et al. (2010)
constituye un fenmeno de seleccin natural en el ambiente que permite conocer la capacidad
biolgica de sobrevivencia de un microorganismo, durante el presente estudio se demostr que
las bacterias obtenidas luego de un periodo de refrigeracin presentaron una mayor tolerancia a
todos los metales txicos examinados, desarrollando un nuevo mecanismo de seleccin capaz de
obtener bacterias con mayor adaptacin.
Algunas de las bacterias aisladas podran haber presentado, adems de los mecanismos de
adaptacin descritos para cada metal una resistencia a travs de otros sistemas de tolerancia como
los descritos por Sueiro (2012, pp. 12-15) que se basan en limitar el acceso del metal a la clula
por una barrera de permeabilidad o bombas de eflujo, transformndolos en molculas menos
txicas, alterando componentes celulares para disminuir su sensibilidad o mediante el secuestro
intra o extracelular.
4.4.5 Produccin de enzimas
El anlisis de la actividad enzimtica de los clones, fue realizado con la finalidad de identificar
microorganismos capaces de degradar compuestos orgnicos existentes en aguas residuales de la
57
industria de lcteos, especficamente protenas, lpidos y azcares complejos, los resultados
obtenidos demostraron que en el Grupo B existe ms del 90% de clones capaces de producir
proteasas y lipasas en el medio, mientras que en el Grupo A un porcentaje menor al 24% es capaz
de producir las mismas enzimas y un 14.29% es capaz de producir amilasas, como se muestra en
la Figura 4-25.
Los resultados obtenidos demuestran que los clones seleccionados en el Grupo B son ms idneos
para degradar protenas y lpidos en los residuos lcteos que los clones pertenecientes al Grupo
A, los cuales presentaron una mayor capacidad de degradar azcares complejos permitiendo su
aprovechamiento en la degradacin de glucgeno y almidn.
100%
93.55% 90.32%
90%
80%
70%
60%
50%
Grupo A
40%
Grupo B
30%
19.05% 23.81%
20%
14.29%
10%
0%
Proteasas Lipasas Amilasas
Tipo de Enzimas
Figura 4-25 Produccin de diferentes tipos de enzimas

El porcentaje de bacterias productoras de proteasas obtenido en el Grupo B fue similar al

reportado por Guerrero et al. (2003) y Romn et al. (2003) al trabajar con leche cruda refrigerada
donde un 80% de las bacterias presentaba actividad proteoltica, mientras que la cantidad de
bacterias productoras de lipasas fue mayor en la presente investigacin con respecto al 23% de
bacterias lipolticas reportado en las anteriores investigaciones.
La expresin enzimtica presentada por los clones del Grupo A y B segn Bachmann (1979, p.
143) podra ser resultado de la codificacin gentica del ADN microbiolgico que determina los
patrones metablicos de las bacterias y permite adaptar a los microorganismos a las condiciones
nutritivas del medio.
58
4.4.6 Identificacin bacteriana
La identificacin de los gneros microbianos desarrollada a travs de pruebas bioqumicas obtuvo

como resultado bacterias de los gneros Klebsiella, Acinetobacter, Aeromonas y Enterobacter en
el Grupo A y los gneros Pseudomonas, Acinetobacter y Klebsiella en el Grupo B, destacando
entre los gneros mencionados Klebsiella y Pseudomonas en el Grupo A y B respectivamente con
porcentajes superiores al 50 por ciento, como muestra la Figura 4-26.
Los resultados obtenidos demuestran que los mtodos de seleccin realizados durante la
investigacin permitieron aislar diferentes tipos de bacterias, demostrado la gran variedad
microbiolgica presente en las aguas residuales de la industria lctea.
Grupo A Grupo B
100%
83.87%
80%
61.90%
60%
40%
20% 14.29% 14.29%

9.52% 6.45% 6.45% 3.23%
0%
Figura 4-26 Identificacin bacteriana de los clones aislados

La presencia de los gneros reportados en la presente investigacin es usual considerando que son
gneros microbianos habituales en productos lcteos y agua residual, por ejemplo, los gneros
Klebsiella y Escherichia son parte del grupo coliformes totales comnmente analizados en la
calidad del agua, mientras que Pseudomonas es un gnero muy estudiado por sus caractersticas
psicrficas y su influencia en las caractersticas de la leche y sus derivados, fundamentos que
permiten validar los datos obtenidos. (Henry & Heinke, 1999, pp. 273,274) (Guerrero, et al., 2003, pp.
187, 188)
59
CONCLUSIONES
En la presente investigacin se aislaron 68 clones a partir de muestras de agua residual

de la industria lctea, de los cuales se lograron reaislar y estabilizar 52 clones adaptados
al medio mnimo de produccin de polihidroxialcanoatos.
El anlisis de polihidroxialcanoatos realizado mediante tincin con Sudn Black e

Infrarrojo por transformada de Fourier permiti conocer que los clones seleccionados no
producan el biopolmero, incluso utilizando diferentes sustratos o bajo diferentes
condiciones de estrs.
La caracterizacin bacteriana demostr que los clones seleccionados en el grupo A son

capaces de producir exopolmeros, mientras que los clones presentes en el Grupo B
demostraron una mejor adaptacin a medios suplementados con cloruro de sodio y
ajustados a pH cido.
Las pruebas de tolerancia a metales pesados demostraron que los clones analizados
presentaban una mayor adaptacin a medios suplementados con plomo y cadmio,
mientras que en medios suplementados con mercurio, cobre y arsnico se observ mayor
inhibicin en su crecimiento, lo cual permite identificar los diferentes ambientes txicos
que podran ser aptos para su desarrollo.
El anlisis de produccin de enzimas demostr la presencia de proteasas y lipasas en un

mayor porcentaje de los clones del Grupo B, demostrando su potencial utilizacin en la
degradacin de protenas y lpidos, mientras que los clones presentes en el Grupo A
presentaron mayor capacidad de producir amilasas, permitiendo su potencial utilizacin
durante la degradacin de almidn y glucgeno.
Las pruebas de identificacin bioqumica mostraron un mayor porcentaje de clones

pertenecientes a los gneros Pseudomonas spp. y Klebsiella spp, sin embargo, tambin
se encontr la presencia en menor porcentaje de los gneros Acinetobacter, Aeromonas y
Enterobacter.
El esquema de aislamiento y seleccin de los microorganismos, utilizado en la presente

investigacin permite afirmar que sometiendo las muestras a un periodo de refrigeracin,
60
se indujo un proceso de enriquecimiento de microorganismos capaces de resistir
condiciones extremas, entre ellas, metales pasados, salinidad y pH cido.
61
RECOMENDACIONES
El estudio de polihidroxialcanoatos como alternativa a plsticos derivados de

hidrocarburos es reciente en el Ecuador y un campo de estudio no explorado ni explotado
a nivel local, recomendando su anlisis, con el fin de mejorar su investigacin y proyectar
su aplicacin.
Para el proceso de identificacin de bacterias productoras de polihidroxialcanoatos se

sugiere la utilizacin de oxazinas bsicas como Azul Nilo A y Rojo Nilo para anlisis In
vivo por fluorescencia, pues segn referencias bibliogrficas demuestra mayor
especificidad al compuesto descartando problemas de incertidumbre y mejorando el
tiempo de anlisis.
62
BIBLIOGRAFA
1. INSTITUTO TECNOLGICO DEL PLSTICO (AIMPLAS). Biopolmeros:

Procesabilidad y Casos de Estudio. Valencia Espaa. 2011. [En lnea] Disponible en:
http://www.academia.edu/6210384/Biodegradaci%C3%B3n_por_microorganismos_PO
L%C3%8DMEROS_BIODEGRADABLES [Consulta: 28 de diciembre de 2015].
2. ALARCN, Luis, & OLIVAS, Evangelina. Manual de practicas de Microbiologa

bsica y Microbiologa de alimentos. Programa de Nutricin. 1ra ed. Juarez - Mxico.
UACJ, 2001. pp. 17, 18.
3. ANDERSON, Alistair, & DAWES, Edwin. Occurrence, Metabolism, Metabolic Role,

and Industrial Uses of Bacterial Polyhydroxyalkanoates. Microbiological Reviews.
Yorkshire-Inglaterra (1990). [En lnea]. 54(4), pp. 450-472. Disponible en:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC372789/
[Consulta: 20 de noviembre de 2015].
4. ARROYAVE, Ana, CARDONA, Mariana, & AGUDELO, Lina. Identificacin de

cepas nativas con potencial para obtencin de polihidroxialcanoatos (PHAs) en lodos
activados. Biotecnologa en el Sector Agropecuario y Agroindustrial. Antoquia-
Colombia (2013) [En lnea]. 11 (2). pp. 69-76. Disponible en:
http://www.scielo.org.co/pdf/bsaa/v11nspe/v11nespa08.pdf
[Consulta: 25 de septiembre de 2015].
5. BABEL, Wolfgang, & STEINBCHEL, Alexander. Biopolyesters. Nueva York -

Estados Unidos de Amrica. Springer, 2001. pp. 52-55
6. BACHMANN, Konrad. Biologa para mdicos: conceptos bsicos para las facultades
de medicina, farmacia y biologa. 1ra ed. Barcelona - Espaa: Reverte. 1979. p. 143
7. BELGACEM, Mohamed Naceur, & GANDINI, Alessandro. Monomers, Polymers

and Composites from Renewable Resources. 1ra ed. Oxford Inglaterra. Elsevier. 2011.
pp. 452, 453
8. BENGTSSON, Simon, WERKER, Alan, & WELANDER, Thomas. Production of

polyhydroxyalkanoates by glycogen accumulating organisms treating a paper mill
wastewater. Water Science & Technology. Lund - Suecia (2008) [En lnea]. 58(2). pp.
323-330. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18701781
9. BERLANGA, Mercedes, MONTERO, Mara Teresa, et al. Rapid spectrofluorometric

screening of poly-hydroxyalkanoate producing bacteria from microbial mats.
International Microbiology. Barcelona - Espaa (2006) [En lnea] 9 (2). pp. 95-102.
Disponible en: http://www.im.microbios.org/0902/0902095.pdf.
[Consulta: 2 de octubre de 2015].
10. BERNLDEZ, Virginia. Polmeros biodegradables realidad o ficcin? Valladolid

Espaa 2007. [En lnea]. Disponible en:
http://www.eis.uva.es/~biopolimeros/virginia/index.html
[Consulta: 2 de enero de 2016].
11. BLANCO, Marina. Deteccin de grnulos de polihidroxialcanoatos en la cepa USBA

355 Tistlia consotensis. (Tesis de pregrado) Pontificia Universidad Javeriana. Bogota -
Colombia. 2010 p. 23
12. BOSCO, Francesca, & CHIAMPO, Fulvia. Production of polyhydroxyalcanoates

(PHAs) using milk whey and dairy wastewater activated sludge Production of bioplastics
using dairy residues. Journal of Bioscience and Bioengineering. Torino - Italia (2010)
109(4), pp. 418421. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20226388
13. BRAUNEGG, Gerhart, LEFEBVRE, Gilles, & GENSER, Klaus.

Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters from renewable resources: Physiological and
engineering aspects. Journal of Biotechnology. Graz Austria. (1998). [En lnea], 65(2-
3), pp. 127 - 161. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9828458
[Consulta: 26 de Octubre de 2015].
14. CMARA DE INDUSTRIAS DE GUAYAQUIL. Importaciones de materias primas

plsticas. Guayaquil- Ecuador. 2012. [En lnea] Disponible en:
http://www.industrias.ec/archivos/file/INFORMACION%20PARA%20AFILIADOS/I
mport_m_primas_plast_corregida03_100212.pdf [Consulta: 22 de septiembre de 2015].
15. CARDONA, Ana, MORA, Amanda, & MARN Mauricio. Identificacin Molecular
de Bacterias Productoras de Polihidroxialcanoatos en Subproductos de Lcteos y Caa
de Azcar. Revista Facultad Nacional de Agronoma. Medelln-Colombia. 2013. [En
lnea] 66 (2), pp. 7129 - 7140. Disponible en:
http://www.redalyc.org/pdf/1799/179930031013.pdf [Consulta: 26 de Octubre de 2015].
16. CASTILLO, Francisco. Biotecnologa ambiental 1ra ed. Madrid Espaa. Editorial
Tebar. 2005. pp. 221, 240
17. CELIS, Mauricio, & JUREZ, Daniel. Microbiologia de la leche. Buenos Aires-
Argentina: Universidad Tecnolgica Nacional, 2009 [En lnea] Disponible en:
http://www.edutecne.utn.edu.ar/sem_fi_qui_micrb_09/microbiologia_leche.pdf
[Consulta: 12 de enero de 2016].
18. CERVANTES, Carlos. Mecanismos de expulsin de metales txicos en bacterias. BEB.

Boletn de educacin bioqumica. Michoacn Mxico. 2000. [En lnea]. 19 (1), pp. 24-
31. Disponible en: http://www.smb.org.mx/smb-anterior/text/beb/beb001912431.pdf
[Consulta: 26 de Enero de 2016].
19. CHAKRAVARTY, Partha, MHAISALKAR, Vasant, & CHAKRABARTY, Tapan.

Study on poly-hydroxyalkanoate (PHA) production in pilot scale continuous mode
wastewater treatment system. Bioresource Technology. Hyderabad India. 2010. [En
lnea]. 101(8), pp. 2896-2899. Disponible en:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20045314 [Consulta: 26 de Noviembre de 2015].
20. CHEN, Guo-Qiang.. Plastics from Bacteria: Natural Functions and Applications.
Mnster Alemania. Springer. 2010. pp. 122-129
21. DELGADILLO, Oscar, CAMACHO, Alan, et al. Depuracin de aguas residuales por
medio de humedales artificiales. 2a ed. Cochabamba Bolivia. Universidad Mayor de
San Sim. 2010. pp. 61-66.
22. DES ABBAYES, Henry. Botnica: vegetales inferiores. 2a ed. Barcelona Espaa.
Revert S.A. 1989. pp. 9, 10.
23. ELLNER, Richard, & SCHULZ, Rodrigo. Preguntas y respuestas sobre la
microbiologa de la leche y los productos lcteos. 1ra ed. Madrid, Espaa. Ediciones Daz
de Santos. 2000. pp. 37-40.
24. ESCUELA DE ORGANIZACIN INDUSTRIAL DE SEVILLA. Los vertidos del

Sector Lcteo. Sevilla Espaa. 2008. [En lnea]. Disponible en:
http://api.eoi.es/api_v1_dev.php/fedora/asset/eoi:48159/componente48157.pdf
25. ESPINAL, Georgina. Manual de prcticas de microbiologa I. Santo Domingo-

Repblica Dominicana. INTEC. 2005. pp. 14-20.
26. Escuela Superior Politcnica de Chimborazo. Informativo Curricular 2012: Ingeniera

en Biotecnologa Ambiental. Riobamba Ecuador. 2013. [En lnea]. Disponible en:
http://www.espoch.edu.ec/Descargas/Pensum/ING_BIOTEC_AMBIENTAL_d17d6.pd
f [Consulta: 22 de septiembre de 2015].
27. FORBES, Betty. Diagnostico Microbiologico. 12a ed. Madrid Espaa. Editorial
Mdica Panamericana. 2009. pp. 216, 246.
28. GAMAZO, Carlos, LPEZ-GOI, Ignacio, & DAZ, Ramn. Manual prctico de
microbiologa. 3a ed. Barcelona Espaa. Masson. 2005. p. 1.
29. GARCA, Antonia. Estudio estadstico para precedir el tiempo de maduracin del
queso manchego, e identificacin de la microbiota. (Tesis doctoral) Universidad de
Castilla- La Mancha. Cuenca Espaa. 1998. p. 145.
30. GARCA, Mariano, QUINTERO, Rodolfo, & LPEZ, Agustn. Biotecnologa

alimentaria. 2da ed. Mxico D.F., Mxico: Limusa, 1993. pp. 423-424
31. GONZLEZ, Yolanda, MESA, Juan, et al. Sntesis y degradacin de

polihidroxialcanoatos: Plsticos de Origen Microbiano. Revista internacional de
contaminacin ambiental. Guadalajara - Mxico. 2013. [En lnea] 29(1), pp. 77-115.
Disponible en: http://www.scielo.org.mx/pdf/rica/v29n1/v29n1a7.pdf
32. GUERRERO, Lourdes, ROMN, Sol, & PACHECO, Lidis. Protelisis de la leche
cruda almacenada en fro. Efecto de las enzimas proteolticas sobre la integridad de las
casenas. Revista Cientfica-Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad del
Zulia. Trujillo- Venezuela (2003) [En lnea]. 13(3), pp. 187-192. Disponible en:
http://www.saber.ula.ve/bitstream/123456789/16636/1/proteolisis.pdf
[Consulta: 17 de febrero de 2016].
33. HENRY, Glynn, & HEINKE, Gary. Ingeniera ambiental. 2a ed. Mxico D.F. -
Mxico. Pearson Educacin. 1999. pp. 273, 274.
34. HERNNDEZ, Alicia. Microbiologa Industrial. 2da ed. San Jos - Costa Rica.
EUNED. 2003. pp. 16-67.
35. HONG, Keum-Shik, SUN, Shu Qiang, et al. A rapid method for detecting bacterial
polyhydroxyalkanoates in intact cells by Fourier transform infrared spectroscopy.
Applied Microbiology and Biotechnology. Beijing - China (1999) [En lnea] 51(4), pp.
523-526. Disponible en: http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs002530051427
36. INSTITUTO DE ACADEMIAS DE ANDALUCA. Contaminacin en la Industria

Lctea. Andaluca Espaa. 1995. [En lnea] Disponible en:
http://www.insacan.org/racvao/anales/1995/articulos/08-1995-02.pdf
37. INSTITUTO NACIONAL DE ESTADSTICAS Y CENSOS. Datos estadsticos

agropecuarios. Quito- Ecuador. INEC. 2011 [En lnea]. Disponible en:
http://www.inec.gob.ec/espac_publicaciones/espac-2011/INFORME_EJECUTIVO%202011.pdf
38. JOVER, Alejandro, & GARCA, Mara Jos. Manual de Auxiliar de Farmacia
Temario General Modulo II. Farmacia Practica. Sevilla Espaa. MAD. 2004. pp. 242-
243.
39. KHANNA, Shilpi, & ASHOK, Srivastava. Recent advances in microbial

polyhydroxyalkanoates. Process Biochemistry. New Delhi - India (2005) [En lnea].
40(2), pp. 607- 619. Disponible en:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032959204000949
40. KHARDENAVIS, Anshuman, KUMAR, Suresh, et al. Biotechnological conversion

of agro-industrial wastewaters into biodegradable plastic, poly b-hydroxybutyrate.
Bioresource Technology. Nagpur - India 2007 [En lnea]. 98(18), pp. 35793584.
Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17207999
41. LEE, Sang Yup. Bacterial Polyhydroxyalkanoates. Biotechnology and Bioengineering.

Taejon - Korea (1996). [En lnea] 49(1), pp. 1 14 Disponible en:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18623547 . [Consulta: 25 de noviembre de 2015].
42. LEE, Sang Yup, & CHANG, Ho Nam. Production of Poly(hydroxyalkanoic acid).
Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. Taejon Korea. (1996) [En lnea]
52, pp. 27 - 58. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7484359
[Consulta: 11 de diciembre de 2015].
43. OATE, Leonor. Biologa I con enfoque por competencias Mxico D.F. Mxico.
Cengage Learning Editores. 2010. pp. 212, 213.
44. MALAJOVICH, Maria Antonia. BioTecnologa: Enseanza y divulgacin. Brasilia

Brasil. 2015 [En lnea] Disponible en:
http://www.bteduc.bio.br/guias_es/79_Preparacion_del_medio_de_agar-leche.pdf
45. MALAJOVICH, Maria Antonia.. Guas de actividades Biotecnologa: enseanza y

divulgacin. Brasilia Brasil. 2015 [En lnea] Disponible en:
http://www.bteduc.bio.br/guias_es/78_Preparacion_del_medio_de_agar-almidon.pdf
46. MARTNEZ, Armando., CRUZ, Mario, et al. Resistencia a antibiticos y a metales

pesados en bacterias aisladas del ro Almendares. Revista CENIC. Ciencias Biolgicas.
La Habana Cuba. 2010. [En lnea] 41, pp. 1-10. Disponible en:
http://www.redalyc.org/pdf/1812/181220509038.pdf [Consulta: 11 de febrero de 2016].
47. MARTNEZ, Carlos, & GARCA, Alavaro. Permetros de proteccin para
captaciones de agua subterrnea destinada al consumo humano: metodologa y
aplicacin al territorio. 10a ed. Madrid Espaa. IGME. 2003. pp. 264.
48. MINISTERIO DEL AMBIENTE ECUADOR. Acuerdo 019 Polticas Generales para
la Gestin Integral de Plsticos en el Ecuador. Quito - Ecuador: Ministerio del Ambiente.
2014 [En lnea]. Disponible en: http://www.ambiente.gob.ec/wp-
content/uploads/downloads/2014/04/AM-019-PLA%CC%81STICOS.pdf
Consulta: 28 de septiembre de 2015].
49. MORAGA, Rubn, MERINO, Carlos, & MONDACA, Mara Anglica. Resistencia
a metales pesados en bacterias aisladas de la baha de Iquique. Investigaciones Marinas.
Iquique - Chile (2003) [En lnea] 31(1), pp. 91-95. Disponible en:
http://www.scielo.cl/pdf/imar/v31n1/art10.pdf [Consulta: 15 de febrero de 2016].
50. MORCILLO, Gloria, CORTS, Estrella, & GARCAS, Jos Luis. Biotecnologa y
alimentacin. 1ra ed. Madrid Espaa. Editorial UNED. 2013. pp. 39, 40
51. MOTAMEDI, Hossein, ARDAKANI, Mohammad Roayaee, & MAYELI, Nasim.

Isolation and screening of native polyhydroxyalkanoate producing bacteria from oil
contaminated soils of Abadan refinery. Biological Journal of Mocroorganism. Abadan -
Irn (2015) [En lnea]. 3(12). pp. 93-104. Disponible en:
http://uijs.ui.ac.ir/bjm/browse.php?a_code=A-10-310-3&slc_lang=en&sid=1
52. NAHEED, Nighat, & JAMIL, Nazia. Optimization of biodegradable plastic production
on sugar cane molasses in Enterobacter sp. SEL2. Brazilian Journal of Microbiology.
Lahore - Pakistn (2015) [En lnea] 45(2), pp. 417-426. Disponible en:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4166265/
53. NEGRONI, Marta. Microbiologa Estomatolgica. 2a ed. Buenos Aires Argentina.

Mdica Panamericana. 2009. pp. 557, 558.
54. NEMEROW, Nelson, & DASGUPTA, Avijit. Tratamiento de vertidos industriales y

peligrosos. 1ra ed. Madrid Espaa. Ediciones Daz de Santos. 1998 pp. 448, 449
55. ORTIZ, Mara. El impacto de los plsticos en el ambiente. Mxico D.F. - Mxico. 2013.
[En lnea]. Disponible en: http://www.jornada.unam.mx/2013/05/27/eco-f.html
[Consulta: 27 de octubre de 2015]
56. PIERO, Judith. Importancia biotecnolgica de la microbiodiversidad. Los nuevos

cazadores de microbios . Revista Venezolana de Ciencia y Tecnologa de Alimentos.
Carabobo - Venezuela (2013) [En lnea] 4(2), pp. 284-317. Disponible en:
http://150.185.136.71:82/repo/ArchivoDocumento/rvcta/v4n2/art10.pdf
57. Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente (PNUMA-DEAT).

Anuario Pnuma: Temas Emergentes en Nuestro Medio Ambiente Global 2011. 1a ed.
Nairobi Kenia. UNEP/Earthprint. 2011. pp. 21-26
58. PRIETO, Jos, DE LA ROSA, Manuel, & NAVARRO, Jos Mara. Microbiologa
en ciencias de la salud : conceptos y aplicaciones. 3a ed. Barcelona Espaa. Elsevier
Espaa. 2001. pp. 15, 16
59. QUILLAGUAMN, Jorge, GUZMN, Hector, et al. Synthesis and production of

polyhydroxyalkanoates by halophiles: current potential and future prospects. Applied
Microbiology and Biotechnology. Cochabamba - Bolivia. (2009) [En lnea]. 85(6), pp.
1687-1696. Disponible en: http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00253-009-
2397-6 [Consulta: 27 de enero de 2016].
60. RAMREZ, Ninfa, SERRANO, Jse, & SANDOVAL, Horacio. Microorganismos

extremfilos. Actinomicetos halfilos en Mxico. Revista Mexicana de Ciencias
Farmacuticas. Mxico D.F. - Mxico (2006) [En lnea] 37(3), pp. 56-71. Disponible en:
http://www.redalyc.org/pdf/579/57937307.pdf [Consulta: 21 de enero de 2016].
61. RANDRIAMAHEFA, Solo, RENARD, Estel, et al. Fourier Transform Infrared

Spectroscopy for Screening and Quantifying Porduction of PHAs by Pseudomonas
Grown on Sodium Octanoate. Biomacromolecules. Thiais - Francia (2003) [En lnea].
4(4), pp. 1092-1097. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12857097
62. RAPRA TECHNOLOGY. Handbook of Biodegradable Polymers. Shrewsbury

Inglaterra. Rapra Technology Limited. 2005. pp. 232-240
63. REDDY, C., GHAI, Rashmi., et al. Polyhydroxyalkanoates: an overview. Bioresource
Technology. Delhi - India (2003) [En lnea] 82(2), pp. 137146. Disponible en:
64. RIVERO, Zulbey, FARA, Jse, & SANTORO, Rosa. Aislamiento de Gram Negativas
en leches crudas con antibiticos. Revista cientfica de la Facultad de Ciencias
Veterinarias de la Universidad del Zulia. Maracaibo - Venezuela (1994) [En lnea]. 4(1),
pp. 11-16. Disponible en: http://www.saber.ula.ve/bitstream/123456789/26868/1/articulo2.pdf
[Consulta: 05 de marzo de 2016].
65. ROMN, Sol, GUERRERO, Lourdes, & PACHECO, Lidis. Evaluacin de la calidad
fsico-qumica, higinica y sanitaria de la leche cruda almacenada en fro. Revista
Cientifica - Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad del Zulia. Maracaibo -
Venezuela (2003) [En lnea]. 13(2), pp. 146-152. Disponible en:
http://www.saber.ula.ve/bitstream/123456789/16646/1/evaluacion_fisicoquimica.pdf
66. SAMROT, Antony, REDDY, Avinesh R., et al. Accumulation of Poly[(R)-3-

hydroxyalkanoates] in Enterobacter cloacae SU-1 During Growth with Two Different
Carbon Sources in Batch Culture. Applied Biochemistry and Biotechnology. Chennai -
India (2011) [En lnea]. 163(1), pp. 195-203. Disponible en:
http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs12010-010-9028-7
67. SNCHEZ, Manuel. Poblacin y ambiente: Serie sociedad y recursos naturales.

Mxico D.F - Mxico. UNAM. 2005. pp. 162-182
68. SECRETARA NACIONAL DE PLANIFICACIN Y DESARROLLO. Plan

Nacional de Desarrollo / Plan Nacional para el Buen Vivir 2013-2017. Quito - Ecuador:
Secretara Nacional de Planificacin y Desarrollo Senplades. 2013 [En lnea].
Disponible en:
http://documentos.senplades.gob.ec/Plan%20Nacional%20Buen%20Vivir%202013-
2017.pdf [Consulta: 27 de septiembre de 2015].
69. SHAMALA, Tumkur., CHANDRASHEKAR, Arun, et al. Identification of

polyhydroxyalkanoate (PHA)-producing Bacillus spp. using the polymerase chain
reaction (PCR). Journal of Applied Microbiology. Karnataka - India (2003) [En lnea]
94(3), pp. 369374. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12588544
70. SLONCZEWSKI, Joan, FUJISAWA, Makoto, et al. Cytoplasmic pH Measurement

and Homeostasis in Bacteria and Archaea. Advances in Microbial Physiology. Ohio -
Estados Unidos de Amrica. (2009) [En lnea] 55, pp. 1-79. Disponible en:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19573695 [Consulta: 03 de febrero de 2016].
71. STANIER, Roger., INGRAHAM, Jhon., et al. Microbiologa. 2a ed. Barcelona

Espaa. Reverte. 1996. pp. 177, 178.
72. STEINBCHEL, Alexander. Perspectives for Biotechnological Production and

Utilization of Biopolymers: Metabolic Engineering of Polyhydroxyalkanoate
Biosynthesis Pathways as a Successful Example. Macromolecular Bioscience. Mnster-
Alemania (2001) [En lnea] 1(1), pp. 1 - 24. Disponible en:
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/1616-5195(200101)1:1%3C1::AID-
MABI1%3E3.0.CO;2-B/epdf [Consulta: 07 de noviembre de 2015]
73. SUDESH, Kumar, ABE, H., & DOI, Yoshiharu. Synthesis, structure and properties of
polyhydroxyalkanoates: biological polyester. Progress in Polymer Science. Saitama -
Japn (2000) [En lnea] 25(10), pp. 15031555. Disponible en:
74. SUEIRO, Fabiana. Caracterizacin de la resistencia a metales pesados y bsqueda de

integrones en cepas de Deiftia sp. (Tesis de pregrado). Universidad de la Repblica.
Facultad de Ciencias. Montevideo - Uruguay. 2012. pp. 12-15
75. TEEGARDEN, David. Polymer chemistry: introduction to an indispensable science.

1ra ed. Virginia - Estados Unidos de Amrica. National Science Teachers Association
Press. 2004. pp. 5-13
76. TORTORA, Gerard, FUNKE, Berdell, & CASE, Christine. Introduccin a la

microbiologa. 9a ed. Madrid Espaa. Editorial Mdica Panamericana. 2007. pp. 292-
297
77. UNITED NATIONS. Convention on Biological Diversity . Rio de Janeiro - Brasil: CBD-
UN. 1992. p. 3
78. UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA. Lecitinasa. Caracas Venezuela.

Universidad Central de Venezuela, 2009 [En lnea]. Disponible en:
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/lecitinasa.pd
f [Consulta: 11 de enero de 2016].
79. UR-REHMAN, Shafiq., JAMIL, Nazia., & HUSSNAIN, Shahida. Characterization

and Optimization of Antibiotic Resistant Bacterial strains for Polyhydroxyalkanoates
(PHA) production. Pakistan journal of agricultural research. Lahore - Pakistan (2006)
[En lnea] 19(4), pp. 81-86. Disponible en:
80. VALENCIA, Adriana. Diseo de un sistema de tratamiento para las aguas residuales
de la cabecera parroquial de San Luis-Chimborazo. (Tesis de pregrado). Escuela
Superior Politcnica de Chimborazo, Facultad de Ciencias. Riobamba - Ecuador. 2013.
p. 92
81. VALENCIA, Elizabeth., & RAMREZ, Mara. La industria de la leche y la

contaminacin del agua. Elementos. Puebla - Mxico (2009) [En lnea] 16(73) pp. 27-31
Disponible en: http://www.redalyc.org/pdf/294/29411996004.pdf
ANEXOS
ANEXO A Obtencin de los clones de experimentacin
Fotografa 1. Recoleccin de las muestras en la Empresa Lcteos Santilln
Fotografa 2 Conteo de Microorganismos presentes en las muestras

ANEXO B Pruebas de produccin de polihidroxialcanoatos
Fotografa 3 Tincin de bacterias utilizando el colorante Sudan Black
Fotografa 4 Observacin en el microscopio de bacterias teidas con Sudan Black

Fotografa 5 Bacterias teidas con Sudan Black y Safranina en lente 100X
Fotografa 6 Prueba de produccin de PHA utilizando Infrarrojo por Transformada de Fourier

Fotografa 7 Espectro de Infrarrojo por Transformada de Fourier de las bacterias analizadas
Fotografa 8 Espectro de Infrarrojo por Transformada de Fourier del control negativo

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ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DE CHIMBORAZO

CARACTERIZACIN Y EVALUACIN DE BACTERIAS PARA

Trabajo de titulacin para optar por el ttulo de:

AUTOR: CHRISTIAN ORLANDO CAMACHO LPEZ

El Tribunal de Trabajo de Titulacin certifica que: El trabajo de investigacin:

PhD. Gerardo Emilio Medina

MSc. Paola Argello

Riobamba, 12 de abril de 2016

Christian Orlando Camacho Lpez

Christian Orlando Camacho Lpez

A mis abuelitos por su apoyo y consejo permanente

Christian Orlando Camacho Lpez

Palabras clave: <BIOPOLMEROS> <BIOPLSTICOS> <POLIHIDROXIALCANOATOS>

Polyhydroxyalkanoates are bioplastics synthesized by some bacteria as reserve of carbon and

Keywords: <BIOPOLYMERS> <BIOPLASTICS> <POLYHYDROXYALKANOATES>

1.1 Identificacin del problema ..........................................................................................1

2. MARCO TERICO ...................................................................................................6

2.1 Antecedentes de la Investigacin ..................................................................................6

3.1 Metodologa de la Investigacin ................................................................................. 24

4.1 Obtencin de los clones bacterianos ........................................................................... 33

Figura 2-1 Contaminacin segn el agente contaminante ......................................................8

Tabla 2-1 Mtodos de aislamiento frecuentes......................................................................... 11

1.1 Identificacin del problema

El principal problema ambiental de la industria lctea es la generacin de aguas residuales

En Ecuador, segn el Sistema Estadstico Agropecuario Nacional la produccin nacional de leche

El plstico constituye uno de los materiales ms utilizados en todo el mundo y su disposicin

La bsqueda e identificacin de microorganismos en ambientes extremos o poco frecuentes

El presente estudio busca asilar, caracterizar e identificar bacterias en aguas residuales de la

La identificacin de bacterias capaces de sintetizar polihidroxialcanoatos (PHAs) a partir de

La produccin de biopolmeros a partir de bacterias permite el aprovechamiento de grandes

El aprovechamiento a nivel industrial de biopolmeros hace imprescindible identificar las

Este proyecto propone la bsqueda, identificacin y utilizacin de microorganismos no

El presente proyecto de investigacin se enmarca en las leyes y reglamentos que promueven el

Adems, de manera complementaria la investigacin impulsa el cumplimiento de los objetivos

1.3.1 Objetivo General

1.3.2 Objetivos Especficos

Aislar y estabilizar bacterias del agua residual de la industria lctea.

Analizar la produccin de polihidroxialcanoatos de las bacterias aisladas del agua residual

Caracterizar las bacterias aisladas mediante pruebas adaptativas, enzimticas y metablicas.

2.1 Antecedentes de la Investigacin

La primera observacin de inclusiones citoplasmticas de reserva en clulas bacterianas fue

En el ao de 1974 Wallen y Davis registraron el aislamiento de otro biopolister generado por

Los polihidroxialcanoatos fueron producidos de manera comercial desde inicios de la dcada de

Actualmente existe gran informacin de microorganismos y substratos utilizados para la sntesis

En la actualidad, los diferentes enfoques de estudio exhiben diversos tipos de contaminacin,

Fsica Qumica Biolgica

* xidos de Carbono, *Metabolitos biolgicos

Figura 2-1 Contaminacin segn el agente contaminante

La contaminacin hdrica es causada fundamentalmente por la actividad humana, a travs, de la

Algunos de los contaminantes ms comunes en el agua son celulosa, sulfatos, nitratos,

2.2.1.2 Agua residual de la industria lctea

El agua residual producida por la industria de lcteos es de composicin variable y aunque

As mismo, la elaboracin de queso produce aguas residuales cidas debido a la descomposicin

Los microorganismos ms abundantes en el agua residual de la industria de lcteos son las

Existe otro tipo de microorganismos denominados microorganismos ambientales, como las

La presencia de una alta carga microbiolgica y la composicin rica en nutrientes de la leche y

2.2.2 Tcnicas de anlisis microbiolgico

La inoculacin es un mtodo de laboratorio que permite establecer microorganismos de una

Tabla 2-1 Mtodos de aislamiento frecuentes

Tipo de Siembra Mecanismo Tcnica

2.2.2.3 Identificacin morfolgica y bioqumica

La identificacin microbiolgica permite conocer las categoras taxonmicas de un

Caracterstica Clasificacin Detalle o Tipo

2.2.3.1 Las bacterias en el sistema ecolgico