Aplicacin de tcnicas rpidas y de biologa

molecular en la deteccin de parsitos en heces

Dra. Isabel de Fuentes

Instituto de Salud Carlos III, Madrid.
ifuentes@isciii.es
 Diagnstico clsico de las parasitosis intestinales:

Examen microscpico de heces: aislamiento e identificacin de

las formas parasitarias que se eliminan

Estas determinaciones:
- Son en la mayora de casos especficas, pero en otros no
- Pobre sensibilidad
- Slo permiten el diagnstico de la infeccin patente
- Toma de muestras seriadas
- Son muy laboriosas
- Requieren especializacin del analista
- Permite deteccin de ms de una especie (poliparasitacin)
Entamoeba coli E. histolytica

Giardia intestinalis
B. hominis
Endolimax nana
Iodamoeba

Iodamoeba btschlii Blastocystis hominis

 Inmunodeteccin de coproantgenos
-Ac (monoclonales y/o policl.) que reconocen Ag
parasitarios (secrecin, superficie, o somticos)

- Desarrollado para el dco. protozoos y helmintos

Esquema
Los Ac contra molculas del parsito se inmovilizan sobre un soporte
slido (placas de ELISA, membranas inmunocromatogrficas)

Los soportes sensibilizados se incuban con muestras diluidas de las

heces problema

Los complejos inmunes Ag-Ac se detectan con Ac especfico

- Inmunodiagnstico enzimtico: ELISA-Ag: alta S y E
- Requiere la adicin de mltiples reactivos, pasos de lavados y
tiempos de incubacin
- Ventaja: procesar simultneamente lotes de muestras y adems,
en la mayora de los casos, presenta una S y E > que IC.

- Inmunodiagnstico no enzimticos: ms rpidos y sencillos,

como las pruebas inmunocromatogrficas (IC). Se basan en la
utilizacin de microesferas de materiales como el poliestireno,
coloreadas, a las que se conjuga covalentemente un anticuerpo
monoclonal anti-antgeno del parsito
- No necesitan equipos de laboratorio especiales y se utilizan de
forma individual.
 Tcnica de inmunocromatografa
Cryptosporidium/Giardia
Anticuerpos monoclonales especficos frente a antgenos de Cryptosporidium/Giardia

Partculas de ltex (microesferas de poliestireno) conjugado covalentemente

con Anticuerpos monoclonales especficos

Presencia de los coproantgenos

Complejo ltex-Ac monoclonal-Ooquistes/Quistes

Migrar por una membrana de celulosa con Anticuerpos
especficos que reconocen el complejo

Control de reaccin Zona del captura Zona del conjugado

del complejo Ag-Ac (Absorcin)
 Agregar 1 ml Homogenizar en vortex, Transferir 150 l
tampn 15 segundos, centrifugar sobrenadante a un
1 min a 2000 rpm tubo Eppendorf

Heces Suspensin fecal Sedimento Introducir la tira

congeladas Lectura a los 10 minutos

Tira Negativo Giardia Giardia/Cryptosporidium Cryptosporidium

(+) (+/+) (+)
Tcnica de Inmunofluorescencia directa
Cryptosporidium/Giardia

5 l suspensin fecal Montaje

Secar, fijar con metanol

Lavar con PBS

1 minuto

10 l conjugado

Incubar a 37 C durante 30 minutos (oscuridad y cmara hmeda)

Inmunofluorescencia directa Cryptosporidium/Giardia

Ooquistes de Cryptosporidium

Quistes y trofozotos de Giardia

 Inmunodeteccin de coproantgenos

Ventajas

- la mayora de las pruebas: excelente S y E

- no requiere personal experimentado
- es un diagnstico rpido, de fcil interpretacin
- posibilita el cribado de gran nmero de muestras, de inters
especial en casos de brotes
- habitualmente su desaparicin de las heces se relaciona con la
eliminacin del parsito ante quimioterapia eficaz
- permite, en algunos casos, la distincin de especies isomrficas
del mismo gnero (Entamoeba histolytica patgena-/
Entamoeba dispar no patgena).
 Inmunodeteccin de coproantgenos
Desventajas

- Mayor coste de los reactivos, pero los costes de trabajo del

personal son menores (el anlisis de comparacin de costes
no es tan desfavorable ya que en las microscpicas deben
incluirse los reactivos, controles de calidad, tiempo de trabajo
y requerimiento de personal cualificado)

- Obligacin de emplear heces recientes o congeladas en la

mayora de los ensayos comercializados

- En ocasiones, la necesidad de examinar ms de una muestra

para conseguir un resultado concluyente.
 Tcnica de PCR

- Mtodo in vitro de sntesis de ADN.

- Un segmento diana es especficamente ampliado.

- Copiado de forma exponencial por repeticin de ciclos

con diferentes periodos de temperatura de incubacin
en presencia de una enzima ADN polimerasa.

- Se obtiene millones de copias de la secuencia diana.

- Tcnica especfica, rpida, sensible, verstil

 Diagnstico Molecular

PCR

Diferentes mtodos de extraccin ADN:

-Segn muestra
.

- Muestras hepticas, tejidos, etc:

- Extraccin fenol-cloroformo
- Buffer lisis proteinasa K
- Kit extraccin ADN

-Muestra de heces:
- Kit extraccin especfico
Inhibidores: hemoglobina, bilirrubina, sales biliares, carbohidratos complejos
 HELMINTOS INTESTINALES
Cestodos
Taenia solium
Taenia saginata
Hymenolepis nana
Hymenolepis diminuta
Dipylidium caninum
No comercializados
Nematodos
Enterobius vermicuralis
Strongyloides stercoralis
Anisakis sp
No autctonos: Ascaris
lumbricoides, Trichuris trichiura,
Capillaria philippinensis,
Ancylostoma duodenale, Necator
americanus, Trichostrongylus spp,
S. fuelleborni
Trematodos
Fasciola hepatica
No autctonos:Fasciolopsis buski,
Echinostoma ilocanum,
Heterophyes heterophyes,
Metagonimus yokogawai,
Gastrodiscoides
Schistosoma spp
 PROTOZOOS INTESTINALES
Aplicomplexa

Cryptosporidium sp.
Cyclospora cayetanensis
Isospora belli
Ameba
Flagelados Entamoeba histolytica

Giardia duodenalis Entamoeba dispar

Dientamoeba fragilis Entamoeba coli
Chilomastix mesnili Entamoeba hartmanni
Endolimax nana
Iodamoeba btschlii
Otros

Blastocystis hominis
 Giardia duodenalis
Inmunodeteccin de coproantgenos

-ELISA_ deteccin de antgenos : S 88-100%, E 99%

-IFD: deteccin de quistes: S 94%, E 97%

- Inmunocromatografa rpida (ICT) S 99%, E 97%

 Giardia duodenalis

Mtodos moleculares

- Mtodos biologa molecular: diagnstico y caracterizacin

- PCR (PCR, nested-PCR, PCR-RFLP, secuenciacin).

Dianas: gen B giardina, TPI, HSP, SSrRNA). S 1-10 quistes

+ sensible que microscopa , => ELISA

- PCR tiempo real

 Cryptosporidium
Inmunodeteccin de coproantgenos

ICR S 93%, E 90%

ELISA_ Ag: (Ag 18,20 Kda) (S 93%, E 99%)

-IFD: deteccin de quistes

S 94%, E 100 %
 TCNICAS DE PCR

Amplificacin de secuencias : 18SrRNA, COWP, HSP70, PolyT, TRAP-C1

Menor utilidad en diagnstico en heces. Importancia caracterizacin

Gran utilidad diagnstico otras muestras (esputo, pulmn, biopsia

parfinada)

Determinacin de especies y genotipos (brotes, estudios epidemiolgicos)

- PCR-RFLP

- RAPD

- PCR en tiempo real

- Secuenciacin

- Microarrays
 Entamoeba histolytica
Inmunodeteccin de coproantgenos

-- ELISA Ag (Ac monoclonales frente a lectina

Gal/galactosamina, o frente a Ag rico en serina de
E.histolytica). Pocos tests diferencian E.histolytica
de E.dispar

- Inmunocromatografa en tiras: Sla o puede

detectar E.histolytica/dispar, Cryptosporidium y
Giardia
 Diagnstico Molecular
PCR nested diferenciacin de E.histolytica/ E.dispar:
ssurRNA. 1 amplificacin 1076pb

1 2 3 4 5 6 7 8

427-pb
195-pb

Nested PCR
Calle 1,2: muestra de paciente con AHA, extraccin con Tiocianato de Guanidino.
Calle 3,4: muestra de paciente con AHA, extraccin con Kit de QUIAGEN.
Calle 5: control negativo .
Calle 6: control E. dispar.
Calle 7: control E. histolytica.
Calle 8: marcador peso molecular 100pb
 PCR tiempo-real
-Amplificacin 18S rRNA

c) TaqMan2 +
especfica+cuantitativa
Detectan<0,5 cel/ml
 ESQUEMA GENRAL DE DIAGNSTICO DE PARASITOSIS INTESTINALES

Sospecha parasitosis basada en sintomatologa y epidemiologa

Parasitosis intestinales
* Diagnstico de helmintos y protozoos

Heces, 3 muestras, Biopsias Suero

en das alternos

D. parasitolgico D. inmunolgico D. molecular D. parasitolgico D. inmunolgico D. inmunolgico

Observacin Deteccin de copro-

microscpica antgenos ** Deteccin ADN del Tcnicas de Inmunno- Mtodos
Helmintos: huevos, parsito anatoma histoqumica inmunolgicos
larvas,adultos -ELISA-Ag Diagnstico y patolgica con para deteccin
Protozoos: quistes, caracterizacin de anticuerpos de anticuerpos.
ooquistes, trofozotos -Inmunofluorescencia especies, genotipos, Posibilidad de mono y
-Mtodos de (IFD) depas.. hibridaciones poiclonales -IF
concentracin -PCR, PCR-Tiempo moleculares -ELISA
-T-Graham, otros -Inmunocromatografa real, PCR-RFLPs, - ...
-Tinciones especficas rpida (ICR) secuenciacin,
microarrays con
oligos

** : Heces frescas o congeeladas para diagnstico de algunas especies.

!!!GRACIAS!!!