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www.elsevier.es/eimc
Revisin
Historia del artculo: Los microbilogos clnicos deben asegurar, al mximo nivel permitido por el desarrollo cientfico y tcnico,
Recibido el 13 de noviembre de 2013 la fiabilidad de los resultados. Esto implica que, adems de reunir los criterios tcnicos que aseguren su
Aceptado el 21 de noviembre de 2013 validez, deben ser realizados con una serie de garantas, que permitan obtener resultados comparables,
con independencia del laboratorio que los ejecute. En este sentido, el empleo de mtodos de referencia,
Palabras clave: reconocidos y aceptados, es la herramienta ms eficaz para obtener estas garantas.
Validacin Las actividades relacionadas con la verificacin y validacin de mtodos analticos ha cobrado gran
Verificacin
importancia, debido por un lado al continuo desarrollo y actualizacin de tcnicas y equipos analticos
Control de mtodos
cada vez ms complejos, y por otro lado, al inters de los profesionales en garantizar la calidad de sus
procesos y resultados.
Se describen las definiciones de validacin y verificacin, las diferentes modalidades de valida-
cin/verificacin, as como los tipos de mtodos y el nivel de validacin necesario segn sea el grado
de normalizacin. Se comentan las situaciones en las que es obligatoria y/o recomendable la valida-
cin/verificacin, as como las particularidades que la validacin tiene en microbiologa.
Se incide en la importancia de potenciar el uso de las cepas de referencia como control en microbio-
loga y del uso de controles normalizados, as como en la importancia de la participacin en programas
de evaluacin externa de la calidad para poder demostrar competencia tcnica. Se hace hincapi en la
forma de calcular algunos de los parmetros imprescindibles para la validacin/verificacin, como son
la exactitud y la precisin.
El desarrollo completo de estos conceptos se puede consultar en el procedimiento microbio-
lgico SEIMC nmero 48: Validacin y verificacin de mtodos microbiolgicos disponible en:
www.seimc.org/protocolos/microbiologia.
2013 Elsevier Espaa, S.L.U. y Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa
Clnica. Todos los derechos reservados.
a b s t r a c t
Keywords: Clinical microbiologists should ensure, to the maximum level allowed by the scientific and technical
Validation development, the reliability of the results. This implies that, in addition to meeting the technical criteria to
Verification ensure their validity, they must be performed with a number of conditions that allows comparable results
Control of methods
to be obtained, regardless of the laboratory that performs the test. In this sense, the use of recognized
and accepted reference methodsis the most effective tool for these guarantees.
The activities related to verification and validation of analytical methods has become very important,
as there is continuous development, as well as updating techniques and increasingly complex analytical
equipment, and an interest of professionals to ensure quality processes and results.
The definitions of validation and verification are described, along with the different types of valida-
tion/verification, and the types of methods, and the level of validation necessary depending on the degree
of standardization. The situations in which validation/verification is mandatory and/or recommended is
discussed, including those particularly related to validation in Microbiology.
Autor para correspondencia.
Correo electrnico: concepcion.gimeno@uv.es (C. Gimeno-Cardona).
0213-005X/$ see front matter 2013 Elsevier Espaa, S.L.U. y Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica. Todos los derechos reservados.
http://dx.doi.org/10.1016/j.eimc.2013.11.010
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It stresses the importance of promoting the use of reference strains as controls in Microbiology and the use
of standard controls, as well as the importance of participation in External Quality Assessment programs to
demonstrate technical competence. The emphasis is on how to calculate some of the parameters required
for validation/verification, such as the accuracy and precision.
The development of these concepts can be found in the microbiological process SEIMC number 48:
Validation and verification of microbiological methods www.seimc.org/protocols/microbiology.
2013 Elsevier Espaa, S.L.U. and Sociedad Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa
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del mtodo de extraccin de los cidos nucleicos en el caso de una En el caso de los mtodos (tipo iv) la validacin deber
tcnica de PCR o aplicados a muestras que no aparecen validadas en completarse estudiando las diferentes variables que pudieran
el insert) y mtodos desarrollados por el propio laboratorio usando verse afectadas por las modificaciones propuestas de entre los
reactivos comerciales que s estn bien caracterizados, pero que parmetros: especificidad, sensibilidad, exactitud relativa, desvia-
no est validado el proceso completo para el que el laboratorio cin positiva, desviacin negativa, repetibilidad, reproducibilidad,
clnico lo va a utilizar. linealidad, incertidumbre y el lmite de cuantificacin dentro de una
Es importante comentar la definicin de tipos de mtodos segn variabilidad establecida y, en caso necesario, determinar cuantita-
las directrices definidas por la Entidad Nacional de Acreditacin tivamente estos parmetros. Las diferencias debidas a las matrices
(ENAC), y que los clasifica en mtodos tipo i, ii, iii y iv, con exigencias (tipos de muestra) deben tenerse en cuenta al analizar diferen-
de validacin distintas3 : tes tipos de muestras, y los resultados deben evaluarse utilizando
mtodos estadsticos apropiados.
Mtodos normalizados (tipo i)
Particularidades de los mtodos microbiolgicos. esta definicin coincide con la existente para material de refe-
Caractersticas de la medicin microbiolgica rencia, y por tanto deberan ser consideradas tambin materiales
de referencia. Sin embargo, tambin se entiende por material de
El proceso analtico microbiolgico obliga a tener en cuenta una referencia aquellas muestras suministradas por certificadores que
serie de caractersticas propias de los mtodos microbiolgicos que tienen un valor conocido y certificado de un nmero concreto
van a influir en su forma de validacin, as como en el resultado final de microorganismos de un determinado tipo, obtenido mediante
obtenido. la aplicacin de un determinado mtodo6,7 . Este caso incluira
A diferencia de las ciencias fsicas y qumicas, en microbiolo- tambin las cepas que se han usado en ensayos de intercompa-
ga se trabaja con microorganismos que se multiplican por divisin racin.
binaria y crecen exponencialmente.
Adems, el nmero de colonias observadas es solamente una
aproximacin del nmero de partculas vivas, y la viabilidad se Etapas del proceso de validacin/verificacin
define como crecimiento por el propio mtodo, que depender del
medio de cultivo empelado, tiempo y temperatura de incubacin. El proceso de validacin/verificacin de un mtodo debe estar
Hay una falta de referencias comunes internacionales, y en conse- cuidadosamente planificado, por ello deben contemplarse los
cuencia la tasa de recuperacin absoluta no puede ser definida y siguientes pasos:
la trazabilidad es imposible, presentndose los recuentos obteni-
dos como recuperaciones relativas. Dado que se trabaja con seres
vivos, en muchas ocasiones impredecibles, los procesos de estabi- 1) Conocer el problema analtico a resolver. Los procedimientos y
lizacin de las muestras para disponer de un valor de referencia el alcance de la validacin no son siempre los mismos. Deben
o para poder realizar ensayos de reproducibilidad son complica- ser establecidos de acuerdo a las caractersticas del mtodo de
dos, siendo difcil, en muchos casos, asegurar completamente la ensayo utilizado por el laboratorio y tener en cuenta las necesi-
estabilidad. dades del solicitante de la prueba.
Siguiendo las recomendaciones de la gua de validacin G-04 2) Planificar las acciones a seguir. Esto implica especificar los requi-
de ENAC3 , la validacin de los mtodos de ensayo debe reflejar sitos y condiciones a cumplir, determinar los parmetros de
las condiciones reales de ensayo. Esto puede conseguirse utili- desempeno del mtodo, establecer el diseno experimental y el
zando muestras contaminadas naturalmente o inoculadas con un mtodo de anlisis de resultados. El diseno experimental y
nivel conocido de microorganismos contaminantes. El microbi- el anlisis de resultado tienen que ser estadsticamente vlidos.
logo debe ser consciente de que la inoculacin de una matriz En esta etapa es fundamental definir el alcance de la validacin
(muestra) con microorganismos contaminantes imita tan solo de de acuerdo al mtodo a emplear, especificar la muestra en la
una manera superficial la presencia de contaminantes naturales. que se va a aplicar; establecer condiciones tales como tempera-
No obstante, a menudo es la mejor y la nica solucin disponible. tura y tiempo de incubacin, lmites de operacin; realizar una
En general, en el campo de la medida microbiolgica no se dis- clara descripcin del/los microorganismos de inters; y estable-
pone de patrones como ocurre en el campo fsico. Sin embargo, cer otras limitaciones y especificaciones. Si los parmetros de
como consecuencia del avance de las necesidades de comparabili- realizacin no estn ya especificados, el laboratorio debe decidir
dad entre laboratorios ha sido necesario desarrollar herramientas cules deben ser caracterizados con el fin de validar el mtodo,
similares. A estas muestras que tienen como objetivo ser una base lo cual deber estar fundamentado de manera fiable y cientfica.
comn y fiable para todos los laboratorios se les ha denominado Se planificar todo en funcin del protocolo de validacin.
materiales de referencia. 3) Llevar a cabo la validacin y evaluar los resultados obtenidos,
Se define como material de referencia al material o sustancia por comparacin con los parmetros establecidos. Confirmar
de la que uno o ms de los valores cuyas propiedades son suficien- la validez del procedimiento utilizado de acuerdo al propsito
temente homogneas y claramente establecidas como para poder establecido, y si se han satisfecho los requisitos.
ser utilizadas en la calibracin de un aparato, la valoracin de un 4) Realizar el informe de validacin.
mtodo de medicin o la asignacin de valores a materiales4,5 .
Para obtener los valores de la propiedad se ha empleado un
mtodo de referencia, que se define como un mtodo investigado As pues, se puede definir que los criterios generales de vali-
a fondo que describe, con claridad y exactitud, las condiciones y dacin consisten en el proceso de evaluacin de las caractersticas
los procedimientos para la medicin de los valores de una o ms de un procedimiento de medida y la comprobacin de que dichas
propiedades, cuando se ha demostrado que tiene una exactitud y caractersticas cumplen una serie de requisitos preestablecidos.
una precisin adecuadas para la finalidad pretendida y, por consi- Una validacin requiere una serie de actividades o criterios
guiente, puede utilizarse para evaluar la precisin de otros mtodos generales de validacin1 :
para la misma medicin, permitiendo especialmente la caracteri-
zacin de un material de referencia.
Sin embargo, en el campo microbiolgico se producen hechos 1) Definicin de requisitos: ser en funcin del tipo de mtodo y
diferenciadores importantes respecto de otros campos: definir rangos para los parmetros.
2) Definicin del mtodo.
1) Pueden producirse mutaciones. 3) Obtencin de muestras o cepas con valor de referencia para
2) Los mtodos no son definitivos y diferentes microorganismos poder realizar comparaciones.
pueden actuar de la misma manera. 4) Aplicacin del mtodo a las muestras en las condiciones esta-
blecidas.
Por ello, adems, en microbiologa existen otro tipo de mate- 5) Obtencin de valores de los parmetros.
riales que se utilizan tanto para comprobar la validez de los 6) Comprobacin del cumplimiento de requisitos y declaracin de
mtodos como para controlar los medios de cultivo utilizados en validez del mtodo.
los anlisis microbiolgicos. Son las denominadas cepas de refe-
rencia. Se entiende coloquialmente por cepa de referencia un
cultivo procedente de una coleccin reconocida. Evidentemente En la figura 1 se muestran las fases del proceso de validacin.
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Diseo y Comparacin
Mtodo a Datos de Anlisis Mtodo
ejecucin de con
validar validacin estadstico validado
ensayos requisitos
Selectividad/especificidad Precisin
Grado en que un mtodo puede determinar un analito parti- Es el grado de concordancia entre los resultados obtenidos al
cular en una muestra, sin ser interferido por otros componentes. aplicar el procedimiento analtico repetidas veces bajo condiciones
La especificidad analtica (proporcin de muestras que no contie- establecidas. La precisin depende solo de la distribucin de errores
nen el microorganismo investigado y responden negativamente al aleatorios y no tiene ninguna relacin con el valor verdadero o el
mtodo). Es la fraccin total del nmero de resultados negativos valor especificado. Se expresa como coeficiente de variacin.
asignados correctamente con el mtodo utilizado. La especificidad En el caso de que las condiciones establecidas sean mismo ope-
analtica se refiere a la capacidad de un ensayo para detectar solo el rador, laboratorio, aparato, en corto intervalo de tiempo y sobre la
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misma muestra y la diferencia entre 2 resultados de ensayo pueda no se puede disponer de muestras de valor de referencia estable,
esperarse dentro de una determinada probabilidad (95%) a este o cuando sindolo no se disponga de cantidad suficiente. Esta
valor se le llama repetibilidad. sistemtica se basa en la utilizacin de resultados de intercom-
En el caso de que las condiciones establecidas permitan cam- paraciones en las que haya participado el laboratorio, y utilizar
biar (operador, laboratorio, aparato, etc.) y la diferencia entre 2 estos datos como valores de referencia.
resultados de ensayo pueda esperarse dentro de una determinada
probabilidad (95%), a este valor se le llama reproducibilidad8,9 . La participacin en intercomparaciones permite una evaluacin
del sesgo de forma que el laboratorio pueda demostrar que se man-
Tcnicas para la validacin tiene dentro de los criterios de aceptacin definidos por normas,
reglamentos, por el cliente o por el laboratorio.
El desarrollo de estos conceptos se puede consultar en el
Para la validacin es conveniente utilizar una o varias de las
procedimiento microbiolgico SEIMC nmero 48: Validacin
tcnicas siguientes para la determinacin del desempeno de un
y verificacin de mtodos microbiolgicos disponible en:
mtodo:
www.seimc.org/protocolos/microbiologia11 .
1) Contaminacin de muestras artificialmente. La validacin de
mtodos microbiolgicos debe ser reflejo de las condiciones Conflicto de intereses
de ensayo reales. Esto se puede conseguir utilizando muestras
contaminadas naturalmente o muestras contaminadas o forti- Los autores declaran no tener ningn conflicto de intereses.
ficadas a un determinado nivel. En general, el proceso consiste
en la preparacin de una muestra agregando el material inter- Bibliografa
ferente a una muestra real que contenga el material a ensayar.
1. Qualitative and quantitative, microbiology. Guidelines for methods, validation.
Una segunda alcuota de la muestra original se diluye con un sol- J AOAC Int. 1999:132.
vente, y ambas se analizan determinndose la diferencia entre 2. Directiva 98/79/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 27 de octubre 1998
ambas. en diagnstico in vitro mdicos; 1998.
3. Gua para la acreditacin de laboratorios microbiolgicos. Gua G-ENAC-04 Rev.
2) Uso de materiales de referencia o materiales de referencia cer- 3 noviembre 2002. p. 117.
tificados. Esta alternativa tiene algunos inconvenientes como el 4. Trminos y definiciones utilizados en relacin con los materiales de referencia.
elevado coste econmico, la posibilidad y facilidad de encontrar Gua ISO 30. 1992:123.
5. Rabenau HF, Kessler HH, Kortenbusc M, Steinhorst A, Berger A. Guidelines for
un material de referencia suficientemente representativo de la the methodical validation and verification of virus diagnostic laboratory tests. J
muestra a validar. Clin Virol. 2007;40:938.
3) Comparacin de resultados obtenidos con otros mtodos alter- 6. Criterios generales para la acreditacin de laboratorios de ensayo y calibracin
segn norma UNE-EN ISO/IEC 17025. CGA-ENAC-LEC Rev. 5 octubre 2009. p. 1-7.
nativos. Se analizan muestras de pacientes por el mtodo en 7. ENAC. Anlisis microbiolgico. Documento aclaratorio. Nota tcnica NT-32. Rev.
estudio y otro mtodo de comparacin, luego se estima el 3 abril 2012. p. 17.
error sistemtico basndose en las diferencias observadas entre 8. Jacobson RH. Validacin de pruebas serolgicas para el diagnstico de enferme-
dades infecciosas. Rev Sci Tech Off Int Epiz. 1998;17:50726.
ambos mtodos. El mtodo de comparacin debera ser, en la 9. Gua para la expresin de la incertidumbre de los resultados, cuantitativos. Gua
medida de lo posible, el de referencia (gold standard). G-ENAC 9. 2005:121.
4) Comparaciones interlaboratorios10 (validacin por pares de 10. Poltica de ENAC sobre intercomparaciones. NT-03 Rev. 5 septiembre 2012. p.
112.
valores). La validacin por pares de valores es aplicable cuando
11. Validacin y verificacin de mtodos microbiolgicos. Procedimientos micro-
no es posible utilizar ninguno de los mtodos anteriores, es decir, biolgicos. SEIMC. 2013; 48:1-35 [consultado 18 Sep 2013]. Disponible en:
no es posible realizar contaminacin artificial de las muestras, http://www.seimc.org/protocolos/microbiologia