Universidade Federal do Esprito Santo

Laboratrio de Biotecnologia Aplicado ao Agronegcio

Anlise de expresso gnica

Fernanda Bravim
EXPRESSO GNICA

Processo pelo qual a informao

contida em um gene traduzido
em estruturas presentes em
um determinado tipo
celular (mRNA ou protenas).
CONTROLE DA EXPRESSO GNICA

Nos microrganismos o controle da expresso gnica serve

principalmente para permitir que as clulas se ajustem s
mudanas nutricionais no ambiente, de forma que o seu
crescimento e diviso sejam otimizados;

Em organismos multicelulares a expresso gnica controlada

regula um programa gentico fundamental para o
desenvolvimento embrionrio e a diferenciao.
ERA MICA

A metabolmica o
estudo que visa
Coleo de RNAs Estuda o conjunto de identificar e
(transcritos) presentes
protenas e suas quantificar o
em uma clula/tecido
isoformas contidas em conjunto de
em uma clula/tecido que metablitos
um dado momento so determinadas pelo produzidos e/ou
genoma da mesma modificados por um
organismo
 O acumulo exponencial de sequencias gnicas e genomas depositados em bancos de
dados pblicos mundiais tm aumentado consideravelmente a demanda por
metodologias que permitam sua identificao funcional ou confirmao de
homologia, alm da elucidao dos padres de expresso
 ANLISE DE TRANSCRIPTOMA EM LARGA ESCALA

Identificao de todos os RNAs expressos em um dado organismo ou tecido;

Comparao do perfil de expresso gnica em diferentes condies ambientais,

estados patolgicos, fisiolgicos ou de desenvolvimento;

Caracterizao de polimorfismos associados aos genes transcritos: formas

alternativas de splicing e SNPs (- Variaes na sequencia de DNA dos humanos
pode afetar como eles desenvolvem as doenas e respondem aos patgenos, as
drogas e as vacinas medicina personalizada).
 QUAIS INFORMAES PODEM SER OBTIDAS
ATRAVS DA ANLISE DE TRANSCRIPTOMA?

Identificao de genes e vias moleculares envolvidas em processos

biolgicos: genes com perfil de expresso semelhante podem estar funcionalmente
relacionados ou sob o mesmo mecanismo e controle;
- Manipulao de drogas;
- Melhoramento de plantas;

Fornecer pistas sobre as funes de genes ainda no caracterizados a partir do

estudo do padro espacial (localizao sub-celular) e temporal de expresso;

Identificar marcadores para diagnstico molecular de doenas;

Podem ainda indicar alteraes no proteoma e/ou metaboloma.

ANLISE FEITA DE MODO COMPARATIVO

Expresso do conjunto de genes em um tecido tumoral X os genes

encontrados em amostras controle de tecido normal;

Traar o perfil de expresso gnica em uma determinada anomalia,

fazendo a investigao em um determinado n de indivduos (ou
organismos) portadores dessa anomalia;

Identificao de genes envolvidos em numerosos processos biolgicos;

- Identificao de genes expressos durante diferentes etapas do

desenvolvimento;
- Identificao e comparao de genes expressos diferencialmente em
tecidos normais e malignos;
- Diagnstico, avaliao, prognstico.
MTODOS PARA ESTUDO DE TRANSCRITOMA
A quantidade de expresso de um gene em uma clula pode ser medida pelo
nmero de cpias de um transcrito de mRNA de um determinado gene
presente em uma amostra. Para detectar e quantificar a expresso gnica
de pequenas quantidades de RNA, a amplificao dos genes transcrito
necessria.

Permitem a quantificao do nvel de expresso gnica

Northem Blot

RT-PCR qRT-PCR;
Uma tcnica usada para
usado para a quantificao do
SAGE (Serial Analysis of Gene Expression); produzir um rpida populao
transcriptoma e anlise
de mRNA em uma amostra de
Microarrays de DNA; estutural .
interesse na forma de pequenas
Next-generation sequencing
etiquetas que corresponde a
RNA-seq technology.
fragmentos desses transcritos
 A levedura Saccharomyces cerevisiae

Organismo-modelo

Espcies diferentes Processos similares

Respostas no organismo modelo parcialmente aplicadas a
outras

1- Ascomiceto unicelular;

2- So muito utilizadas nas indstrias de fermentao,

para a produo de bebidas, biocombustvel e massas;

3- Linhagens laboratoriais so haploide;

4- So a E. coli do eucariotos:
 A levedura Saccharomyces cerevisiae

- So pequenas;
- Completam seu ciclo de vida em 90 min;
- Podem ser cultivadas em meios de cultura muito facilmente;
- Produzem colnias quando plaqueadas (mutaes e replica-plate);
- Ciclo de diviso mittico.

5- No so patognicas;

6- Genoma sequenciado desde 1996.

A levedura Saccharomyces cerevisiae

Principais contribuies:

1- Ciclo celular:
- Etapas especficas na progresso do ciclo celular;
- Controles anormais da diviso celular que levam ao cncer humano.

2- Recombinao:
- Crossing over.

3- Gentica mitocondrial:
- Estrutura do genoma mitocondrial.

4- Gentica do tipo reprodutivo:

- Transduo de sinal durante a deteco e
resposta aos hormnios reprodutivos do tipo oposto.

5- Gentica da senescncia
Saccharomyces cerevisiae AND cell cycle
AND cancer

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term
=saccharomyces+cerevisiae+AND+cell+cy
cle+AND+cancer
 GENOMA

Genoma sequenciado desde 1996.

 GENOMA
1- RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)

Um dos variantes da PCR;

Utilizada em biologia molecular para detectar

os nveis de expresso de RNA;

Para a reao o RNA primeiro convertido

em cDNA usando a transcriptase reversa;

O cDNA ser usado como template para a

amplificao exponencial usando PCR;

Qualquer gene pode ser detectado por esta tcnica??

 RT-PCR semiquantitativo ou relativo:

Envolve a amplificao de um controle interno simultaneamente com o

gene de interesse;

Controle interno Normalizar as amostras

Depois de normalizado: comparao dos transcritos;

Comparar os nveis dos transcritos em diferentes amostras.

Aplicaes:

- Pesquisa;
- Diagnstico de doenas genticas;
- Deteco de cncer.
Controle 50 MPa 15 30 60
 qRT-PCR: Real-time RT-PCR / Real-time PCR

usada para amplificar e simultaneamente

quantificar uma molcula de DNA alvo;

Deteco e quantificao;

Quantificao: absoluta ou relativa;

Tcnica EFICIENTE, SENSVEL e RPIDA;

Segue o mesmo principio da PCR Porm a deteco acontece em tempo

real (na fase exponencial da ciclagem);

A quantidade de DNA medida depois de cada ciclo pelas sondas

fluorescentes;
 Equipamento: capacidade de ciclagem termal e de capturar a
fluorescncia das sondas;

Plot de amplificao: representa o acumulo de produto pela durao da

reao
 Sondas fluorescentes:

No-especficas: se ligam a qualquer fita dupla de DNA

Um aumento na quantidade de DNA/RNA conduz a um aumento na

intensidade de fluorescncia e medido a cada ciclo;

SYBR Green;

Produtos de PCR no especficos: dmeros

1 Par de primers: reduo do custo.

 Sondas fluorescentes:

Sequencias-especficas: detecta apenas o DNA contido na sequencia da

sonda

2 primer e a sonda TaqMan;

Especificidade maior.
 Barras brancas: 50 MPa
Barras pretas: 50 MPa + 15 min
2- Microarray ou DNA chip

Medir o nvel de expresso de vrios genes simultaneamente;

Os arranjos pr-definidos de molculas de DNA so quimicamente

ligadas uma superfcie slida (lminas de microscpio);

As amostras so postas para

hibridar com o DNA fixado no
array (complementariedade de
bases). A deteco possvel
pois as amostras so
"marcadas" com fluorocromos
cianina 3 (Cy3) ou
cianina 5 (Cy5)
 Vermelho: expressos
Verde: reprimidos
Preto: no h diferena na expresso
 Vermelho: expressos
Verde: reprimidos
Preto: no h diferena na expresso
 Anlise dos dados por anlise de bioinformtica

Quantidade grande de dados geradas

 Genes classificados em diferentes categoria do MIPS-CYGD

Poucas variaes na expresso imediatamente aps o tratamento e

aumento aps o tratamento;

Classe 4: Defesa celular (estresse oxidativo e osmtico)

Classe 9: energia cido ctrico, fermentao e fosforilao oxidativa,
genes relacionados a sntese de metionina e glutamato.
 Este artigo identificou os fatores de transcrio ativados
durante um tratamento sub-letal de presso hidrosttica,
utilizando diferentes ferramentas de bioinformtica.

Foram identificados os fatores de transcrio e seu correspondentes motivos de

DNA e RNA em resposta a alta presso hidrosttica.

Alm disso, foi observado que diferentes motivos esto presentes na promoo
de genes induzidos ou reprimidos durante o tratamento de presso hidrosttica.

Os genes ativados imediatamente aps a presso esto relacionados com a

adaptao e ao crescimento, enquanto genes envolvidos na parada do
ciclo celular e metabolismo energtico continuam expressos 15 min aps o
tratamento.
 Os genes que fazem parte de um
mdulo altamente conectado
normalmente fazem parte de
importantes processos biolgicos;

Motivos relacionados a genes

associados com metabolismo de energia
e resposta a estresse;

Estes genes normalmente esto

superexpressos

Cor do crculo: maior abundncia de

conexes

Msn2/4 pode estar relacionados na

transcrio de genes envolvidos na
Genes relacionados ao complexo degradao de protenas via
proteossomico compartilham o mesmo proteossomo.
motivo em ambos os mdulos.
 O mdulo B:

Motivos relacionados a genes

requeridos para a sntese de
RNA , DNA e protenas.

Maioria est reprimida.

Rgm1p: envolvido na represso de processos necessrios para o crescimento
celular normal;
Cin5: resposta a estresses;
Abf1p: controle do crescimento celular;
Oaf1p: beta-oxidao de cido graxo.
 AGRADECIMENTOS

OBRIGADA!

Fernanda Bravim
bravimf@gmail.com