Portaria N 101 de 11 de Agosto de 1993

MINISTRIO DA AGRICULTURA, PECURIA E ABASTECIMENTO
SECRETARIA DE DEFESA AGROPECUARIA.
PORTARIA N 101, DE 11 DE AGOSTO DE 1993.
O SECRETRIO DE DEFESA AGROPECURIA, no uso da atribuio que lhe confere o artigo 78,
item VII do Regimento Interno da Secretaria, aprovado pela Portaria Ministerial n 212, de 21 de agosto
de 1992, resolve:
Art. 1 - Aprovar e oficializar os mtodos analticos para controle de produtos de origem animal e seus
ingredientes - mtodos microbiolgicos (anexo) determinando seu emprego em todas as atividades
desenvolvidas pela rede oficial do sistema coordenado pela Coordenao Geral de Laboratrio Animal
CGLA do Departamento de Defesa Animal - DDA.
Pargrafo nico - Os mtodos analticos de que trata o artigo 1 podero ser periodicamente atualizados,
por propostas da Coordenao Geral de Laboratrio Animal - CGLA, sempre que o desenvolvimento de
novas tcnicas assim o recomende.
Art. 2 - Esta Portaria entra em vigor na data de sua publicao revogadas as disposies em contrrio.
JORGE SALIM WAQUIM
ANEXO
PARTE I
1 - NORMAS DE SEGURANA NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA.
1.01 - No comer, beber ou fumar dentro do laboratrio;
1.02- No usar os refrigeradores ou estufas para conservar ou aquecer alimentos;
1.03- Usar sempre avental de algodo;
1.04- As mesas ou bancadas de trabalho devem ter superfcie lisa, de fcil limpeza e desinfeco;
1.05- Quando da manipulao de material txico ou infectante, usar luvas de proteo;
1.06- Usar culos especiais quando da manipulao de culturas de C.botulinum ou toxina botulnica.
Manter as mos longe da boca, nariz, olhos e rosto;
1.07- O trabalho com organismos de alto risco deve ser feito em cmaras de segurana biolgica
adequada;
1.08- Proteger a superfcie de trabalho com papel ou outro material embebido com soluo desinfetante;
1.09- No pipetar material txico ou infeccioso com a boca.
O trabalho de pipetagem devera ser realizado com o auxlio de ajudantes de pipeta mecnicos ou eltricos.
1.10- As pipetas usadas devem ser colocadas horizontalmente em soluo desinfetante imediatamente
aps o uso, antes de esterilizar em autoclave;
1.11- Descartar todo o material contaminado em recipiente apropriado e esterilizar em autoclave;

1.12- Esterilizar os aventais na autoclave antes de lavar.
No lav-los em casa;
1.13- No caso de derramamento de algum material infeccioso, cobrir imediatamente a rea com um
desinfetante adequado e deixar de 15 a 30 minutos antes da limpeza; se o material derramado contiver
toxina botulnica cobri-lo com carbonato de sdio;
1.14- Todas as etiquetas devem ser auto-adesivas;
1.15- Evitar a formao de arossis quando da centrifugao de materiais infectantes ou de culturas.
No parar bruscamente a centrfuga, esperar que pare naturalmente uma vez concludo o ciclo.
Aps a parada, esperar 10 minutos para abr- la.
Aps o uso, limpar a superfcie interna com desinfetante;
1.16- Devem ser registrados os acidentes como o derrame de culturas, ferimentos, etc.
Os ferimentos devem ser desinfetados e cobertos com esparadrapo;
1.17- Os tubos com culturas devem ser conservados sempre em suas respectivas estantes;
1.18- As culturas de fungos, quando esporuladas, apresentam risco de infeco respiratria ou de reao
alrgica, mesmo sem formar aerossis.
Estas culturas devem ser manipuladas rapidamente e sem movimentos bruscos, em cmaras de aspirao
de ar;
1.19- As placas de contagem de bactrias, preparadas com meios incuos como o gar nutritivo, no
podem ser consideradas inofensivas.
Muitos patognicos como staphylocuccus e Salmonella desenvolvem-se bem nestes meios.
As bactrias presentes em pequeno nmero no alimento se reproduzem no meio de cultura podendo

provocar infeco por inalao;
1.20- No cheirar os meios de culturas inoculados;
1.21- A expulso rpida e violenta do contedo da pipeta pode produzir aerossis; geralmente, no trabalho
microbiolgico prefervel movimentao suave e tranqila;
1.22- As lminas e lamnulas usadas devem ser colocadas em recipiente com desinfetante;
1.23- Ter especial cuidado quando do uso de injetores (aparelhos de injeo), em relao produo de
aerossis, como tambm quando se efetuam as inoculaes;
1.24- Lavar as mos com freqncia, usando soluo desinfetante, com gua corrente e sabo,
especialmente antes e aps o trabalho laboratorial e manipulao de animais de laboratrio;
1.25- Limpar a mesa de trabalho, antes e depois de cada sesso de trabalho, usando desinfetante;
1.26- Todos os que trabalham no laboratrio devem saber onde esto e como usar as garrafas lava-olhos,
chuveiros e o extintor de incndio. Deve-se elaborar e colocar a disposio de todos, uma lista de perigos
especficos dos produtos qumicos e de microrganismos manipulados no laboratrio, para que, em casos
de acidentes, seja possvel informar corretamente ao mdico;
1.27- No permitir a entrada e a permanncia de pessoas estranhas no laboratrio;
2 - NORMAS DE COLHEITA DE AMOSTRAS
2.01- A colheita da amostra constitui a primeira fase da anlise do produto.
2.02- Dentro do conceito de que a anlise comea com a colheita da amostra, este servio deve estar bem
integrado com o laboratrio devendo haver sincronismo entre a remessa e a capacidade do laboratrio em
executar as anlises.
2.03- As amostras para exame microbiolgico devero ser enviadas separadamente daquelas destinadas
aos exames fsico-qumicos;
2.04- Sempre que possvel, tais amostras devero ser enviadas em sua embalagem original para evitar
modificaes em suas caractersticas.
Quando tal procedimento for invivel, em funo do volume mnimo disponvel para colheita, aceita-se o
fracionamento desde que o mesmo seja realizado em condies asspticas, cabendo, nesse caso, ao
fracionador da amostra, toda a responsabilidade por qualquer alterao da mesma;
2.05- As amostras para exame microbiolgico devero ser acondicionadas em recipientes limpos, estreis
e ntegros (sem perfuraes, rachaduras, etc.) na quantidade mnima de 500 (quinhentos) gramas.
Quando o peso unitrio no atingir o mnimo aqui estabelecido, devero ser colhidas tantas amostras
quantas necessrias para se obter aquele quantitativo.
Nesse caso, cuidados especiais so necessrios para que todas as unidades pertenam ao mesmo lote,
partida, data de fabricao, etc., a fim de serem mantidas as caractersticas de homogeneidade da amostra.
No caso de enlatados, remeter no mnimo duas latas.
2.06- Para colheita e remessa de gua, observar as instrues especificadas a seguir:
Utilizar material estril;
Os frascos para colheita de gua clorada devem ser adicionados de tiosulfato de sdio (0,1ml de soluo a
15% por frasco de 250ml).
No abrir os frascos at o momento da colheita;
Evitar que a tampa entre em contato com qualquer objeto;
Ser breve na colheita;
O frasco com amostra deve ser colocado em saco plstico acondicionado em recipiente isotrmico com
gelo.
O tempo entre a colheita e o recebimento no laboratrio no deve exceder de 24 horas para guas tratadas,
12 horas para guas no tratadas e 6 horas para guas muito poludas.
No caso de amostras transportadas em temperatura ambiente, o prazo no deve exceder a 2 horas.
2.06.1 - TORNEIRAS COM INSTALAO DE AGUA CORRENTE:
Limpar a parte externa da torneira. Deixar correr a gua durante 3 a 5 minutos.

Passar lcool e flambar.
Deixar correr um filete pouco intenso de gua.
Retirar a tampa, flambar a tampa do frasco e colher 2/3 de sua capacidade.
Flambar novamente e tampar, vedando com fita adesiva ou parafina.
Acondicionar sob refrigerao at a entrega no laboratrio.
2.06.2 - DE POOS ARTESIANOS E SEMI-ARTESIANOS:
Convm utilizar uma torneira colocada no conduto ascendente do poo (torneira de descarga). Deixar a
gua correr durante 10 minutos e proceder como no item 2.06.1.
2.06.3 DE POOS
Utilizar, de preferncia um balde de metal. Lav-lo interna e externamente e flamb-lo. Submergir o balde
na gua quente aps a flambagem e, uma vez cheio, verter para o frasco estril.
2.06.4 RESERVATRIOS
Utilizar o prprio frasco de colheita usando uma pina de braos longos.
Havendo essa impossibilidade, proceder como no item 2.06.3
2.06.5 RIOS, ARROIOS, LAGOS, VERTENTES, ETC.
Proceder como no item 2.06.4 tomando-se o cuidado de dirigir a boca do frasco em sentido contrrio
corrente.
3 - NORMAS DE ACONDICIONAMENTO E MANUTENO DAS AMOSTRAS
3.01- Somente sero aceitas pelo laboratrio as amostras que vierem acompanhadas de cintas de
identificao no produto (protegidas para evitar danificaes), e certificado oficial de anlise devidamente
preenchido com indicao precisa do(s) tipo(s) de exame(s) a ser(em) realizado(s).
3.02- Em casos especiais a amostra poder ser acompanhada de relatrio adicional, contendo informaes
que possam auxiliar o analista na conduo de seu trabalho.
3.03- Depois de colhidas, as amostras devero ser acondicionadas adequadamente para evitar qualquer
alterao nas mesmas, at sua chegada ao laboratrio.
Para produtos que no exijam estocagem sob refrigerao, o envio poder ser feito temperatura
ambiente em embalagens resistentes.
s amostras de produtos facilmente alterveis podero ser acondicionadas em recipientes isotrmicos, e

acompanhadas de gelo ou outra substncia refrigerante, cuidando-se sempre para que no haja contato
destes com a amostra, especialmente no caso da gua proveniente do degelo. No caso de produtos
congelados, realizar a remessa em tempo hbil, que no permita alteraes no seu estado de
congelamento.
Providncias especiais devero ser tomadas para que o tempo decorrido entre a colheita da amostra e sua
chegada ao laboratrio seja o menor possvel.
No caso de leite pasteurizado, esse tempo no dever exceder a 24 horas, respeitando-se o prazo de
validade do produto.
Deve-se evitar a utilizao de mecanismos que impliquem em estocagem intermediria entre o ponto de
colheita e o laboratrio.
3.04- Somente sero aceitas para anlise, amostras em embalagens lacradas pela pessoa que efetuou a
colheita, sugerindo-se, para tal, a utilizao de lacre ou outro tipo de fechamento hermtico, que no
possa ser violado sem que se torne evidente.
Tal providncia se faz necessria para evitar a substituio ou adulterao da amostra entre o ponto de
colheita e o laboratrio; com reflexos no resultado da anlise.
3.05- Todas as amostras que chegarem ao laboratrio em condies diferentes das preconizadas nestas
normas de colheita sero recusadas, cabendo ao laboratrio notificar pessoa que realizou a colheita, as
razes da no aceitao.
3.06- Aps o recebimento, as amostras devero ser estocadas adequadamente at o momento da anlise.
As refrigeradas perecveis devero ser analisadas em um perodo mximo de 12 horas; as congeladas

devero ser mantidas a 18C, no mnimo, por perodo no superior a 7 dias.
Amostras no perecveis devero ser estocadas em lugar fresco e protegidas da umidade, e analisadas em
um prazo mximo de 3 dias.
3.07- Manter registros de recebimento, nmeros de protocolo, datas de liberao e outros registros que se
fizerem necessrios.
PARTE II
CONTROLE DE QUALIDADE
1 - INTRODUO
Controle de qualidade um componente necessrio de um programa de garantia de qualidade do trabalho

realizado pelo laboratrio.
Pelo desenvolvimento efetivo de uma srie de atividades, visa melhorar o desempenho do laboratrio e
assegura resultados corretos e confiveis.
O controle de qualidade permite tambm o reconhecimento de erros, quando ocorrem, e a tomada de

medidas corretivas imediatas impedindo que a informao saia incorreta do laboratrio.
A aplicao deste programa de controle de qualidade deve ser compartilhada por todos os membros do
laboratrio, entretanto, deve ser escolhida uma pessoa responsvel pelo programa.
Um benefcio indireto do programa de garantia de qualidade a padronizao de metodologias, pois a

uniformidade de procedimentos analticos um dos fatores
mais importantes que influenciam as variaes de resultados nos diferentes laboratrios.
O programa deve estabelecer mtodos e manter registros necessrios na avaliao do nvel de preciso e
coerncia.
Deve estabelecer procedimentos corretivos quando detectada a qualidade inaceitvel.
2 - INSTALAES
O ambiente de trabalho deve estar isento de p tanto quanto possvel, e a rea deve ter uma distribuio
que permita a circulao fcil de acordo com o fluxo de trabalho.
Os materiais e equipamentos devem ser armazenados e dispostos adequadamente de acordo com o
fluxograma.
As bancadas ou mesas de trabalho devem ser limpas e desinfetadas sempre que necessrio ou pelo menos
duas vezes ao dia, o piso nunca deve ser limpo com
vassoura e sim com pano umedecido em soluo desinfetante/detergente, usando-se dois baldes, de modo
que se tenha sempre um deles com a soluo gua/desinfetante limpa e outro, com gua, para enxaguar o
pano sujo.
3 - EQUIPAMENTOS
O bom funcionamento dos equipamentos fundamental para a realizao satisfatria de todas as anlises.
As instrues para o funcionamento de cada aparelho devem ser colocadas junto ao mesmo, para
verificao quando necessrio.
Os equipamentos eltricos e mecnicos devem ser includos em programa de manuteno preventiva.

necessrio lubrificar e ajustar os aparelhos mecnicos, como centrfugas, pipetadores automticos,
stomacher, etc. A manuteno corretiva poder somente ser realizada por pessoal especializado.
Consultar o quadro a seguir para o controle dos equipamentos de uso mais comum.
QUADRO PARA CONTROLE DE EQUIPAMENTOS
Limite de
Equipamento Procedimento Freqncia Observao
Tolerncia
Limpeza quinzenal.
Adicionar substncia
Registro de
Banho-maria Diria 1C fungicida na gua
temperatura
(formol ou azida de
sdio)
Limpeza quinzenal.
Adicionar substncia
Registro de
Banho-maria/colifecais Diria 0,2C fungicida na gua
temperatura
(formol ou azida de
sdio)
1)Trocar ou limpar os
filtros a cada 3 meses.
2)Expor placas de
gar sangue
diariamente por 10
Medir a 50 minutos. Incubar e
Cabine de fluxo velocidade do Trimestral ps/min observar a presena
ar ps min de colnias. Tomar
medidas corretivas.
3)A cada 15 dias
limpar as lmpadas
ultravioletas com
pano macio e mido.
1) Utilizar
termmetros de
Registro de
Incubadores Diria 1C mxima e mnima,
temperatura
anotar pelo menos 2
vezes ao dia.
1) Limpar
mensalmente.
Registro de 2) Utilizar esporos B.
Fornos Diria -.-
temperatura stearothermophilus
para controle mensal.
Termmetros Aferio Anual
Balana Calibrao Diria
1) Calibrar com 2
padres(pH 4,0 e 7,0
ou 7,0 e 10,0).
2) Semanalmente
0,05 um comparar com
pHmetro Calibrao Diria leituras de padres
de pH
em outro pHmetro.
Quando a diferena
for maior que 0,05
unidades, solicitar a
reviso dos aparelhos.
Regenerar o
A cada
Uso de catalizalidor a 160C
Jarra de anaerobiose ciclo de -.-
indicador 2 horas aps 10
uso
utilizaes das jarras.
1) Usar soluo de K2Cr2
O7 (60,25mg/l de H2SO4
0,01N) e realizar a
leitura de absorbncia
Calibrao de nos comprimentos de
Mximo onda:
Espectro-fotmetro exatido Quinzenal
1%
fotomtrica nm absorbncia
235 0,747
257 0,869
313 0,293
350 0,644
Medir a 2)Com didmetro,
Mximo
exatido e Quinzenal verificar dois
de 1,0nm
reprodutividade espectros no mnimo.
com
didmetro
A cada
Controle de
ciclo de -.- 1) Com fitas para autoclave.
temperatura
uso
Autoclave
Controle de
eficincia Trimestral 2) Utilizar esporos B.sterothermophilus.
Biolgica
4 - REAGENTES
O controle de qualidade de reagentes tem inicio no recebimento, com a observao externa de suas
caractersticas.
Adquirir quantidades pequenas para garantia da estabilidade e validade do produto.
Preparados os reagentes, deve constar no rtulo: o nome da prova para qual foi preparado, o nome do
reagente, a data de preparao, as iniciais de quem preparou, a data de validade ou qualquer outra
indicao ou advertncia especial.
Todos os reagentes utilizados para identificar agentes microbianos devem ser testados periodicamente,
para comprovar sua correta reatividade com meios e microrganismos apropriados e testados cada vez que
forem utilizados para reao positiva e negativa com microrganismos apropriados.
Os corantes utilizados nos trabalhos microbiolgicos devem ser testados, assegurando que os mesmos
sejam de boa qualidade e que seu desempenho seja uniforme e reprodutvel.
Adquirir os anti-soros em laboratrios ou instituies reconhecidas.
Testar periodicamente aps a reidratrao ou diluio.
Quando da sua utilizao, verificar a limpidez, turbidez ou presena de floculao que indicam
contaminao.
5 - VIDRARIA
A vidraria utilizada deve ser de borosilicato neutro.
Frascos rachados, com bordas quebradas e graduao apagada devem ser descartados.
O Material de vidro contaminado deve ser esterilizado em autoclave (30 a 45 min: a 121C) antes da
lavagem.
A lavagem deve ser feita com detergente apropriado e gua quente.
Quando necessrio deixar em soluo sulfocrmica (dissolver 100g de cromato de potssio (K2Cr2O7)
em 600ml de gua destilada; adicionar 400ml de cido sulfrico concentrado comercial (H2SO4).
Manter resfriamento durante a adio do cido), antes da lavagem.
Aps a lavagem proceder rigorosa enxaguadura de maneira a assegurar a retirada de todo o detergente.
Testar rotineiramente toda a vidraria quanto presena de resduos alcalinos ou cidos pela adio de
algumas gotas de azul de bromotimol a 0,04g/l, indicador que oferece viragem de cor do amarelo ao azul
esverdeado na faixa de pH 6,5 a 7,3.
Aps a lavagem e secagem (mximo 60C) preparar a vidraria, acondicionando adequadamente.
Esterilizar o material no volumtrico a 170C por 2 horas (calor seco).
A esterilidade da vidraria deve ser avaliada mensalmente e sempre que necessrio conforme indicao a
seguir:
a) Placas de petri - verter gar no seletivo em diversas placas coletadas ao acaso.
Deixar solidificar e incubar em aerobiose e/ou anaerobiose (a 30C por 48 horas).
b) Frascos ou sacos para colheita de amostras - adicionar caldo nutritivo como o caldo tioglicolato ou BHI
e incubar a 30C por 48 horas.
c) Tubos erlenmeyer e outros - adicionar caldo tioglicolato ou BHI e observar crescimento aps incubao
a 30C por 48 horas.
d) Pipetas - pipetar diluente estril e semear em caldo no seletivo e observar crescimento aps incubao
a 30C por 48 horas.
Quando for comprovada a no esterilidade do material, descartar e corrigir falhas.
Manter registros dos resultados dos controles de vidraria e das medidas tomadas para corrigir falhas.
6 - MEIOS DE CULTURA
O desempenho dos meios de cultura depende de sua composio, modo de preparao, etc.
necessria a avaliao sistemtica dos meios adquiridos desidratados ou aqueles preparados no

laboratrio com ingredientes bsicos.
A estocagem dos meios desidratados, reagentes e ingredientes deve ser feita em lugar fresco, protegidos
da luz e da umidade.
Quando especificado no rtulo, manter sob refrigerao ou em frasco escuro.
Verificar prazos de validade.
Descartar meios e reagentes hidratados ou com colorao alterada.
Os corantes e meios que os contenham devem ser guardados protegidos da luz, em frascos escuros ou
cobertos por papel metlico ou outro tipo que os proteja da claridade.
Para ajuste de pH de meios, nunca utilizar cidos ou bases fracas.
Normalmente utiliza-se HCl ou NaOH 0,1N.
Os pontos crticos na preparao dos meios de cultura so os seguintes:
a) Pesagem do material;
b) Material desidratado no alterado pela exposio ao ar, umidade, oxidao, etc.
c) gua de hidratao (deionizada ou destilada recentemente);
d) Vidrarias (resduos de detergentes ou outras substncias qumicas ou biolgicas);
e) Mistura e dissoluo;
f) Temperaturas e tempos de preparao e esterilizao, podendo resultar na hidrlise do gar,

caramelizao dos carbohidratos, diminuio do pH, aumento da ao de inibio, alterao de corantes
em meio seletivo ou diferencial e formao de precipitados;
g) Temperatura de determinao de pH;
h) Adio de suplementos;
i) Teste de eficincia dos meios antes do uso;
j) Controle dos meios desidratados adquiridos comercialmente, principalmente com relao

produtividade-seletividade.
Consultar o quadro 2 a seguir para o controle dos meios de cultura.
QUADRO 2
CONTROLE DE QUALIDADE DE MEIOS DE CULTURA

Reao
Meio Microrganismo Observao
Esperada
Colnias
1) Descartara a soluo de
negras de
S. Aureus telurito de potssio quando
lecitinase e
apresentar precipitado
liplise
gar Baird Parker 2) A emulso da gema de ovo e
a soluo de piruvato de sdio
Colonias pretas podem ser mantidos sob
S. epidermidis
sem halo refrigerao por at 30 dias,
desde que protegidos de
contaminao
S.cerevisiae Crescimento
Agar OGY
E.coli inibido
Caldo Tetrationato S.typhimurium Crescimento Evidenciar o crescimento ou
inibio por repique em meios
Caldo Rappaport Inibio seletivos diferenciais
E.coli
vassiliadis parcial ou total especficos
N distribuio do meio colocar

Crescimento tubos de Duhram invertidos
Caldo E C E.coli
com gs antes de esterelizao. Incubar a
45,5C por 24 a 48 horas.
Colnias
prpura com O meio preparado pode ser
gar Vermelho E. coli ou sem mantido por 5 dias sob
Neutro bile Lactose precipitado refrigerao. Incubar a 45,5C
central por 24 a 48 horas.
S. aureus Inibido
Colnias
rodeadas por
B. cereus
-hemlise
completa.
Agar sangue
Colnias
pequenas
S. viridans
rodeadas por
B - hemlise
Bisel verde
P. vulgaris
Agar Fenilalanina (+) Reao observada aps a adio
desaminase Sem mudana de cloreto frrico a 10%
E. coli
(-)
Quando o meio apresentar
alterao de cor, antes do uso,
Caldo Tioglicolato C.perfringens Crescimento
regenerar em banho-maria
fervente por 5 minutos.
Agar ou caldo B.subtilis
Crescimento
tripticase Soja S.aureus
Agar ou caldo S.aureus
Crescimento
Nutritivo B.subtilis
Crescimento
E.coli difuso no
meio (+)
Meio de motilidade K.pneumoniae Crescimento
na linha de
inoculao (-)
gar ou caldo crbro S.aureus
Crescimento
corao E.coli
S. Colnias
typhimurium rosas ou
Conservar o meio distribudo em
vermelhas
placas em sacos plsticos, sob
gar verde brilhante translcidas
refrigerao por no mximo por
E. coli Inibido ou
5 dias.
colnias
amarelas
Zona rosada
S.aureus ao redor do
gar DNASE orifcio
S.epidermidis Sem alterao
E.coli Colnia azul
S.sonnei prpura quase
sempre com
brilho verde
gar eosina azul de
metlico
metileno
S.aureus Colnia
incolor
Crescimento
inibido
Crescimento
E.coli inibido
gar batata glicose
S.cerevisiae
Crescimento.
Salmonella Verde (-)
Caldo malonato
E.coli Azul (+)
Base e biseI
E.aerogenes
violeta
Agar ferro lisina Bisel de pequena inclinao
Base amarela
Proteus
e biseI
violeta
E. coli Base e bisel
P. mirabilis amarelos com gs
P. aeruginosa sem H2 S Bisel
alcalino, base
cida com gs e H2
P. aeruginosa. No cresce na
Agar TSI S Bisel e base base. Preparar bisel de
S. alcalina, sem gs e pequena inclinao.
typhimurium sem H2S Base
cida, Bisel
alcalino com gs
e H2S
P. vulgaris Vermelha (+)
Caldo ou gar uria S. Sem mudana de
typhimurium cor (-)
E. coli Na distribuio do meio
Caldo verde Crescimento colocar tubos de Durham
Brilhante Bile lactose S. aureus com gs Inibido invertidos antes da
esterelizao.
E. coli Com tubos de Durham
invertidos. Pode ser usado at
Crescimento
Caldo Lauril sulfato um ms da preparao se
S. aureus com gs Inibido
conservado sob refrigerao e
protegido da desidratao.
S. faecalis Crescimento em
Caldo glicose azida boto no fundo
S. aureus do tubo. Inibido
S. faecalis Crescimento Crescimento e reao
S. aureus Inibido bioqumica verificada pela
Caldo EVA
formao de boto violeta no
S. pyogenes Inibido fundo do tubo.
Caldo de carne C.
Crescimento
cozida perfringens
Colnias
S.
vermelhas com
typhimurium
centro Negro.
Colnias O meio distribudo em placa
E. aerogenes amarelas com deve ser conservado sob
Agar XLD precipitado. refrigerao (sacos plsticos)
Colnias e utilizados at 5 dias.
E. coli amarelas ou
inibido.
S. aureus Inibido
Superfcie do
Quando o acar utilizado
meio com
no for a glicose fazer os
Meio O/F P. aeruginosa camada oleosa,
contrles positivos e negativos
sem mudana de
para os respectivos acares
cor
E. coli Marrom (-) A reao verificada at 2
horas aps a adio dos
Caldo VP reativos. Para uma resposta
E. aerogenes Vermelha (+) mais rpida, adicionar 3 gotas
de creatina a 5%.
Inibido ou
E.coli
colnias laranja
Colnias verdes Distribuir em placas
com ou sem imediatamente aps a
P. mirabilis
gar Hektoen centro negro. preparao, manter em sacos
Inibido plsticos sob refrigerao e
Streptococcus Colnias verdes utilizar em at 5 dias.
com ou sem
Salmonella centro negro
Anel vermelho A leitura da reao
E. coli
gua peptonada (+). observada aps a adio do
E. aerogenes Sem alterao (-) reativo de Kovacs.
6.1 - TESTE DE PRODUTIVIDADE E SELETIVIDADE
Mossel colaboradores desenvolveram uma tcnica simples para avaliado de meios seletivos, que foi
denominada de Mtodo Ecomtrico por avaliar, a suscetibilidade do meio para colonizao do
microrganismo desejado, assim como a resistncia colonizao por cepas interferentes.
6.1.1 - MTODO ECOMTRICO PARA AVALIAO DE MEIOS SLIDOS SELETIVOS E NO
SELETIVOS
Tomar: uma cultura fresca em fase estacionria{18 horas a 30C) de uma cepa que tenha sido semeada em
caldo BHI ou tripticase soja.
Adequar o tempo..e temperatura de acordo com a cepa em estudo;
Preparar placas de petri com o meio em teste. A espessura do meio no deve ser menor que 4mm. Da
mesma forma preparar placas com meio de referncia.
Secar as placas invertidas em estufa a 45C por 1 hora.
Dividir as placas em quadrantes conforme figura abaixo. (marc-Ia convenientemente.
A partir de cada cultura em caldo tripticase soja ou BHI, com ala calibrada de 1l, traar 5 estrias em cada
quadrante, e uma estria central de forma progressiva sem carregar nem flambar a ala. Proceder da mesma
forma no meio de referncia.
Incubar as placas por tempo e temperatura especificados, para os meios de cultura em teste e de
referncia;
6.1.1.1 - CLCULO DO NDICE DE CRESCIMENTO ABSOLUTO (ICA)
A cada estria se d um valor de 0,2 (preciso do mtodo).
Este valor se multiplica pelo nmero de estrias nas quais se observou crescimento.
Por exemplo: se observou crescimento .nas cinco estrias do mesmo quadrante, o valor 1 (um).
Quando se observar crescimento completo nas cinco estrias dos quatro quadrantes e na estria central, o
ndice de crescimento absoluto igual a 5.
O ICA ser igual ao nmero do quadrante quando todas as estrias deste quadrante e dos quadrantes
anteriores mostrarem um crescimento completo, enquanto no se observar crescimento em nenhuma estria
do prximo quadrante.
Quando aproximadamente a metade das estrias de um quadrante mostrarem desenvolvimento completo ou

quase completo, o ICA ser igual ao nmero do quadrante menos 0,5.
Calcular o ICA pela soma dos valores obtidos.
6.1.1.2 - CLCULO DO NDICE DE CRESCIMENTO RELATIVO (ICR)
O ICR para uma cepa determinada a comparao entre o ICA em um meio em estudo e o ICA .no meio
de referncia (ICA-ME/ICA-MR).
6.1.1.3 - CRITRIO DE AVALIAO
a) Produtividade
Para todas as cepas em um meio de cultivo no seletivo o ICA deve ser pelo menos igual a 3,5.
b) Seletividade
Para as cepas no desejadas nos meios seletivos o ICA no deve ser maior que 2.
Para as cepas desejadas no deve ser menor que 3.
6.1.2 - MEIOS LQUIDOS SELETIVOS E NO SELETIVOS
Este um mtodo geral para avaliar a taxa de crescimento em meios de cultura lquidos seletivos e no
seletivos, No controle dos meios seletivos pode ser conveniente acrescentar uma amostra comparvel ao
material a ser analisado.
Distribuir 10ml do caldo de referncia e do caldo em teste em tubos com tampa de rosca. Autotclavar
segundo as especificaes do fabricante.
Preparar culturas em fase estacionria dos microrganismos teste, homogeneizar e fazer diluies em
soluo salina peptonada at a concentrao aproximada de 10UFC/ml.
Semear os caldos em duplicata, com 0,1ml do cultivo de cada microrganismo em estudo, que contenha
aproximadamente 105 UFc/ml.
Retirar 0,1ml do caldo em teste e coloc-lo numa placa de petri que contenha gar no seletivo com
superfcie seca. Espalhar com auxilio de basto tipo "hockey".
Repetir o procedimento sobre outra placa de petri semeando 0,1ml do caldo de referncia.
Incubar os caldos e as placas de petri sob condies especificas para os meios e microrganismos em
estudo. Em diversos intervalos de tempo retirar uma poro de cada caldo, por meio de ala calibrada,
pipeta ou micropipeta. Diluir se for necessrio e distribuir sobre placas de Petri que contenham o mesmo
meio usado no item, anterior.
Os resultados podem ser avaliados visualmente e tambm pode ser graficada a contagem em funo do
tempo.
SOLUO SALINA PEPTONADA
Cloreto de Sdio(NaCl) 8,5g
Peptona 1,0g
gua destilada 1000,0ml.
pH 7,0 a 7,2
6.1.3 - AVALIAO DO DESEMPENHO DE CALDO SELETIVO COM UMA MISTURA DE

CULTIVOS DESEJADOS E NO DESEJADOS
Este mtodo foi desenvolvido para controlar os meios seletivos de enriquecimento de salmonelas. Quando
se utiliza com este propsito, deve-se usar como cepa desejada Salmonella typhimurium Lfd TM 98,
resistente ao cido nalidxico. Deve-se preparar placas de petri com gar tripticase soja ou outro gar no
seletivo, com e sem cido nalidxico.
Preparar, a partir de cultivo em fase estacionria da cepa, diluies decimais consecutivas (10-1 a 10-10)
em soluo salina peptonada.
Em paralelo, preparar cultivos em fase estacionria das cepas no desejadas Citrobacter freundii NCTC
6272, E. coli ATCC 11775/NCTC 9001, Proteus mirabilis ATCC 29906 e Pseudomonas aeruginosa
ATCC 25668/NCTC-10662;
6.1.3.1 - Preparar cultivos em fase estacionria de todas as cepas.
6.1.3.2 - Preparar uma mistura contendo 1ml de cada um dos microrganismos em fase estacionria no
desejados e dilui-la a 10-1, em soluo salina peptonada.
6.1.3.3 - Diluir o microrganismo desejado a 10-1 at 10-10, em soluo salina peptonada.
6.1.3.4 - Estimar o nmero de UFC/ml do microrganismo desejado por meio de contagem em superfcie
de gar tripticase soja (com e sem cido nalidxico).
De cada diluio preparada, selecionar a maior diluio que revelar contagem.
6.1.3.5 - Determinar a habilidade de recuperar pequenos nmeros do microrganismo desejado, do caldo

de enriquecimento seletivo, semeando 1ml de cada diluio em 10ml de caldo de enriquecimento seletivo.
Incubar na temperatura tima por 18.a 24 horas e aps estriar sobre a superfcie de gar tripticase soja
com e sem cido nalidlxico.
6.1.3.6 - Observar as placas e calcular o nmero de microrganismos necessrios para iniciar o

desenvolvimento no caldo de enriquecimento seletivo.
Verificar se a cepa resistente ao cido nalidxico no inibida no gar que o contm.
6.1.3.7 - Para determinar a habilidade do caldo de enriquecimento seletivo de recuperar pequenos

nmeros do microrganismo desejado a partir de uma mistura de cepas, transferir 1ml de cada uma das
diluies em soluo salina peptonada (6.1.3.3) em tubos separados que .contenham 10 ml de caldo de
enriquecimento e 0,02ml da diluio 10-1 da mistura de cepas indesejveis. Incubar em temperatura
apropriada por 18 a 24 horas e aps estriar sobre placas de gar tripticase soja com e sem cido nalidxico,
e, se desejar, em outro gar seletivo (XLD, HEKTOEN).
Aps incubao, observar as colnias da cepa desejada. Registrar os resultados, incluindo a maior
diluio que permite o isolamento do microrganismo desejado separadamente ou em conjunto com os no
desejados.
6.1.3.8 - INTERPRETAO DOS RESULTADOS

a) Produtividade: O caldo de cultivo seletivo deve permitir o desenvolvimento de um cultivo puro da cepa
desejada a partir de um inculo de 20 ou menos clulas.
Ao plaquear nos gares seletivos e no seletivos qualquer interao entre os meios lquidos e slidos,
pode tambm colocar-se em evidncia.
b) Seletividade: O desenvolvimento das cepas desejadas nos caldos de enriquecimento que contm
microrganismos competidores (no desejveis) deve ser detectado utilizando-se a diluio mais alta que
permite o desenvolvimento do cultivo puro.
6.2 - TESTE DE ESTERILIDADE
Cada lote de meio preparado no laboratrio ou adquirido pronto deve ser submetido ao teste de
esterilidade. Selecionar aleatoriamente uma quantidade representativa de tubos e placas (5%) e incubar
antes ou durante a utilizao do lote de meios. A temperatura .de incubao ser e mesma utilizada na
anlise.
6.3 - OUTRAS RECOMENDAES
Os reagentes e meios empregados devem ser testados semanalmente com culturas-controle positivas e
negativas (veja quadro 2, parte II, item 6).
Anti-soros devem ser estocados conforme as instrues do fabricante e testados frente a culturas-controle
positivas e negativas, rotineiramente.
Todo laboratrio deve manter uma coleo de culturas para utilizao nos testes de
produtividade/seletividade, e checagem de caractersticas bioqumicas diferenciais de cada meio ou
reagente utilizado no laboratrio:
As culturas-estoque podem ser mantidas liofilizadas, sob ultracongelamento ou em meios apropriados

com freqentes repiques.
Registro de todos os controles devem ser efetuados e mantidos disponveis para apreciao aps trmino
do trabalho analtico.
6.4 - INSTRUES PARA REIDRATAO DE CULTURAS LIOFILIZIDAS
1) Serrar a base da parte superior da ampola.
2) Quebrar a ampola no lugar serrado, protegendo com .uma gaze embebida em cool.
3) Proceder conforme abaixo descrito quando quando no estiver disponvel serrinha para vidro:
a) Aquecer a parte superior da ampola na chama do bico de Bunsen.
b) Adicionar algumas gotas de soluo salina estril (NaCl 0,05%), na parte aquecida da ampola para que
o vidro quebre por chcoque trmico.
c) Retirar a parte superior fragmentada com auxlio de uma pina estril.
d) Adicionar, com uma pipeta de Pasteur estril de 0,3 a 0,5ml do meio liquido recomendado, para o
interior da ampola.
e) Ressuspender o sedimento homogeneizando-o.
f) Transferir a suspenso para tubos ou placas contendo o meio recomendado nas formas lquida ou
slida.
g) Incubar na temperatura e perodo de tempo indicados.
Obs: Caso o microrganismo no apresente crescimento durante o perodo de tempo indicado, prolongar a
incubao ao dobro, antes de ser descartado como invivel.
PARTE III
PREPARO DA AMOSTRA
1 - PRODUTOS ESTERILIZADOS
Cuidados especiais devero ser observados na abertura de recipientes enlatados, hermeticamente

fechados. Posicionar a lata com a borda no codificado para cima e costura lateral voltada para o lado
oposto ao analista.
Fazer desinfeco da embalagem com algodo embebido em lcool iodado e flambar.
Usando um abridor de latas metlico, previamente esterilizado, abrir um pequeno orifcio. Abrir a lata e
transferir pores do contedo para os meios de cultivo indicados.
Para leite e creme de leite Longa Vida, proceder conforme item 2.3.
2 - PRODUTOS NO ESTERILIZADOS
2.1 - PRODUTOS SLIDOS: Com o auxilio de pinas, tesouras ou bisturis estreis, cortar e pesar
assepticamente 25g representativos da amostra, em copos de homogeneizador ou sacos plsticos
(Stomacher), tarados.
Adicionar 225ml de gua peptonada a 0,1% homogeneizar no mximo por 2 minutos a 8.000 - 25.000
rpm ou aproximadamente 60 segundos no Stomacher.
Esta a diluio 10-1.
Homogeneizar e pipetar 1ml para tubo contendo 9ml do mesmo diluente (diluio 10-2), e assim, preparar
as diluies de trabalho desejadas, segundo o tipo de anlise a ser realizada.
Obs: Produtos congelados devem ser descongelados em refrigerador de 2 a 8C, por um tempo mximo de
18 horas antes da anlise.
2.1.1 - Para contagem de halfilos, pesar 10g de amostra e diluir em 90ml de gua peptonada 0,1%
adicionada de 3% de NaCl. Homogeneizar e preparar as diluies com o mesmo diluente.
2.1.2 - Para pesquisa de salmonella pesar separadamente 25g e adicionar 225ml de gua peptonada a 1 %
tamponada.
2.2 - PRODUTOS EM P, GRANULADOS, ETC.
Com o auxilio de esptula ou colher estril, pesar assepticamente 25 gramas da amostra em copos de
homogeneizador ou sacos plsticos (Stomacher), tarados.
Adicionar 225ml de gua peptonada a 0,1%.
Homogeneizar e preparar as diluies de trabalho de acordo com o item 2.1.
2.3 - PRODUTOS LQUIDOS E GUA

Agitar ou inverter o recipiente com a amostra por 25 vezes. No caso do mesmo estar sem espao livre,
aspirar 10 vezes com pipeta.
Pipetar assepticamente 1ml da amostra, transferindo para um tubo com 9ml de gua peptonada a 0,1%
(diluio 10-1). Homogeneizar e pipetar 1ml para tubo contendo 9ml do mesmo diluente (diluio 10-2).
Preparar assim as diluies sucessivas necessrias s anlises a serem efetuadas.
2.4 - PRODUTOS GORDUROSOS
Com o auxilio de esptula estril pesar, asspticamente, 25g da amostra em frasco estril e colocar em
banho-maria a 45C por um perodo mximo de 15 minutos. Aps liquefao, adicionar 225ml de gua
peptonada a 0,1% mesma temperatura. Agitar, de forma a obter uma suspenso homognea e preparar as
diluies de acordo com o item 2.3.
2.5 - OVOS COM CASCA
O ovo deve ser lavado com sabo e enxaguado em gua morna e seco com gaze. Fazer assepsia no local
de abertura com lcool iodado e flambar. Homogeneizar a clara com a gema e retirar 25g. Caso seja
necessrio, utilizar gua peptonada a 6,1% para efetuar diluies. Para pesquisa de salmonella proceder
conforme item 2.1.2, parte III.
2.6 - (Revogado(a) pelo(a) Portaria 8/1995/SDA/MAPA)
_______________________________________________ Redao(es) Anterior(es)
2.7 - SEMI-CONSERVAS
Proceder conforme item 2.1, parte III.
3 - CUIDADOS DURANTE O PROCESSO ANALTICO
3.01 - Identificar devidamente todo o material utilizado, incluindo a data de incio da anlise.
3.02 - Assegurar-se da perfeita homogeneizao da primeira diluio, o que interferir em todo restante da
anlise.
3.03 - Selecionar diluies que ofeream contagens entre 25-250 colnias por placa, aproximadamente.
3.04 - No utilizar a mesma pipeta em diluies diferentes.
3.05 - Quando o volume a ser semeado for 0,1ml deix-lo verter livremente sobre a placa ou superfcie do
gar sem tocar a ponta da pipeta nos mesmos.
3.06 - Distribuir a amostra homogeneamente em todo o meio de cultivo atravs de movimentos rotatrios
ou de vai-e-vem suaves.
3.07 - O tempo decorrido desde a primeira diluio da amostra at a adio do gar nas placas no deve
exceder a 20 minutos.
3.08 - No deixar o gar fundido permanecer no banho-maria (44 a 46C) por tempo superior a 60
minutos.
3.09 - Aps verter o gar nas placas, o tempo necessrio para solidificao no deve exceder 10 minutos.
3.10 - Nos casos em que h a expectativa de contagens padres muito baixas, devido ao tipo de
processamento que sofreu o produto, em que a amostra dever ser pouco diluda, partculas do alimento
podero acarretar dificuldades durante a contagem. Para facilitar a visualizao de colnias, adicionar ao
gar fundido, imediatamente antes de vert-lo nas placas, 1ml de soluo aquosa a 0,5% p/v de cloreto de
2,3,5 trifeniltetrazolium (TTC) por 100ml de gar.
A maioria das bactrias formam colnias vermelhas no gar adicionado de TTC, o que facilita a leitura.
Conservar a soluo de TTC abrigado da luz e calor.
PARTE IV
DETERMINAES ANALTICAS
A - TCNICAS BSICAS DE CONTAGEM
A.1 - TCNICA DE CONTAGEM EM PLACAS
As tcnicas de contagem em placas permitem a visualizao de formao de colnias a partir de um

nmero "fixo" de clulas viveis. So utilizadas, portanto, para obter a contagem de unidades formadores
de colnias (UFC) presentes na amostra sob anlise.
Os meios de cultura usados para a obteno do nmero de colnias, podem ser de uso geral (meios com
ingredientes nutritivos bsicos), enriquecidos (meios com nutriente adicional, como sangue, gema de ovo
e soro), acrescidos ou no de sistemas inibidores e sistemas indicadores.
A aplicao das tcnicas tem por base o uso de diluies seriadas obtidas a partir da homogeneizao de
amostras slidas e semi-slidas ou a partir de diluies diretas de amostras lquidas.
As tcnicas bsicas de contagem em placas incluem: Semeadura em Profundidade. Distribuir a alquota

das diluies escolhidas em placas de petri estreis.
Acrescentar 12 a 15ml do gar e misturar.
Deixar solidificar e incubar de acordo com o requerido para a pesquisa especfica.
Semeadura em superfcie. Usar meio j distribudo em placas, solidificado.
Promover a secagem da superfcie, quando necessrio. Usar 0,1ml das diluies escolhidas, podendo ser
inoculado, no mximo, at 0,5ml da(s) diluio (es) em questo.
Observar que o inculo deve ser depositado no centro da superfcie do gar, evitando tocar a ponta da
pipeta no meio, mantendo-a entretanto, o mais prximo posslvel. Espalhar, com auxlio de ala de
Drigalski, ou basto de vidro tipo "hockey" por toda a superfcie do gar ou at absoro completa do
inculo.
Inverter as placas e incubar como requerido.
Semeadura por Sobrecamada. Proceder como para semeadura em profundidade.
Aps mistura e solidificao, acrescentar de 10 a 12ml de gar fundido.
No misturar, deixar solidificar e incubar as placas invertidas, conforme requerido.
Pode-se proceder semeadura em superfcie e, aps espalhar o inculo adequadamente, acrescentar 10 a

12ml de gar fundido e mantido a 45C.
No misturar, deixar solidificar e incubar.
O tempo entre a inoculao da primeira camada e a adio da sobrecamada pode ser dilatado, quando se
pretende a recuperao de clulas em "stress". Nestes casos, em geral, o gar usado para a semeadura no
seletivo-diferencial sendo que o usado para a sobrecamada tem estas caractersticas.
Ecometria - Este mtodo, usado para o controle de qualidade de meios de cultura, est descrito na parte II
deste manual.
A.2 - NMERO MAIS PROVVEL
A tcnica do Nmero Mais Provvel (NMP) um mtodo que permite estimar a densidade de organismos
viveis presentes em uma amostra sob anlise.
Esta tcnica tem por base a probabilidade estatstica relacionada com a freqncia e ocorrncia de
resultados positivos mais provveis em funo do nmero real dos microrganismos presentes.
A avaliao estimativa do nmero de clulas viveis presentes obtida atravs de 3 diluies decimais
sucessivas e a transferncia de alquotas determinadas (tambm decimais, como 10 e 1ml) de cada
diluio em sries de tubos.
O nmero de tubos por srie varivel, podendo ser de 2 a 10.
Os mais comumente usados, so sries de 3 e de 5 tubos por diluies.
O arranjo de tubos positivos das 3 diluies transposto para tabelas estatsticas, que incluem os limites
de confiana dos nmeros mais provveis dos microrganismos pesquisados em funo da tabela em
questo.
Entretanto, a expresso do NMP feita somente atravs do numero mais provvel que corresponde aos
tubos positivos por srie.
A expresso do NMP por g ou ml do produto sob anlise feita considerando o fator de diluio usado.
Em geral, as tabelas j esto corrigidas considerando g ou ml (e conseqentemente, as diluies), para a
obteno do NMP.
Podem ser inoculadas mais do que 3 diluies seriadas. Entretanto, a leitura final do NMP deve
considerar somente as 3 diluies mais significativas.
Os exemplos a seguir permitem a seleo das diluies significativas, dentre as possibilidades

descritas.
Diluio (g ou
Exemplo Combinao de
ml)
1,0 0,1 0,01 0,001 0,0001 tubos
1 3/3* 3/3 1/3** 3-3-1
2 3/3 3/3 2/3 1/3 0/3 3-2-1
3 3/3 2/3 0/3 0/3 3-2-0
4 2/3 2/3 0/3 2-2-0
5 3/3 3/3 2/3 1/3 1/3 3-2-2
6 3/3 2/3 0/3 1/3 0/3 3-2-1
* Numerador = nmero de tubos positivos
Denominador = nmero de tubos semeados
** 3 diluies consideradas significativas para a obteno do NMP
INTERPRETAO
a) Quando da inoculao de mais do que 3 diluies seriadas, selecionar a maior diluio na qual todos os
tubos inoculados so positivos e considerar as 2 diluies seguintes maiores que a selecionada (exemplos
2 e 3).
b) Nos casos em que mais do que 2 diluies seguintes escolhida revelarem tubos positivos, repassar um
tubo positivo da maior diluio positiva para a imediatamente anterior, sucessivamente, at obter arranjo
de tubos que se enquadre na situao anterior (exemplos 5 e 6).
c) Nos casos de inoculao de somente 3 diluies seriadas, proceder a leitura diretamente na tabela
(exemplos 1 e 4).
A tcnica do NMP no permite contagem "fixa" de clulas viveis ou de UFC, como acontece com a
tcnica de contagem em placas.
O uso desta tcnica, entretanto, se justifica principalmente quando necessrio estimar o nmero de
clulas viveis no detectadas (visualizadas) pela contagem em placas em razo do volume possvel do
inculo por esta tcnica e na recuperao de clulas em "stress" fisiolgico, uma vez que so usados
meios lquidos na tcnica do NMP.
Quanto maior o nmero esperado do microrganismo pesquisado, maiores devero ser as diluies usadas.
O uso de meios de cultura com maior ou menor impedincia explorado pela tcnica do NMP, seja para
recuperar clulas sob "stress", seja para obter resultados mais rpidos.
Por outro lado, esta tcnica no permite confiabilidade ou confirmao do microrganismo pesquisado no
mesmo perodo de tempo do que a contagem em placas.
A tcnica de NMP deve ser realizada pelas seguintes etapas analiticas: teste presuntivo (leitura da srie de
tubos positivos); teste confirmatrio (subcultura dos tubos do teste presuntivo em caldo de maior
impedincia ou em gar seletivodiferencial para o microorganismo pesquisado) e teste completo
(identificao da(s) espcie(s) microbiana(s) presente(s).
1 - CONTAGEM PADRO DE MICRORGANISMOS AERBIOS ESTRITOS E FACULTATIVOS

VIVEIS: MESFILOS, PSIOOTRFICOS E TERMFILOS.
Os mtodos de contagem padro em placa oferecem o nmero de microrganismos viveis no alimento,

pela utilizao do meio de cultivo adequado, de maneira a promover o crescimento do mais amplo
espectro de microrganismos presentes na amostra sob anlise. Alguma seletividade ser exercida pela
temperatura de incubao.
Em muitos casos, como nos alimentos processados, a contagem padro demonstra o nvel geral de higiene
durante a fbricao, condies de armazenamento e transporte, etc. daquele alimento, enquanto em
produtos no processados pode ser indicador da qualidade do alimento.
A preciso do mtodo pode ser limitada pela incapacidade de alguns microrganismos formarem colnias
visveis no meio e condies utilizadas, como tambm, pela presena de substncias inibidoras produzidas
por microrganismos do prprio alimento durante o crescimento no gar.
Visando obteno de melhores resultados, observar as recomendaes contidas na parte III, item 3.
Quando presentes em nmeros elevados, os psicrotrficos podem causar Uma variedade de alteraes em
produtos conservados sob refrigerao.
A maioria dos organismos psicrotrficos so destrudos pelo calor. Assim, sua presena pode significar
subprocessamento trmico ou contaminao ps-processamento em produtos pasteurizados; a elevao do
seu nmero est associada a uma estocagem prolongada sob refrigerao ou manuteno a frio
inadequada, ou ainda, pode significar risco de alterao tanto para produtos processados como no
processados.
Microrganismos termfilos so aqueles que podem sobreviver de forma significativa ao tratamento

trmico.
Usualmente o tratamento trmico inclui temperaturas de pasteurizao ou superiores. A presena de

termfilos em grande nmero est relacionada com a qualidade higinica da matria prima ou
processamento trmico insuficiente.
1.1 - MEIOS UTILIZADOS
gua peptonada a 0,1%
gar padro para contagem (PCA) r
1.2 - TCNICA
Pipetar, assepticamente, pores de 1ml das diluies selecionadas transferindo-as para placas de petri
devidamente identificadas; semear utilizando, no mnimo, duas diluies diferentes.
Adicionar a cada placa cerca de 15ml de PCA previamente fundido e mantido a 45C. Homogeneizar
cuidadosamente.
Para contagem de psicrotrficos deve-se realizar a semeadura de 0,1ml das diluies desejadas sobre a
superfcie seca do gar previamente distribudo em placas. Aps solidificao, incubar as placas
invertidas de acordo com o que segue:
Termfilos 55C/48 horas
Mesfilos 35C/48 horas
Psicrotrficos - 7 a 10C/7- a 10 dias
Aps incubao, selecionar as placas e contar todas as colnias.
Calcular, de acordo com as diluies, o nmero de unidades formadores de colnias por grama ou rol da
amostra.
Ver tcnica de contagem no Anexo I.
a) GUA PEPTONADA 0,1%

Peptona de carne 1,0g
gua destilada/deionizada 1000,0ml
Dissolver a peptona na gua destilada/deionizada. Distribuir 9ml em tubos e autoclavar a 121C por 15
minutos.
pH final 7,0 0,2

b) AGAR PADRO PARA
CONTAGEM (PCA)
Extrato de levedura 2,5g
Triptona 5,0g
Glicose (C6H12O6) 1,0g
gar 15,0g
Suspender os componentes em 1 litro de gua destilada/deionizada.
Deixar em repouso por 15 minutos. Ferver at dissoluo completa.
Distribuir em tubos ou frascos apropriados. Autoclavar a 121C por 15 minutos.
pH final: 7,0 0,1
2 - CONTAGEM PADRO DE MICRORGANISMOS ANAERBIOS ESTRITOS OU

FACULTATIVOS VIVEIS - MESFILOS E TERMFILOS
Os anaerbios esto presentes na natureza. Algumas espcies so encontradas comumente no trato

intestinal do homem e animais, no solo, em pescados e ambiente marinho.
Os clostrdios podem ser proteolticos (putrefativos) ou no, o que demonstra sua importncia na
deteriorao de alimentos; algumas espcies so patognicas para o homem e a isto se deve o maior
interesse do seu controle nos alimentos.
Os anaerbios putrefativos podem ser demonstrados em meios com protena (OVO, soro, leite, crebro ou
carne) pois so capazes de decompor protenas, peptonas e aminocidos anaerobicamente, resultando em
aminas primrias, cido sulfdrico (H2S), metil e etilsulfito, amnia, mercaptanos, dixido de carbono
(CO2), H2, indol e escatol.
A maioria capaz de crescer entre 10 e 50C, o que abrange a temperatura de armazenamento de

alimentos refrigerados e curados.
Os esporos dos anaerbios putrefativos so mais resistentes ao calor que os dos no putrefativos, e por
esta razo so mais freqentemente encontrados em produtos subprocessados.
A presena de anaerbios no putretativos em alimentos processados trmicamente indcio de

contaminao ps-processo e no de subprocessamento.
A importncia do controle dos mesfilos anaerbicos nos alimentos de baixa acidez, mantidos em
embalagens hermticas est relacionada a sua alta resistncia ao calor, habilidade de crescer em
anaerobiose e nas temperaturas normais de armazenamento destes produtos.
Os anaerbios deteriorantes, devem ser considerados como um problema potencial em relao a

deteriorao de todos os alimentos de baixa acidez que supram
as necessidades de crescimento e, particularmente de anaerobiose.
Nos alimentos processados termicamente ou no, submetidos a operaes que visam a preveno de
deteriorao, como acidificao artificial ou reduo de atividade de gua, a presena de pequenos
nmeros de anaerbios mesfilos no tem significncia em relao ao risco potencial de deteriorao.
Os esporos de anaerbios termfilos tm uma excepcional resistncia ao calor e produtos qumicos.

Podem chegar ao alimento com ingredientes adicionados ao mesmo.
gar para contagem de anaerbios
2.2 - TCNICA
Proceder conforme o indicado na Parte IV, item 1.2, utilizando como meio o gar, para contagem de
anaerbios. Para anaerbios mesfilos incubar a 35C por 48
horas, e para termfilos incubar a 55C por 48 horas, ambos em anaerobiose.
2.3 - COMPOSIO E PREPARO DOS MEIOS DE CULTURA
a) gua Peptonada 0,1%
Peptonada de carne 1,0g

Dissolver a peptona na gua destilada/deionizada.
Distribuir 9ml em tubos e autoclavar a 121C por 15 minutos.
pH final 7,0 0,1

b) gar para Contagem de Anaerbios
Extrato de carne 3,0g
Triptona 15,0g
Cloreto de Sdio (NaCl) 2,5g
Fosfato dissdico dihidratado (Na2HPO4 2H
2,5g
2O)
Cistena hidrocloreto 0,5g
gar 15,0g
Suspender os componentes em 1 litro de gua destilada deionizada.
Distribuir em frascos ou tubos e autoclavar a 121C, por 20 minutos.
pH final 7,1 0,1
3 - CONTAGEM DE MICRORGANISMOS HALFILOS
O nvel de sal requerido pelos microrganismos halfilos varia enormemente.
A microflora associada a alimentos salgados depende da concentrao de sal, do tipo de sal e do tipo de
alimento. A classificao de halfilos, mais prtica, baseia-se na tolerncia concentrao salina na qual
apresenta timo crescimento.
- Levemente halfilos 0,5 a 3% cloreto de sdio

- Moderadamente
3,0 a 15% cloreto de sdio
halfilos
- Extremamente halfilos 15,0 a 30% cloreto de sdio
Os halfilos psicrotrficos de origem marinha dos gneros pseudomonas, Morazella, Acinetobacter e

Flavobacterium contribuem para a deteriorao de alimentos de origem marinha.
Alguns psicrotrficos halfilos necessitam de ons Mg++ e K+ alm de NaCl para o seu crescimento e
atividade proteoltica, enquanto que a
necessidade de sdio em outras bactrias halfilas, apenas osmtica. Diluies com gua destilada
podem causar a lise de halfilos deteriorantes, por isso todos os diluentes devem, no mnimo, conter 3%
de cloreto de sdio.
gua peptonada 0,1%, com 3% de cloreto de sdio Meio de Gibbons modificado, adicionado de 20% de
cloreto de sdio.
3.2 - TCNICA
Utilizando diluente adicionado de 3% de NaCl, semear, em duplicata, 0,1ml do inculo sobre a superfcie
do meio de cultura.
Espalhar cuidadosamente, com o auxilio de ala de Drigalsky ou basto tipo "hockey". Incubar as placas
invertidas conforme indicado abaixo:
Produtos de estocagem recomendada em temperatura ambiente: 25C por 4 dias.
Produtos de estocagem recomendada em refrigerao: 7C por 10 dias.
Em pescado salgado, preparar 4 placas e incubar nas duas temperaturas (7C por 10 dias e 25C por 4
dias).
a) gua Peptonada a 0,1% com 3% de Cloreto de Sdio (NaCl)
Peptona 1,0g
Cloreto de sdio (NaCl) 30,0g
Dissolver os componentes na gua destilada/deionizada.
pH final 7,0 0,2
b) MEIO DE GIBBONS MODIFICADO
Casoaminocido 10,0g
cido L-Glutmico (C5H9NO3) 2,5g
citrato trisdico (C6H5O7Na3H20) 3,Og
Cloreto de potssio (KCl) 2,0g
Sulfato de magnsio hepta hidratado (MgSO4 7H2O) 2,5g
gua deionizada/destilada 950,0ml
Dissolver os componentes na gua e ajustar o pH 7,5 - 7,6.
Autoclavar a 120C por 15 minutos. Filtrar, ajustar o pH para 7,0.
Acrescentar 20g de gar, completar o volume para 1000ml com gua deionizada, distribuir em frascos e
autoclavar a 121C por 15 minutos.
4 - CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS C
Os bolores e leveduras esto presentes no meio ambiente e podem fazer parte da flora do alimento. s
vezes podem ser responsveis pela deteriorao de muitos tipos de alimentos, os quais, pelas suas
caractersticas de baixo pH e de atividade de gua, contedo de sal ou de acar e estocagem em baixa
temperatura, favorecem seu a desenvolvimento. Alguns podem causar problemas nos alimentos devido a
sua resistncia ao calor, congelamento, antibiticos e irradiao, alm da formao de toxinas. Podem
tambm transformar substratos imprprios em favorveis ao desenvolvimento de bactrias patognicas.
4.1 - MEIOS UTILIZADOS.
gua peptonada 0,1%
Agar batata glicosado
Agar batata glicosado 20%
Agar OGY (opcional)
4.2 - REAGENTES
cido tartrico, soluo aquosa 10%
Oxitetraclicina, soluo a 1% em 0,01N cido clordrico (HCl)
4.3 - TCNICA
Proceder conforme o item 1.2 da parte IV utilizando o gar batata glicosado, acidificando imediatamente
antes do uso, a pH 3,5 com cido tartrico a 10% em
soluo aquosa. Incubar as placas invertidas em 22 a 25C durante 3 a 5 dias.
Selecionar placas que contenham 10 a 150 colnias e contar conforme Anexo I.
No caso de amostras de mel, e outros produtos com altas concentraes de acares, contar bolores e
leveduras osmoflicas, utilizando gar batata glicosado adicionado de 20% de glicose, em paralelo ao gar
batata glicosado normal. Neste caso, as diluies devem ser efetuadas com gua peptonada 0,1%,
acrescida de 20% de glicose e o pH do meio deve ser 4,5.
No caso de utilizar o meio opcional, incorporar 0,1g/l de oxitetraciclina em soluo aquosa, ao gar
previamente fundido e mantido a 50C, imediatamente antes do uso.
a) AGUA PEPTONADA A 0,1%
Peptona 1,0g
Agua destilada/deionizada 1000,0ml
pH final 7,0 0,2
b) AGAR BATATA GLICOSADO

Glicose (C6H1206) 20,0g
Agar 15,0g
Quando tratar-se de meio desidratado observar rigorosamente as recomendaes contidas no rtulo ou

manual. No momento da utilizao, fundir, resfriar a 45C e acidificar at pH 3,5 com cido tartrico a
10% estril.
No aquecer aps a adio do cido.
c) AGAR BATATA GLICOSE 20%
Preparar da mesma forma que o gar batata glicosado. Adicionado de 180g de glicose por litro de meio.
d) AGAR OGY (GAR OXITETRACICLINA - GLICOSE - EXTRATO DE LEVEDURA)

D (+) glicose (Na2HPO4 2H2O) 10,0g
gar 15,0g
Por tratar-se de meio desidratado, observar rigorosamente as recomendaes contidas no rtulo ou

manual. Antes do uso fundir o meio e esfriar a 50C. Adicionar a cada litro 0,1g de oxitetraciclina em
soluo aquosa.
pH final 6,5 0,2
5 - CONTAGEM DE MICRORGANISMOS LIPOLTICOS
As gorduras dos alimentos so suscetveis hidrlise e oxidao, o que pode ser causado por bactrias,
bolores e leveduras, como tambm por processos qumicos.
A deteriorao hidroltica e oxidativa das gorduras do alimento levam a alteraes do odor do mesmo e
diminuio da qualidade at deteriorao.
Os alimentos mais freqentemente envolvidos em problemas da liplise so os cremes de leite, manteigas,

margarinas e outros produtos com grande proporo de gorduras.
A temperatura e umidade durante o armazenamento podem proporcionar condies de desenvolvimento

de microrganismos lipolticos.
Os gneros Pseudomonas, Alcaligenes e Staphylococcus possuem espcies lipolticas.
As lipases so relativamente ativas em baixa atividade de gua (congelados, alimentos em p) embora o

aumento nas condies de atividade de gua aumente a ao enzimtica.
As lipases so enzimas exocelulares podendo estar atuando na gordura do alimento mesmo aps a
destruio da clula microbiana por processos tecnolgicos.
5.1 - MEIOS UTILIZADOS.
gar tributirina
5.2 - TCNICA
Proceder como na parte IV item 1.2, semeando em superfcie.

Utilizar como meio de cultura o gar tributirina.
Incubar a 22C, durante 5 dias.
Contar as colnias rodeadas por um halo transparente.
a) AGUA PEPTONADA A 0,1%
Peptona 1,0g
pH final 7,0 0,2
b) AGAR TRIBUTIRINA
Peptona 5,0g
gar 15,0g
Deixar repousar por 15 minutos.
Ferver at dissoluo completa.
Distribuir em frascos (volume conhecido) e autoclavar a 121C por 15 minutos.
O pH do meio base dever ser 7,5 0,1 a 30C.
Para preparao do gar tributirina adicionar a um litro de meio base, fundido e resfriado a 80C, 10g de
tributirina (glicerina tributirato) neutra, aquecida a 80C, homogeneizar.
Em lugar de tributirina pode-se usar outros glicerdeos como triolena e trilinolena.
pH final: 7,5 0,1
6 - CONTAGEM DE MICRORGANISMOS PROTEOLTICOS
Alteraes no sabor e odor dos alimentos podem ser produzidas por microrganismos proteolticos.
Alguns psicrotrficos deteriorantes so fortemente proteolticos, causando alteraes indesejveis em

produtos crneos, laticnios e pescado.
Em alguns alimentos, o nmero de proteolticos pode projetar o tempo de vida do produto estocado sob
refrigerao e avaliar o processamento tecnolgico.
Proteases termoresistentes so produzidas por algumas espcies de Pseudomonas e podem alterar leites
esterilizados.
Espcies proteolticas so comuns entre os gneros Bacillus, Clostridium, Pseudomonas e Proteus.
O nvel de bactrias proteolticas e/ou a proporo em termos da flora total pode ser til para indicar a
qualidade de alguns tipos de alimentos (vida-til sob refrigerao).
As colnias de bactrias proteolticas no gar leite apresentam-se rodeadas por uma zona clara como
resultado da converso da casena em compostos nitrogenados solveis.
Como o meio opaco, utiliza-se um precipitante qumico (HCl ou cido actico) para detectar a protelise
e para confirmar se as zonas claras so causadas por protelise ou pela formao de cidos devida
fermentao de carbohidratos.
Aps o tratamento com o precipitante qumico, as colnias no podem ser usadas para outras anlises.
gua peptonada 0,1%
gar leite
6.2 - REAGENTES
cido cloridrico a 1%, soluo aquosa
cido actico a 10%, soluo aquosa
Ao manipular o cido clordrico fumegante e o cido actico glacial para o preparo destas solues,
cuidados devem ser tomados para evitar o contato com mucosas, pele e inalao.
Utilizar pr-pipetas para pipet-los. Realizar este trabalho em capela.
6.3 - TCNICA
Proceder como na parte IV, item 1.2, exceto nos seguintes pontos:
a) Semear em superfcie.
b) utilizar o gar leite
c) Incubao a 22C por 72 horas
d) Aps a incubao, cobrir o gar com soluo de cido clordrico (HCl) a 1% ou cido actico a 10%
por 1 (um) minuto. Retirar o excesso de lquido e contar as colnias rodeadas por um halo transparente.
a) GUA PEPTONADA A 0,1%
Peptona 1,0g
Dissolver a peptona na gua destilada/deionizada, distribuir 9ml em tubos e autoclavar a 121C por 15
minutos.
pH final 7,0 0,2

b) GAR LEITE

gar 12,0g
Suspender os componentes em 900ml de gua destilada/deionizada.
Deixar repousar por 15 minutos. Ferver at dissoluo completa.
Distribuir em frascos e autoclavar a 121C, por 15 minutos.
Adicionar 100ml de leite desnatado reconstitudo (10%), estril, na hora da utilizao.
pH final 7,0 0,2
7 - CONTAGEM DE COLIFORMES
Coliformes so bastonetes Gram-negativos, aerbicos e facultativamente anaerbicos, que fermentam a

lactose com formao de gs em 48 horas a 35C.
Para produtos lcteos, alguns pesquisadores especificam a temperatura de 32C.
A especificao do meio e da temperatura crtica para a interpretao dos resultados. com base nas
evidncias disponveis, 20 ou mais espcies representativas atendem aos critrios que definem o grupo
coliforme. O grupo coliforme, que no identifica os membros individualmente, tem menor valor
interpretativo que o nico organismo ndice, a E.coli, bem como o grupo coliforme de origem fecal, pois
o grupo coliforme pode conter alguns membros no entricos como o gnero Serratia e Aeromonas.
gar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBL)
Caldo verde brilhante bile 2% lactose
7.2 - TCNICA
Semear em placas, 1ml das diluies selecionadas. Adicionar a cada uma 15ml de gar cristal violeta
vermelho neutro bile, previamente fundido e mantido a 45C e homogeneizar.
Deixar solidificar em superfcie plana.
Acrescentar uma segunda camada menos espessa do meio e deixar solidificar.
Alternativamente, semear 0,1ml de cada diluio em superfcie de gar tripticase soja, espalhar
homogeneamente e deixar as placas em temperatura ambiente por 5 a 6 horas para revitalizao.
Aps este perodo, cobrir cada placa com 10ml de VRBL, deixar solidificar e incubar a 35C por 24 a 48
horas.
Incubar as placas invertidas a 35C, por 24 a 48 horas. Selecionar as placas que contenham de 10 a 150
colnias.
Caractersticas das colnias: 0,5 - 2mm de dimetro, de cor avermelhada.

Contar as colnias tpicas e calcular o nmero de coliformes por g ou ml da amostra. Em caso de dvida,
confirmar 3 a 5 colnias em caldo verde brilhante bile 2% lactose. Ver tcnica de contagem no Anexo I.
a) gua Peptonada A 0,1%
Peptona 1,0g
Dissolver a peptona na gua destilada/deoinizada, distribuir 9ml em tubos e autoclavar 121C por 15
minutos.
b) gar Cristal-Violeta Vermelho Neutro Bile.
Lactose (C12H22O11H2O) 10,0g

Sais biliares (n 3) l,5g
Vermelho neutro (C15H17ClN4) 0,03g
Cristal violeta (C25H30ClN3) 0,002g
gar 15,0g

manual. No autoclavar.
pH final 7,4 0,1
c) Caldo Verde Brilhante Bile 2% Lactose
Peptona 10,0g
Bile concentrado 20,0g
Verde brilhante (C21H14Br4O5S) 0,0133g

manual.
pH final 7,4 0,1
8 - NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES
Caldo lauril sulfato
Caldo verde brilhante bile 2% lactose
gar eosina azul de metileno lactose segundo Levine
8.2 - TCNICA
Utilizar o caldo lauril sulfato para o exame presuntivo de coliformes em gua e caldo verde brilhante bile
2% lactose ou caldo lauril sulfato para os produtos em geral.
Semear trs sries de 3 tubos utilizando 10ml, 1ml. e 0,1ml ou outras diluies decimais em caldo lauril
sulfato ou verde brilhante bile 2% lactose, contendo tubos de fermentao (Durhan).
A ltima diluio empregada dever ser suficientemente alta para dar um tubo com resultado negativo.
Homogeneizar com cuidado e incubar a 35C, por 24 a 48 horas.
Quando for necessrio semear 10ml da amostra original ou diluio, utilizando meio preparado com dupla
concentrao.
Anotar os tubos positivos em cada uma das trs sries de 3 tubos, (presena de gs nos tubos de Durhan).
Confirmar os tubos positivos em gar Levine.
Verificar a tabela no Anexo II para o clculo do NMP de coliformes.
Quando necessrio, realizar as provas complementares do IMVIC.
a) Caldo Lauril Sulfato
Triptona 20,0g
Lauril Sulfato de Sdio (CH3(CH2)10CH2OSO3Na) 0,1g
Fostato dipotssico (K2HPO4) 2,75g
Fosfato Monopotssico (KH2PO4) 2,75g
Por tratar-se de meio desidratado, observar rigorosamente as recomendaes contidas na embalagem ou

manual.
pH final: 6,8 0,1
b) Caldo Verde Brilhante Bile 2% Lactose
Peptona 10,0g
Bile concentrado 20,0g
Verde brilhante (C21H14Br4O5S) 0,0133g

manual.
c) gar Eosina Azul De Metileno Lactose Segundo Levine

Fosfato dipotssico (K2HPO4) 2,0g
Eosina amarela (C20H6Br4Na2O5) 0,4g
Azul de metileno (C16H18ClN3S.2H2O) 0,065g
Agar 15,0G
pH final: 7,0 0,2
manual.
9 - CONTAGEM DE COLIFORMES DE ORIGEM FECAL
A separao dos coliformes de origem fecal, daqueles de origem no fecal feita atravs de testes
baseados em incubao temperaturas elevadas.
Tais testes so usados internacionalmente com algumas variaes. Entretanto, estes mtodos no so
absolutos.
O termo coliforme de origem fecal no tem validade taxmica, pois no pretende identificar, mas apenas
indicar, a presena de E.coli, no separando esta bactria das demais, geralmente consideradas de pouco
ou nenhum significado em sade pblica. Por outro lado, a presena de microrganismo do grupo de
origem fecal no alimento pode ser atribuda a uma contaminao pelo ambiente e no necessariamente a
uma contaminao fecal direta, e o seu nmero pode estar associado ao desenvolvimento no prprio
produto.
Como para os demais coliformes, a tolerncia ou no para este grupo, depende do tipo de produto em
anlise, e das condies necessrias de higienizao/sanitarizao nos locais de estocagem, fabricao e
processamento de alimentos. Sua interpretao e tolerncia, portanto, tem mais sentido quando da
comparao dos resultados obtidos em funo da padronizao da metodologia analtica.
Caldo EC
Caldo triptona
Caldo VM-VP
Agar citrato de Simmons
9.2 - REAGENTES
a) Reativo de Kovacs
Paradimetilaminobenzaldedo (C9H11NO) 5,0g

Alcool isoamlico (C11H11OH) 75,0ml
Acido clordrico concentrado (HCl) 25,0ml
Dissolver o benzaldedo em lcool isoamlico e aps adicionar o cido clordrico.
Estocar em frasco escuro, sob refrigerao.
b) Vermelho de metila soluo alcolica - pesar 0,04g de vermelho de metila e dissolver em 60ml de
etanol absoluto.
VM em pH 4,4 - Vermelho
VM em pH 6,2 - Amarelo
c) Alfa-naftol, soluo alcolica a 5% - Estocar em frasco escuro e sob refrigerao. Evitar contato com
mucosas e pele.
d) Hidrxido de potssio, soluo aquosa 40%.
9.3 - TCNICA
A partir das placas de gar cristal violeta vermelho neutro bile utilizado na contagem de coliformes,
selecionar 3-5 colnias tpicas e realizar as provas do IMVEC:
I - Indol 35C/48h
M - Vermelho de metila 35C/48h
V - Voges Proskauer 35C por 5 dias
E - Eijkman Banho-maria a 45,5C/48h
C - Citrato 35C/48h
Para leitura verificar:
a) Fermentao da Lactose - Verificar no tubo de Durban a presena de gs.
b) Teste de Presena de Indol - Adicionar no tubo com caldo triptona 3ml do reativo de Kovacs.
Agitar, deixar em repouso por 10 minutos.
O aparecimento de uma colorao vermelho escura na camada de lcool isoamlico representa uma reao
positiva. Considerar como coliforme fecal os que demonstrarem positividade em ambas as provas.
c) VM-VP - incubar a 35C por 5 dias, aps pipetar 1 e 5ml para dois tubos estreis.
No primeiro colocar 2 a 3 gotas de soluo de vermelho de metila e no outro tubo adicionar 0,6ml de
soluo alcolica de alfa-naftol a 5% e 0,2ml de soluo
aquosa de KOH a 40%.
Agitar, deixando em repouso por 1 a 2 horas.
O aparecimento da colorao vermelha no tubo com vermelho de metila indica reao VM positiva, e
vermelho-escuro no tubo com alfa-naftol e KOH indica reao VP-positiva.
Para uma resposta mais rpida da reao de VP adicionar algumas gotas de soluo de creatina a 5% em
hidrxido de sdio (NaOH) 0,1N.
d) Agar citrato de Simmons - incubar a 35C por 24 a 48 horas.
Observar a alterao ou no de cor do indicador.
A cor azul indica reao positiva. Calcular o nmero de coliformes fecais por g ou ml do produto,
utilizando a frmula:
R=Cxcxd
________________
r
R=Resultado
C=colnias contadas
c=colnias confirmadas
d=Diluio utilizada para contagem
r=Colnias repicadas
a) Caldo EC
Peptona de casena 20,0g

Sais biliares 1,5g
Fosfato monopotssico (KH2PO4) 1,5g
Por tratar-se de meio desidratado observar rigorosamente as recomendaes

contidas na embalagem ou manual.
pH final: 6,9 0,2
b) Caldo triptona
Triptona 10,0g
Dissolver os componentes em 1 litro de gua destilada/deionizada.
Distribuir em tubos e autoclavar a 121C, por 15 minutos.
PH final 6,9 0,2
c) Caldo VM-VP
Proteose peptona 7,0g

Glicose (C6O1206) 5,0g

manual.
pH final: 6,9 0,2
d) gar Citrato Seg. Simons
Dihidrogenofosfato de amnio (NH2PO4) 1,0g

Citrato de sdio (C6H5O7Na3.2H2O) 2,0g
Sulfato de magnsio (MgSO4.7H2O) 0,2g
Azul de bromotimol (C27H28Br2O5S) 0,08g
Agar 15,0g
pH final 6,9 0,1

manual.
10 - NMERO MAIS PROVVEL DE COLIFORMES DE ORIGEM FECAL
Caldo triptona
Caldo EC
gar EMB (Levine)
10.2 - REAGENTES
a) Reativo de Kovacs
Paradimetilaminobenzaldedo(C9H11NO) 5,0g
Alcool isoamlico (C5H11OH) 75,0ml
cido clordrico concentrado (HCl) 25,0ml
Dissolver o berizaldedo no lcool isoamlico, e aps adicionar o cido clordrico.
10.3 - TCNICA
A partir de cada um dos tubos positivos no NMP de coliformes, semear um tubo de caldo EC e um tubo
de caldo triptona. Incubar ambos os tubos a 45,5C, 0,2C por 24-48 horas em banho-maria com
agitao.
Aps incubao, verificar:
a) Fermentao da Lactose verificar a presena de gs no tubo de Durhan.
b) Teste da presena de Indol - adicionar ao tubo com caldo triptona 0,3ml do reativo de Kovacs.
Agitar.
O aparecimento de colorao vermelho escura na camada do lcool isoamlico representa uma reao
positiva.
Considerar como coliforme fecal quando ambas as provas apresentarem resultados positivos.
Quando necessrio, realizar as provas da IMVEC selecionando as colnias do gar Levine.
Calcular o NMP de coliformes fecais atravs do nmero de tubos confirmados, verificando a tabela do
Anexo II.
10..4 - COMPOSIO E PREPARO DOS MEIOS DE CULTURA
a) Caldo EC

Sais Biliares 1,5g

manual.
pH final: 6,9 0,2
b) Caldo Triptona
Triptona 10,0g
Por tratar-se de meio desidratado, observar rigorosamente as recomendaes contidas na embalagem.
pH final: 6,9 0,2
c) gar Emb (Eosina - Azul De Metileno - Lactose) - Levine

Eosina amarela (C20H6Br4Na2O5) 0,4g
Azul de metileno (C16H18ClN3S.2H2O) 0,065
gar 15,0g

manual.
pH f1nal: 7,0 0,2
11 - CONTAGEM DE E. coli
Investigaes ecolgicas tem demonstrado que a E. coli procede do intestino do homem e dos animais de
sangue quente. A presena de E. coli em um alimento indica que ocorreu uma contaminao de origem
fecal e que conseqentemente existe o risco potencial de que tenham chegado ao alimento outros
microrganismos patognicos de origem entrica.
At o momento a E. coli o marcador sanitrio ideal na anlise microbiolgica de alimentos crs ou que
no tenham sido submetidos a nenhum tratamento trmico para assegurar sua inocuidade.
A E. coli o ndice fecal melhor conhecido, mas pode apresentar comportamento anmalo nos testes de
identificao laboratorial.
Devido a isto ela se torna um indicador de contaminao fecal no perfeito, nos casos negativos. A
identificao feita com base no padro do teste de INVEC.
11.1 - MEIO UTILIZADO
Caldo lauril triptose - MUG (4 metil-umbeliferil-Beta-D-Glicurondeo)

11.2 - TCNICA
A partir das placas de cristal violeta vermelho neutro bile, utilizadas para a contagem de coliformes,
selecionar 3-5 colnias tpicas e semear em caldo lauril triptose - MUG.
Incubar a 35C por 20 horas.
Fazer a leitura em cmara com lmpada de UV, com emisso de luz de 366 nm. A Beta-Glicoronidase da
E. coli hidrolisa o MUG (incolor) liberando o composto 4-metil-umbeliferona, fortemente fluorescente.
Aps a leitura da fluorescncia, adicionar ao meio algumas gotas do reativo de Kovacs, para verificar a
formao de indol.
Considerar como E. coli as colnias que apresentarem fluorescncia e indol positivos.
Calcular o nmero de E. coli, utilizando a frmula:
R=Cxcxd
___________________
r
R=Resultado
C=Colnias contadas
c=Colnias confirmadas
d=Diluio utilizada para contagem
r=Colnias repicadas
Microrganismo Indol VM VP Citrato Lactose

E. coli tpica + + - - +
E. coli inativa* + + - - -
E. blattae - + - -
E. fergusoni - + - - -
E. ewingii + + - -
Plesiomonas
+ + - -
shiqelloides
Klebsiella taxon 53* - -
Klebsiella taxon 62 - +
Klebsiella taxon 68* - +
Hafnia alvei - - -
2Aeromonas hidrophila + + -
E. hermannii + + - -
E.vulneris - + - - +
* grupos ensaiados reconhecidos no CDC, Atlanta, USA - tabela retirada do Compendium APHA, 1984.
11.3 - COMPOSIO E PREPARO DO MEIO DE CULTURA
a) Caldo Lauril - Triptose - Mug
Triptose 20,0g
Lauril sulfato de sdio (CH3(CH2)10CH2OSO3
Na) 0,1g
4-Metilumbeliferil-Beta-D-Glicurondeo 100,0mg
Dissolver em 1 litro de gua destilada/deionizada.
Distribuir em tubos de ensaio com tubos de Durham, esterilizar a 121C por 15 minutos.
pH final 6,8 0,2
12 - NMP DE E. coli
12.1 - MEIO DE CULTURA
Caldo lauril triptose - MUG (4-metil-umbeliferil-beta-D-glicurondeo)
12.2 - TCNICA
A partir dos tubos de caldo EC incubados a 45,5C positivos, utilizados para confirmao de NMP
coliformes fecais, semear tubos com caldo Lauril triptose-MUG.
Fazer a leitura em cmara de UV, com emisso de luz em 366nm.
A Beta-glicuronidase da E. coli hidrolisa o MUG (incolor) liberando o composto 4- metilumbeliferona,

fortemente fluorescente.
Aps a leitura da fluorescncia adicionar reativo de Kovacs para verificao da produo de Indol.
Considerar presena de E. coli nos tubos que forem positivos para fluorescncia e indol.
Calcular o NMP de E. coli consultando a tabela do Anexo no II.
a) Caldo Lauril - Triptose - MUG
Triptose 20,0g
Lauril sulfato de sdio (CH3(CH2)10CH2OSO3
Na) 0,1g
4-Metilumbeliferil-Beta-D-Glicurondeo 100,0mg
Dissolver em 1 litro de gua destilada/deionizada.
Distribuir em tubos de ensaio com tubos de Durham, esterilizar a 121C por 15 minutos.
pH final 6,8 0,2
12 - NMP DE E. coli
Caldo lauril triptose - MUG (4-metil-umbeliferil-beta-D-glicurondeo)
12.2 - TCNICA
A partir dos tubos de caldo EC incubados a 45,5C positivos, utilizados para confirmao de NMP
coliformes fecais, semear tubos com caldo Lauril triptose-MUG.
Fazer a leitura em cmara de UV, com emisso de luz em 366nm.
A Beta-glicuronidase da E. coli hidrolisa o MUG (incolor) liberando o composto 4- metilumbeliferona,

fortemente fluorescente.
Aps a leitura da fluorescncia adicionar reativo de Kovacs para verificao da produo de Indol.
Considerar presena de E. coli nos tubos que forem positivos para fluorescncia e indol. Calcular o NMP
de E. coli consultando a tabela do Anexo no II.
a) Caldo Lauril - Triptose - MUG
Triptose 20,0g
Fosfato Monopotssico (KH2PO4) 2,75g
Cloretode sdio (NaCl) 5,0g
Lauril Sulfato de Sdio (CH3(CH2)10CH2OSO3
Na) 0,1g
4-Metilumbeliferil-Beta-D-glicurondeo 100,0mg
Distribuir em tubos de ensaio, cerca de 10ml por tubo. Esterilizar a 121C por 15 minutos.
pH final: 6,8 0,2
13 - CONTAGEM DE S. aureus
O S. aureus representa um risco para a sade pblica pela produo de enterotoxina estafiloccica, agente
causal de intoxicao alimentar.
A determinao do S" aureus importante para:
- Confirmar que este microrganismo agente de doena veiculada por alimento;
- Identificar os alimentos veiculadores desta bactria;

- Demonstrar contaminao ps processamento por manipulao humana de produtos processados
termicamente.
A interpretao da determinao quantitativa de S. aureus deve considerar o conjunto das razes

,assinaladas, associada a possibilidade deste microrganismo se desenvolver no produto alimentcio, em
funo de suas caractersticas e das condies de conservao e manuseio do produto acabado.
No que se refere s matrias primas, deve-se considerar a possibilidade de sobrevivncia durante o

processo de transformao das mesmas.
A presena de S. aureus em produtos fermentados pode indicar fermentao imprpria.
gar Baird-parker
Caldo crebro corao (BHI)
gar azul de toluidina (DNA)
Meio para fermentao aer6bica de maltose
13.2 - REAGENTES
Telurito de potssio a 3,5%
Soluo salina a 0,85%
Plasma de coelho oxalatado, ou com EDTA
Emulso de gema de ovo a 50%
Soluo de piruvato de sdio a 10%
Cloreto de mercrio a 1%
Soluo aquosa de maltose a 10%
13.3 - TCNICA
Semear sobre a superfcie do gar Baird-Parker, 0,1ml de cada diluio selecionada.
Com o auxIlio de ala de Drigalsky ou basto tipo "hockey", espalhar o inculo cuidadosamente, por toda
a superfcie do meio.
Incubar as placas invertidas a 35C por 30-48 horas.
Selecionar placas que contenham entre 10-150 colnias.
Contar as colnias tpicas, negras brilhantes com anel opaco, rodeado por um halo claro transparente,
destacando-se sobre a opacidade do meio.
Contar tambm as colnias atpicas, acinzentadas ou negras brilhantes, sem halo ou com apenas um dos
halos.
De cada placa selecionar 3-5 colnias tpicas e atpicas, semear em tubos contendo caldo crebro-corao.
Incubar a 35C, por 24 horas.
A partir do caldo crebro-corao efetuar as seguinte provas:
13.3.1 - PESQUISA DA PRESENA DE COAGULASE
Transferir 0,3ml do cultivo de caldo crebro-corao para tubos contendo 0,5ml de plasma de coelho
oxalatado, ou com EDTA. Incubar a 35C por 6 horas.
Verificar a presena de cogulos evidentes (reaao positiva).
Quando negativa, reincubar at 12 horas.
Em caso de dvida, na prova de coagulase, corar pelo mtodo de Gram, para evidenciar cocos Gram
positivos e realizar a prova da termonuclease.
Neste caso, considerar como S. aureus quando a termonuclease for positiva (Mossel).
13.3.2 - PESQUISA DA PRESENA DE TERMONUCLEASE
Com pipeta de Pasteur ou ala de platina, fazer orifcios, eqidistantes com 2mm de dimetro, no gar
azul de toluidina DNA, em placas previamente preparadas.
Colocar nos orifcios uma gota (0,03ml) do cultivo em caldo crebro-coraao, aquecido previamente em
banho-maria fervente por 15 minutos.
Incubar a 35C, por 4 horas, em cmara mida.
O aparecimento de um halo cor-de-rosa de mais de 1mm ao redor dos orifcios demonstrar a presena da
termonuclease.
Considerar como S. aureus aqueles que apresentarem positividade em uma ou outra prova
(coagulase/termonuclease).
13.3.3 - FERMENTAO AERBICA DA MALTOSE
A partir da cultura em caldo crebro-corao semear, por estrias, placas de gar para fermentao
aerbica da maltose.
Incubar a 35C por 24/72h.
Verificar a presena de colnias rodeadas de zona amarela, fermentadoras da maltose.
O S. aureus fermenta a maltose aerobicamente.
Colnias de s. intermedium e de S. hycus apresentam-se com zona amarelada apenas embaixo da linha de
semeadura ou sobre meio sem alterao.
a) gua Peptonada a 0,1%
Peptona 1,0g
Dissolver a peptona na gua destilada/deionizada. Distribuir 9ml em tubos e autoclavar a 121C por 15
minutos.
pH final 7,0 0,2
b) gar Baird-Parker

Triptona 10,0g
Piruvato de sdio (C9H11NO) 10,0g
Glicina (H2NCH2COOH) 12,0g
Cloreto de ltio (Li2Cl.6H2O) 5,0g
gar 20,0g
Deixar repousar por 15 minutos. Ferver at dissoluo completa.
Distribuir em frascos (volume conhecido) e autoclavar a 121C, por 15 minutos.
pH final: 6,8 0,2
Antes do uso, fundir e resfriar a 50C.
Adicionar, para cada litro de meio base, 50ml de emulso de gema de ovo a 50% e 3ml de uma soluo
aquosa de telurito de potssio a 3,5%, esterilizada por filtrao.
Homogeneizar bem e distribuir em placas.
Obs: Preparao de gema de ovo a 50%: Escolher ovos com casca perfeita e lavar com sabo e gua
morna. Secar, imergir em soluo aquosa de cloreto de mercrio a 1% durante 10 minutos,
aproximadamente. Secar com toalha estril.
Quebrar a casca assepticamente, separar a gema do ovo e colocar em copo graduado estril.
Adicionar o mesmo volume de soluo salina a 0,85% estril, misturar bem.
c) Caldo Crebro-Corao
Infuso de crebro de terneiro 12,5g

Infuso de corao de boi 5,0g
Peptona 10,0g
Fosfato dissdico (Na2HPO.) 2,5g
Por tratar-se de meio desidratado, observar rigorosamente as recomendaes contidas no rtulo e manual.
pH final: 7,4 0,1

d) gar azul de toluidina - DNA
Acido desoxiribonucleico (DNA) 0,3g

Cloreto de clcio (CaCl) 0,00011g
Azul de toluidina O(Soluo aquosa a 1%)* 9,2ml
Tris (hidroximetil) aminometano (C4H11NO3) 6,1g
gar 10,0g
Dissolver tris (hidroximetil) aminometano em 1 litro de gua destilada/deionizada e ajustar o pH para 9,0.
Adicionar os demais componentes (exceto azul de toluidina) e aquecer at dissoluo completa.
Finalmente, adicionar azul de toluidina. No necessrio esterilizar.
* - Proteger o p da ao da luz e umidade. Evitar contato com a pele, mucosas e ingesto.
e) Meio para Fermentao Aerbica da Maltose.
Proteose Peptona 10,0g

Prpura de bromocresol (C21H16Br2O5S) 0,02g
gar 15,0g
Antes do uso adicionar a 100ml do gar, 20ml da soluo de maltose a 10%, esterilizada por filtrao.
pH final: 6,8 0,1
14 NMP DE Staphylococcus aureus
14.1 - MEIOS
gua peptona a 0,1%
Caldo telurito manitol glicina (Giolitti e Cantoni)
gar Baird-Parker
Caldo crebro-corao
gar azul de toluidina - DNA
Meio para fermentao aerbica da maltose
14.2 - REAGENTES
Soluo salina 0,85%
Plasma de coelho oxalatado
Cloreto de mercrio a 1%
Maltose soluo aquosa a 10%

14.3 - TCNICA
Semear 3 sries de trs tubos, em caldo telurito manitol glicina utilizando pores de 1ml de cada uma
das diluies escolhidas.
Colocar em cada tubo uma camada de 1-2ml de parafina estril. Incubar a 35C por 48 horas.
O S. aureus formar precipitado negro ou escurecer todo o meio.
Com pipetas de Pasteur, estreis, remover gotas de cultura do fundo dos tubos positivos e repicar sobre a
superfcie de gar Baird-Parker de modo a formar colnias isoladas. Incubar a 35C por 30-48 horas.
Selecionar as colnias negras, brilhantes, com anel opaco, rodeadas por um halo claro transparente.
Repicar em caldo crebrocorao e realizar os testes para produo de coagulase, termunoclease e

fermentao da maltose (ver item 13.3.1, 13.3.2 e 13.3.3).
Calcular o NMP do S. aureus atravs de tubos positivos confirmados (coagulase e/ou termonuclease
positivos, e maltose positivos) verificando tabela do Anexo II.
Peptona 1,0g
Dissolver a peptona na gua destilada/deionizada. Distribuir 9ml em tubos.
Autoclavar a 121C por 15 minutos.
pH final: 7,0 0,2
b) Caldo Telurito Manitol Glicina (Giolitti e Cantoni)
Triptona 10,0g
Cloreto de ltio (LiCl) 5,0g
D - Manitol (C6H14O6) 20,0q
Piruvato de s6dio (C,HIINO) 3,og
Dissolver os ingredientes em 1 litro de gua destilada e ajustar o pH para 6,9.
Distribuir em volumes de 19ml em tubos e esterilizar a 121C, por 20 minutos. o meio base pode ser
estocado a 4C por 10-12 dias.
Antes de usar, regenerar o meio aquecendo a 100C, por 20 minutos.
Esfriar e adicionar 0,1ml de uma soluo de telurito de potssio a 1% esterilizada por filtrao.
Manter a soluo de telurito de potssio sob refrigerao.

c) gar Baird-Parker

Triptona 10,0g
Piruvato de sdio (C9H11NO) 10,0g
Cloreto de ltio (Li2Cl.6H2O) 5,0g
gar 20,0g
Deixar repousar por 15 minutos.
Distribuir em frascos (volume conhecido) e autoclavar a 121C, por 15 minutos. pH final: 6,7 0,1
Antes do uso, fundir e resfriar a 50C.
Adicionar para cada litro do meio base, 50ml de emulso de gema de ovo a 50% e 3ml de uma soluo
aquosa de telurito de potssio a 3,5% esterilizada por filtrao.
Homogeneizar bem e distribuir em placas.
Obs: Preparao de gema de ovo a 50%:
Escolher ovos com cascas perfeitas e lavar com sabo e gua morna.
Secar.
Imergir em soluo aquosa de cloreto de mercrio a 1% durante 10 minutos, aproximadamente.
Secar com toalha estril.
Quebrar a casca assepticamente, separar a gema da clara e colocar em copo graduado estril.
Adicionar, a gema, o mesmo volume de soluo salina estril a 0,85% e misturar bem.
c) Caldo Crebro-Corao

Peptona 10,0g
Fosfato dissdico (Na2HPO.) 2,5g
pH final: 7,4 0,2
d) gar azul de toluidina - DNA

Acido desoxiribonucleico (DNA) 0,3g
Cloreto de clcio (CaCl) 0,00011g
Azul de toluidina O(Soluo aquosa a
9,2ml
1%)*
Tris (hidroximetil) aminometano (C4H11NO3) 6,1g
gar 10,0g
Dissolver tris (hidroximetil) aminometano em 1 litro de gua destilada/deionizada e ajustar o pH para 9,0.
Adicionar os demais componentes (exceto azul de toluidina) e aquecer at dissoluo completa.
Finalmente, adicionar azul de toluidina.
No necessrio esterilizar.
Manter o p protegido da luz e umidade. Evitar contato com a pele, mucosas e ingesto.
e) Meio para Fermentao Aerbica da Maltose.

gar 15,0g
Antes do uso adicionar a 100ml do gar, 20ml da soluo maltose a 10%, esterilizada por filtrao.
pH final: 6,8 0,1
15 - CONTAGEM DE Clostridium perfringens
O C. perfrinqens um bastonete reto, gram positivo, formador de esporos ovais, subterminais.
A temperatura tima de crescimento de 45C, crescendo no intervalo de 20 a 50C.
Pode ser encontrado no solo, sedimentos marinhos, fezes e ferimentos.
Sua presena no rara em carnes cruas, aves, sopas desidratadas, vegetais crs, etc.
No alimento pode ser encontrado na forma esporulada e/ou vegetativa.
A forma esporulada resistente ao frio e a temperaturas elevadas.
Esta forma no considerada como agente causal de doena por alimentos, entretanto, esporos que
sobrevivem coco germinam e se multiplicam rapidamente em alimentos cozidos que so
inadequadamente refrigerados.
A forma vegetativa destruda por temperaturas baixas e altas, sendo porm a forma que causa
toxiinfeco alimentar quando em nmeros elevados (acima de 105/g).
O significado e interpretao da presena de C. perfringens depende da forma e nmero encontrados, bem

como da possibilidade de multiplicao deste microrganismo no produto sob anlise.
Cabe assinalar que este microrganismo no altera o produto de forma a ser perceptvel pelos caracteres
organolpticos nas quantidades capazes de provocar toxiinfeco alimentar.
gar Sulfito de polimixina Sulfadiazina (SPS)
gar Sahid Ferguson Perfringens (SFP)
gar crebro-corao
gar motilidade - nitrato tamponado
Meio de leite com ferro
Meio lactose - gelatina
15.2 - REAGENTES
Alfa-naftilamina soluo aquosa 0,5% em cido actico 5N
Acido sulfanllico soluo aquosa 0,8% em cido actico 5N
Acido actico 5N - adicionar 28,75 ml de cido actico glacial a 71,25ml
de gua destilada. Evitar inalao, ingesto e contato dos reagentes com a pele e mucosas.
15.3 - TCNICA
A partir das diluies escolhidas, semear alquotas de 0,1ml na superfcie de placas com gar SFP ou em
profundidade em gar SPS.
Com auxlio de basto tipo "hockey", espalhar o inculo.
Incubar em anaerobiose a 35C por 24-48 horas.
Selecionar placas que contenham entre 10-150 colnias tpicas negras.
Repicar 3-5 colnias tpicas em tubos com gar crebro-corao, inclinado.
Incubar em anaerobiose a 35C por 24 horas, Corar pelo mtodo de Gram verificando a presena de
bastonetes grandes Gram positivos, com extremidades arredondadas.
A partir destas, realizar as provas:
15.3.1 - FERMENTAO TEMPESTUOSA (STORM-TEST)
A partir das culturas puras, semear meio de leite com ferro (adicionar cerca de 2ml de vaspar estril),
incubar a 46C em banho-maria, no mximo por 5 horas.
Verificar coagulao do leite com fermentao "tempestuosa", caracterstica do C. perfringens.
15.3.2 - PROVA DE MOTILIDADE

A partir das culturas puras semear com agulha, tubos com gar motilidadenitrato.
Incubar em anaerobiose.
O C.perfrinqens imvel e reduz o nitrato a nitrito.
15.3.3 - PROVA DE REDUO DO NITRATO
Aps a leitura da motilidade acrescentar 0,5 - 1ml da soluo de alfanaftilamina e 0,5 a 1ml de cido
sulfanlico ao gar.
O aparecimento da cor vermelha indicar reduo de nitrato a nitrito.
Para confirmao do resultado negativo, acrescentar algumas miligramas de p de zinco.
O aparecimento de cor rosa indicar a no reduo do nitrato.
O C. perfringens reduz o nitrato a nitrito.
15.3.4 - LACT05E GELATINA
Quando utilizado aps 8 horas da preparao, regenerar o meio para eliminar o oxignio do mesmo.
A partir das culturas puras semear o meio de lactose-gelatina com agulha, inoculando vrios pontos do
mesmo.
Incubar a 35C por 24 a 48 horas, em anaerobiose.
Aps incubao manter os tubos em geladeira por 1 hora.
Observar a fermentao da lactose pela viragem do indicador e a liquefao da gelatina.
O C. perfringens fermenta a lactose e liquefaz a gelatina.
Para calcular o n de Clostridium perfringens por grama ou ml da amostra, utilizar a frmula:
R=Cxcxd
________________
r
R = resultado
C = colnias contadas
c = colnias confirmadas
r = colnias repicadas c
d = diluio utilizada
a) SFP gar base

Triptose 15,0g
Peptona de soja 5,0g
Citrato de ferro e Amnia 1,0g
Bissulfito de sdio (Na2S205) 1,0g
gar 20,0g
pH final: 7,6 0,2
Aquecer at a dissoluo completa do meio.
Distribuir em frascos e esterilizar a 121C por 15 minutos.
Adicionar 100ml de emulso de gema de ovo a 50% a 900ml do meio base fundido e resfriado a 50C.
Adicionar 30.000 UI de polimixina B e 25.000 mcg de Kanamicina.
Homogeneizar e utilizar.
Aps solidificao, acrescentar uma segunda camada do meio base adicionado apenas de polimixina B e
de Kanamicina (sem gema de ovo).
Obs: a Kanamicina pode ser substituda por Neomicina ou Estreptomicina.
b) gar Motilidade - Nitrato Tamponado

Peptona 5,0g
Nitrato de potssio (KNO3) 1,0g
Fosfato dissdico (Na2HPO4) 2,5g
gar 3,0g
Galactose (C6H1206) 5,0g
Glicerina (C3H8O3) 5,0ml
Deixar em repouso por 15 minutos.
Ferver at dissoluo completa e distribuir em tubos de ensaio, autoclavar a 121C por l5 minutos.
Solidificar o meio em posio vertical.
pH final: 7,0 0,2
c) Meio de Leite com Ferro
Leite integral 1000,0ml

Sulfato ferroso Heptahidratado 1,0g
gua destilada 50,0ml
Dissolver o sulfato ferroso heptahidratado em 50ml de gua destilada e adicionar lentamente ao leite..
Autoclavar a 118C durante 12 minutos.

Preparar imediatamente antes do uso.
d) gar Crebro Corao
Infuso de crebro de carneiro 12,5g

Proteose-peptona 10,0g
D (+) glicose (C6H12O6.H2O) 2,0g
gar 15,0g
pH final: 7,4 0,2
e) Meio Lactose Gelatina
Triptose 15,0g
Vermelho de fenol (C19H14O5S) 0,05g
Gelatina 120,0g
Ferver at dissoluo completa, distribuir em tubos e autoclavar a 121C por 10 minutos.
pH final: 7,5 0,2
Obs: Antes de usar, o meio deve ser colocado em banho-maria a 5O-70C por 2 horas para eliminar o
oxignio.
16 - NMP DE ESPOROS DE CLOSTRIDIUM SULFITO REDUTORES
Caldo diferencial para Clostrdios
16.2 - TCNICA
Semear trs sries de 3 tubos, respectivamente com 10ml, 1ml e 0,1ml da amostra em anlise.
Na primeira srie utilizar o caldo com dupla concentrao.
Aquecer em banho-maria 75 a 80C, durante 15 minutos.
Verificar a ausncia de bolhas de ar. Incubar a 35C por 48 horas.
Aps a leitura os tubos negativos devem ser reincubados por at 7 dias.
Observar turvao e escurecimento do meio.

Calcular o NMP com auxlio da tabela do Anexo II.
a) Caldo Diferencial para Clostrdios (DRCM)

Amido 1,0g
D (+) glicose (C6H12O6) 1,0g
Cloreto de L-cisteIna (C3H8ClNO2S.H2O) 0,5g
Acetato de sdio (C2H3O2Na.3H2O) 5,0g
Sulfito de sdio (Na2S03) 0,4g
Citrato frrico 0,7g
Resasurina sdica (C12H6NnaO4) 0,002g
pH final: 7,1 0,1
17 - CONTAGEM DE Bacillus cereus
O Bacillus cereus um bastonete, gram-positivo, esporulado, aerbio e anaerbio facultativo, com

temperatura tima de crescimento entre 28 a 35C.
comum no solo, vegetais, alimentos crs e processados.
Alimentos com contagens superiores a 106 UFC/g podem produzir intoxicao alimentar.
Normalmente os alimentos implicados em intoxicaes foram submetidos a um tratamento pelo calor

porm no foram esfriados com rapidez, nem conservados em temperaturas de refrigerao, permitindo
deste modo que os poucos esporos que sobreviveram ao tratamento trmico, germinassem e
posteriormente multiplicassem produzindo enterotoxinas.
gua peptonada
gar nutritivo
gar polimixina gema de ovo vermelho de fenol
gar B.cereus base
gar sangue de carneiro
gar motilidade nitrato
gar tirosina
17.2 - REAGENTES
Alfa-naftilamina soluo aquosa 0,5% em cido actico 5N.
cido sulfan!lico soluo aquosa 0,8% em cido actico 5N.
cido actico 5N - adicionar 28,75ml de cido actico glacial a 71,25ml de gua destilada.
Evitar inalao, ingesto e contato com a pele e mucosas.
Polimixina B - soluo contendo 5.000 UI/ml.
Emulso de gema de ovo a 50%.
Sangue de carneiro desfribinado.
17.3 - TCNICA
A partir das diluies escolhidas, semear 0,1ml de cada diluio na superfcie de placas de gar
polimixina gema de ovo vermelho de fenol e/ou em superfcie de gar B.cereus base.
Com auxlio de uma ala de Drigalsky ou basto tipo "hockey", espalhar cuidadosamente o inculo em
toda a superfcie do gar, at completa absoro.
Incubar as placas invertidas a 30C, por 24 a 48 horas.
Selecionar placas que contenham entre 10-150 colnias.
Contar as colnias rodeadas por um halo de precipitao opaco, sobre um fundo rseo, no gar polimixina
gema de ovo vermelho de fenol, e azuis turquesa de aspecto recortado, com cerca de 5mm de dimetro e
rodeadas por halo de precipitao da lecitina hidrolizada no gar B.cereus base.
Selecionar 3-5 colnias tpicas e seme-las em tubos com gar nutritivo inclinado.
De cada tubo, fazer esfregao e corar pelo mtodo de Gram, para verificar a presena de bastonetes
curtos, Gram positivos, com extremidades quadradas, em cadeias curtas ou longas emaranhadas.
Os esporos so centrais ou subterminais.
Das culturas puras em gar inclinado, realizar as seguintes provas:
17.3.1 - BETA-HEMLISE EM GAR SANGUE DE CARNEIRO.
A partir de cultivos puros em gar nutritivo inclinado, semear por estria em placas de gar sangue de
carneiro.
Incubar,a 30C, por 18 a 24 horas.
Observar a produo de Beta-hemlise caracterstica do B. cereus.
17.3.2 - REDUO DE NITRATO

A partir de cultivos puros em gar nutritivo inclinado, semear tubos com gar motilidade nitrato.
Incubar a 30C, em aerobiose por 24 horas.
Observar item 15.3.3.
O B. cereus reduz o nitrato a nitrito e apresenta motilidade positiva em 50 a 90% dos casos.
17.3.3 - DECOMPOSIO DA TIROSINA
A partir de cultivos puros, inocular em estria, a superfcie de gar tirosina inclinado.
Incubar a 35C por 48 horas. Aps incubao observar a zona clara prxima ao crescimento produzida
pela decomposio da tirosina.
Nos casos em que houver dvida reincubar at 7 dias a 35C. O B. cereus decompe a tirosina.
17.3.4 - TESTE PARA VERIFICAO DOS CORPOS DE INCLUSO CRISTALINA
Repicar a cultura suspeita em gar nutritivo inclinado.
Incubar a 30C, 24 horas e posteriormente deixar em temperatura ambiente por 2-3 dias.
Preparar esfregao, secar e fixar ligeiramente ao fogo.
Mergulhar em lcool metlico, deixando em contato por 30 segundos.
Secar.
Corar com soluo de fucsina bsica a 0,5% quente, isto , colocar lmina com o corante sobre a chama
do bico de Bunsen at o aparecimento de vapor, repetir a operao 1-2 minutos depois esperar 30
segundos e lavar com gua.
Secar e observar ao microscpio em objetiva de imerso.
Alternativamente, aps fixao do esfregao pelo calor, pode-se corar por 3 minutos com o seguinte
corante:
Azul coomasie 0,25g

Metanol (CH3OH) 50,0ml
cido actico glacial (C2H2O2) 7,0ml
Aps, escorrer e lavar com gua corrente.
A presena de cristais tetragonais de toxina so abundantes em culturas velhas (3-4 dias) de B.

thuringiensis mas so liberados somente aps a lise do esporngio.
Verifica-se ento a presena dos cristais e esporos livres.
O B. cereus no produz corpos de incluso cristalina.
Bacillus megaterium cereus thuringiensis mycoides anthracis

Colorao de Gram + +a + + +
Catalase + + + + +
Motilidade b -c -
Reduo de Nitrato -d + + +
Hemlise em sangue
- + + + -d
de carneiro
Decomposio da
+ + -d
Tirosina
Corpos de Incluso
- - + - -
Cristalina
a: 90 a 100% so positivos
b: 50 a 90% so positivos
c: 90 a 100% so negativos
d: a maioria negativa
Peptona 1,0g
pH final 7,0 0,2
b) gar Polimixina Gema de Ovo Vermelho de Fenol

Peptona 10,0g
D-manitol .(C6H14O6) 10,0g
gar 15,0g
Por tratar-se de meio desidratado, observar rigorosamente as recomendaes contidas na embalagem.
No momento da utilizao, adicionar ao gar fundido e resfriado a 50C, em volumes de 90ml:
a) 10ml de emulso de gema de ovo a 50%
b) 1ml de sulfato de polimixina B a 0,1% esterilizada por filtrao.
pH final: 7,1 0,1
c) gar B.Cereus Base
Peptona 1,0g,
Manitol (C6H14O6) 10,0g
Cloreto de Sdio (NaCl) 2,0g,
Sulfato de magnsio (MnSO4H20) 0,1g
Azul de bromotimol 0,12g
Piruvato de sdio 10,0g
gar 14,0g

manual.
No momento do uso adicionar ao gar fundido e resfriado a 50C, em volume de 90ml:
a) 2,5ml de emulso de gema de ovo a 50%
b) 1ml de soluo de polimixina B 5.000 UI/ml
pH final: 7,2 0,2
d) gar Nutritivo

Extrado de carne 1,0g
Peptona 5,0g
gar 15,0g
pH final: 7,0 0,2
Aps a esterilizao colocar os tubos em posio inclinada, at solidificao do gar.
e) gar Sangue de Carneiro
Adicionar 5% de sangue de carneiro desfibrinado ao gar casoy ou gar crebrocorao fundido e

mantido a 48-50C.
Homogeneizar e distribuir 12ml em cada placa de petri. Guardar sob refrigerao, acondicionados em
sacos plsticos at o momento do uso.
f) Caldo Nitrato

Nitrato de potssio (KN03) 1,5g
Por tratar-se de meio desidratado, observar rigorosamente as recomendaes contidas na embalagem e

manual.
pH final: 7,2 0,1
g) gar Tirosina
1) Base

Peptona 1,0g
gar 15,0g
Ferver at dissoluo completa e distribuir em volumes de 100 ou 50ml, em frascos adequados.
pH final: 7,0 0,2
2) Soluo de tirosina
L-Tirosina (C9h11N03) 0,5g

Dissolver a tirosina e esterilizar a 121'C por 15 minutos.
3) Preparao
A 100ml do meio base, fundido e resfriado a 48C, adicionar 10ml de soluo aquosa de tirosina a 5% e
misturar bem.
Distribuir 3,5ml por tubo de ensaio estril, agitando freqentemente.
Inclinar os tubos e resfriar rapidamente para evitar a separao da tirosina.
18 - NMP DE streptococcus
DO GRUPO D
Os streptococcus do grupo D so tambm denominados de estreptococos fecais e enterococos.
Pertencem a este grupo os S. faecalis, S. faecium e suas variedades.
A incluso do S. bovis, S. equinus e S. avium, se justifica por apresentarem antgenos de Estreptococos do

grupo D.
O habitat original dos enterococos o intestino. dos animais.
Entretanto, membros deste grupo podem se desenvolver no ambiente, notadamente nos vegetais em
crescimento.
Desta forma, os animais no podem ser considerados como hospedeiros especficos absolutos.
O grupo apresenta resistncia considervel: so cloreto de sdio tolerantes (6,5%), crescem a 45C,
suportam refrigerao e congelamento.
O S. faecium termo-resistente, sendo uma das causas de alterao em produtos enlatados
sub-processados termicamente.
Alm destes aspectos, os Streptococcus do grupo D podem representar um risco a sade em pessoas
debilitadas ou com sade comprometida.
Por no ser comum, este risco considerado marginal.
A presena deste grupo de bactrias nos alimentos no facilmente interpretada.
Apesar da semelhana quanto a fonte inicial do grupo com a E. coli (intestino), sua permanncia e at
multiplicao no ambiente e nos animais de sangue frio, incluindo os insetos, o assemelha tambm com
os coliformes de origem no fecal.
18.1 - MEIOS DE CULTURA
gua peptonada
Caldo azida glicose
Caldo de Etil-violeta azida
gar triptose
Caldo crebro-corao
Caldo crebro-corao 6,5% de sal
18.2 - REAGENTES
Prpura de Bromocresol soluo alcolica a 1,6%: dissolver 1,6g em 100ml de etanol absoluto p.a.
utilizar 1ml por litro do meio.
Perxido de hidrognio 10 volumes.
Conservar em frasco escuro, sob refrigerao.
18.3 - TCNICA
Semear trs sries de trs tubos de caldo azida glicose, utilizando 10ml, 1ml e 0,1ml ou outras diluies
decimais sucessivas.
A ltima diluio empregada dever ser, suficientemente alta para dar um tubo com resultado negativo.
Homogeneizar e incubar a 35C, por 24-48 horas.
Quando for necessrio semear 10ml da amostra original ou da diluio, utilizar meio preparado com dupla
concentrao.
Realizar a leitura, considerando positivos os tubos que apresentarem turbidez.
Quando for acrescentado prpura de bromocresol ao meio, a resposta positiva ser indicada pela mudana
da cor violeta para amarela. Anotar os tubos positivos de cada srie.
A partir de cada tubo positivo, semear trs gotas em tubos de caldo etil-violeta azida.
Incubar a 35C, por 24 horas;
Considerar como positivos os tubos que apresentarem turbidez e sedimento no fundo.
Dos tubos positivos semear em gar triptose inclinado.
Fazer um esfregao para verificar a presena de cocos Gram positivos.
A partir dos cu1tivos puros, realizar as seguintes provas diferencias:
a) Prova da Catalase:
Retirar, com ala, uma pequena quantidade do cultivo e depositar em uma lmina.
Adicionar gotas de perxido de hidrognio a 10 volumes e observar a formao ou no de borbulhas.
Streptococcus do grupo D so catalase negativa, isto , no formam borbulhas.
b) Crescimento a 45C:
A partir dos cultivos puros, semear tubos com caldo crebro-corao.
Verificar o crescimento.
Streptococcus do grupo D crescem a 45C.
c) Crescimento em 6,5% de Cloreto de Sdio (NaCl):
A partir dos cultivos puros, semear tubos com caldo crebro-corao adicionado de 6,5% de cloreto de
sdio (NaCl). Incubar a 35C por 24 horas.
Ocorrendo turvao do meio, considerar a prova como positiva.
Os Streptococcus do grupo D crescem em 6,5% de cloreto de sdio (NaCl).
Calcular o NMP de streptococcus do grupo D com o auxlio da tabela do Anexo II.
Peptona 1,0g
pH final: 7,0: 0,2
b) Caldo Azida Glicose

Triptose 15,0g
Azida sdica (NaN3) 0,2g
pH final: 7,2 0,2
c) Caldo Etil Violeta Azida (EVA)
Triptose 20,0g
Fosfato dipotssico 3H2O (K2HPO4) 2,7g
Azida sdica (NaN3) 0,2g
Violeta de etila 0,00083g
Por tratar-se de meio desidratado, observar. rigorosamente as recomendaes contidas no rtulo e manual.
pH final: 7,0 0,2
d) gar Triptose
Triptose 20,0g
gar 13,0g
Cloridrato de Tiamina (C12H17ON4SClHCl.H2O) 0,005g
Suspender os ingredientes em 1 litro de gua destilada/deionizada e deixar em repouso por 15 minutos.
Distribuir em tubos e esterilizar a 121C, por 15 minutos.
Deixar solidificar o gar com tubos em posio inclinada.
e) Caldo Crebro-Corao
Infuso slido de crebro de terneiro 12,5g

Infuso slido de corao de boi 5,0g
Peptona 10,0g
Por se tratar de meio desidratado, observar rigorosamente as recomendaes contidas no rtulo e manual.
pH final: 7,4 0,2
f) Caldo Crebro-Corao Sal 6,5%
Adicionar ao caldo crebro-corao normal, 60g de NaCl por litro, antes de autoclavar.
19 - NMP de Vibrio parahaemolyticus
O Vibrio parahaemolyticus habitante saproftico normal da costa martima, e se multiplica nos meses
mais quentes, encontrado nas espcies de pescado
provenientes dessas reas.
Pesquisadores japoneses separaram cepas virulentas e no virulentas do V. parahaemolyticus.
Na maioria das vezes, as cepas Kanagawa negativas no causam gastroenterite humana.
As Kanagawa negativas so freqentemente isoladas em pescados marinhos, enquanto que cepas

Kanagawa positiva so mais freqentemente isoladas a partir de
fezes de pessoas afetadas.
O significado e a interpretao de sua presena nos pescados tem importncia do ponto de vista de sade
pblica, quando associada s caractersticas prprias do
produto e das condies em que processado e mantido.
Soluo salina 3%
Caldo glicose sal-teepol
gar tiosulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS)
gar trplice acar ferro sal 3%
gar nutritivo sal 3%
Caldo peptonado sal 3%, 7% e 11%
gar motilidade sal 3%
Meio de Hugh-Leifson sal 3%
Caldo Arginina descarboxilase sal 3%
Caldo Lisina descarboxilase sal 3%
Caldo vermelho de fenol base (manitol e sacarose)
gar Wagatsuma
19.2 - REAGENTES
Parafina Lquida, estril
Prpura de bromocresol, soluo alcolica a 1,6%
Cristal violeta - soluo alcolica a 1%

Sol. aquosas a 10% de manitol e sacarose esterilizadas por filtrao.
19.3 - TCNICA
Preparar as diluies, usando como diluente soluo salina a 3%.
Tomar trs sries de trs tubos em caldo teepol glicose, sal 3%. Semear pores de 10ml, 1ml e 0,1ml da
diluio 10-1.
Na primeira srie utilizar o caldo com dupla concentrao dos ingredientes. Incubar a 35C por 18-24
horas.
Anotar os tubos com turvao do meio (positivo). Dos tubos positivos repicar em gar tiosulfato citrato
sacarose sais biliares. Incubar as placas invertidas a 35C por 24-48 horas.
Verificar a presena de colnias tpicas, arredondadas de cor azul esverdeadas. selecionar 2-3 colnias e
seme-las em gar motilidade sal 3%, caldo peptonado sal 3%, gar nutritivo sal 3% inclinado e gar TSI
sal 3%.
Incubar todos os tubos a 35C, por 24 horas.
A partir dos cultivos constitudos de organismos mveis, bastonetes retos ou curvos Gram negativos, com
base cida e bisel alcalino no TSI e sem produo de gs
e H2S, efetuar os seguintes testes bioqumicos:
a) Teste de Halofilismo
A partir de cultivo puro em caldo, semear uma ala em tubo com caldo peptonado cloreto de sdio 7% e
11%. incubar a 35C, por 24 horas.
O V. parahaemolyticus cresce em presena do cloreto de sdio a 7% mas no a 11%.
b) Crescimento a 42C
A partir de cultivo puro semear em caldo peptonado cloreto de sdio 3%. Incubar a 42C, por 24 horas. O
V. parahaemolyticus cresce em temperatura de 42C.
c) Teste de Kanagawa
A partir de cultivo puro em caldo, semear vrias alas em placas de gar Wagatsuma, de modo que forme
pontes de semeadura circulares.
Utilizar uma placa para cada cultura. Incubar a 35C por 18-24 horas.
O aparecimento de zonas claras, transparentes ao redor das colnias significa um teste positivo.
O V. parahaemolyticus patognico Kanagawa positivo.
d) Prova de Hugh-Leifson
A partir dos cultivos puros em gar nutritivo cloreto de sdio 3% inclinado semear dois tubos com meio
de Hugh-Leifson cloreto de sdio 3%.
Cobrir o meio de um dos tubos com parafina lquida (1 a 2,5cm de espessura). Incubar ambos os tubos a
35C, por 18-24 horas.
Verificar a viragem da cor do meio e presena de gs. A cor amarela em ambos os tubos significa
fermentao da glicose.
O crescimento somente no tubo sem parafina significa utilizao oxidativa da glicose.
O V.parahaemolyticus fermenta a glicose sem produo de gs.
e) Descarboxilao da Lisina
A partir de cultivo puro em gar nutritivo sal 3% semear tubos de caldo lisina descarboxilase sal 3%.
Incubar a 35C por at 4 dias. Semear tambm um tubo do meio base para controle..
O meio torna-se de cor amarela pela produo de cido a partir da fermentao da glicose e, ocorrendo
descarboxilao o meio retorna sua cor prpura original pela produo de aminas primrias e dixido de
carbono (CO2).
O V. parahaemolyticus LDC positiva.
f) Descarboxilao da Arginina
Proceder como no item acima, utilizando o caldo arginina descarboxilase. O V.
parahaemolyticus e ADC negativa.
g) Fermentao de Carbohidratos
A partir de cultivo puro em gar nutritivo sal 3%, semear tubos de caldo manitol sal 3% e caldo sacarose
sal 3%. Incubar a 35C por 24 horas.
Verificar mudana da cor do meio.
O V. parahaemolyticus fermenta o manitol mas no fermenta a sacarose.
Calcular o NMP de V. parahaemolyticus com o auxIlio da tabela do Anexo II.
a) Caldo Glicose Sal Teepol (GSTB)

Peptona 10,0g
Violeta de metila 0,002g
Teepol 4,0ml
Distribuir volumes de 10ml em tubos e esterilizar a 121C, por l5 minutos.
pH final: 7,4 0,2
b) gar Tiosulfato Citrato Sais Biliares Sacarose (TCBS)

Citrato de sdio C6H5O7Na3.2H20) 10,0g
Tiosulfato de sdio (Na2S2O3 5H2O) 10,0g
Bile desidratada 5,0g
Colato de sdio 3,0g
Citrato frrico 1,0g
Azul de timol (C27H30O5S) 0,04g
Sacarose(C12H22O11) 20,0g
gar 15,0g

manual. No autoclavado.
pH final: 8,6 0,2
c) gar Trplice Acar Ferro (TSI) Sal 3%

Sacarose (C12H22O11) 10,0g
D {+) Glicose (C6H12O6 H20) 1,0g
Citrato de amnia e ferro 0,5g
Tiosulfato de sdio (Na2S2O3) 0,3g
gar 12,0g
Suspender os componentes em 1 litro de gua destilada/deionizada e deixar em repouso por 15 minutos.
Acrescentar 25g de cloreto de sdio.
Distribuir em tubos e autoclavar a 121C, por 15 minutos..
Solidificar o gar com os tubos em posio inclinada, de modo a obter uma coluna de 3cm e sobre ela
uma superfcie inclinada de igual comprimento.
pH final: 7,4 0,1
d) gar Nutritivo Sal 3%

Peptona 5,0g
gar 15,0g
pH final: 7,2 0,1
Aps a esterilizao colocar os tubos em posio inclinada, at solidificar o gar.
e) Caldo Peptonado Sal 3%, 7% e 11%
Dissolver 10g de peptona em 1 litro de gua destilada/deionizada.
Acrescentar cloreto de sdio na quantidade desejada (30 70 ou 110g).
Distribuir em tubos e esterilizar a 121C por 15 minutos.
pH final: 7,2 0,1
f) gar Motilidade Sal 3%

Peptona 5,0g
gar 3,0g
Suspender os componentes em litro de gua destilada/deionizada e deixar em repouso por 15 minutos.
Distribuir 10ml em tubos 16 x 150 e esterilizar a 121C, por 15 minutos.
Solidificar o gar em posio vertical.
pH final: 7,2 0,2
g) Meio De Hugh-Leifson Sal 3%

Fosfato Dipotssico (K2HPO4) 0,2g

gar 2,5g
Aditivo: Glicose (C6H12O6) 10,0g
Suspender os componentes em 1 litro dequa destilada/deionizada.
Distribuir em tubos e esterilizar a 121C por 15 minutos.
pH final: 7,1 0,2
h) Caldo Arginina-Lisina Descarboxllase Sal 3%

Prpura de bromocresol (Sol.alcolica 1,6%) 1,0ml
Ajustar o pH 6,7 0,1 e dividir em trs partes: adicionar 0,5% de L-arginina na primeira e 0,5% de
L-lisina na segunda.
A terceira parte destina-se ao controle.
Distribuir 3ml em tubos (13X100) com tampa de rosca.
pH final: 6,8 0,2
i) Caldo Vermelho de Fenol Base - Sal 3%
Triptona 5,0g
Cloreto de s6dio (NaCl) 5,0g
Aos ingredientes do meio desidratado, acrescentar 25g de cloreto de sdio.
Aps seguir rigorosamente as recomendaes contidas no rtulo ou manual.
Antes de uso acrescentar 10ml de sol. de manitol e de sacarose separadamente, para 100ml do meio.
Distribuir em tubos.
pH final
0,2
j) gar Wagatsuma

Peptona 10,0g
D - Manitol (C6H14O6) 10,0g
Cristal violeta (Sol.alc. 1%)(C25H30ClN3) 1,0ml
gar 15,0g
Suspender os componentes em 1 litro de gua destilada, deixar em repouso por 15 minutos.
Ajustar o pH para 8,0 0,2.
Colocar em vapor fluente por 30 minutos, resfriar a 50C.
Acrescentar 5% de eritrcitos humanos ou de coelho.
Homogeneizar e plaquear.
Para se obter os eritrcitos, centrifugar o sangue, lavar o sedimento por trs vezes com soluo salina
0,85%.
20 - CONTAGEM TOTAL DE ENTEROBACTRIAS
As Enterobactrias so bastonetespequenos Gram negativos, mveis ou no, no formadores de esporos,

aerbios e anaerbios facultativos.
Metabolismo oxidativo e fermentativo. Produzem cido da glicose, so catalase positivos, com exceo
de um sorotipo de Shiqella. Oxidase negativos, reduzem nitrato a nitrito (exceto algumas cepas de
Erwinia).
A utilizao do grupo completo de Enterobacteriaceae como indicador foi sugerida para avaliao da
qualidade microbiolqica de produtos processados termicamente (leite pasteurizado) e gua clorada.
Nesses produtos, todos os membros da familia Enterobacteriaceae, tem um significado equivalente,

devido a expectativa de sua eliminao dos alimentos e da gua pelos tratamentos citados.
Sua presena em nmeros significativos indica falhas no processo e, conseqentemente, risco para o
consumidor.
Embora estas consideraes sejam vlidas tambm para s bactrias do grupo coli -aerogenes, no se
recomenda limitar as provas somente para os membros lactose positivos da famlia Enterobacteriacea pelo
menos por 3 razes:
1) Taxonomicamente, o grupo coli-aerogenes no est bem definido.
2) Uma prova para lactose pode dar resultados falso-negativos, nos casos em que predominam os
microrganismos lactose negativos ou nos casos de presena de lentofermentadores da lactose.
3) A sensibilidade de prova reduzida por estar limitada aos tipos lactose positivos.
gar Cristal Violeta-Vermelho neutro bile glicose sego Mossel (VRBG)
20.2 - TCNICA
Semear aliquotas de 1ml de cada diluio selecionada, em placas de Petri, em duplicata.
Adicionar 15ml de gar Cristal violeta vermelho neutro bile glicose, previamente fundido e mantido a
45C. Homogeneizar e deixar solidificar em superfcie plana.
Cobrir com uma segunda camada do mesmo gar ( 5ml) e deixar solidificar em superficie plana. Incubar
as placas invertidas a 35C por 24-48 horas.
Alternativamente, e quando necessria a recuperao de clulas em "stress", proceder a semeadura em

superfcie de gar tripticase soja.
Deixar em temperatura ambiente por 5-6 horas.
Cobrir com 15ml de gar VRBG fundido e mantido a 45C. Incubar a 35C por 24-48 horas.
Selecionar placas que apresentem entre 10-150 colnias, roxo-avermelhadas, rodeadas por halo de
precipitao da mesma cor.
20.3 - COMPOSIO PREPARO DO MEIO DE CULTURA.
a) gar Cristal Violeta Vermelho Neutro Bile Glicose
Extrato de .levedura 3,0g

Sais biliares 1,5g
Vermelho neutro (C15H17ClN4) 0,03g
gar 15,0G
pH final: 7,3 0,1
Por tratar-se de meio de desidratado observar rigorosamente as recomendaes contidas no rtulo ou

manual.
21 - (Revogado(a) pelo(a) Portaria 8/1995/SDA/MAPA)
21.1 (Revogado(a) pelo(a) Portaria 8/1995/SDA/MAPA)

22 - PESQUISA DE Listeria monocytogenes
A L. monocytogenes um microrganismo Gram positivo, facultativamente anaerbio, capaz de produzir

doena no homem, estando amplamente distribudo no meio ambiente.
um organismos psicrotrfico capaz de multiplicar-se em temperaturas entre 1 a 45C, que pode

sobreviver no leite por mais de um ano, quando estocado a 5C.
Sobrevive em pH entre 4,8 e 13,0 sendo que seu pH timo de 5,5 a 9,6.
Pode sobreviver em solues a 18% de sal por 6 meses, demonstrando tambm tolerncia ao nitrito de
sdio.
No sobrevive ao aquecimento a 60C por 30 minutos nem pasteurizao.
No homem a infeco pode ser marcada por um quadro semelhante ao estado gripal acompanhado de
diarria e febre branda.
Esta fase pode passar despercebida com formao de portadores (5% deles eliminam a L.monocytogene
nas fezes).
A L. monocytogenes invade os macrfagos onde cepas virulentas se multiplicam e, aps a ruptura destas
clulas causam septicemia, que a manifestao mais freqente, acompanhada de febre (adultos).
A mortalidade dentro do grupo de risco de 30%.
As formas de listeriose envolvendo o sistema nervoso central tem como manifestao mais comum a
meningite, sendo que a mortalidade, nestes casos, pode alcanar 70%.
O nmero de clulas necessrias para induzir doena no est bem definido, porm alguns autores
acreditam que, entre 102 e 103 clulas por grama de alimento sejam suficientes para produzir listeriose
em pessoas do grupo de risco (gestantes, imunodeprimidos, faixas etrias extremas, etc.).
O grau de desenvolvimento da L. monocytoqenes em produtos estocados sob refrigerao depende

largamente do tipo de produto e pH do mesmo.
Nos produtos prontos para consumo muito importante a preveno da contaminao ps-processamento,
tendo em vista sua habilidade de crescer sob refrigerao.
Dentro do gnero Listeria, existem duas espcies capazes de produzir doena no homem: L.
monocytoqenes e L. ivanovii, sendo que a incidncia desta ltima
extremamente rara no homem.
Estas duas espcies so hemolticas, o que est diretamente relacionado com sua virulencia.
A presena de L. monocytogenes em produtos processados termicamente, indica tratamento inadequado

ou contaminao ps-processamento.
Caldo de enriquecimento para Listeria (LEB1)
gar triptose com cido nalidxico (ATN)
gar triptose com cido nalidxico e sangue desfibrinado de cobaio (ATNS)
gar Oxford (AO)

gar motilidade-nitrato modificado (Hatano, Schuch)
gar sangue de cobaio desfibrinado
gar tripticase soja-sangue de carneiro
gar crebro-corao
Caldo VM-VP
Caldo vermelho de fenol-base
22.2 - REAGENTES
a) cido nalidxico soluo 2% em 0,1 N hidrxido de sdio (NaOH)
b) 0,1N hidrxido de sdio(NaOH) - dissolver 4g de hidrxido de sdio (NaOH) em gua destilada,

completar para 1 litro
c) Acriflavina - solues aquosas a 1,0% e 0,2% esterilizadas por filtrao
d) perxido de hidrognio 10 volume. Conservar em frasco escuro, sob refrigerao
e) Vermelho de metila soluo alcolica - pesar 0,04 de vermelho de metila e dissolver em 60ml de etanol
absoluto
f) Alfa-naftol - soluo lcolica a 5%
g) Hidrxido de potssio soluo aquosa a 40%
h) cido actico glacial 5N - adicionar 28,75 ml de cido actico glacial a 71,25ml de gua destilada.
i) cido sulfanlico soluo a 0,8% em cido actico 5N - adicionar 1g de cido sulfanlico a 125ml de
cido actico 5N
j) Alfa-naftilamina soluo a 0,5% em cido actico 5N
l) Soluo salina tamponada pH 7,2 com 0,067M de fosfato de potssio monobsico (Dissolver 9,118 g de
fosfato de potssio monobsico em gua destilada).
Adicionar
8,5g de cloreto de sdio (NaCl) e completar o volume para 1 litro.
m) Soro anti-Listeria polivalente "O"
n) Xilose soluo aquosa a 5%, esterilizada por filtrao
o) Manitol soluo aquosa a 10%, esterilizada por filtrao
p) Ramnose soluo aquosa a 5%, esterilizada por filtrao
q) Glicose soluo aquosa a 10% esterilizada por filtrao
r) Metilmanopiranosideo soluo aquosa 5% esterilizada por filtrao Alfa-metil-Dmanosdeo).

s) Sangue desfibrinado de carneiro e cobaio.
Coletar o sangue em frasco com prolas de vidro (estreis), movimentando suavemente at que a fibrina
fique aderida s prolas.
Deixar repousar em temperatura ambiente por 1 a 2 horas.
Separar o sangue desfibrinado e distribuir em frascos estreis.
Guardar sob refrigerao.
22.3 - TCNICA
22.3.1 - ENRIQUECIMENTO SELETIVO
Pesar assepticamente 25 g da amostra em saco plstico resistente (para stomacher) ou copo

homogeneizador estril.
Acrescentar 225ml de LEB adicionado de 1ml de soluo acriflavina a 1,0% por litro de caldo.
Homogeneizar e incubar a 30C por 24 horas.
Transferir 0,2 ml desta cultura para tubo contendo 10ml de LEB adicionado de acriflavina a 0,2 % por
tubo (LEB2). Incubar por 24 horas a 30C, e aps, at 7 dias em temperatura ambiente.
22.3.2 - ISOLAMENTO E SELEO
Utilizando ala de platina de 5mm de dimetro, semear do LEB2 para placas contendo ATN, ATNS e AO
de modo a obter colnias isoladas.
Incubar a 30C, por 24 a 48 horas.
Com auxlio de estereoscpio ou lupa e iluminao angular de 45. Selecionar 3 a 5 colnias de cor
azulada ou azul-acinzentada em ATN e hemolticas em ATNS.
No gar Oxford as colnias tpicas so verde-amareladas rodeadas por zona escura devido a degradao
da esculina.
Repicar em gar triptose com cido nalidxico, para obteno de culturas puras.
Aps incubao, realizar prova de catalase, depositando a cultura pura sobre uma lmina de vidro ou
fundo de placa de Petri, quimicamente limpos e recobrindo-a com algumas gotas de H2O2 a 10 volume.
A presena de catalase se traduz por desprendimento de borbulhas de oxignio (catalase positiva).
Das culturas catalasepositivas, fazer um esfregao para colorao de Gram.
As culturas que apresentam bastonetes curtos ou em forma cocide Gram positivos, devem ser repicados:
a) Com agulha, em gar motilidade-nitrato modificado incubando a 22 a 25C por 2 a 5 dias, para
verificar o crescimento mvel caracterstico em forma de guardachuva.
b) Com ala, em gar sangue desfibrinado de cobaio, incubando a 35C por 24 a 48 horas.
As placas de gar sangue de cobaio devem ser preparadas em gar Columbia ou ATN, utilizando uma
camada base de aproximadamente 12ml do gar sem sangue deixando-a solidificar em superfcie plana, e
aps pipetando 5 do mesmo gar adicionado de 5% de sangue desfibrinado sobre a camada base.
A reao positiva se traduz pelo aparecimento de zona clara transparente (beta-hemlise) ao redor das
colnias.
c) Com agulha, em gar tripticase soja adicionado de 5% de sangue de carneiro desfibrinado

perpendicular as linhas, previamente semeadas com S. aureus ATCC 25923. Incubar em atmosfera de 2 a
5% de dixido de carbono (CO2) a 35C por 72 horas.
A L. monocytogenes produz zona clara de hemlise total, acentuada prximo linha de crescimento de
S.aureus.
Esta prova chama-se CAMP-test.
d) Com ala, em gar crebro-corao inclinado, incubado a 30C por 24 horas.
22.3.3 - CONFIRMAO E IDENTIFICAO
A partir do gar crebro-corao inclinado, realizar as seguintes provas bioqumicas das culturas beta
hemolticas:
a) VM-VP: Semear tubos de caldo VM-VP, incubar a 35C, por 5 dias.
Aps a incubao pipetar 5 e 1ml para dois tubos estreis.
No primeiro colocar 2 a 3 gotas de vermelho de metila soluo alcolica.
O aparecimento da cor vermelha indica reao VM positiva.
No outro tubo adicionar 0,6ml de soluo alcolica de alfa naftol a 5% e 0,2ml de soluo aquosa de
hidrxido de potssio (KOH) 40% e agitar.
Deixar em repouso por 1 a 2 horas.
O aparecimento da cor vermelho-escuro indica reao VP positiva.
b) REDUO DE NITRATO:
Aps a leitura da motilidade adicionar 2 a 3 gotas de cido sulfanlico e 2 a 3 gotas de alfa-naftilamina

0,5%.
O aparecimento de colorao rosa indica positividade.
Quando no houver desenvolvimento de colorao, adicionar ao meio alguns miligramas de p de zinco.
O aparecimento de colorao rosa indica reao negativa e a no alterao de cor indica positividade.
c) FERMENTAO DE CARBOIDRATOS:
Semear tubos com caldo vermelho de fenolbase adicionado dos acares glicose, xilose, manitol, ramnose
e alfa-metil-Dmanosideo, separadamente (adicionar a 100ml do caldo base estril, 10ml das solues de
acares previamente preparadas e esterilizadas por filtrao (conforme 22.2-n, o, p, q, r). Incubar a 30C,
por 36 horas.
A viragem de cor do indicador vermelho de fenol para amarelo indica a fermentao do acar presente.
A L. monocytogenes um bastonete curto ou de forma cocide, gram positivo, catalase positiva, com
motilidade caractrlstica em meio semi-slido em forma de guarda-chuva, Beta-hemoltico, CAMP-teste
positivo com S. aureus ATCC 25923 , VMVP positivo, no reduz nitrato a nitrito, fermenta a glicose,
ramnose e
metilmanopiranosideo (metil-D-manosideo) e no fermenta a xilose e manitol.
CAMP-Teste Metil Red.

Xilose Ramnose Manitol NO
hemlise S. aureus Manosdeo 3
L.monocytoqenes + + - + + - -
L.ivanovii + - + - - - -
L.innocua - - - V + - -
L.welshimeri - - + V + - -
L.seeligeri + + + - - - -
L.grayi - - - - + + -
L.murrayi - - - V + + +
Berqeys Manual of Sistematic MicrobioloGy VOL. II, 1986.
d) TESTE SOROLGICO - SOROAGLUTINAO RPIDA:
Cultivar o microrganismo em gar triptose ou crebro-corao em tubo inclinado, por 18 a 24 horas a

30C.
Lavar a cultura com 1ml de soluo salina tamponada a pH 7,2.
Misturar, em lmina de vidro, uma gota da suspenso com uma gota de antisoro. Aguardar 1 a 2 minutos.
Simultaneamente, misturar uma gota de suspenso com salina tamponada, para controle. A suspenso de
microrganismo deve aglutinar somente frente ao antisoro homlogo e no frente a soluo salina.
e) PROVA DE INVASIVIDADE (ANTON): Cultivar o microrganismo suspeito em tubo com gar

crebro-corao inclinado. Incubar a 30C por 18 a 24 horas.
Lavar o cultivo com 1ml de soluo salina a 0,85% estril.
Instilar na conjuntiva de cobaio. Observar por at 96 horas.
A prova deve ser acompanhada de controles positivo e negativo.
A prova positiva se caracteriza pela produo de queratoconjuntivite em at 96 horas.
a) Caldo De Enriquecimento Para Listeria (LEB1)

Triptona 5,0g
Extrato de carne purificado 5,0g
Fosfato de potssio (KH2PO4) 1,3g
Acido nalidxico (sol. 2% em 0,1N NaOH) 1,0ml
Dissolver os componentes em 1 litro de gua destilada/deionizada e esterilizar a 121C, por 15 minutos.
Esfriar logo aps a esterilizao e manter sob refrigerao.
Imediatamente antes do uso adicionar 1ml de soluo aquosa a 1,0% de acriflavina (esterilizada por
filtrao) por litro de caldo.
pH final: 7,4 0,2
b) Caldo De Enriquecimento Para Listeria (LEB2)
Este caldo tem a mesma composio do LEB1 exceto na concentrao final de acriflavina.
Preparar conforme indicado acima distribuindo em tubos (10ml por tubo);
Imediatamente antes do uso adicionar a cada tubo 0,1ml de acriflavina, soluo aquosa a 0,2%.
c) gar Triptose com cido Nalidxico (ATN)
Bacto triptose 20,0g

Dextrose (C6H12O6.H2O) 1,0g
Acido nalidixico (sol. 2% em 0,1 N NaOH) 1,0ml
gar 15,0g
Aquecer at dissoluo completa. Autoclavar a 121C por 15 minutos.
pH final: 7,4 0,2
d) gar Triptose com cido Nalidixico e Sangue Desfibrinado de Cobaia
Preparar conforme o indicado para ATN.
Fundir o gar pronto e esterilizado e manter em banho-maria at que alcance temperatura de 50C.
Preparar uma camada base colocando cerca de 12ml de gar fundido em placas de 100mm de dimetro.
Sobre esta distribuir 5ml do mesmo gar adicionado de 5% de sangue desfibrinado de cobaio.
Estocar em sacos plsticos sob refrigerao.
e) gar Motilidade- Nitrato Modificado (HATANO, SCHUCH)
Nitrato de potssio (KNO3) 1,5g

Peptona 5,0g
gar 3,0g

Aquecer at dissoluao completa.
Distribuir 10ml por tubo e autoclavar a 121C por 15 minutos.
Solidificar em posiao vertical.
pH final 7,0 0,2
f) gar Sangue de Cabaio Desfibrinado
gar Columbia-base 44,0g


manual. Fundir o gar e manter em banho-maria a 50C.
Preparar uma camada base colocando 12ml do gar fundido em placas com 100mm de dimetro. Deixar
solidificar em superfcie plana. Sobre esta distribuir 5ml do mesmo gar adicionado de 5% de sangue de
cobaio desfibrinado. Estocar em sacos plsticos, sob refrigerao.
OBS: Este meio pode ser preparado com gar ATN ao invs de gar Columbia.
g) gar Tripticase-Soja-Sangue de Carneiro

Peptona de farinha de soja 5,0g
gar 15,0g
pH final: 7,3 0,1

manual. Fundir o gar e resfri-lo at 50C, em banho-maria.
Adicionar 5% de sangue de carneiro desfibrinado.
Distribuir 12ml em placas de Petri.
Guardar em sacos plsticos sob refrigerao.
h) gar Crebro-Corao

Infuso de corao 5,0g
Proteose-peptona 10,0g
D (+) Glicose (C6H12O6) .H20) 2,0g
gar 15,0g
pH final: 7,4 0,2

manual.
i) Caldo VM-VP

Fosfato Dipotssio (K2HPO4) 5,0g
pH final: 7,5 0,1

manual.
j) Caldo Vermelho de Fenol-Base
Triptona 5,0g
Vermelho de fenol (C19H14O5S) 0,018
pH final: 7,4 0,2

manual.
l) gar Bile Esculina

Esculina (C15H16O9.1,5H2O) 0,1g
Citrato frrico 0,5g
gar 14,5g
pH final: 6,6 0,2

manual.
m) gar Columbia-CNA
Pantona 10,0g
Bitona 10,0g
Corao de boi digerido 3,0g
Amido de milho 1,0g
gar 15,0g
pH final: 7,3 0,2

manual.
23- Pesquisa de Vibrio cholerae
A clera uma infeco intestinal transmitida por gua, pescado cru ou impropriamente cozido, frutas e
vegetais contaminados pelo V.cholerae, sendo a transmisso direta, pessoa a pessoa, muito rara.
A doena se caracteriza por um perodo de incubao de um a quatro dias, nuseas, vmitos, clicas
abdominais e diarria profusa (com aspecto de gua de arroz).
A perda de grande volume de gua leva desidratao, que acompanhada de hipotenso arterial,
hipotermia, anria e colapso circulatrio.
O V. cholerae um bastonete Gram negativo, curto, ligeiramente encurvado, aerbico, mvel (um flagelo
polar), que cresce em temperaturas de 25C a 42C em
pH 6;9 a 9,6, possuindo baixa resistncia a cidos.
Nas culturas artificiais pode perder a forma encurvada tipica.
Produz catalase, lecitinase, oxidase, indol, lisina e ornitina descaboxilase, reduz nitrato a nitrito, fermenta
a sacarose, a manose, sem formao de gs; no fermenta a lactose, a ramnose e dulcitol; liquefaz
lentamente a gelatina, no produz cido sulfdrico (H2S), resistente ao telurito de potssio formando
colnias negras nos meios que o contm, hidrolisa ativamente o amido em meios alcalinos.
O biotipo clssico, ao contrrio do biotipo El Tor, no hemoltico, porm ambos podem ser toxignicos;
possui antgenos O especficos, termoestveis (100C/3 horas) e antigenos flagelares termolbeis.
Tanto o biotipo clssico como El Tor se incluem no grupo 0-1 de Gardner & Ventrakaman, que
compreende 3 antigenos major (a,b,c) combinados com 3 sorotipos: OGAWA (AB), INABA (AC) e
HIKOJIMA (ABC).
O biotipo clssico sensivel ao fago IV de Mukerjee.
Quando injetado intraperitonealmente em cobaio ou camundongo, o V. cholerae produz morte por

toxemia em 20 a 40 horas.
A clera ocorre somente em humanos, mas possivel reproduzi-la em coelhos por administrao oral
aps prvia neutralizao da acidez gstrica.
No coelho se observa diarria com perda considervel de peso e morte por colapso circulatrio em 10 a
48 horas.
gua peptonada alcalina
gar TCBS
gar estoque
gr sal-triptoria (T1Nl)
gar TSI ou Kliegler
gar lisina descarboxilase (LIA)
gua peptonada alcalina a 0%, 3% e 7%
Meio de Hugh-Leifson
Caldo para descarboxilao de amino-cidos base
Caldo para fermentao de carboidratos-base
23.2 - REAGENTES
a) Soluo desoxicolato de sdio a 0,5% soluo aquosa
b) Tetrametil-para-fenileno diamina dihidrocloreto, soluo aquosa a 1% ou oxalato de

para-amino-dimetil anilina, soluo aquosa a 1%.
c) leo mineral estril (calor seco a 180C/2 horas)
d) Manose, soluo aquosa a 10% esterilizada por filtrao
e) D-manitol, soluo aquosa a 10% esterilizada por filtrao
f) L-inositol, soluo aquosa a 10% esterilizada por filtrao
g) Arabinose, soluo aquosa a 10% esterilizada por filtrao
h) Soluo salina formalizada de iodeto de mercrio
i) L-lisina
j) L-arginina
l) L-ornitina
23.3 - TtCNICA
Pesar assepticamente 25g .da amostra e homogeneizar com 225ml de gua peptonada alcalina.
Incubar a 35-37C por cerca de 6 horas.
Repicar para placas secas de gar TCBS.
Incubar a 35-37C por 24 horas.
Paralelamente repicar com ala de platina, para 2 tubos com 10ml de gua peptonada alcalina.
Incubar a 35-37C e 42C por 18 horas.
Dos tubos de gua peptonada alcalina, repicar para gar TCBS e incubar a 35-37C.
Selecionar 3 ou mais colnias tpicas de cada meio utilizado e repic-las para tubo com gar sal triptona
inclinado.
As caracterlsticas das colnias tpicas so as seguintes no gar TCBS:
Coinias de 2 a 3mm, lisas, amarelas e ligeiramente elevadas no centro com bordas translcidas.
A partir do gar sal triptona inclinado realizar as seguintes provas:
23.3.1 - STRING-TESTE (Prova de filamentosidade):
Emulsionar os cultivos puros suspeitos em uma gota grande de soluo aquosa de desoxicolato de sdio a
0,5%.
Em cerca de um minuto se forma uma massa mucide filamentosa.
Todos os biotipos de V.cholerae so string teste positivos.
23.3.2 - PROVA DE OXIDASE
Colocar um disco de papel filtro dentro de uma placa de petri estril e adicionar 3 gotas de soluao de
oxalato de para-amino-dimetilanilina a 1% ou de uma soluo de tetrametil-para-fenilenodiamina.
Este reativo menos estvel que o anterior.
A soluo deve ser descartada quando desenvolver colorao azul.
O oxalato de para-amino-dimetilanilina deve ser conservado sob congelamento e pode ser utilizado at 30
dias aps a preparao.
Usando ala de platina ou basto de vidro extender o cultivo suspeito sobre o papel impregnado.
O aparecimento de uma cor azul intenso indicativo de positividade quando for usado reativo
tetrametil-para-fenilenodiamina e cor prpura escura quando o reativo for o oxalato de
para-amino-dimetilanilina.
A partir das culturas que derem resultados positivos em ambas as provas realizar repiques em gar
nutritivo inclinado e nos seguintes meios:
23.3.3 - TSI OU KLIEGLER
Incubar por 18 a 24 horas a 35-37C.
O V.cholerae produz cido na base e bisel do gar TSI e apenas na base quando em gar Kliegler, ambos
sem produo de cido sulfdrico (H2S).
23.3.4 - LIA
O V.cholerae descarboxila a lisina tornando o meio mais alcalino (violeta).
23.3.5 - GUA PEPTONADA ALCALINA SEM CLORETO DE SDIO COM 3% E 7% DE

CLORETO DE SDIO
O V.cholerae cresce em ausncia total e a 3% de cloreto de sdio.

No cresce a 7% de cloreto de sdio (NaCl).
Das culturas que se comportarem como o V. cholerae nas provas acima, realizar as seguintes provas
bioqumicas.
23.3.6 - OXIFERMENTAO DA GLICOSE
Incubar 2 tubos com meio de Hugh-Leifson com as culturas suspeitas.
Cobrir um dos tubos com leo mineral estril.
A formao de cido em ambos os tubos indicador de fermentaao.
A produo de cido na parte superior do tubo sem leo indicador de oxidao.
O V. cholerae produz cido em ambos os tubos.
23.3.7 - FERMENTAO DE CARBOIDRATOS
Inocular as culturas suspeitas em caldo vermelho de fenol para fermentaao de carboidratos adicionado
separadamente dos diferentes acares (arabinose, manitol,
sacarose, manose, L-inositol).
A viragem da cor do indicador para amarelo indica formao de cido pela fermentao do acar
presente.
O V.cholerae apresenta as seguintes respostas: manose sacarose e manitol positivos; arabinose e

L-inositol, negativos.
23.3.8 - DESCARBOXILAO DE AMINOCIDOS
Inocular tubos com caldo para descarboxilao de arginina e de ornitina.
Adicionar uma camada de 1 a 2 ml de leo mineral estril em ambos os tubos.
Incubar a 35-37C e observar por 4 dias.
Os tubos positivos mostram colorao violeta (alcalinizaao pela liberao de aminas e dixido de
carbono (C02) e os negativos, cor amarela (acidificao pela fermentao da glicose presente no meio).
Um tubo controle do meio sem aminocido deve tambm ser semeado e incubado juntamente com as
amostras suspeitas.
Este tubo deve permanecer amarelo at o final dos 4 dias.
O V. cholerae descarboxila a ornitina e nao a arginina.
23.3.9 - TESTE SOROLGICO
Lavar as culturas de 24 horas em gar nutritivo com soluo salina formalizada de iodeto de mercrio.
Pingar duas gotas separadas sobre uma das gotas e misturar.

A outra gota servir de controle. Aps um minuto observar a formao de grumos (aglutinao).
Caracterizao do Vibrio Cholerae

Gram Negativo
Aglutinao Antisoro Poli O Positiva
Oxidase Positiva
cido Sulfdrico(H2s) Negativo
Fermentao da glicose Positiva
D-Manitol Positiva
L-Inositol Negativa
Sacarose Positiva
Manose Positiva
Arabinose Negativa
Descarboxilao da Lisina Positiva
Descarboxilao da Ornitina Positiva
Hidrlise da Arginina Negativa
String Teste Positivo
Crescimento em ausncia de sal Positivo
Formao de gs da glicose Negativa
As culturas que se comportarem como V. cholerae devem ser remetidas para o Instituto Oswaldo Cruz,
mantidas em gar estoque.
a) gua Peptonada Alcalina
Peptona 10,0g
Dissolver os ingredientes em um litro de gua destilada/deionizada e ajustar o pH a 8,8 a 9,0 com

hidrxico de sdio (NaOH).
Distribuir em frascos erlenmeyer (225ml) e em tubos (10ml). Esterilizar a 121C por 15 minutos.
b) Soluo Salina Formalizada de Iodeto de Mercrio
Soluo estoque:
Iodeto de potssio (KI) 4,0q

Iodeto de ,mercrio (HgI) 1,0g
Soluo de trabalho:
Soluo estoque 10,0

Soluo salina 0,85% 90,0ml
Formalina 0,05ml
c) gar Sal Triptona (T1N1)
Triptona 10,0g
gr 20,0g
Dissolver os componentes na gua e aquecer at a dissoluo completa.
Esterilizar a 121C por 15 minutos.
pH final: 7,2 0,2
d) gar Tiosulfato Citrato Sais Biliares Sacarose (TCBS)

Extrato de Levedura 5,0g
Citrato de sdio (C6H5O7Na3.2H2O) 10,0g
Tiosulfato de sdio (Na2S2O3 5H2O) 10,0g
Colato de sdio 3,0g
Citrato frrico 1,0g
Azul de timol (C27H3O5S) 0,04g
Azul de bromotimol(C27H28Br2O5S) 0,04g
gar 15,0g

manual.
No autoclavar.
pH final: 8,6 0,6
e) gar Triplice Acar Ferro (TSI)

Lactose (C12H22O11.H2O) 10,0g
D(+) glicose (C6H12O6H2O) 1,0g
Citrato de amnia e ferro 0,5g
gar 12,0g

Solidificar o gar com os tubos em posio inclinada, de modo a obter uma coluna de 3cm e sobre ela
uma superfcie inclinada de igual comprimento.
pH final: 7,4 0,1
f) gar Lisina Ferro (LIA)
Peptona 5,0g
L-Lisina (C6H15ClN2O2) 10,0g
Citrato frrico amoniacal 0,5g
gar 15,0g
Por tratar-se de meio desidratado, seguir rigorosamente as recomendaes contidas no rtulo ou manual.
Aps autoclavao, deixar os tubos solidificarem em posio inclinada de maneira a formar um bisel de
aproximadamente 2 cm.
pH final: 6,7 0,1
g) gua Peptonada Alcalina 0%, 3%, 7% Cloreto de Sdio (NaCl)
a) Zero % de cloreto de sdio (NaCl)
Peptona 10,0g
b) 3% de Cloreto de Sdio (NaCl) 30,0g

c) 7% de cloreto de sdio (NaCl)
Peptona 10,0g
Dissolver os ingredientes e ajustar o pH patra 8,8 a 9,0 com NaOH e autoclavar 121C por 15 minutos.
h) Meio de Hugh-Leifson

Fosfato Dipotssico (K2HPO4) 0,2g
gar 2,5g
Aditivo: Carbohidrato 10,0g
Por tratar-se de meio desidratado, observar rigorosamente as recomendaes contidas no rtulo do
manual.
pH final: 6,8 0,2
i) Caldo para Descarboxilaao de Amino-cidos-Base

Dextrose (C6H12O6.H2O) 1,0g
Prpura de bromocresol (C21H16Br205S) 0,02g
Aminocido 5,0g

manual.
pH final: 6,8 0,2
j) Caldo para Fermentao de Carbohidratos-Base I


manual.
pH final: 7,4 0,2
24 - PESQUISA DE INIBIDORES DE CRESCIMENTO BACTERIANO NO LEITE.
A pesquisa de inibidores de Crescimento Bacteriano no leite visa a deteco de resduos de substncias

capazes de impedir ou inibir o crescimento microbiano, sejam elas anti-spticas, antibiticas ou
quimioterpicas.
A presena de resduos de substncias anti-spticas no leite pode ser conseqncia da higienizao de

equipamentos e utenslios ou da adio proposital para encobrir deficiente qualidade higinica do leite e
aumentar o tempo de vida til.
A presena de reslduos de antibiticos e quimioterpicos no leite, provenientes do uso profiltico ou

teraputico de mamites e outras enfermidades ou da adio intencional para prolongar a vida til do leite,
representa risco para a sade do consumidor e para a sade pblica, Resduos de alguns antibiticos
podem ter ao direta sobre o organismo do consumidor.
Deste modo, resduos de cloranfenicol podem induzir anemia aplstica em pessoas suscetlveis enquanto
os resduos de penicilina podem levar manifestao de fenmenos de hipersensibilidade imediata ou
tardia nas pessoas alrgicas e previamente sensibilizadas por este antibitico.
Alm dos possveis efeitos txicos diretos dos resduos de antibiticos e seus metablitos sobre estruturas
ou funes biolgicas (clulas ou ao de enzimas), das manifestaes de reaes alrgicas e induo de
quadros patolgicos como a anemia aplstica fatal, h o risco de induo de resistncia bacteriana e
posterior transferncia de multiresistncia entre microrganismos, especialmente Gram negativos atravs
de plasmdeos.
O leite de reteno e o colostro possuem substncias naturais com ao antimicrobiana e no podem ser
usados para a alimentao humana.
As lactoperoxidases, lactoferrinas, lacteninas, etc., possuem ao inibidora sobre o crescimento

bacteriano.
O aquecimento do leite a 83C, antes da anlise, visa a inativao de enzimas naturais do leite que
possuem ao antimicrobiana, evitando resultados falso-positivos para presena de inibidores de
crescimento bacteriano.
O B.stearothermophilus sensvel a concentraes de penicilina extremamente baixas.
A adio de penicilinase, visa confirmar que a inibio foi devida presena de penicilina pois esta
enzima atua sobre a molcula do referido antibitico rompendo o anel beta-lactmico tornando-a inativa
biologicamente. Alm da penicilina, outros antibiticos sero detectados no gar semeado com
B.stearothermophilus.
O uso paralelo de B. subtilis e B.cereus var mycoides visa a deteco de outros antibiticos aos quais o
B.stearothermophilus pouco ou no sensvel.
gar p/ensaio de estreptomicina com extrato de levedura (gar n 5)
gar para ensaio de antibiticos com baixo pH (gar n 8)
gar glicose triptona prpura de bromocresol
Caldo glicose triptona prpura de bromocresol
24.2 - REAGENTES .
a) penicilinase 10.000.000 UI
24.3 - ORGANISMOS-TESTE
Bacillus subtilis, ATCC 6633
Bacillus cereus, var mycoides ATCC 11778
Baoillus stearothermophilus, var calidolactis
24.4 - B. subtilis - PADRONIZAO DA SUSPENSO DE ESPOROS
24.4.1- Para determinar o nmero de esporos de cada suspenso estoque proceder conforme abaixo:
- Preparar uma srie de diluies decimais (10-2 a 10-1) da suspenso de esporos com soluo salina
0,85% estril.
- Semear, em duplicata, 1ml de cada diluio em gar n 5. Incubar a 29 1C por 18 a 24 horas.
- Selecionar placas com 30-300 colnias fazer a contagem nas duas placas correspondentes, e tirar a
mdia aritmtica.
24.4.2 - Determinar o nmero timo de clulas na camada semeada, conforme o que se segue:
Diluir a suspenso estoque, em soluo salina 0,85% que corresponda a 1x105 esporos por rol. Para
determinar a diluio necessria para obter 1x105 esporos/ml na suspenso usar a seguinte frmula:
Volume x concentrao = Volume x Concentrao desejada Exemplo:
A leitura em 24.4.1 foi de 30 colnias na diluio 108 (1ml).
(30x108) = (x).
(1X105) x = (1) (30x108) = 30 X 103

__________
(1) (1X105)
Neste exemplo, a suspenso e.stoque dever ser diluda a 1:300 em soluo salina 0,85% estril e manter
sob refrigerao. Adicionar 1ml desta suspenso em 100ml de gar para fazer a camada semeada. Cada
rol do gar semeado ter 1x105 esporos de B. subtilis.
Para preparar as placas, colocar 10ml de gar n 5 em placas de petri (15 x 100)mm e deixar solidificar
em superfcie plana. Pipetar sobre esta, 4ml de gar semeado com a diluio da suspenso de esporos em
teste tomando cuidado para que esta camada fique uniformemente distribuda por toda a superfcie da
camada base.
Controlar a sensibilidade da camada semeada com disco de Neomicina 5mcg, incubando a 29C 1C por
18 a 24 horas esperada a obteno de halos de inibio de 22 a 23mm.
Fracionar a suspenso padronizada em tubos com tampa de rosca e guardar sob refrigerao. Pode-se usar
esta suspenso padronizada por longo tempo desde que no ocorra contaminao ou turvao da mesma.
24.4.3 - PREPARAO DAS PLACAS PARA USO
Fundir um frasco com 100ml e outro com 50ml de gar n 5 e manter em banho-maria a 50C at que o
meio alcance esta temperatura.
Aps semear o frasco com 50ml de gar com quantidade adequada de suspenso padronizada de B.
subtilis e manter em banho-maria a 50C por 75 minutos para ativao dos esporos.
De 5 a 10 minutos antes de completar o perodo de ativao da suspenso de esporos, colocar em placas

de Petri (15 x 100) estreis cerca de 10ml de gar n 5 do frasco de 100ml, que no foi semeado.
Deixar solidificar em superfcie plana e aps ter completado o perodo de ativao dos esporos,adicionar
0,5ml de penicilinase pipetar 4ml do gar semeado sobre a camada base distribuindo homogeneamente
sobre toda a superfcie.
Testar a sensibilidade da camada semeada com disco de Estreptomicina 2mcg incubando a placa a 30C,
por 18 a 24 horas. O halo de inibio deve ser em torno de 30mm. Guardar as placas invertidas em
refrigerador at o momento da sua utilizao que deve ser de no mximo 72 horas.
24.5 - Bacillus cereus, var mycoides PADRONIZAO DA SUSPENSO DE ESPOROS.
Para padronizao da suspenso de esporos de B.cereus proceder de forma semelhante a utilizada para
B.subtilis em 24.4.1. usando gar n 8. Determinar a quantidade tima de clulas na camada semeada por
tentativas, testando a sensibilidade da mesma com disco de oxitetraciclina 5mcg. Incubando a 30C por 18
a 24 horas e aps fazendo a leitura do halo de inibio. esperada uma zona de inibio de 37 a 39mm.
24.5.1 - PREPARAAO DAS PLACAS PARA USO
Fundir 1 frasco com 100ml e outro com 50ml de gar n 8 e aps manter em banho-maria a 50C at que o
meio alcance esta temperatura.
Semear o frasco com 50ml com a quantidade adequada de suspenso de esporos e deixar no banho-maria
a 50C por 45 minutos para ativao dos esporos.
De 5 a 10 minutos antes de completar o perodo de ativao dos esporos, colocar em placas de petri (15 x
100) estreis, cerca de 10ml de gar n.8 do frasco que no foi semeado.
Deixar solidificar em superfcie plana e aps ter completado o tempo de ativao, adicionar 0,5ml de
Penicilinase. pipetar 4ml do gar semeado sobre a camada base, distribuindo homogeneamente sobre toda
a superfcie Testar a sensibilidade da camada semeada com disco de oxitetraciclina 5mcg incubando a
30C por 18 a 24 horas.
O halo de inibio deve ser de 37 a 39mm. Guardar as placas invertidas sob refrigerao at sua utilizao
que no deve ultrapassar 48 horas do preparo.
24.6 - Bacillus stearothermophilus varo calidolactis
PREPARAAo DA SUSPENSO BACTERIANA
Para preparar a suspenso de B.stearothermophilus, semear maciamente em caldo glicose triptona

prpura de bromocresol ou caldo BHI. Incubar a 55C por 24 a 30 horas.
24.6.1 - PREPARAO DAS PLACAS
Inicialmente preparar a camada base, distribuindo em placas (15 x 100) 10ml de gar glicose triptona
prpura de bromocresol, fundido e mantido a 50C
Adicionar volume adequado (normalmente 1ml por 100 ml de gar da suspenso anteriormente preparada
e diluda a 1:10, de modo a obter a sensibilidade desejada na camada semeada. Homogeneizar e colocar
4ml sobre a camada base de cada placa de forma a cobrir toda a superfcie.
Em paralelo preparar placas adicionadas de penicilinase.
Testar a sensibilidade com discos de penicilina 2 UI. Incubar a 55C Verificar o dimetro do halo, que
dever ser de 45-50mm. As placas devem ser utilizadas at 72 horas da preparao e conservadas em
temperaturas prximas a 20C.
24.7 - TCNICA
Descongelar as amostras de leite em refrigerador por 18 horas.
Pipetar cerca de 5-8ml em tubos quimicamente limpos e estreis.
Colocar em banho-maria a 82C por 3 minutos, para inativao enzimtica.
Resfriar imediatamente em gua corrente.
Aps colocar em cada tubo 4 "swabs" e deixar que fiquem totalmente embebidos com leite.
Aps coloc-los sobre a superfcie das placas semeadas com B.subtilis, B.cereus e B. stearothermophilus
com e sem penicilinase, previamente preparadas e testadas quanto a sensibilidade.
Incubar as placas semeadas com B.subtilis e B.cereus em 30C por 18 a 24 horas, e as de

B.stearothermophilus a 55C, por 18 a 24 horas.
Aps a incubao observar zonas de inibio de crescimento bacteriano ao redor dos swabs.
Qualquer inibio do crescimento em uma ou mais das trs placas indica a presena de inibidores no leite.
Expressar o resultado como "Inibidor de crescimento bacteriano: Positivo".
Quando no for observada inibio em nenhuma das placas, expressar o resultado como "Inibidor de
crescimento bacteriano: no detectado".
a) gar para Ensaio de Estreptomicina com Extrato de Levedura

Gelysate peptona 6,0g
gar 15,0g
pH final: 8,0 0,1

manual.
b)gar Para Antibiticos Com Baixo pH (GAR N 8)

Gelysate peptona 6,0g
gar 15,0g
pH final: 5,7 0,2
O gelysate um hidrolisado de gelatina obtida por digesto pancretica e, por isso uma peptona pobre em
nutrientes.
c) gar Triptona Glicose Prpura de Bromocresol
Triptona 10,0g
Prpura de bromocresol(sol.alcolica 1,6%) 2,0ml
gar 15,0g
pH final: 6,7 0,2
Deixar em repouso por 15 minutos e ferver at dissoluo completa.
Distribuir em frascos com 50 e 100ml.
d) Caldo Triptona Glicose Purpura de Bromocresol
Este m,eio tem a mesma composio do gar triptona glicose purpura de bromocresol exceto no fato de
que este no contm gar por tratar-se de caldo.
25 - TESTE DE ESTERILIDADE COMERCIAL
A esterilizao comercial tem o objetivo de impedir a permanncia de microrganismos viveis nas

temperaturas normais de armazenamento e comercializao.
Os alimentos enlatados so estveis em temperatura ambiente pois so hermeticamente fechados, o que

impede a passagem de gases ou microrganismos para o alimento.
A esterilizao comercial visa a obteno de alimento isento inclusive das formas esporuladas de
microrganismos.
A presena de organismos viveis nas provas de esterilidade est relacionada com subprocessamento
trmico, defeitos de recravao, manipulao inadequada das latas durante o resfriamento ou m
qualidade da gua de resfriamento.
As latas que chegarem ao laboratrio para anlise j bombeadas (tufadas) devem ser abertas com muito
cuidado de forma a no colocar a sade do analista em risco.
No devem ser flambadas como as latas normais, mas apenas desinfectadas com uso de substncias
comprovadamente eficazes. Aps semeadura e incubao devero ser conduzidas provas de identificao
dos microrganismos presentes visando maior orientao para diagnstico e soluo do problema.
25.1 - PR-INCUBAO
As latas ou vidros hermticamente fechados devero ser lavados com gua e sabo e posteriormente
secos. Incubar 1 amostra na temperatura de 35C, por 14 dias e 1 a 55C por 10 dias.
Os recipientes devero ser incubados sobre papel de filtro ou similar a fim de se constatar possveis
microfugas.
Os produtos j bombeados (tufados) na chegada ao laboratrio devero ser analisados imediatamente,

dispensando a prova de estufa.
Caldo de carne cozida
Caldo glicose triptona
gar nutritivo ou gar crebro-corao

gar para esporulao
25.3 - TCNICA
Aps o perodo de pr-incubao a 35C, semear em dois tubos de caldo de carne cozida e dois tubos de
caldo glicose triptona, 1 a 2g da amostra.
Os tubos de calda de carne cozida aps serem semeados, devero ser aquecidos a 80C por 15 minutos.
Aps o aquecimento e antes de endurecer o vaspar, tomar medidas para eliminar possiveis bolhas de ar.
Incubar um tubo de cada meio a 35C e a 55C por 120 horas.
Os tubos que apresentarem turvao devero ser repicados por estriamento em placas com gar nutritivo
u gar crebro-corao e incubados por 24 horas nas mesmas condies de temperatura, em aerobiose ou
anaerobiose conforme os tubos de origem. Se houver turvao nos tubos a 35C incubar as placas tambm
a 22C.
Do crescimento obtido fazer colorao de Gram.
Quando o tubo de origem for aquele incubado em anaerobiose e ocorrer presena de bastonetes Gram
positivos, realizar prova de catalase.
A prova de catalase positiva indica a presena de Bacillus sp e a negativa indica a presena de

Clostridium sp.
Ocorrendo presena de bastonetes termfilos ou termfilos e mesfilos confirmar a termofilia estrita do

microrganismo presente.
Do caldo glicose triptona incubado a 55C, repicar maciamente em gar para esporulao.
Incubar a 55C por 2 a 10 dias.
A partir do 2 dia verificar a presena de esporos atravs de esfregao com colorao especfica.
Lavar a cultura esporulada com gua destilada estril e colocar em banho-maria a 80C por 10 minutos.
Aps o choque trmico, semear 2 tubos com caldo glicose triptona incubar 1 tubo a 35C e outro a 55C,
por 2 a 4 dias.
Verificar o crescimento nos 2 tubos. Se houver crescimento somente no tubo incubado a 55C
confirmar-se o carter termoflico estrito do microrganismo presente.
Observao: Leite e produtos lcteos submetidos esterilizao comercial devero ser incubados a 35C
por 10 dias.
Aps este perodo no devero existir sinais de alterao da embalagem nem quaisquer modificaes
organolpticas, fisicas ou qumicas que evidenciem deteriorao do produto.
Quando necessrio ser verificada a esterilizao comercial conforme metodologia especfica.
As anlises devero ser efetuadas em 2 amostras, separadamente.
25.4 - Composio e Preparo dos Meios de Cultura
a) Caldo De Carne Cozida (Cooked Meat Medium)

Corao de boi 454,0g
Pesar 125g de material desidratado e adicionar 1000ml de gua destilada/deionizada. Misturar bem,
deixar em repouso por 10 a 15 minutos.
Distribuir em tubos. Esterilizar a 121C por 15 minutos.
Adicionar uma camada de "Vaspar"(partes iguais de vaselina slida e parafina) de cerca de 2 cm de

espessura antes da esterilizao.
b) Caldo Glicose Triptona
Triptona 10,0g
Dissolver os componentes em 1 litro de gua destilada/deionizada e distribuir em tubos (15ml). Esterilizar

a 121C por 15 minutos.
pH final: 6,7 0,2
c) gar Nutritivo.

Peptona 5,0g
gar 15,0g
pH final: 7,0 0,2

manual.
d) gar para Esporulao

Peptona 5,0g
gar 15,0g
Sulfato de magnsio(MnSO4H2O) (sol.a 3,08%) 1,0ml
Ferver at dissoluo completa e distribuir em tubos ou frascos.
Esterelizar a 121C, por 15 minutos.

pH final: 7,3 0,2
26-DETERMINAO DE TOXINA BOTULNICA EM ALIMENTOS POR BIOENSAIO
A toxina botulnica produzida e liberada durante o desenvolvimento do Clostridium botulinum.
So produzidas toxinas, sorologicamente, diferentes, denominadas de A, B, C, D, E, F e G, e

possivelmente outras, no classificadas.
A especificidade dos tipos diferente no reino animal.
As toxinas A, B e E afetam o homem incluindo mais raramente a F, enquanto C e D afetam animais,

como gado e aves.
No existe at o momento, referncia de casos envolvendo a toxina G.
Estas toxinas so consideradas como venenos biolgicos dos mais potentes.
nveis de mcg so capazes de provocar a morte de adultos sos.
O C. botulinum um microrganismo ubquo do solo e guas.
Sua presena considerada comum nos vegetais "in natura".
Por ser um microrganismo formador de esporos, apresenta termoresistncia quando nesta forma.
As clulas vegetativas so mais tacilmente destrudas pelo uso do calor e sua multiplicao acontece
particularmente em produtos mantidos sob condies de anaerobiose.
Algumas das toxinas botulnicas (no proteolticas) so ativadas pela tripsina.
As toxinas botulnicas so termolbeis, podendo ser inativadas a 80C por 10 minutos.
A pesquisa de toxina botulnica nos alimentos deve ser realizada observando as mais estritas condies de
segurana, por se tratar de substncia de alto risco.
As amostras devem ser mantidas refrigeradas ou congeladas uma vez que a toxina termolbil.
26.1 - REAGENTES
) Tampo Gel Fosfato pH 6,2
b) Soluo de tripsina
c) Soluo de HCl 1N
d) Soluo de NaOH 1N
e) Antitoxina botulnica polivalente
f) Antitoxinas botulnicas monovalentes
26.2 - TCNICA
Manter todos os reagentes e amostras sob refrigerao, executando todas as etapas analticas com exceo
das etapas assinaladas a seguir em temperatura mxima de 15C.
Remover poro da amostra para anlise (5, 10 ou 25g ou ainda enxaguadura de embalagem vazia) e
acrescentar volume igual de tampo gel fosfato.
Macerar a amostra com pistilo em Gral pr-refrigerados ou em stomacher, evitando aquecimento.
Acertar para o pH mnimo de 6,0 e mximo de 7,5 se necessrio.
Centrifugar para remover a parte slida em centrifuga refrigerada.
Usar sobrenadante para o bioensaio.
Para a ativao tripsnica das toxinas no proteoliticas, usar uma poro do sobrenadante obtido ou tratar
uma poro da amostra caso se trate de produto liquido.
Para tanto, acertar o pH para 6,2 com soluo 1N de cido clordrico ou hidrxido de sdio.
Para cada poro de 1,8ml, acrescentar 0,2ml da soluo de tripsina. Incubar a 37C por 1 hora, agitando
de vez em quando.
Injetar separadamente em dois camundongos de 20 a 25 g cada 0,5ml do extrato tripsinisado e no

tripsinisado por via intraperitoneal.
Em paralelo, aquecer em banho-maria fervente por 10 minutos, 1,5ml do sobrenadante.
Aps resfriar, inocular 0,5ml em 2 camundongos via intraperitoneal.
Manter 2 camundongos no inoculados para controle.
Observar continuamente os camundongos por 6 horas e a cada 12 horas por at 72 horas.
Registrar sintomas de intoxicao botulnica que incluem paralisia total ou parcial e dificuldade
respiratria (com implicaes diafragmticas que marcam ou acinturam o animal e respirao lenta, em
fole, elaborada) e morte.
Considerar como suspeita de presena de toxina botulnica quando os camundongos inoculados com o
sobrenadante tratado termicamente se comportarem como os animais controles no final do perodo de
observao e os demais apresentarem os sintomas acima relatados.
Podem ser observados sintomas somente nos animais inoculados com o sobrenadante tripsinisado.
importante observar que quando os animais inoculados morrem imediatamente aps a injeo, em geral
devido a presena de alguma substncia txica, como amnia e alta concentrao de sal.
Os que morrem aps cerca de 12 horas, com os olhos fechados e alterados, sofreram de sndrome
txico-infecciosa por outro agente,
Estes sintomas podem mascarar os de botulismo e, neste caso, o teste permanece indeterminado.
Pode-se filtrar para retirar os contaminantes microbianos, porm esta etapa pode reduzir o nivel de toxina
presente.
Se os animais apresentarem sintomas especficos de botulismo proceder aos testes de inativao com
anti-toxinas polivalentes e monovalentes.
Para tanto, usar o sobrenadante do extrato, tripsinisado ou no de acordo com os resultados da etapa
anterior.
Quando do uso do extrato tripsinisado, realizar a mesma imediatamente antes da inativao pois a ao
contnua da tripsina pode inativar esta toxina.
Preparar diluies de antitoxina, de forma a ter uma unidade internacional de cada (caso da polivalente)
por 0,5ml.
Usar anti-toxinas A, B, E, e F no caso de suspeita ou risco de humanos.
Inocular 0,5ml em pares de camundongos via intrapeitoral.
Aps 30 minutos a 1 hora, inocular o extrato.
Observar e registrar os sintomas como j descrito.
Manter 2 camundongos para controle.
Considerar como positiva a pesquisa de toxina quando os animais protegidos pela anti-toxina (polivalente
e uma ou mais monovalentes) se comportarem como.os
animais controle no final da observao (72 horas) e os demais apresentarem sintomas de botulismo.
Os testes podem ser repetidos, usando-se diluies decimais do inculo, para determinar a quantidade de
toxina presente na amostra.
Neste caso, expressar o resultado de forma quantitativa.
26.3 - PREPARAO DOS REAGENTES
a) Tampo Gel Fosfato
Gelatina 2,0g
Fosfato de Sdio (Na2HPO4) 4,0g
Dissolver os ingredientes em BOOml de gua, sob aquecimento brando.
Ajustar o pH 6,2 com HCl. Adicionar gua at completar o volume (200ml menos o volume do cido
adicionado).
Esterilizar a 121C/20 minutos. pH 6,2
b) Soluo de Tripsina
Tripsina 1:250 1,0g

gua destilada estril 10,0ml
Pesar a tripsina em tubo limpo e estril. Acrescentar a gua.
Agitar de vez em quando e manter temperatura ambiente at que o mximo

de tripsina tenha dissolvido.
pH 6,0.
c) cido Clordrico 1N
35,6 ml de cido clor1drico(HCl) fumegante a 97% para 1 litro de gua destilada.

d) Hidrxido de Sdio 1N
40g de hidrxido de sdio(NaOH) para 1 litro de gua destilada.
e) Antitoxinas Polivalentes e Monovalentes
Usar antitoxinas controladas, grau reagente. As mesmas podem ser adquiridas no "Center for Diseases
Control", Estados Unidos.
27 - RECUPERAO DE CLULAS EM "STRESS"
A recuperao de clulas em estado fisiol6gico alterado necessria para a deteco de microrganismos,

que por ao do processamento trmico congelamento, dissecao, irradiao, desinfeco, ou agentes
qumicos, etc., estaro incapacitados de multiplicar em meios seletivos para identificao ou quantificao
dos mesmos.
Devido a estas leses subletais (destruio de integridade da membrana celular ou degradao do ARN
ribossomal), bactrias consideradas mortas ou ausentes em um meio podem demonstrar viabilidade em
outros meios.
O efeito do "stress" se manifesta por um aumento da fase lag que proporcional extenso da leso
celular ou at perda total do poder de multiplicao por parte do microrganismo.
Se o efeito for apenas a ampliao da fase lag por dependncia de certas substncias, as conseqncias
para sua recuperao no so to graves.
As clulas lesadas apresentam sensibilidade especial a compostos antimicrobianos tais como o NaCl, sais
biliares agentes tensoativos e corantes.
Este aumento de sensibilidade a principal caracterstica da alterao fisiolgica da clula bacteriana.
Os procedimentos de recuperao de clulas com leso subletal so dependentes:
(1) do tipo de microrganismo (esporulado ou no, bacilos ou cocos, gram positivos ou negativos, catalase
positiva ou negativa)
(2) do tipo de "Stress" (aquecimento, congelamento, etc.)
(3) caracterlsticas do alimento (substncias intrnsecas impedindo impedindo o crescimento)
(4) meio utilizado, e
(5) temperatura de incubao.
Alguns meios como Baird-Parker, permitem, por si s a recuperao de clulas lesadas em semeaduras
diretas.
recomendado porm, uma boa padronizao de tratamentos para recuperao de clulas lesadas devido
ao processamento recebido pelo alimento.
27.1 - MTODO
A recuperao pode ser realizada de duas formas:
1) Em .eio lquido: ap6s homogeneizao da amostra em soluo salina peptonada a 0,1 % ou soluo
Ringer, deixar por duas horas a 25C antes do incio da anlise propriamente dita. Indicado para anlises
que buscam positividade ou negatividade.
2) Em meio slido: utilizado nos casos em que se julgue necessrio um tempo maior de recuperao.
Semear 0,1ml das diluies desejadas do alimento sobre superfcie de gar crebro-corao ou gar
tripticase soja e espalhar cuidadosamente sobre toda a superfcie. Deixar a 25C por seis horas.
Aps colocar sobre-camada de cerca de 12ml do agr especifico.
Solidificar e incubar as placas invertidas nas temperaturas adequadas para cada caso.
28 - VERIFICAO DA EFICINCIA DE DESINFETANTES
O termo "desinfetante comumente empregado para designar substncias capazes de destruir

microrganismos patognicos noesporulados em curto espao de tempo, quando aplicado a objetos
inanimados.
Sanitizantes so desinfetantes que reduzem o nmero de microrganismos a nveis considerados seguros

para a sade pblica, porm como a grande maioria dos produtos comercializados encontra-se rotulado
como "desinfetante" qualquer germe patognico que se mostrar resistente ao desinfetante na maior
diluio recomendada pelo fabricante motivo de reprovao.
A denominao "germicida", isto , bactericida, virucida, fungicida, amebicida, somente pode ser
aplicado a agentes capazes de destruir os microrganismos.
O fabricante deve especificar quais os germes sensiveis, conforme legislao do Ministrio da Agricultura
Abastecimento e Reforma Agrria vigente.
Neste caso os microrganismos-teste sero aqueles citados pelo fabricante.
Na avaliao da eficincia de desinfetantes necessrio considerar a(s) diluio(es) e as condies de

uso recomendadas pelo fabricante.
Os testes devem ser conduzidos em presena de matria orgnica, dependendo das indicaes do
fabricante.
As diluies do desinfetante devem ser feitas em gua destilada.
O uso de matria orgnica nos testes de eficincia assegura que perdas no poder desinfetante ou
inativao dos mesmos, nas condies de uso sejam detectadas.
Como fonte da matria orgnica para os testes podem ser usados: extrato de levedura a 1%, albumina
bovina a 1%, soro, sangue, protenas, leite, etc.
Solues aquosas de soro bovino a 1% normalmente oferecem concentraes de matria orgnica em

torno de 0,2 mg/ml, enquanto que solues aquosas de leite
integral a 1:5000 oferecem concentraes bem maiores de matria orgnica.
A escolha dos microrganismos-teste deve levar em considerao as condies de uso do desinfetante

recomendadas pelo fabricante, simulando-se assim a condio em questo.
Na anlise fiscal torna-se mais prtico iniciar os testes com os microrganismos mais resistentes como a
P.aeroginosa, Proteus sp, M.smegmatis, S.faecalis, L.monocytogenes, Clostridium sp, etc, conforme
indicao do produto.
Mostrando-se eficiente frente a estes microrganismos, seguem-se os testes frente a outras bactrias contra
as quais est indicado o produto, fungos e vrus, levando-se em conta a prvia concentrao do
microrganismo-teste pois o objetivo do teste o de uma avaliao com comportamento de cintica de
primeira ordem.
Sempre que um desinfetante for recomendado como esporicida testes devem ser conduzidos frente a
suspenses de esporos.
As suspenses devem ser preparadas a partir de cultivos dos microrganismos desejados em meio
apropriado, incubados nas temperaturas e condies especficas e aps deixadas em temperatura ambiente
ou refrigerao por 10 a 15 dias para esporulao.
Os meios utilizados para esta finalidade podem ser adicionados de 300mg de sulfato de mangans por
litro de meio, o que auxilia a esporulao.
Aps colhidas, lavadas e centrifugadas, as suspenses de esporos devem ser submetidas a um choque
trmico de 80C por 15 minutos, para destruir as clulas vegetativas, deixando apenas os esporos viveis.
Aps o choque trmico realizar diluies em gua peptonada a 0,1% e fazer contagem do nmero de
esporos por mililitro em meio slido e condies adequadas. Manter as suspenses de esporos em soluo
salina, sob refrigerao.
Alguns produtos qumicos tem a capacidade de produzir leses sub-letais em alguns microrganismos,
exercendo assim, ao bacteriosttica e no bactericida.
O prolongamento do perodo de incubao (mnimo de 96 horas) e o uso de meios ricos apropriados

(livres de inibidores) permite a recuperao das clulas com leso fisiolgica reversvel. Devido a isso, os
ensaios de eficincia de desinfetantes devem prever perodos de incubao nunca inferiores a 96 horas.
Caldo Sabouraud
Caldo de carne cozida ou Caldo Tarozzi
gar crebro-corao (BHI) ou
gar tripticase soja com 0,6% de extrato de levedura (TSYE)
Meios slidos especficos para confirmao dos microrganismos utilizados (XLD,
gar Baird-Parker,
gar vermelho-neutro-bile,
gar para anaerbios,
gar Sabouraud,
gar batata glicosado, etc).
28.2 - TCNICA
28.2.1 - PREPARO DAS CULTURAS-TESTE
- Semear os microrganismos-teste em tubos com caldo BHI ou tripticase soja (bactrias), caldo Sabouraud
(fungos), caldo de carne cozida (anaerbios), e incubar por 18 a 24 horas (bactrias) e por 3 a 5 dias
(fungos), nas temperaturas e condies de aerobiose/anaerobiose apropriadas.
- Aps incubao diluir cada cultura de 10-1 a 10-10 em gua peptonada 0,1% e realizar contagem do
nmero de clulas (UFC) por mililitro, em meio slido livre de substncias impedientes (agar BHI ou
TSYE): utilizar 0,1ml da diluio 1:1000 para os testes de eficincia a qual normalmente oferece entre
105 e 107 UFC/ml.
28.2.2 - PREPARO DA DILUIO DO DESINFETANTE
Deve ser testada a maior diluio recomendada pelo fabricante.
Preparar, em agua destilada, diluio do desinfetante igual maior diluio recomendada pelo fabricante
mais 10%, utilizando-se vidraria volumtrica de modo que, aps a adio da matria orgnica, a
concentrao final do produto seja igual aquela maior diluio indicada.
Distribuir assepticamente, 9ml do desinfetante diludo em tubos de ensaio estreis.
28.2.3 - ADIO DE MATRIA ORGANICA
Determinar o contedo de matria orgnica a ser adicionada pelo mtodo oficial da Rede LANARA,
diluindo a fonte escolhida em gua destilada.
Imediatamente antes do incio dos testes de eficincia, adicionar a cada tubo com 9 ml do desinfetante
diludo, 1ml da soluo fonte de matria orgnica.
28.2.4 - TESTE DE EFICINCIA FRENTE A MICRORGANISMOS
Adicionar 0,1ml da cultura-teste em fase estacionria na diluio 1:100 aos tubos contendo o desinfetante
diludo conforme item 28.2.
Homogeneizar.
Cronometrar o tempo de exposio a partir do momento exato da adio da cultura ao desinfetante.
Aps 5, 10, 15 e 20 minutos de exposio repicar para tubos com caldo BHI ou TSYE (bactrias
aerbias), caldo de carne cozida ou caldo tarozzi (bactrias anaerbias), caldo sabouraud (fungos), com
ala calibrada de 10 microlitros.
Incubar nas temperaturas e condies apropriadas para cada microrganismo por no mnimo, 96 horas.
Realizar a leitura dos tubos em perodo de incubao no inferior a 96 horas, verificando turvao,
formao de pelcula na superfcie ou de precipitado no fundo dos tubos.
Registrar em livro apropriado.
Confirmar todos os tubos positivos em meios slidos especficos para cada microrganismo. Incubar em
temperaturas e condies apropriadas para cada caso fazendo a leitura em 24 a 48 horas (bactrias) e,3 a 5
dias (fungos).
Registrar como positivos apenas os tubos confirmados nos meios slidos.
Registrar os respectivos tempos de exposio.
ANEXO I
I - REGRAS PARA CONTAGEM DE COLNIAS
As colnias devem ser contadas com o auxilio de conta-colnias equipado com placa de vidro, dividido
em quadrados com 1 centimetro de quando so contadas placas em duplicata, e/ou diluies sucessivas e
calculada a mdia aritmtica, arredondar em 2 casas significativas somente o resultado final.
Para no criar urna falsa idia de preciso quando do clculo da contagem de colnias, registrar somente
as 2 unidades da esquerda substituindo a segunda unidade pelo nmero imediatamente superior quando a
terceira unidade for igualou maior que 5, e pelo inferior quando for menor que 5.
Registrar tambm os resultados dos testes de controle e a temperatura de incubao.
O resultado final dever ser expresso da seguinte maneira:
R = a x 10b UFC/g ou ml
a=1 a 9
b = 1 ou mais de 1
UFC = Unidade formadora de colnias
Quando o nmero de UFC/g ou ml for determinado por estimativa incluir no registro do resultado a
informao "estimado".
Ex.: 1,7 x 105 UFC/g estimado
> 6,3 x 106 UFC/ml estimado
II - CLCULO E REGISTRO DE CONTAGEM
1 - Quando nas Diversas Diluies o Nmero de Colnias se encontra entre os limites de 25-250.
1.1 - MESMA DILUIO
Calcular a mdia aritmtica dos resultados encontrados e multiplicar pela diluio correspondente.
Exemplo: Tabela 1 - exemplo 1
Dil: 10-3 = 130 colnias
(130 + 224) /2 = 177 x 1000 = 177000--------------180.000 UFC
Resultado: 1,8 x 105 UFC/g ou ml
1.2 - DILUIES DIFERENTES
1.2.1 - Multiplicar o resultado encontrado em cada placa pelas respectivas diluies e calcular a mdia
aritmtica.
Tabela 1 - Exemplo 2
(180+210) /2 = 195 x 1000 = 195000
Dil: 104 = 28 colnias

(28+32) /2 = 30 x 10000 = 300000
Fazer a mdia das diluies diferentes
(195000 + 30000) /2 = 247000 250000
Resultado: 2,5 x 105 UFC/g ou ml
1.3 - PLACAS COM MAIS DE 250 COLNIAS
Quando todas as placas apresentarem mais de 250 colnias na maior diluio, multiplicar o resultado
encontrado em cada placa pelas respectivas diluies e calcular a mdia aritmtica.
(410 + 380) /2 = 395 x 10000 = 3950000 4000000
Resultado: 4,0 x 106 UFC/g ou ml estimada
1.4 - PLACAS COM COLNIAS INVASORAS
1.4.1 - Quando a rea invadida exceder de 1/4 da rea total expressar o resultado com "presena de
colnias invasoras".
1.4.2 - Quando a rea invadida for inferior a 1/4 da rea total contar tanto as invasoras como as normais.
Quando as colnias invasoras estiverem aglutinadas contar como urna colnia, se isoladas contar uma a
uma.
1.5 - TODAS PLACAS SEM COLNIAS
Se todas placas no apresentarem colnias, expressar o resultado como menor do que a menor diluio
utilizada por estimativa.
Dil: 10-2 = O
Dil: 10-3 = O
Resultado: menor do que 1,0 x 102 UFC/g ou ml estimado
1.6 - QUANDO O NMERO DE COLNIAS SE ENCONTRA ENTRE OS LIMITES DE 25-250
EM UMA S DILUIO
1.6.1 - MESMA DILUIO
Calcular a mdia aritmtica dos resultados encontrados e multiplicar pela diluio correspondente.
Exemplo: Tabela 1 - Exemplo 7

(230+261) /2 = 245 x 1000 = 245000 250000
Resultado: 2,5 x 10-1 col/g ou ml
1.7 - QUANDO, NA MAIOR DILUIO AS PLACAS APRESENTAREM NMEROS
SUPERIORES AO LIMITE DE 250
10-2 (> 250)
10-3 (> 250) > 250x104 = > 2500000
10-4 (> 250)
Resultado: > 2,5 x 106 UFC/g ou ml estimado
Observao: Pode-se calcular o nmero de UFC nas placas com a maior diluio para obter a estimativa.
Expressar o resultado em funo do nmero estimado.
1.8 - QUANDO NAS DIVERSAS DILUIES O NMERO DE COLNIAS EM UMA DILUIO

ENCONTRA-SE DENTRO DO LIMITE 25-250 COLNIAS E NA OUTRA DILUIO UMA NICA
ENCONTRA-SE DENTRO DO LIMITE 25-250 COLNIAS.
Exemplo A:
(232+224) /2 = 228 x 1000 = 228000
Dil: 10-4 = 26 co10nias
(15+26) /2 = 20 )( 10000 = 200000
(228000 + 200000) /2 = 210000
Resultado: 2,1 x 105 col/g ou ml
Exemplo B:
(270+248) /2 = 259 x 1000 = 259000

(34+29) /2 = 31 x 10000 = 310000
(310000 + 259000) /2 = 280000
Resultado: 2,8 x 105 col/g ou ml
1.9 - PLACAS COM MENOS DE 25 COLNIAS
Expressar o resultado pelo nmero de colnias da placa de menor diluio por estimativa.
(21+17) /2 = 19 x 100 = 1900
Resultado 1,9 x 103 UFC/g ou ml estimado
1.10 - ACIDENTE DE LABORATRIO
Quando se tem conhecimento de que as placas foram contaminadas ou que por qualquer razo no so
satisfatrias no havendo confiabilidade na anlise, informarse- como acidente de laboratrio.
1.11 - EXPRESSO DE RESULTADOS DE CONTAGEM
O resultado de contagem dever ser expresso da seguinte maneira:
N = a x 10b/g ou ml
N = nmero de UFC (Unidades Formadoras de Colnias)
a=1 a 9
b = a ou mais de a
g = grama
ml= mililitro
ANEXO I
TABELA 1 - clculo e Registro de contagens
DILUIES
Forma de emisso de
1:100 1:1000 1:10000 RESULTADO
Resultado
130* 12 180.000 1,8 x 105 UFC/g

1 Incontvel
224*
180* 28* 250.000 2,5 x 105 UFC/g
2 Incontvel 210* 32*
3 21* 3 0 1.900 1,9 x 103 UFC/g
17* 0 0 estimado estimado
410* 4.000.000
4 Incontvel Incontvel
estimado 4,0 x 106 UFC/g
380*
225 4
5 Incontvel 290.000 2,9 x 105 UFC/g
242 Invasora
6. 0 0 0 <100 est.
<1,0 x 102 UFC/g estimado
0 0 0
230* 20
7 Incontvel 250.000 2,5 x 105 UFC/g
261* 18
>2.500.000
8 Incontvel Incontvel Incontvel
estimado >2,5 x 105 UFC/g
232* 15*
210.000
224* 26*
9 Incontvel 2,8 x 105 UFC/g
270* 34*
280.000
248* 29*
Contagens com as quais sero feitas as mdias aritmticas.
ANEXO II
ndice de nmero mais provvel e 95% de limite de confiana para vrias combinaes de resultados
positivos, quando so utilizados trs tubos por diluio.
NMERO MAIS PROVVEL (N M P)

Diluio: 1 - 0,1 - 0,01
Limites de confiana 95%
Tubos Positivos NMP/g ou ml Inferior Superior
000 < 0,3
001 0,3 <0,05 0,9
010 0,3 <0,05 1,3
020 0,6
100 0,4 0,05 2,0
101 0,7 0,1 2,0
110 0,7 0,1 2,3
111 1,1 0,3 3,6
120 1,1 0,3 3,6
200 0,9 0,1 3,6
201 1,4 0,3 3,7
210 1,5 0,3 4,4
211 2,0 0,7 8,9
220 2,1 0,4 4,7
221 2,8 1,0 15,0
230 2,9
300 2,3 0,4 12,0
301 3,9 0,7 13,0
302 6,4 1,5 38,0
310 4,3 0,7 21,0
311 7,5 1,4 23,0
312 12,0 3,0 38,0
320 9,3 1,5 30,0
321 15,0 3,0 44,0
322 21,0 3,5 47,0
330 24,0 3,6 130,0
331 46,0 7,1 240,0
332 110,0 15,0 480,0
333 >110,0 15,0
Referncia: FDA - Bacteriblogical Analytical Manual - 6 edio, 1984.
ANEXO III
REAGENTES E SOLUES
1 - Colorao de bactrias - Mtodo de Gram
a - Corar o esfregao com sol. de cristal violeta fenicada;
b - Escorrer e cobrir com soluo de lugol por um minuto;
c - Lavar em gua corrente;
d - Diferenciar com etanol absoluto;
e - Lavar em gua corrente;
f - Corar com fuccina fenicada;
g - Lavar em gua corrente;
h - Secar.
2 - Soluo de Cristal violeta Fenicada
Cristal Violeta (C25H30ClN3) 1,0g

Etanol absoluto (C2H6O) 10,0ml
Fenol fundido (C6H5OH) 2,0ml
Dissolver o corante no lcool.
Juntar lentamente o fenol fundido e aps a gua, tambm lentamente, misturando at obter
homogeneidade.
Deixar em repouso por 24 horas e aps filtrar.
3 - Soluo de Lugol
Iodo (I2) 1,0g

Iodeto de potssio (KI) 2,0g
4 - Soluo de Fuccina Fenicada
Fuccina bsica 0,3g

Fenol fundido (C6H5OH) 5,0ml
Dissolver o corante no lcool.
Juntar lentamente o fenol fundido e aps a gua, tambm lentamente, misturando at obter
homogeneidade.
Deixar em repouso por 24 horas e aps filtrar.
5 - Colorao de Esporos - Mtodo de Wirtz-Conklin
a - Esfregao fixado pelo calor;
b - Corar a quente com soluo de verde malaquita a 5% durante 3 a 6 minutos;
c - Lavar;
d - Contracorar com soluo aquosa de safranina a 0,5% por 0,5 a 1 minuto;
e - Lavar e secar.
Com este mtodo de colorao os esporos coram-se de verde, enquanto os corpos bacterianos e detritos
coram-se de vermelho.
6 - Reativo de Kovacs
a - Dissolver 5g de paradimetilaminobenzaldedo em 75ml de lcool amilico;
b - Aquecer a 60C por 5 minutos;
c - Adicionar 25ml de HCl puro (33 - 15%). Deve aparecer uma colorao vermelha;
d - Deixar em repouso at que a colorao mude para amarelo (6 a 7 horas) .
e - Manter em frasco escuro sob refrigerao.
7 - Soluo aquosa de cido tartrico a 10%
cido tartrico (C4H6O6) 10,0g

Esterilizar por filtrao.
8 - Soluo alcolica de vermelho de metila.
Vermelho de metila 0,04g

9 - Soluo alcolica de alfa naftol a 5%
Alfa naftol (C10H8O) 5,0g

10 - Hidrxido de Potssio a 40 %
Hidrxido de potssio (KOH) 40,0g

Agua destilada qsp 100,0ml
11 - Soluo de Telurito de Potssio a 3,5 %
Telurito de potssio (K3TeO3) 3,5g

Esterilizar por filtrao e manter sob refrigerao.
12 - Soluo de Azul de Toluidina O a 1%
Azul de toluidina "O" 1,0g

Agua destilada, qsp 100,0ml
Manter em frasco escuro sob refrigerao.
13 - Acido Actico Glacial 5N
Acido actico glacial (C2H402) 28,75ml

Agua destilada 71,25ml
14 - Soluo de Alfanaftilamina a 0,5 %
Alfanaftilamina (C10H9N) 0,5g

Acido actico glacial (C2H402) 5N qsp 100,0ml
15 - Soluo de Acido Sulfanlico a 0,8 %
Acido sulfanilico (C6H7NO3S) 0,8g

Acido actico glacial (C2H402) 5N qsp 100,0ml
16 - Corante para corpsculo de Incluso Cristalina
Azul de Coomasie 0,25g

Metanol(CH4O) 50,0ml
Acido actico glacial (C2H402) 7,0ml
17 - Soluo de Sulfato de polimixina B a 0,1 %
Sulfato de polimixina B 0,1g

Esterilizar por filtrao e manter sob congelamento.
18 - Soluo de Tirosina a 0,5 %

L-tirosina .(C9H11NO3) 0,5g
Agua destilada 99,5ml
Esterilizar a 121C por 15 minutos.
19 - Soluo de Prpura de Bromocresol a 1,6 %
Prpura de bromocresol(C21H16Br2O5S) 1,6g

Etanol absoluto (C2H6O) qsp 100,0ml
20 - Soluo Alcolica de cristal violeta a 1 %

Manter em frasco escuro. Filtrar antes do uso caso apresente precipitado.
21 - Soluo de Iodo-Iodeto
Iodo metlico (I2) 5,0g

22 - Soluo de Tiosulfato de Sdio a 2 %

gua destilada qsp 100,0ml
23 - Soluo de Cloreto de Maqnsio a 40 %
Cloreto de magnsio (MgCl2.6H20) 40,0g

24 - Soluo de Verde Malaquita a 4 %
Verde malaquita (C2H34N2O4S) 4,0g

25 - Soluo de Verde Brilhante a 0,1 %
Verde Brilhante (C21H14Br4O5S) 0,1g

26 - Soluo de Cloreto Frrico 10%
Cloreto frrico (FeCl3.6H20) 10,0g

27 -: Soluo de cido Nalidxico a 2 %

cido nalidxico (C12H12N2O3) 2,0g
Hidrxido de sdio (NaOH) 0,1M, qsp 100,0ml
Esterilizar por filtrao e manter sob refrigerao em frasco escuro.
28 - Hidrxido de Sdio 0,1M
Hidrxido de sdio (NaOH) 4,0g

29 - Soluo de Acriflavina a 1 %
Acriflavina 1,0g
Esterilizar por filtrao e 1iIanter sob retrigerao em frasco escuro.
30 - Soluo de Desoxicolato de Sdio a 0,5 %
Desoxicolato de sdio (C24H39Nao4) 0,5g

31 - Soluo Salina Tamponada pH 7,2 (0,067M KH2PO4)

Cloreto de s6dio (NaCl) 8,5g
32 - Soluo de Oxalato de Para-amino-dimetilanilina a 1%
Oxalato de para-amino-ditnetilanilina 1,0g

33 - Soluco salina formalizada de Iodeto de Mercrio
a-Soluo estoque:

Iodeto de mercrio (HgI) 1,0g
b-Soluo de trabalho:
Soluo estoque 10,0ml

Soluo salina 0,85% 90,0ml
Formalina 0,05ml
34 - Tampo Gel Fosfato
Gelatina 2,0g
Dissolver os ingredientes em 800ml de gua sob aquecimento brando. Ajustar o pH a 6,2 com HCl.
Adicionar gua at completar um litro. Autoclavar a 121C por 20 minutos.
35 - Acido Clordrico 1N
cido clordrico fumegante (HCl) 35,6ml

36 - Alcool Iodado
a-Tintura de Iodo 2%

Iodo metlico (I2) 6,0ml
Diluir o iodeto de potssio na gua, acrescentar o iodo metlico e por ultimo o etanol absoluto.
b-Misturar 20 ml de tintura de iodo 2% com 980ml de etanol absoluto 70GL.
37 - Etanol Absoluto 70GL

D.O.U., 17/08/1993

Portaria N 101 de 11 de Agosto de 1993

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MINISTRIO DA AGRICULTURA, PECURIA E ABASTECIMENTO

SECRETARIA DE DEFESA AGROPECUARIA.

PORTARIA N 101, DE 11 DE AGOSTO DE 1993.

JORGE SALIM WAQUIM

1 - NORMAS DE SEGURANA NO LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA.

1.01 - No comer, beber ou fumar dentro do laboratrio;

1.02- No usar os refrigeradores ou estufas para conservar ou aquecer alimentos;

1.03- Usar sempre avental de algodo;

1.05- Quando da manipulao de material txico ou infectante, usar luvas de proteo;

Manter as mos longe da boca, nariz, olhos e rosto;

1.09- No pipetar material txico ou infeccioso com a boca.

1.11- Descartar todo o material contaminado em recipiente apropriado e esterilizar em autoclave;

1.14- Todas as etiquetas devem ser auto-adesivas;

1.15- Evitar a formao de arossis quando da centrifugao de materiais infectantes ou de culturas.

Aps a parada, esperar 10 minutos para abr- la.

Aps o uso, limpar a superfcie interna com desinfetante;

Os ferimentos devem ser desinfetados e cobertos com esparadrapo;

Muitos patognicos como staphylocuccus e Salmonella desenvolvem-se bem nestes meios.

As bactrias presentes em pequeno nmero no alimento se reproduzem no meio de cultura podendo

1.20- No cheirar os meios de culturas inoculados;

2 - NORMAS DE COLHEITA DE AMOSTRAS

2.01- A colheita da amostra constitui a primeira fase da anlise do produto.

No caso de enlatados, remeter no mnimo duas latas.

2.06- Para colheita e remessa de gua, observar as instrues especificadas a seguir:

Utilizar material estril;

No abrir os frascos at o momento da colheita;

Evitar que a tampa entre em contato com qualquer objeto;

Ser breve na colheita;

No caso de amostras transportadas em temperatura ambiente, o prazo no deve exceder a 2 horas.

2.06.1 - TORNEIRAS COM INSTALAO DE AGUA CORRENTE:

Limpar a parte externa da torneira. Deixar correr a gua durante 3 a 5 minutos.

Deixar correr um filete pouco intenso de gua.

Retirar a tampa, flambar a tampa do frasco e colher 2/3 de sua capacidade.

Flambar novamente e tampar, vedando com fita adesiva ou parafina.

Acondicionar sob refrigerao at a entrega no laboratrio.

2.06.2 - DE POOS ARTESIANOS E SEMI-ARTESIANOS:

Utilizar o prprio frasco de colheita usando uma pina de braos longos.

Havendo essa impossibilidade, proceder como no item 2.06.3

2.06.5 RIOS, ARROIOS, LAGOS, VERTENTES, ETC.

3 - NORMAS DE ACONDICIONAMENTO E MANUTENO DAS AMOSTRAS

s amostras de produtos facilmente alterveis podero ser acondicionadas em recipientes isotrmicos, e

As refrigeradas perecveis devero ser analisadas em um perodo mximo de 12 horas; as congeladas

Controle de qualidade um componente necessrio de um programa de garantia de qualidade do trabalho

O controle de qualidade permite tambm o reconhecimento de erros, quando ocorrem, e a tomada de

Um benefcio indireto do programa de garantia de qualidade a padronizao de metodologias, pois a

Deve estabelecer procedimentos corretivos quando detectada a qualidade inaceitvel.

Os equipamentos eltricos e mecnicos devem ser includos em programa de manuteno preventiva.

QUADRO PARA CONTROLE DE EQUIPAMENTOS

Adquirir quantidades pequenas para garantia da estabilidade e validade do produto.

Adquirir os anti-soros em laboratrios ou instituies reconhecidas.

Testar periodicamente aps a reidratrao ou diluio.

A vidraria utilizada deve ser de borosilicato neutro.

A lavagem deve ser feita com detergente apropriado e gua quente.

Manter resfriamento durante a adio do cido), antes da lavagem.

Aps a lavagem e secagem (mximo 60C) preparar a vidraria, acondicionando adequadamente.

Esterilizar o material no volumtrico a 170C por 2 horas (calor seco).

a) Placas de petri - verter gar no seletivo em diversas placas coletadas ao acaso.

Deixar solidificar e incubar em aerobiose e/ou anaerobiose (a 30C por 48 horas).

necessria a avaliao sistemtica dos meios adquiridos desidratados ou aqueles preparados no

Quando especificado no rtulo, manter sob refrigerao ou em frasco escuro.

Verificar prazos de validade.

Descartar meios e reagentes hidratados ou com colorao alterada.

Para ajuste de pH de meios, nunca utilizar cidos ou bases fracas.