PRACTICA N2 PREPARACIN DE MEDIOS

DE CULTIVO
INTRODUCCIN:
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones
adecuadas y en condiciones fsicas ptimas, permiten el crecimiento de los
microorganismos. Estos medios son esenciales en el Laboratorio de Microbiologa
por lo que un control en su fabricacin, preparacin, conservacin y uso, asegura
la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos.
En los laboratorios de microbiologa se utilizan diferentes tipos de medios de
cultivo que pueden ser preparados en forma lquida o en forma slida. Usualmente
para preparar un medio slido, se parte de un medio lquido al que se le aade un
agente solidificante como el agar, la gelatina.
Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus
constituyentes en:
Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de
origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la
adicin de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los
componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.
Medios definidos o sintticos: son los medios que tienen una
composicin qumica definida cualitativa y cuantitativamente. Generalmente
se usan en trabajos de investigacin.

De acuerdo al uso del medio de cultivo, stos se clasifican en:

Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que favorecen el

crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar
el nmero de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o
ms sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con
excepcin de los que se quieren cultivar.
Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian
por ser medios slidos y estn diseados para el aislamiento de
microorganismos especficos.
Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos
derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen
ningn tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar
caractersticas fisiolgicas de los microorganismos.

Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de

sus constituyentes bsicos, o por simple rehidratacin de productos asequibles
comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el
uso de los medios de cultivo deshidratados porque, adems de simplificar el
trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.
 Para su preparacin se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:

Prepararlos slo a partir de productos que provengan de fabricantes o

proveedores que suministren productos de calidad.
Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiolgica y
fisicoqumica adecuada.
Utilizar materiales de vidrio bien lavado y enjuagado con agua destilada o
desmineralizada.
Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilizacin.
Nunca se deben exceder las condiciones sealadas por el fabricante.

ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados

bajo las condiciones que seale el fabricante. Generalmente se almacenan en un
lugar fresco (entre 15 y 25), con poca humedad y protegidos de la luz solar
directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de
calor o vapor.
Los medios de cultivo deshidratados son higroscpicos. Cuando los envases de
estos medios de cultivo deshidratados son abiertos para su uso inicial, se debe
tener la precaucin de cerrarlos tan pronto como sea posible y mantenerlos bien
cerrados para prevenir la entrada de humedad. La absorcin de agua produce
cambios de pH, formacin de grumos, decoloraciones del polvo, etc., lo cual indica
que deben ser descartados porque pueden haber sufrido cambios qumicos o
estar contaminados.
Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado, puede
almacenarse a temperatura ambiente por un periodo mximo de 2 semanas
protegido de la luz, o por periodos mayores a 12 -15C. Sin embargo,
almacenados bajo refrigeracin entre 2 y 8C se prolonga la vida til de los
mismos, (nunca por debajo de 0C porque se destruye la estructura del gel). Los
medios de cultivo se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su
deshidratacin y cuando se usa tapn de algodn, se debe colocar por encima
una envoltura de papel (Craft).
Otro punto importante a tomar en cuenta, es que cada lote de medio de cultivo
preparado debe pasar por un riguroso proceso de control de calidad, en donde se
determinan sus propiedades fisicoqumicas (apariencia, pH, etc.) y microbiolgicas
(esterilidad y promocin de crecimiento) verificando que cumplan con los
requisitos de calidad establecidos y por ende demostrar que son aptos para su
uso.
FUNDAMENTO:
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Puesto que la diversidad metablica de los microorganismos es
enorme, la variedad de medios de cultivo es tambin muy grande. La mayora de
los medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso
rehidratar. La preparacin de un medio de cultivo se reduce en general a pesar la
cantidad de medio y redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores del
crecimiento) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolbiles
se esterilizan por filtracin y se aaden al resto de los componentes previamente
esterilizados en la autoclave.
Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son:
1. Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacrido que se
obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de
degradarlo.
2. Azcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los
ms empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa.
3. Extractos. Son preparados de ciertos rganos o tejidos animales o
vegetales obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de levadura,
de malta, etc.
4. Peptonas. Son protenas hidrolizadas, se obtienen por digestin qumica
o enzimtica de protenas animales o vegetales.
5. Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o
suero sanguneo son aadidos a los medios empleados para el cultivo de
algunos microorganismos patgenos.
6. Sistemas amortiguadores. Son sales que se aaden al medio para
mantener el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano.
Ej.fosfatos bisdicos o bipotsicos.
7. Indicadores de pH. Son indicadores cido-base que se aaden para
detectar cambios de pH en el medio.
8. Agentes reductores. Sustancias que se aaden al medio para crear las
condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos o
anaerobios. Ej. cistena y tioglicolato.

9. Agentes selectivos: sustancia como el cristal violeta, las sales biliares,

etc. que a determinadas concentraciones en el medio actan como
agentes selectivos frente a determinados microorganismos

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO.

POR SU CONSISTENCIA:

Slidos. Son aquellos que contienen un agente solidificante entre sus

componentes, normalmente agar. Se preparan en placas de Petri o en
tubos en slant (tubos con la superficie del medio inclinada).
Lquidos. Se denominan caldos y se preparan en tubos o erlenmeyers.
POR SU COMPOSICIN:

Medios generales. Permiten el desarrollo de una gran variedad de

microorganismos.
Medios de enriquecimiento. Favorecen el crecimiento de un determinado
grupo de microorganismos, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del
resto.
Medios selectivos. Permiten el crecimiento de un tipo de microorganismos
determinado, inhibiendo el desarrollo de los dems.
Medios diferenciales. Son aquellos en los que se pone de relieve alguna
propiedad que un determinado tipo de microorganismos posee.

LA ESTERILIZACIN
Se utilizan dos tipos principales de esterilizacin:
Por MTODOS FSICOS (calor, filtracin, radiaciones).
Por MTODOS QUMICOS (empleo de soluciones qumicas).

Los medios de cultivo se esterilizan en el AUTOCLAVE, el cual hace uso del calor
hmedo. La autoclave es un aparato que permite elevar la presin y la
temperatura con lo que se consigue un aumento en la temperatura de ebullicin
del agua. Normalmente, se lleva la presin a 1 atmsfera (por encima de la
ambiental) lo que corresponde a una temperatura interior de 126C,
mantenindolo en estas condiciones durante 20 minutos.
Todo el material de vidrio (pipetas, tubos, varillas.etc.) se esteriliza con calor seco,
siendo el "horno Pasteur" el aparato ms empleado (se somete a temperaturas de
140-180 C durante 2h-3h).
OBJETIVOS:
Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes para el
desarrollo de los microorganismos.

Manejar los instrumentos de uso rutinario, en el laboratorio de

microbiologa.

Preparar adecuadamente medios de cultivo a partir de sus ingredientes y a

partir de medios de cultivo deshidratados.
Conocer los principios generales de la preparacin y tcnicas de
esterilizacin de diversos materiales y medios de cultivo de uso comn en
Microbiologa.
MATERIALES:

Balanza analtica

Luna de reloj

Matraz

Varilla

Autoclave

Agar plate count

Agua destilada

PROCEDIMIENTO:

1. Leer cuidadosamente el marbete del medio de cultivo agar Plate Count

2. Pesarnos la cantidad exacta de medio (1.175 g) de agar Plate Count en

una luna de reloj.

3. En un matraz agregamos 50 ml de agua destilada y tambin agregamos el

agar (Plate Count) pesado.

4. Agitamos con la varilla desapareciendo algunos de los grumos.

5. Tapamos y llevamos a la autoclave.

RESULTADO:
MEDIO DE CULTIVO: Plate Coun
CANTIDAD PREPARADA: 50ml
CANTIDAD PESADA: 1.175 g
CLCULOS:

23.501000
X 50
X=1.175

AGAR Plate Count (APC)

Medio de cultivo slido, de identificacin de organismos heterotrficos (aerobios mezofilos),
recomendado para el recuento de bacterias aerbicas en aguas, aguas residuales,
productos lcteos y otros alimentos. Tambin es recomendado como medio
general para determinar poblaciones microbianas.
RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESOFILOS
Mtodo de recuento en placa (SPC): determina clulas viables en un alimento
1. Mtodo: Recuento por siembra de inclusin.
2. Siembra en caja de Petri vaca.
3. Aade muestra, aade medio, homogeniza.
4. Todas las clulas forman una colonia y todas las colonias nacen de una
clula.
5. Grado de contaminacin de alimento en cualquier proceso de produccin.
COMPOSICION MODO DE ACCION DEL INGREDIENTE
 Casena enzimtica Casena enzimtica hidrolizada:
hidrolizada 5.0 gr Provee aminocidos y otros complejos de
sustancias nitrogenadas
Extracto de levadura Extracto de levadura: Provee complejo
Agar Plate 2.5 gr de vitamina B.
Count Trifenil cloruro de tetrazolio (TTC):
Dextrosa 1.0 gr Ayuda al reconocimiento de las colonias
de microorganismos debido a la
Agar 15.0 gr formacin del colorante rojo insoluble
(TTC es reducido)
pH final 7.0 +/- 0.2

DISCUSIN: Dentro del marco de discusin podemos Destacamos el

resultado positivo sobre los medios de cultivo, ya que en l aplicamos toda la
teora estudiada en la clase, es decir, los diversos modos de cultivo fueron
necesarios para hacer comparaciones entre ellos, y de esta manera definir el que
se acomodara de mejor forma a la prctica que elaboramos.
Agar Nutritivo
Medio de cultivo utilizado para propsitos generales, para el aislamiento de
microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos.
Su uso est descrito en muchos procedimientos para el anlisis de alimentos,
aguas y otros materiales de importancia sanitaria.
Es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus
requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. La
pluripeptona es la fuente de carbono y nitrgeno para el desarrollo bacteriano. El
agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u
otras sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes.
Caractersticas del medio: mbar claro a medio ligeramente opalescente.
Frmula (en gramos por litro) Instrucciones
Pluripeptona 5.0 Suspender 31 g de polvo por litro de agua
Extracto de carne 3.0 destilada. Mezclar y dejar reposar 5 minutos.
Cloruro de sodio 8.0 Calentar suavemente agitando 1 o 2 minutos
Agar 15.0 hasta su disolucin.
Distribuir y esterilizar a 121C durante 15
minutos
pH final: 7.3 0.2

CONCLUSIN:
En esta prctica se aprendi la importancia de preparar medios de cultivo,
los distintos tipos de cultivos que pueden desarrollarse en el laboratorio,
as como su clasificacin, sus caractersticas principales, los distintos tipos
que pueden servir para identificar diferentes bacterias, as como las
condiciones que estos deben de reunir.
Mediante el desarrollo de la prctica definimos, estudiamos y aplicamos los
procedimientos que se deben realizara para la elaboracin de un medio de
cultivo, es claro que esto es referido para con la unidad que estamos
estudiando, microbiologa.

CUESTIONARIO:
 1. Cul es la importancia de conocer el tipo de medio para el
aislamiento de microorganismos?
Para que podamos diferenciar la gran variedad de tipo de agares y poder
emplearlos correctamente en las muestras que queramos utilizar para as
presencia de microorganismos en una muestra y su posterior identificacin
2. Por qu algunos medios de cultivo no necesitan ser llevados a
autoclave?
Porque algunos de sus componentes se degradan con la temperatura de
autoclave. Adems si es un medio altamente selectivo, es hipersalino y con
pH muy alcalino. Solamente sobreviven bacterias halo y alcalinotolerantes,
como las bacterias del gnero Vibrio, as que no se necesita esterilizar
porque su riesgo de contaminacin es muy bajo.
En todo caso, el agua que agregas para hacer el medio, debe ser destilada
y estril, y prepararla en un matraz previamente esterilizado.

3. Averiguar sobre el mtodo petrifilm 3M

Las placas Petrifilm contienen un

medio de cultivo selectivo listo para
usar: Violeta Rojo Bilis (VRB), un
agente gelificante soluble en agua fra
y un indicador de tetrazolio que facilita
la enumeracin de colonias. El film
superior atrapa el gas producido por la
fermentacin de la lactosa por los
coliformes totales, y tambin
coliformes termotolerantes (fecales). El
tiempo y la temperatura de incubacin,
as como la interpretacin, vara segn el mtodo seguido.

Las placas Petrifilm pueden leerse con un contador de colonias standard u

otra lente de aumento iluminada. Las colonias pueden aislarse para una
posterior identificacin. Levantar el film superior y seleccionar la colonia del
gel.

REFERENCIAS:
 http://www.danival.org/notasmicro/medioscult/_madre_medios.html

http://www.mastgrp.com/IFUS/IFU342_SPA.pdf

Merck. 2002. Microbiology Manual

Manual de prcticas de laboratorio de microbiologa general.