Sunteți pe pagina 1din 51

UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE GR.T.

POPA IAI
FACULTATEA DE MEDICIN

Rezumat
al tezei de doctorat
Implicaii ale formulrilor cu eliberare
prelungit n reducerea efectelor adverse

COORDONATOR TIINIFIC,
Prof. Univ. Dr. Carmen Lcrmioara Zamfir
Prof. Univ. Dr. Ctlina Elena Lupuoru

DOCTORAND,
Rzvan Cosmin Tudor

IAI
- 2015 -
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

CUPRINS

PARTEA GENERAL

Capitolul I Formulri cu eliberare modificat-consideraii generale 1

I.1.Evoluia sistemelor de eliberare a medicamentelor 1


I.2.Sisteme de transport i eliberare a substanelor medicamentoase 3
-repere farmacoterapice
I.3.Microparticule - metode de producere 5
I.4. Biomateriale-tipuri, degradare 14
Capitolul II - Morfologia ficatului-structur, ultrastructur 16

Capitolul III Dantrolen - Caractere generale, mecanism de aciune 22


III.1. Caractere generale 22
III.1.1. Scurt istoric al sintezei i evoluiei dantrolenului 22
III.1.2. Indicaii terapeutice 22
III.2. Dantrolen-Particulariti de structur 23
III.3. Mecanism de aciune 24
Capitolul IV Alterri hepatice produse de principii active sub diverse 28
forme
IV.1. Date generale, factori de risc
28
IV.2. Mecanisme generale de hepatotoxicitate 29
IV.3. Mecanisme de reglare a apoptozei la nivel hepatic 36
IV.4. Mecanisme de protecie i regenerare 39
IV.5. Modaliti de alterare hepatica indus de medicamente 40

PARTEA PERSONAL

Capitolul V Motivaia i obiectivele studiului personal 42


Capitolul VI Material i metode 44
VI.1. Material 44
VI.2. Metode de lucru 46
VI.2.1. Prepararea microparticulelor de chitosan 46
VI.2.2. Caracterizarea microparticulelor de chitosan funcionalizat 47

2
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

VI.2.3. Evaluarea dimensiunii microparticulelor 48


VI.2.4. Evaluarea biocompatibilitii microparticulelor 48
VI.2.4.1. Testul de hemocompatibilitate 48
VI.2.4.2. Teste de toxicitate 48
VI.2.4.3. Evaluarea biocompatibilitii microparticulelor de 51
chitosan in vivo-examen histopatologic
VI.2.5. Explorri histopatologice i imunohistochimice 51
VI.2.6. Explorri biochimice 53

VI.2.7. Analiza statistic 56


Capitolul VIIRezultate 57
VII.1. Evaluarea caracteristicilor microparticulelor de chitosan 57
VII.1.1.Analiza spectral n infrarou a chitosanului funcionalizat 57
VII.1.2. Estimarea coninutului de dantrolen n microparticule 57
de chitosan
VII.1.3. Analiza spectral n infrarou 57
VII.1.4. Evaluarea dimensiunii microparticulelor 59
VII.1.5. Teste de toxicitate 60
VII.1.6. Evaluarea hemocompatibilitii microparticulelor 61
VII.2. Evaluarea greutii animalelor de laborator din loturile studiate 66
VII.3. Evaluarea principalilor parametri biochimici care monitorizeaz 68
activitatea la nivel hepatic
VII.3.1. Evoluia fosfatazei alcaline 68
VII.3.2. Evoluia AST 70

VII.3.3 Evoluia ALT 72

VII.3.4 Evoluia bilirubinei 75

VII.3.5 Evaluarea proteinelor totale 80

VII.3.6 Evoluia SOD 86


VII.4. Examen histopatologic 90
VII.5 Evaluare imunohistochimic-anticorpi antifluorescein 97
Capitolul VIIIDiscuii 105

Capitolul IX Concluzii 120

Bibliografie 122

3
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

PARTEA PERSONAL
CAPITOLUL V
MOTIVAIA I OBIECTIVELE STUDIULUI PERSONAL
Studiul administrrii formulrilor cu eliberare prelungit i impactul
acestora n reducerea efectelor adverse se dovedete a fi extrem de actual i de
aplicat pe tiparul modern al unei terapii bazate pe eficien, eliberare prompt a
principiilor active, precum i pe nlturarea inconvenientelor generate de
administrarea clasic. n acest scop, un accent tot mai mare se pune n prezent pe
chimia i biochimia reaciilor metabolice, punctndu-se n mod deosebit
impactul lor asupra toxifierii, detoxifierea sau inactivrii medicamentelor ce
urmeaz a fi administrate, relevarea relaiei indispensabile dintre lanul de etape
metabolice succesive i evaluarea cantitativ a medicamentului, identificarea
complet a tuturor modificrilor care pot apare la nivelul proprietilor
fizicochimice care iau natere pe parcursul biotransformrii principiilor active
ncorporate. Toate aceste elemente contribuie n mod direct la abordarea celui
mai potrivit design care va fi folosit pentru configurarea dinamic a
medicamentului vizat.
n acest studiu ne-am oprit asupra dantrolenului- singurului remediu
terapeutic utilizat n prezent n prevenia i terapia hipertermiei maligne, dar,
dup cum au demonstrat tot mai multe studii, implicat i ntr-o palet extrem de
larg de afeciuni neurologice sau cardiovasculare. Cunoscut drept un antagonist
redutabil al receptorilor rianodinici, rmne medicamentul de elecie n
hipertermia malign, afeciune autosomal dominant, care este declanat de
anestezice volatile de tipul halotanului sau de administrarea unor relaxante
musculare(succinilcolin), care produc o cretere masiv i incontrolabil a
metabolismului oxidativ n muchiul striat, depind capacitatea corpului de a
controla balana O2/CO2 i temperatura corporal. n condiiile n care durata de
administrare a dantrolenului i incidena complicaiilor sau moartea sunt direct
proporionale, de multe ori intervenia n acest caz este urgent, cu administrare
intravenoas de dantrolen, pentru contracararea rapid a efectelor acestui
sindrom asupra organismului. Trebuie bine precizat doza de dantrolen care
asigur obinerea efectului terapeutic scontat, formulrile cu un volum mai
sczut permind o administrare mai uoar, mai facil de controlat i ntr-o
manier mult mai rapid. O serie de studii au vizat includerea dantrolenului ntr-
un nveli fosfolipidic, dar acesta a determinat o capacitate de agregare anormal
a particulelor, care a condus la embolii pulmonare. Ph-ul crescut din formulrile
curente este rspunztor pentru iniierea i creterea potenialului unei necroze
secundare, consecutiv extravazrii sanguine i alterrilor tisulare.
n prezent, acest miorelaxant cu aciune direct asupra muchiului striat
scheletic poate contribui la ameliorarea declinului cognitiv i al neuropatologiei

4
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

asociate bolii Alzheimer, prin normalizarea homeostaziei Ca intracelular-


element cheie n modularea i reducerea disfunciilor sinaptice.
Dantrolenul exercit efecte antiaritmice, prezervnd efectele inotropice ale
cardiocitelor, prin scderea incidenei Ca diastolic, precum i prin creterea
pragului de Ca din reticulul sarcoplasmatic la care survine un aflux spontan de
calciu, contribuind astfel la scderea pierderilor de Ca intrareticulare.
Faptul c dantrolenul a rmas n terapia sindromului de hipertermie
malign drept unicul remediu, cu eficien dovedit, pledeaz pentru importana
acestuia n practica medical curent, cu att mai mult cu ct poate acoperi
benefic i alte afeciuni, unele dintre ele fr a dispune deocamdat de o terapie
cert i bine precizat. Modalitatea clasic de administrare a dantrolenului
prezint riscul major de a induce o hepatotoxicitate ireversibil, fapt ce limiteaz
considerabil utilizarea sa. Din acest motiv, se recomand ntotdeauna o
monitorizare atent a funciei hepatice la debutul terapiei, precum i n timpul
su, cu recomandarea ferm de a opri tratamentul n momentul identificrii
oricrui semn de suferin hepatic, preexistent sau indus.
Pornind de la ideea marii disponibiliti a dantrolenului de a se implica
activ n reducerea sau diminuarea considerabil a anvergurii unor afeciuni care
nu sunt soluionate terapeutic n momentul de fa, ne-am concentrat asupra
investigrii efectelor sale la nivel hepatic, n condiiile n care renunm la
administrarea sa intravenoas clasic i folosim un sistem de eliberare pe baz
de microparticule de chitosan.
Aceast arie a tehnologiei farmaceutice a progresat enorm, utilizarea de
microparticule fiind preferat de multe ori, ntruct ofer o protecie efectiv a
agentului activ ncapsulat fa de degradarea enzimatic, putndu-se controla
administrarea sa uoar i prelungit. Pe de alt parte, materialul utilizat n
obinerea acestor microparticule are o influen semnificativ asupra profilului
de eliberare a medicamentului de-a lungul membranelor celulare, putnd
interveni asupra unei eliberri prelungite i a unui transport mai lent intracelular.
De cele mai multe ori, corelaia dintre cantitaea de medicament ce poate fi
descrcat i eliberarea sa procentual sugereaz faptul c absorbia
medicamentului dintr-un astfel de sistem esste controlat mai curnd de rata de
eliberare, dect de permebilitatea epitelial. Definiia clasic pentru
microparticule este cea a unor particule cu dimensiuni cuprinse ntre 1-1000m;
cele obinute i folosite de noi n experimentul pe animale de laborator au un
diametru de 4,61 m i ne-au permis, printr-un marcaj fluoresceinic,
vizualizarea lor n parenchimul hepatic.
Formulrile farmaceutice cu eliberare modificat pot oferi oportuniti
specifice n modularea eliberrii de medicamente, utilizarea unor polimeri
biodegradabili de tipul chitosanului permind eliminarea unor poteniali factori
toxici locali, care s se supraadauge efectelor adverse generate de medicamentul
n sine.

5
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

Reaciile parenchimului hepatic au fost explorate prin prisma profilului


lor histopatologic i respectiv al amplitudinii reaciilor biochimice care
evalueaz cei mai importani markeri ai activitii hepatice, astfel nct s poat
oferi o imagine de ansamblu ct mai cuprinzatoare a proceselor fiziopatologice
care au loc, cu accent deosebit pe explorarea reactivitii distincte, individuale, a
componentelor direct implicate. Dantrolenul este un compus extrem de puin
solubil n ap, dar puternic solubil n lipide, fapt care afecteaz administrarea sa
intravenoas, deoarece solubilitatea reprezint unul din parametrii greu de
controlat.
Particulele de chitosan sunt biodegradabile, uor de prelucrat i datorit
structurii lor polimerice cationice specifice, sunt dependente de solubilitatea,
greutatea molecular i gradul de ionizare al medicamentului ncorporat;
totodat structura sa chimic permite efectuarea fr mari dificulti a unor
modificri,cu introducerea unor grupri specifice, care pot face chitosanul
accesibil unui mare numr de utilizri practice. Proprietile biologice naturale
ale chitosanului l susin pentru o divers utilizare biomedical i farmaceutic.
Considerm c monitorizarea celor mai importante aspecte ale reactivitii
hepatice n acest context se integreaz foarte bine n tendinele curentului actual
de valorificare a nano/microtehnologiei n vederea reducerii toxicitii diverselor
principii active, printre care se numr i dantrolenul. Rezultatele acestui studiu
derulat pe parcursul acestei teze de doctorat vor permite o apreciere consistent
a reactivitii acestuia, cu direct aplicabilitate clinic.

6
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

CAPITOLUL VI
MATERIAL SI METODE

VI.1. Material
Loturi experimentale
Studiul experimental efectuat n cadrul tezei de doctorat a utilizat obolani
albi rasa Wistar, masculi aduli, cu greutatea cuprins ntre 220-250g, furnizai
de Biobaza Institutului Cantacuzino, Bucureti. Animalele au fost inute n
condiii standard de laborator (cu temperatur constant de 21C 2C,
umiditate relativ de 50-70% i regim de iluminare alternant (raport lumin/
ntuneric = 12 ore/12 ore), cu hran i ap disponibil ad libitum. Pentru a evita
influenele cronobiologice, testele s-au efectuat n intervalul cuprins ntre orele
8-12 a.m. De asemeni, li s-a permis aclimatizarea la noile condiii de mediu,
timp de o sptmn, nainte de nceperea experimentului.
Derularea ntregului experiment s-a efectuat cu acordul Comisiei de Etic
Medical a Universitii de Medicin i FarmacieGrigore T. Popa Iai, cu
respectarea normelor de lucru internaionale cu animale de laborator (Directive
2010/63/EU).
Experimentele s-au desfurat dup protocoale dinainte stabilite, utiliznd
teste acceptate internaional, pentru investigarea toxicitii acute la obolan,
cercetarea biocompatibilitii i a efectelor toxice ale dantrolenului, ncorporat
sau nencorporat n microparticule, cu diferite ci de administrare, la nivel
hepatic. Durata experimentului a fost redus la minimum posibil i s-a folosit cel
mai mic numr de animale pe lot.
Pentru determinarea toxicitii acute au fost utilizate 2 loturi de obolani
albi, Wistar, aduli, de sex masculin, n greutate de 220-250g, tratai astfel:
Lot 1 microparticule cu chitosan, doze ntre 1000 mg/kg corp i 5200
mg/kg corp, pe cale intraperitoneal;
Lot 2 microparticule cu chitosan i Dantrolen, doze ntre 1000 mg/kg
corp i 5080 mg/kg corp, pe cale intraperitoneal.
Pentru determinarea in vivo a biocompatibilitii histologice i
hematocompatibilitii microparticulelor s-au utilizat 24 obolani masculi, rasa
Wistar, cu o greutate de 200-220 g, repartizai n loturi:
Lotul 1- lot martor, ser fiziologic, 0,5 ml/100g corp obolan/zi, pe cale
intraperitoneal;
Lotul 2 microparticule de chitosan, 65 mg/kg corp, pe cale
intraperitoneal.

Microparticulele au fost suspendate n ser fiziologic, cu carboximetilceluloz


0,3%. Doza de substan administrat la obolani, reprezint 1/80 din DL50,
ceea ce corespunde la 65 mg/kg corp (microparticule de chitosan). Substanele

7
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

au fost administrate n doz unic, iar prelevarea fragmentelor tisulare n


vederea examinrii histopatologice a fost realizat la 7 zile.
Dup acest interval, animalele au fost eutanasiate, au fost prelevate
fragmente tisulare din principalele organe, care au fost prelucrate n vederea
includerii lor la parafin, apoi secionate i colorate specific
(Hematoxilin&Eozina), pentru a putea fi examinate microscopic.
Pentru cercetarea biocompatibilitii dantrolenului ncorporat sau
nencorporat n microparticule, cu diferite ci de administrare, au fost utilizate 4
loturi a cte 8 obolani albi, Wistar, aduli, de sex masculin, n greutate de 220-
250g, dup cum urmeaz:
Lot 1 martor, ser fiziologic, 0,5 ml/100 g corp obolan/zi;
Lot 2 Dantrolen, 5mg/kgc, pe cale oral;
Lot 3 Dantrolen, 5mg/kgc, pe cale intravenoas;
Lot 4 Dantrolen ncorporat n microparticule de chitosan, 63,5 mg/kg
corp/zi, pe cale intravenoas.
Substanele administrate au fost suspendate n ser fiziologic, coninnd
carboximetilceluloz 0,3%. Doza de substan administrat la obolani,
reprezint 1/80 din DL50, ceea ce reprezint 63,5 mg/kg corp (microparticule de
chitosan cu Dantrolen). Administrarea pe cale intravenoas a fost realizat la
nivelul venei laterale a cozii obolanilor aflai n studiu (Wang et al, 2014; ).
Animalele au fost cntrite la nceputul i la sfritul experimentului (4
sptmni), n paralel cu recoltarea probelor de snge, din plexul retroorbitar al
obolanilor, pentru determinarea parametrilor biochimici, n aceleai momente
ale experimentului, dup o prealabil anestezie cu ketamin; n final, animalele
au fost eutanasiate dup anestezie cu thiopental, urmat de prelevarea de
fragmente de esut hepatic de la fiecare din obolanii utilizai.

Pentru cercetarea distribuiei la nivel hepatic a dantrolenului ncorporat n


microparticule, a fost utilizat un lot de 18 obolani albi, Wistar, aduli, de sex
masculin, n greutate de 220-250g, tratai cu Dantrolen ncorporat n
microparticule de chitosan, n doz de 63,5 mg/kg corp/zi, pe cale intravenoas.
Substanele au fost administrate n doz unic, n acelai moment (momentul 0).

Probele histologice au fost recoltate de la cte 3 obolani din lot, la


urmtoarele momente: momentul 0, dup 2 ore de la administrare, dup 4 ore,
dup 6 ore, 12 ore i 24 ore de la administrare. Microparticulele de chitosan
avnd dantrolen ncorporat au fost marcate cu fluorescein, pentru studiul
imunohistochimic.

8
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

VI.2. Metode de lucru


VI.2.1. Prepararea microparticulelor de chitosan
n ultima perioad micro-particulele de chitosan obinute prin utilizarea
unui agent de reticulare extern, de tipul tripolifosfat sodic, sunt din ce n ce mai
utilizate n dezvoltarea de forme farmaceutice, care s asigure eliberarea
prelungit i controlat a substanei active. Microncapsularea este definit ca o
metod de ambalare a solidelor, lichidelor sau gazelor n miniatur, capsulele
rezultate putnd elibera substana activ n mod controlat i n condiii speciale
(Desai et al, 2005). Un astfel de sistem de cedare controlat a medicamentelor,
obinut prin utilizarea chitosanului sau a derivailor si, poate fi folosit n
vederea ncapsulrii a diferite principii active: proteine/peptide, factori de
cretere, compui cu aciune anti-inflamatoare, antibiotice, compui cu aciune
antitumoral (Dash et al., 2011). Se estimeaz c exist o gam extrem de larg
de astfel de substane active, care i pot mri substanial eficiena terapeutic, n
urma administrrii lor n acest mod.

Chitosanul, fluoresceina, tripolifosfatul pentasodic, solvenii organici au


fost procurai de la compania Sigma Aldich.

Funcionalizarea chitosanului cu fluorescein:


Chitosanul cu greutate molecular mic a fost supus reaciei cu
fluoresceina n mediu de acid acetic diluat (Fig.6.1). Raportul molar folosit ntre
chitosan i fluorescein a fost de 1:1,5, lundu-se n calcul masa molecular
medie a unitii glucozaminice dezacetilate (Mr unitate=168,14 g). Schema de
sintez a fost optimizat prin adaptarea unor metode citate n literatura de
specialitate pentru obinerea altor derivai de chitosan.
Astfel, 0,1 g chitosan cu greutate molecular mic (0,00056 moli) a fost
dizolvat n 40 ml acid acetic 1%, dup care s-a adugat n pictur, sub agitare
magnetic, fluoresceina (0,27 g, 0,00084 moli) dizolvat n 40 ml alcool etilic
absolut. La scurt timp, suspensia iniial format se transform n soluie
limpede galben-verzuie. Aceasta a fost supus agitrii magnetice pentru 24 de
ore la ntuneric, la temperatura camerei, dup care pH-ul a fost ajustat de la 4,5
la 9 prin adugarea unei soluii de NaOH 15%.
La aceast valoare a pH-ului a precipitat produsul de reacie, care a fost
separat prin centrifugare la 8000 RPM i splat de cteva ori cu ap distilat.
Produsul final a fost uscat prin liofilizare.

9
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

Fig.6.1 Schema de obinere a chitosanului funcionalizat

Caracterizarea chitosanului funcionalizat


Analiza spectral n infrarou
Spectrul n infrarou al chitosanului funcionalizat a fost nregistrat
utiliznd un spectrometru FT-IR ABB Bomem MB-3000 (Canada), dup 32 de
scanri pe o scar de la 4000-500 cm-1, cu o rezoluie spectral de 4 cm-1.

Microncapsularea dantrolenului cu ajutorul chitosanului funcionalizat:


Substane necesare:
Dantrolen sodic
Chitosan funcionalizat
Tripolifosfat pentasodic (TPP)
Solveni: DMSO, acid acetic 1 %, ap distilat
Tehnic de lucru:
Microparticulele de chitosan au fost preparate prin metoda reticulrii
chimice. Astfel, chitosanul funcionalizat a fost dizolvat n acid acetic 1% pn
la obinerea unei concentraii de 0,1% n substan uscat. Apoi 0,1 ml soluie
dantrolen sodic 2,5 % n DMSO a fost amestecat cu 10 ml soluie chitosan
funcionalizat 0,1%. Amestecul obinut a fost adus n pictur, printr-un ac de
sering (18 G), sub agitare magnetic (700 RPM), n 5 ml soluie apoas TPP
1%. Microparticulele obinute au fost lsate sub agitare uoar (300 RPM) timp
de 24 de ore, n contact cu soluia de TPP folosit, pentru realizarea unei
reticulri eficiente, dup care au fost separate prin centrifugare la 8000 RPM
timp de 10 minute, splate cu ap distilat i uscate prin liofilizare. Potocolul de
lucru a fost stabilit conform tehnicilor descrise n literatura de specialitate
(Qingshen et al, 2012; Hao et al, 2010) cu mici modificri.

VI.2.2. Caracterizarea microparticulelor de chitosan funcionalizat


Microparticulele de chitosan funcionalizat dantrolen au fost
caracterizate din punct de vedere al eficacitii de ncapsulare precum i al
capacitii de ncapsulare. Am inut cont de faptul c profilul de eliberare a
substanei incorporate n microparticulele de chitosan depinde nu numai de
durata procesului de reticulare(cu ct acesta este mai mare, cu att procentul de
10
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

eliberare activ scade), ci i de concentraia chitosanului(cu ct e mai mare, cu


att viteza de eliberare a substanei active e mai mic), masa sa molecular i
concentraia TPP(valori crescute reduc eliberarea substanelor), precum i de
caracteristicile mediului de eliberare, ntruct un pH acid va diminua
semnificativ eliberarea substanei active.
ncorporarea substanei active (dantrolen) a fost confirmat i prin analiz
spectral(spectroscopia n infrarou, folosind un spectrometru cu transforman),
bazat pe interaciunea dintre radiaiile electromagnetice cu particulele de
substan activ(pot absorbi radiaii cu lungimi de und variabile), urmat de
analiza distribuiei i intensitii benzilor de absorbie specific rezultate.

Estimarea coninutului de dantrolen n microparticule de chitosan:


Cantitatea de dantrolen ncapsulat a fost determinat spectrofotometric,
utiliznd un spectrofotometru CINTRA 2020, GBC Scientific Equipment.
Cantitatea de dantrolen liber (rmas nencapsulat) a fost determinat
dup separarea microparticulelor prin centrifugare. Supernatantul astfel obinut a
fost analizat spectrofotometric prin citire la 348 nm (maximul de absorbie al
dantrolenului).
Pentru determinarea concentraiei de substan din supernatant s-a trasat
curba de etalonare pentru dantrolen. Aceasta s-a realizat prin prepararea a 10
soluii de dantrolen n DMSO, de diferite concentraii (2,71-27,1 g/ml) i
citirea extinciilor acestor soluii la 348 nm folosind ca i martor DMSO.
Eficacitatea de ncapsulare (E) i capacitatea de ncapsulare (C, g/100g)
au fost determinate folosind urmtoarele formule:
E= (cantitatea total de dantrolen - cantitatea de dantrolen
nencapsulat)/cantitatea total de dantrolen x 100 (1)
C= (cantitatea total de dantrolen - cantitatea de dantrolen nencapsulat)/
cantitatea total de microparticule x 100 (2)

VI.2.3. Evaluarea dimensiunii microparticulelor


Pentru masurarea dimensiunii micorparticulelor s-a folosit
spectrofotomerul de difuzie dinamica a luminii (Dynamic Light Scattering-
DLS) Zetasizer NS, conform standardului ISO 13321: 1996.

VI.2.4. Evaluarea biocompatibilitii microparticulelor


Particulele de chitosan ncrcate cu medicament sunt descompuse n
medicamentul propriu zis i chitosan liber. n timp ce medicamentul ptrunde n
celula vizat i genereaz efecte specifice, chitosanul este degradat catalitic de
lizozomii i enzimele bacteriene din intestinal gros. Chitosanul absorbit n snge
este eliminat la nivel renal.

VI.2.4.1. Testul de hemocompatibilitate


Hemocompatibilitatea este o cerin obligatorie pentru orice biomaterial
care intr n contact cu sngele, n condiiile n care interaciunea materialelor cu
11
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

componentele sanguine poate duce la modificri ale principalilor parametri ai


coagulrii. Deoarece n studiul nostru, microparticulele de chitosan se vor
administra perenteral, s-a apreciat hemocomptibilitatea lor utiliznd un test
standard de coagulare.
n acest sens, s-au determinat la lotul martor i lotul cruia i s-au
administrat microparticulele analizate:
- timpul de protrombin (TP)
- fibrinogenul
- TTPA

VI.2.4.2. Teste de toxicitate


Testarea toxicitii acute a microparticulelor de chitosan/dantrolen
Testele pentru determinarea toxicitii acute a unei substane evalueaz
efectele adverse care survin la scurt timp dup administrarea unei singure doze
din substana vizat. De obicei aceste teste se efectueaz pe oareci sau obolani
maturi, femele (pentru c sensibilitatea lor este mai pronunat), pentru a releva
o posibil toxicitate.
Cel mai precis indicator este DL50, o medie cu valoare statistic mare, n
timp ce DL01 i DL99 sunt cele dou extreme care reprezint doar variaii
individuale rezultate n urma administrrii unei substane cu potenial toxic.
Determinarea DL50 se poate face prin urmtoarele metode:
o Metoda aritmetic Karber-utilizeaz administrarea unor doze cresctoare
n proporie geometric, rezultatele obinute sunt satisfctoare, formula
de calcul este facil, dar are dezavantajul folosirii unui numr mare de
animale
o Metoda up and downiniial se face un test de limitare, urmat apoi de
testul principal. Acesta const n administrarea unor doze, dintr-o serie de
doze egal distanate pe o scal geometric. Fiecare animal se urmrete cu
atenie pentru un interval de 48 de ore. Se noteaz semnele de toxicitate
acut care apar. Unui animal i se administreaz o doz considerat ca
apropiat de DL50. Dac acest animal moare, al doilea se injecteaz cu
doza mai mic imediat urmtoare. Dac primul animal supravieuiete, se
injecteaz cu doza imediat mai mare. Rezultatele obinute sunt
satisfctoare, nu necesit foarte multe animale, dar formula de calcul este
complicat i poate genera erori
o Metoda Miller &Tainter-estimarea DL50 i a erorii standard se determin
printr-o metod grafic, dar necesit multe animale i este laborioas
o Metoda Lorke are dou faze succesive n care dozele administrate se
monitorizeaz iniial 24 de ore, apoi rezultatele se raporteaz dup ce se
evaluea cea mai mare doz la care animalele supravieuiesc i respectiv

12
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

cea mai mic doz la care animalele mor; folosete puine animale, iar
rezultatele sunt grevate de erori.(Patel, 2004).

Investigarea toxicitii acute


Evaluarea toxicitii acute s-a efectuat in vivo dup administrarea
parenteral a unei singure doze la obolan.
Investigarea toxicitii acute a microparticulelor cu chitosan, respectiv a
microparticulelor cu chitosan i Dantrolen a constat n determinarea dozei letale
medii (DL50) doz care apreciaz cantitatea minim estimativ de substan
care produce moartea a cel puin 50% din animalele de experien, dup
administrare unic. (Zbinden G. et al., 1981) Stabilirea DL50 la animale de
laborator este deosebit de util pentru aprecierea gradului de toxicitate acut a
unei substane nou testate.
Tehnica folosit pentru determinarea DL50 este metoda aritmetic Karber,
care ofer o estimare nonparametric a mediei i deviaiei standard pentru o
substan dat.
Pentru stabilirea DL50 s-a utilizat urmtoarea formul de calcul:
DL50 = DL100 - (axb) / n,

unde: a = diferena dintre dou doze succesive de substan administrate;


b = media numrului de animale moarte din dou loturi succesive;
n = numrul de animale dintr-un lot;
DL100 = doza letal 100 (reprezentnd cantitatea de substan care
produce moartea tuturor animalelor de experien).

Metodologie
Principiile metodei aritmetice Karber
- doza trebuie s creasc cu proporia geometric a seriei(logaritmul dozei cu
seriile aritmetice)
- numrul animalelor din fiecare grup trebuie s fie egal
- rspunsul obinut trebuie s corespund unei curbe de distribuie Gaussian
- se utilizeaz intervalul principal al numrului de animale moarte din fiecare
grup/diferena dozelor pentru fiecare interval.
Aceast metod nu impune ca dozajul unei substane s fie egal spaiat
de-a lungul testului, dar trebuie precizat faptul c divergena puternic a dozelor
poate determina un rezultat controversat. Unii specialiti afirm c se pot folosi
i grupe inegale de animale, dar diferena numeric dintre ele sa fie redus.
Inserarea mediei dimensiunii grupurilor n formula de calcul nu afecteaz
sensibil rezultatele.
Observarea animalelor tratate pe parcursul unei perioade de studiu a
inclus:
13
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

- aspectul general raportat la animalele de control,


- debutul, intensitatea i durata efectelor toxice,
- modificri n comportament, motilitate, amplitudinea respiraiei,
apetitul, aportul de lichide
- monitorizarea greutii corporale, aportului alimentar, consumul de
ap, turgescena pielii.
Animalele de experien au fost urmrite n ceea ce privete
comportamentul, semnele vitale, notndu-se apariia eventualelor modificri
sugestive unei stri toxice, la urmtoarele momente de timp: 24 ore, 48 ore, 72
ore, 14 zile, dup administrarea substanelor (Vogelweid C.M., 1994):
Din analiza scrii de toxicitate Hodge-Sterner, se constat faptul c
substanele cu DL50 peste 5000mg/kg corp sunt practic netoxice pentru
animalul de experien (Tabel 6.II)

VI.2.4.3. Evaluarea biocompatibilitii microparticulelor de chitosan in


vivo-examen histopatologic.
Pentru determinarea in vivo a biocompatibilitii microparticulelor de
chitosan, au fost utilizai obolani albi, rasa Wistar, masculi, cu o greutate de
200-220 g, care au fost repartizai n loturi i au primit substanele de testat
conform schemei prezentate n subcapitolul VI.1.
Microparticulele au fost suspendate n ser fiziologic, cu
carboximetilceluloz 0,3%. Substanele au fost administrate n doz unic, iar
prelevarea fragmentelor tisulare n vederea examinrii histopatologice a fost
realizat la 24 ore i la 7 zile.
Dup acest interval, animalele au fost eutanasiate, fragmente tisulare din
organele vitale au fost prelevate, procesate n vederea includerii lor la parafin,
secionate i colorate(H&E), dup care au fost examinate microscopic, utiliznd
un microscop Nikon Eclipse 50i, pentru a observa dac exist alterri tisulare
care s evidenieze impactul administrrii microparticulelor de chitosan ..

VI.2.5. Explorri histopatologice i imunohistochimice


Fragmentele prelevate au fost prelucrate specific prin tehnica includerii la
parafin(deshidratare cu alcool etilic, clarificare cu xilen, parafinare la cald, la
termostat, secionarea blocului de parafin, montarea lamelelor), dup care s-au
colorat specific cu H&E.

Evaluare imunohistochimic
Pentru acest studius-au utilizat anticorpi monoclonali antifluorescein,
vizualizai cu ajutorul Novo link Max Polimer Detection system.

14
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

VI.2.6. Explorri biochimice


Determinarea principalilor parametri ai funciei hepatice

a. Fosfataza alcalin
-se determinn prin metoda spectrofotometric(test colorimetric). Principiul
metodei pornete de la faptul c fosfataza alcalin n mediu alcalin, la un pH de
8,6, va cataliza hidroliza p-nitrofenilfosfat n p-nitrofenol i fosfat.Reactivii
folosii sunt : acetat de magneziu, 2-amino-2-metil-1propanol, p-nitrofenilfosfat,
ser recoltat pe heparin. Activitatea fosfatazei alcaline va fi direct proporional
cu creterea progresiv la 405nm a absorbanei p-nitrofenolului(Dean, 2002).

b. Alanin Aminotransferaza(ALAT)-GPT
- se determin prin metoda spectrofotometric. Principiul metodei pornete de la
intervenia alanil aminotransferazei n catalizarea reaciei dintre acidul
alfacetoglutaric i alanin, cu formare de acid glutamic i acid piruvic. Piruvatul
astfel format este ulterior transformat n lactat de ctre NADH+H+, n urma
reaciei cataliat de ctre lactat dehidrogenaz. Reactivi folosii: substrat-L
alanina; cetoglutamat, NADH+H+ i LDH n tampon fosfat-amestec. Viteza de
diminuare a concentraiei NADH+H+, care va trece progresiv n NAD+, se
determin prin scderea absorbiei n UV. Acest factor este direct proporional
cu activitatea ALAT (Rodgerson et al, 1974)

c. Aspartat Aminotransferaza(ASAT)-GOT
- se determin prin metoda spectrofotometric. Principiul metodei se bazeaz pe
intervenia aspartat aminotransferazei n cataliza reaciei dintre acidul
cetoglutaric i acidul aspartic , cu formare de acid glutamic i respectiv acid
oxalacetic. Ulterior, oxalacetatul va fi transformat n malat de ctre NADH+H+,
sub aciunea catalitic a malat dehidrogenazei. Reactivi: substrat-aspartat, MDH,
LDH, cetoglutarat. Viteza de diminuare a concentraiei NADH+H+, care va
trece progresiv n NAD+, se determin prin scderea absorbiei n UV, fiind
direct proporional cu activitatea ASAT (Huang et al, 2006).

d. Bilirubina
-se determin prin metoda spectrofotometric. Principiul metodei se bazeaz pe
reacia direct abilirubinei conjugate cu acidul sulfanilic diazotat, cu formarea
unui azopigment intens colorat n rou-purpuriu. Bilirubina liber reacioneaz
indirect (dup ce a fost desfcut din legtura cu albuminele i a fost
solubilizat) cu acidul sulfanilic diazotat i formeaz acelai compus colorat care
se poate fotometra. Reactivi folosii: soluie acid sulfanilic (reactiv Diazo I),
soluie nitrit (reactiv Diazo II), soluie NaCl 0,9, soluie accelerator(cafein,
benzoat de sodium, acetat de sodium, ap distilat), soluie Fehling II (metoda a
fost modificat, pentru eliminarea produilor secundari care interfera cu dozarea
15
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

bilirubinei. Se adaug soluie Fehling II att n prob ct i n martor). Se


formeaz o bilirubin azoic albastr. n eprubeta n care s-a introdus reactivul
de solubilizare se gsete att bilirubina conjugat ct i cea liber (solubilizat).
Deci n acest eprubet se determin bilirubina total. n eprubeta n care nu se
introduce reactivul de solubilizare se determin doar bilirubina direct
(bilirubina conjugate, sub form de mono i diglucuronid). Bilirubina
indirect se calculeaz scznd bilirubina direct din bilirubina total (Nyhan et
al, 2011).

e. Proteine totale
Plasma este un amestec coloidal, in care proteinele reprezinta cel mai
semnificativ component. Exista doua clase mari de proteine plasmatice:
albuminele si globulinele, intre care raportul optim de concentratie este A / G =
0,8-1,2 (indexul de disproteinemie). Se pot utiliza mai multe metode n acest
scop:
- metoda spectrofotometric, pornete de la principiul conform cruia proteinele,
att n stare normal, dar i modificat chimic au capacitatea de a
absorbi/mprtia lumina din domeniul UV din spectrul electromagnetic.
Utiliznd soluii proteice de concentraie cunoscut, se determin o curb de
calibrare a concentraiei proteice, la care se va raporta ulterior absorbana
soluiei vizate pentru aceeai lungime de und, determinnd apoi concentraia,
pe baza curbei de calibrare (Grimsley et al, 2004).
-metoda biuretului pornete de la principiul conform cruiaproteinele
(macromolecule cu legturi peptidice) reacioneaz cu ionul de cupru n soluie
alcalin, dnd sruri complexe de culoare violet. Intensitatea culorii este
proporional cu valoarea concentraiei proteinelor. Reactivii folosii sunt:
reactivul biuret(sulfat de cupru dizolvat n ap distilat, hidroxid de sodium,
iodur de potasiu, ap distilat), la care se adaug reactivul standard stoc
protein 6g/dl i ser fiziologic.Blancul (martorul) pentru fiecare prob se
efectueaz numai pentru serurile icterice sau cele hemolizate. Are ns
dezavantajul de a fi mai puin sensibil dect cea spectrofotometric.
Electroforeza proteinelor plasmatice (ELFO) permite evaluarea diverselor
fraciuni proteice (Legler et al, 1985).

f. Fibrinogen
- se determin prin metoda coagulometric (Clauss). Principiul metodei de
determinare se bazeaz pe adugarea de trombin concentrat probei analizate,
urmat de msurarea timpului scurs pn la instalarea coagulrii, ca urmare a
prezenei fibrinogenului. Diluia plasmei (normal de 1:10) minimizeaz orice
interferen provocat de anticoagulani de tipul heparinei, etc. Utilizarea unei
concentraii crescute de trombin (100U/ml) face ca timpii de coagulare s fie
independeni de concentraia de trombin, la un nivel variabil al fibrinogenului.
Reactivi folosii: fibrinogen, tampon imidazol lichid (NCCLS, 1994).
16
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

g. Timp de protrombin (TP)


-se determin prin metoda coagulometric. Principiul metodeiare n vedere
faptul c timpul de protrombin sau timpul Quick reprezint un timp de
coagulare care msoar viteza de formare a cheagului prin adugarea unei
cantiti de plasm peste o cantitate definit de tromboplastin tisular - factor
tisular cu adaos de calciu. Deoarece este descris o mare variabilitate a timpului
de coagulare n funcie de tromboplastina folosit, se poate introduce un
parametru nou, INR (International Normalised Ratio = timp de coagulare
pacient/timp de coagulare martor).

h. timpul de tromboplastin parial activat (TTPA)


APTT - timp de tromboplastina partial activat - evalueaza calea intrinseca de
coagulare. Msoara timpul necesar formarii cheagului de fibrina, dupa ce un
activator prin contact al caii - cefalina si o emulsie de fosfolipide, substitut
pentru plachetele sanguine se pun in contact cu plasma pacientului, sraca in
trombocite (acestea se inlatura). Termenul de parial se refer la faptul c
substituenii trombocitari (emulsia de fosfolipide) nu pot activa calea extrinsec
a coagulrii.

i. TAS
- pentru determinarea TAS(capacitate antioxidant total) se utilizeazmetoda
colorimetric cu ABTS (2-azino-di-3-etilbenztiazolin-sulfonat). n urma
incubrii ABTS cu metmioglobin i peroxid vor rezulta radicalii cationici
ABTS+. Acetia au culoare verde, relativ stabil, ce se msoar la o lungime de
und de 600 nm. Antioxidanii prezeni n prob atenueaz aceast culoare,
direct proporional cu concentraia lor. Pentru acurateea determinrii proba
trebuie citit dup exact trei minute.Reacia este liniar pn la o concentraie a
antioxidanilor de 2,5 mmol/l. Valorile normale ale TAS la aduli sunt cuprinse
n intervalul 1,30-1,77 mmol/l (Erel, 2004).

j. Superoxiddismutaza (SOD)
-se determin prin metoda Csovari si Angyal; prin reacia
dintrefenazinmetosulfat (FMS) si NDH se formeaza o solutie stabila de anion
superoxid (O2 -).Aceti anioni au capacitatea de a reduce nitrobluetetrazoliu
(NBT) n nitroformazan, colorat n albastru. Aceasta reactie e inhibata prin
prezenta SOD n solutie care dismuta n anionii superoxid. Nitroformazanul
absoarbe specific la l=550nm (Csovary et al, 1989).

VI.2.7. Analiza statistic


Pentru a valida rezultatele obinute n studiul nostru experimental, am
utilizat analiza lor statistic, prin intermediul urmtoarelor metode parametrice
pentru valori normal distribuite: testul t student, testul ANOVA.

17
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

CAPITOLUL VII
Rezultate

Caracteristicile structurale i funcionale ale sistemului microparticulat


utilizat n acest experiment au fost determinate, preciznd n cadrul analizei
spectrale n infrarou confirmarea formrii unor noi legturi amidice ntre
gruprile amino ale chitosanului i gruparea carboxilic a fluoresceinei, n
spectrul IR fiind identificate benzile de absorbie specifice gruprilor funcionale
ale acestei substane active. De asemeni s-au fcut msurtori pentru
determinarea dimensiunilor microparticulelor, cu precizarea uniformitii
particulelor n suspensie. n acelai context, au fost evaluat DL50 pentru pentru
microparticulele cu chitosan simple i pentru microparticulele cu chitosan i
Dantrolen. Rezultatele obinute au relevat lipsa de toxicitate a acestor
microparticule.
Hemocompatibilitatea este necesar n condiiile administrrii unui
sistem microparticulat pe cale intravenoas, motiv pentru care se determin
hemocompatibilitatea microparticulelor utilizate, prin evaluarea markerilor
specifici ai procesului de coagulare. Astfel, au fost determinate i comparate
valorile fibrinogenului, timpului de protrombin, respective ale timpului parial
de protrombin. n urma analizei datelor obinute se pot face urmtoarele
observaii: nu exist diferene importante ntre valorile indicilor de coagulare ai
probei martor i ai probei de microparticule; toi indicii de coagulare evaluai se
situeaz n limitele valorilor normale, fapt care sugereaz c microparticulele
obinute prezint o bun compatibilitate cu mediul sanguin, deci pot fi folosite n
administrare intravenoas.

Fig.7.1. Spectre IR: -chitosan, -fluorescein, -chitosan funcionalizat cu fluorescein

18
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

Determinarea biocompatibilitii in vivo a microparticulelor prin examenul


histopatologic al fragmentelor tisulare prelevate de la cele 2 grupe de animale de
laborator nu a evideniat apariia unor modificri n morfologia normal
pulmonar, hepatic, renal i cardiac la animalele care au fost injectate cu
microparticulele de chitosan, comparativ cu lotul martor, fapt care pledeaz
pentru biocompatibilitatea lor. Chitosanul folosit n studiul experimental este un
biopolimer biodegradabil, biocompatibil, non toxic, cunoscut pentru
proprietile sale de factor hemostatic i antitumoral, analgesic i antioxidant,
implicat n reducerea nivelului de colesterol, n procesele immune. Acest fapt
este deplin susinut de rezultatele obinute.
Pentru a monitoriza statusul general al organismului, a fost determinata
greutatea n dinamic pentru animalele de laborator utilizate. Analiza
comparativ dintre loturile DIV i MCLD a evideniat faptul c ncepnd din
sptmna III, greutatea obolanilor tratai cu dantrolen intravenos a sczut
semnificativ fa de cea nregistrat la lotul tratat cu dantrolen incorporat n
microparticule, administrat intravenos.
S-a realizat o explorare biochimic amnunit a celor mai
semnificativi markeri care monitorizeaz activitatea la nivel hepatic: fosfataza
alcalin, transaminaze, bilirubina total, cu fraciile sale direc i indirect,
proteine totale, cu albumine, globuline, TAS i SOD, ultimii doi ca repere ale
statusului antioxidant. Gama extrem de larg i de variat de markeri investigai
permite stabilirea cu certitudine a gradului de degradare a funciei hepatice n
studiul experimental derulat.

1.2
y = 0.0358x + 0.0422
1
R = 0.9969

0.8
Absorbance

0.6

0.4

0.2

0
0 5 10 15 20 25 30
Concentration (g/ml)

Fig.7.2. Curba de etalonare a dantrolenului sodic

19
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

260
Greutate medie (g)

240 SI
S II
S III
220 S IV

200
Control DO DIV MCLD
Lot de studiu
Fig. 7.14.Valori medii ale greutii n dinamic pe loturi de studiu

Pentru fosfataza alcalin, cea mai mare valoare medie nregistrat n sptmna
IV a fost la lotul cu administrare de dantrolen intravenos (121,73 U/l), cea mai
redus valoare medie s-a nregistrat la lotul cu administrare de dantrolen
incorporat n microparticule, administrat intravenos.

130
121.73
118.66
120 116.71

110.01109.95 109.74 110.59 110.31


110 SI
FA (U/l)

S IV
100

90

80
Control DO DIV MCLD
Lot de studiu
Fig. 7.15. Valori medii ale fosfatazei alcaline la debutul i finalul studiului
pe loturi de studiu

n ce privete AST, la lotul cu administrare oral de dantrolen, dup 4


sptmni de tratament, valorile medii au crescut de la 122,63 U/l pn la
189,42 U/l (p=0,001).O cretere semnificativ s-a remarcat i la lotul cu
administrare de dantrolen intravenos (122,88 vs 199,95 U/l; p=0,001). Dintre
loturile tratate, la lotul MCLD s-a nregistrat cea mai mic valoare medie AST,
totui creterea fa de cea nregistrat n prima sptmn a fost semnificativ
(168,90 vs 123,02 U/I). Explorarea biochimic a transaminazelor hepatice,
bilirubinei i fosfatazei alkaline permite relevarea, n cazul creterii concentraiei
lor serice, a hepatotoxicitii unui medicament,

20
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

Referitor la ALT, la lotul cu administrare oral de dantrolen, dup 4


sptmni de tratament, valorile medii au crescut semnificativ (56,90 vs 99,17
U/l; p=0,001).La lotul cu administrare de dantrolen intravenos, valorile medii
ALT aproape s-au dublat (57,06 vs 129,39 U/l; p=0,001), nregistrndu-se i cea
mai mare valoare medie comparativ cu celelalte loturi analizate.
La lotul MCLD s-a nregistrat o creterea semnificativ fa de cea
nregistrat n prima sptmn (56,74 vs 110,61 U/I).Valoarea medie a ALT
nregistrat la lotul DIV a fost semnificativ mai crescut n comparaie cu cea
nregistrat la lotul MCLP (129,39 vs 110,61 U/l; p=0,001.

200 189.42 199.95


168.9

150
122.98 122.88 122.63 122.88 123.02
AST (U/l)

SI
100 S IV

50

0
Control DO DIV MCLD
Lot de studiu
Fig. 7.17. Valori medii ale AST la debutul i finalul studiului pe loturi de studiu

150
129.39

110.61
99.17
100
ALT (U/l)

SI
S IV
57.22 57.3 56.9 57.06 56.74
50

0
Control DO DIV MCLD
Lot de studiu
Fig. 7.19. Valori medii ale ALT la debutul i finalul studiului pe loturi de studiu

Evaluarea bilirubinei totale nregistreaz creteri semnificative la lotul DO


1,01 vs 1,86 mg/dl (p=0,001); la lotul DIV 0,99 vs 2,31 mg/dl (p=0,001), fiind
cea mai mare valoare medie post-tratament; la lotul MCLD 1 vs 1,76 mg/dl
(p=0,001), fiind cea mai mic valoare medie post-tratament.

21
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

Evaluarea bilirubinei directe nregistreaz creteri semnificative, cea


mai important la lotul DIV: la lotul DO 0,85 vs 1,28 mg/dl (p=0,001); la lotul
DIV 0,75 vs 1,66 mg/dl (p=0,001); la lotul MCLD 0,70 vs 1,31 mg/dl (p=0,001).
n sptmna IV, la lotul DIV valoarea medie a fost semnificativ mai crescut n
comparaie cu cea de la lotul MCLP (1,66 vs 1,31 mg/dl; p=0,001)(Fig..6.23).
Evaluarea bilirubinei indirecte nregistreaz creteri semnificative, cea
mai important la lotul DIV: la lotul DO 0,16 vs 0,59 mg/dl (p=0,001); la lotul
DIV 0,24 vs 0,78 mg/dl (p=0,001);la lotul MCLD 0,31 vs 0,44 mg/dl (p=0,001).
n sptmna IV, la lotul DIV valoarea medie a fost semnificativ mai crescut n
comparaie cu cea nregistrat la lotul MCLP (0,78 vs 0,44 mg/dl; p=0,001).

2.5 2.31
Bilirubina totala (mg/dl)

2 1.86
1.76

1.5 SI

0.99 0.99 1.01 0.99 1


S IV
1

0.5

0
Control DO DIV MCLD
Lot de studiu
Fig. 7.21. Valori medii ale bilirubinei totale la debutul i finalul studiului

7
6.68 6.68
6.57 6.53 6.58
Proteina totala (mg/dl)

6.02 6.1
6 5.73
SI
S IV

4
Control DO DIV MCLD
Lot de studiu
Fig. 7.23. Valori medii ale proteinelor totale la debutul i finalul studiului pe loturi de studiu

Pentru proteinele totale, cea mai mare valoare medie nregistrat n sptmna
IV a fost la lotul cu administrare de dantrolen incorporat n microparticule,
administrat intravenous (6,10 mg/dl), cea mai redus valoare medie s-a
nregistrat la lotul cu administrare de dantrolen intravenos (5,73 mg/dl).
22
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

Evaluarea albuminelor comparativ pe loturi tratate, nregistreaz


descreteri semnificative, cea mai important la lotul DIV: la lotul DO 4,23 vs
3,85 mg/dl (p=0,001); la lotul DIV 4,23 vs 3,66 mg/dl (p=0,001); la lotul
MCLD 4,21 vs 3,82 mg/dl (p=0,001).
Evaluarea globulinelor a artat faptul c cea mai mare valoare medie
nregistrat n sptmna IV a fost la lotul cu administrare de dantrolen
incorporat n microparticule, administrat intravenous 2,26 mg/dl, pornind de la
o valoare medie de 2,39 mg/dl (p=0,003); cea mai redus valoare medie s-a
nregistrat la lotul cu administrare de dantrolen intravenos de 2,23 mg/dl
raportat la o medie de 2,46 mg/dl nregistrat n sptmna I (p=0,00).
Evaluarea SOD a relevat faptul c cea mai mare valoare medie
nregistrat n sptmna IV a fost la lotul cu administrare de dantrolen
incorporat n microparticule, administrat intravenous 9,64 U/ml, pornind de la o
valoare medie de 10,04 U/ml (p=0,001); cea mai redus valoare medie s-a
nregistrat la lotul cu administrare de dantrolen intravenos de 9,04 U/ml
raportat la o medie de 10,08 U/ml nregistrat n sptmna I (p=0,001).
Evaluarea TAS a artat c se nregistreaz creteri semnificative din
punct de vedere statistic: la lotul DO 4,98 vs 5,10 moli/ml (p=0,001); la lotul
DIV 4,98 vs 5,11 moli/ml (p=0,001); la lotul MCLD 4,93 vs 5,09 moli/ml
(p=0,001). n sptmna IV, valorile medii ale TAS nregistrate la loturile DIV
i MCLP nu au nregistrat diferene semnificative din punct de vedere statistic
(5,11 vs 5,09 moli/ml; p=0,079)
S-au utilizat microparticule de chitosan cu dantrolen ncorporat pentru a
explora reactivitatea hepatic, n urma administrrii sale intravenoase. Exist
situaii cnd principii biologic active devin mai greu de administrat, fie din
cauza organizrii lor n molecule proteice cu greutate molecular considerabil,
fie din cauza caracterului lor hidrofobic pronunat, care nu le permite accesul la
un transport facil ntr-un mediu apos, fie datorit unei susceptibiliti majore de
a fi degradate proteolitic, a unei capaciti mari de a fi hidrolizate sau
denaturate.
Pe msur ce numrul i structura chimic a medicamentelor se multiplic
i se diversific extrem de rapid, se impune introducerea de noi metode de
administrare, astfel nct s se realizeze de fiecare data un impact terapeutic de
maxima amplitudine. Numeroase studii experimentale i trialuri clinice au
evideniat exiatena unei reacii toxice la nivel hepatic, ca urmare a administrrii
de dantrolen.
Studiul histopatologic a precizat natura real a dimensiunilor alterrii
parenchimului hepatic, preciznd evoluia progresiv de la dilatarea sinusoidal
la micro- i apoi macrosteatoz, congestii vasculare i edeme; examenul
imunohistochimic realizat prin utilizarea anticorpilor anti-fluorescein pentru
detectarea microparticulelor cu dantrolen ncorporat marcate cu fluorescein au
evideniat un pattern vasculo-celular de distribuie, cu un maxim la 6, respectiv
12 ore de la administrare.
23
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

Fig.7.41. Lot control. Hepatocite, sinusoide de aspect


normal. Col.HE, .x20.

Fig.7.46. DO. Degenerare microvezicular incipient,


subcapsular. Col.HE, x20.

Fig.7.52. DIV. Steatoz microvezicular. Col.HE, x20.

Fig.7.56.MCLD. Steatoz macrovezicular. Col.HE, x20.

24
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

Fig.7.64. Anti-fluorescein., x20.Explorare la 2 ore


dup administrare.

Fig. 7.68. Anti-fluorescein, x20. Explorare la 4 ore


dup administrare.

Fig.7.75. Anti-fluorescein, x20. Explorare la 6 ore


dup administrare.

Fig. 7.74. Anti-fluorescein, x20. Explorare la 12 ore


dup administrare.

25
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

CAPITOLUL VIII
Discuii

Studiul nostru experimental a urmrit evidenierea reactivitii hepatice


n urma administrrii unui inhibitor rianodinic de tipul dantrolenului, recunoscut
pentru agresivitatea sa fa de structurile hepatice. n contextul n care, n
prezent, utilizarea dantrolenului, dei recomandat pentru diverse patologii, este
limitat de hepatotoxicitatea pe care o induce, am comparat succesiv efectele
administrrii sale clasice, orale/pe cale intravenoas/prin ncorporarea sa n
microparticule de chitosan. Ideea de baz de la care am pornit pentru a construi
designul experimentului a fost aceea de a verifica dac folosirea unui sistem
microparticulat de administrare a dantrolenului ar putea avea un efect de
protecie la nivel hepatic, fapt care ar putea permite utilizarea acestuia la o scar
mult mai larg; monitorizarea s-a realizat prin intermediul unei explorri
complexe, care a urmrit o evaluare biochimic, histopatologic i
imunohistochimic a animalelor din loturile de studiu, pe parcursul a 4
sptmni.
Am ales dantrolenul pentru acest studiu, deoarece, n prezent, asistm la o
nou reevaluare a rolului i efectelor sale i considerm c rezultatele obinute
pot fi integrate ca repere utile pentru noi scheme terapeutice. Dantrolenul, un
miorelaxant cunoscut mai ales pentru capacitatea sa de a fi unicul remediu
folosit n prezent pentru tratarea hipertermiei maligne, este complet diferit, att
din punct de vedere chimic, ct i farmacologic, de restul substanelor ce
acioneaz la nivelul musculaturii striate. Aciunea sa este periferic, nu
central, prin decuplarea excitaiei/contraciei la nivel membranar, fr a avea
efecte selective asupra reflexelor postsinaptice ce vor genera contractura
spastic. De fapt, este un antagonist al receptorilor rianodinici, prevenind
eliberarea de calciu n exces din aceste canale. Persoane cu mutaii ale genelor
codante R1R2 nu prezint nici un simptom n condiii normale, dar n cazul
expunerii la anestezice volatile-halotan, enfluran, isofluran, sevofluran sau la
succinilcolin dezvolt o suit de contracturi spastice la nivelul musculaturii
striate scheletale, pe fondul creterii rapide i brutale a temperaturii corporale i
a ratei contraciilor cardiace, cu tahicardie, scderea tensiunii arteriale i
creterea creatinkinazei serice; se instaleaz progresiv rabdomioliza i
mioglobinuria, pe fondul unei acidoze metabolice extinse. Dac nu se intervine
de urgen cu dantrolen injectabil, mortalitatea este peste 85-88%; dac se
trateaz prompt, mortalitatea scade la 4-5%. n prezent, reacia fa de
hipertermia malign este diferit, datorit influxului a noi tipuri de anestezice,
bazate pe alte principii de aciune, care au determinat o restrngere a folosirii de
succinilcolin de ctre medicii anesteziti, apoi datorit posibilitii depistrii
precoce a hipertermiei maligne prin investigaii genetice i biopsii de esut
muscular pentru testarea in vitro a contractilitii, a accesului facil la dantrolen i

26
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

a monitorizrii preventive a nivelului CO2. Terapia electiv rmne ns tot cea


bazat pe dantrolen (Goldman et al, 2011).
Studii relativ recente au demonstrat implicarea dantrolenului ca resurs
terapeutic n aritmii; multe dintre acestea pornesc de la faptul c o serie de
mutaii ale RyR2 stau la baza tulburrikor de ritm cardiac i cum dantrolenul
este un antagonist al receptorilor rianodinici, ar putea regla i o serie de
disfuncii ale cordului. Potenarea frecvenei cardiace i susinerea izotrop
adrenergic sunt mecanismele primare care intervin n reglarea contraciei
miocardice. Alterarea relaiei dintre fora i respectiv frecvena contraciilor n
tulburrile de ritm miocardic ar putea avea la baz perturbri ale eliberrii
ritmice de Ca de la nivelul RS, cu afectarea homeostaziei intracelulare a Ca,
urmat de descrcri masive citosolice (Wehrens et al, 2005). Persoanele care
dezvolt sindromul hipertermiei maligne prezint frecvent i aritmii
ventriculare, deci dantrolenul poate reprezenta un factor terapeutic pentru
ambele tipuri de afeciuni. Utilizarea dantrolenului drept antiaritmic prin
controlul RyR2, fr a interfera cu eliberarea sistolic de Ca din RS devine cu
att mai important cu ct n prezent modularea comportamentului canalelor de
calciu de ctre antiaritmicele curent administrate nu este pe deplin realizabil, de
multe ori efectele evolund n sens contrar(Kobayashi et al., 2009).
n ultimii ani se vorbete tot mai mult despre o posibil implicare a
dantrolenului n tratamentul bolii Alzheimer, pornind de la considerarea
perturbrilor funciei canalelor de calciu drept trigger pentru un numr
considerabil de tulburri sistemice. Aceste disfuncii pot afecta organe diverse,
de la cord la muchii striai sau creier, iar patologia rezultat cuprinde din ce n
ce mai multe afeciuni, dintre care se pot meniona boala Alzheimer, hipertermia
malign, tulburrile bipolare, autismul, schizofrenia, boala Huntington (Imbrici
et al., 2013). Tratamentul actual al bolii Alzheimer amelioreaz
simptomatologia, dar nu reuete s corecteze i s mpiedice apariia i mai ales
dezvoltarea disfunciilor cognitive care se accentueaz ntr-un ritm rapid.
Administrarea cronic de dantrolen ar avea avantajul de a normaliza procesul de
eliberare a Ca de la nivelul RS, mbuntind realizarea transmiterii sinaptice i
corectnd deficitele de plasticitate neuronal, permind astfel o ameliorare a
funciilor cognitive.
Dei capacitatea de neuroprotecie a dantrolenului a fost verificat i
recunoscut de foarte multe studii clinice i experimentale, se pare c problema
care se ridic n acest context este identificarea unei formule eficiente de
administrare, ntruct penetrabilitatea sa la nivelul SNC este
modest(Chakroborty et al,2013).
Deoarece n multe din aceste situaii se impune un tratament de durat cu
dantrolen, care va genera alterri hepatice, prin studiul de fa am propus
utilizarea unor microparticule de chitosan cu dantrolen ncorporat, n locul
administrrii clasice. Numeroase studii arat faptul c i n administrarea sa
actual, dantrolenul pune o serie de probleme, intrnd n categoria unor
27
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

medicamente care devin mai greu de administrat, fie din cauza organizrii lor n
molecule proteice cu greutate molecular considerabil, fie din cauza
caracterului lor hidrofobic pronunat, care nu le permite accesul la un transport
facil ntr-un mediu apos, fie datorit unei susceptibiliti majore de a fi
degradate proteolitic, a unei capaciti mari de a fi hidrolizate sau denaturate.
Toate aceste procese au ca rezultat modificarea parametrilor lor funcionali, cu o
scdere evident a impactului lor terapeutic. Orice incompatibilitate de ordin
chimic dintre medicament i vehiculul su de administrare n organism se va
rsfrnge asupra puritii, stabilitii i respectiv eficienei sale terapeutice.
Analiza noastr asupra datelor recente din literatur arat c numeroase
studii susin avantajele unei eliberri controlate a medicamentelor, raportate la
administrarea clasic, avantaje ce includ, printre altele, abilitatea de a urmri o
int precis, identificat la nivel celular sau tisular, controlul concentraiei
medicamentului n organism pentru intervale de timp considerabile, protecia
eficient a medicamentului fa de procesele de degradare iniiate de diveri
compui; n acest context, un rol deosebit revine polimerilor, care pot fi utilizai
cu rezultate practice deosebite (Agrawal, 2014). Tot mai multe studii susin
faptul c utilizarea formulrilor cu eliberare controlat pentru administrarea
diverselor medicamente reprezint unul dintre factorii care contribuie n mod
real i benefic la reuita unui numr considerabil de terapii, ndreptate asupra
celor mai complexe aparate i sisteme din corpul uman(Boulangeret al., 2011).
Numeroase date din literatura de specialitate subliniaz un aspect
important legat de dantrolen-dificultile care apar n special n administrarea
intravenoas, datorit solubilitii sale reduse n ap; din acest motiv, ni s-a prut
util folosirea unor microparticule polimerice cu dantrolen ncapsulat, n
condiiile n care designul polimeric poate fi astfel controlat nct s realizeze
funcii biologice cu o precizie deosebit, caracteristicile polimerice pot fi
modulate, iar polimerii se pot obine relativ uor, elibernd att principiile
hidrofile ct i pe cele hidrofobe.
n studiul nostru experimental am preferat alegerea chitosanului, ntruct
este un biopolimer accesibil, biodegradabil, biocompatibil, non toxic, cunoscut
pentru proprietile sale de factor hemostatic i antitumoral, analgesic i
antioxidant, implicat n reducerea nivelului de colesterol, n procesele imune, n
condiiile n care varietatea polimerilor sintetici sau naturali care pot fi folosii n
acest scop este foarte mare i contribuie la crearea unor repere terapeutice
extrem de complexe, cu aplicaii multiple i a cror eficien este susinut de
numeroase rezultate clinice(Vilos et al., 2012).
Formulrile pe baz de chitosan au o larg utilizare, n funcie de
dimensiunile particulelor, de sursa iniial, greutatea molecular, densitate,
vscozitate, gradul de acetilare i metoda de obinere(Cunha et al., 2012; Kumar
RV, 2000; Barreiro-Iglesias et al., 2005).
Participarea sa la eliberarea diverselor substane biologic active utilizeaz
i proprietile sale mucoadezive, care sunt rezultatul unor fore de atracie,
28
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

generate de interaciuni electrostatice ntre gruprile amino libere ncrcate


pozitiv ale chitosanului i suprafee externe ncrcate negativ; mucoadezivitatea
sa crete considerabil n prezena unui mediu acid sau neutru (Balamurugan,
2012).
n studiul nostru, pe parcursul evalurii microparticulelor de chitosan,
rezultatele obinute prin explorarea toxicitii microparticulelor de chitosan
utilizate au evideniat valori pentru DL50 mai mari de 5000mg/kgcorp, fapt care
vine s confirme lipsa de toxicitate a chitosanului. n acelai context, examenul
histopatologic al principalelor organe care reflect statusul funcional al
organismului, dup administrarea microparticulelor de chitosan, nu a decelat
modificri, promovnd nc un argument pentru susinerea utilizrii lor. De
asemeni, deoarece aceste microparticule au fost administrate intravenos, am
analizat i am constatat existena unei hemocompatibiliti care permite
manipularea lor fr apariia unor riscuri de tipul fenomenelor embolice, etc.
n studiul nostru experimental prepararea microparticulelor de chitosan i
ncapsularea dantrolenului s-au realizat prin metode folosite curent, uor de
efectuat, n condiiile n care numeroase studii acord o atenie deosebit
dezvoltrii acelor linii de produse care permit o eliberare a medicamentelor
urmnd traseul unei cinetici reproductibile, dar i predictibile (Ratner et al,
2011). Se prefer ca att tehnicile de preparare, ct i cele de administrare s fie
facile, s nu implice un numr mare de factori complementari, modificnd
profilul de eliberare a medicamentului.
Un alt argument n favoarea utilizrii chitosanului pentru eliberarea de
principii biologic active este biodegradabilitatea sa. Se apreciaz c este
degradat chimic prin procese de cataliz enzimatic, n funcie de
disponibilitatea grupului amino din structura chitosanului i de amploarea
reaciei de deacetilare- cu ct aceasta este mai mare, cu att degradarea va fi mai
mare. Chitosanul este considerat drept un biopolimer non toxic i non iritant,
fiind folosit frecvent drept excipient n diverse formulri farmaceutice(Wang et
al., 2011).
Date din literatura de specialitate confirm faptul c dei sistemele de
eliberare polimerice nu pot fi ncrcate cu doze mari de medicamente
comparativ cu cele pe baz de nanoparticule, exist multe situaii n care acestea
sunt preferabile, preul de cost, precum i abilitatea lor de a depi barierele
biologice fiind doar dou dintre argumente (Kraljevic et al., 2005).
Microparticulele au abilitatea de a mbunti stabilitatea diverilor ageni
terapeutici fa de procesele de degradare, cresc eficiena terapeutic prin
eliberarea intit a medicamentului la nivelul situsului correspondent, meninnd
totodat efectul asupra zonei int vizate, pot schimba situsul de absorbie a unei
substane, fenomen util n cazul cnd aceste substane cu potenial toxic la un pH
redus, reduc sensibilitatea local la aciunea unui anumit medicament(Malik et
al., 2014; Rathore et al., 2012).

29
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

Studiul nostru a analizat microparticulele de chitosan funcionalizat


dantrolen, care au fost caracterizate din punct de vedere al eficacitii de
ncapsulare precum i al capacitii de ncapsulare. ncorporarea substanei
active (dantrolen) a fost confirmat prin analiz spectral-spectroscopia n
infrarou, iar cantitatea de dantrolen ncapsulat a fost determinat
spectrofotometric. Am inut cont de faptul c profilul de eliberare a substanei
incorporate n microparticulele de chitosan depinde nu numai de durata
procesului de reticulare(cu ct acesta este mai mare, cu att procentul de
eliberare activ scade), ci i de concentraia chitosanului(cu ct e mai mare, cu
att viteza de eliberare a substanei active e mai mic), masa sa molecular i
concentraia TPP(valori crescute reduc eliberarea substanelor), precum i de
caracteristicile mediului de eliberare, ntruct un pH acid va diminua
semnificativ eliberarea substanei active.
Studii privind eliberarea controlat a medicamentelor au precizat c este
condiionat de proprieti fizico-chimice ale principiului biologic inclus, de
tipul gradului de solubilitate i al celui de difuzibilitate, la care se adaug
porozitatea nveliului, rata degradrii sale, de morfologia microparticulei
precum i de cantitatea de medicament ncorporat (Xu Q et al. 2009). Din acest
motiv, utilizarea sistemelor microparticulate poate reprezenta o alternativ
viabil, cu beneficii terapeutice, concentrate mai ales pe eliberarea controlat i
susinut a principiilor bioactive, optimizarea maxim a impactului cu substratul
vizat, reducerea semnificativ a toxicitii precum i a posibilelor efecte
adverse(Rashid et al., 2014)
n studiul nostru, ca indicator general al statusului funcional al
animalelor monitorizate, am ales greutatea animalelor, msurat la debutul i
respectiv la sfritul experimentului. Datele rezultate au indicat variaii ale
acestui parametru, o perturbare a valorilor normale printr-o scdere
semnificativ a valorilor medii la lotul DIV, urmat de lotul DO, apoi de lotul
MCLD. Este un prim semnal care ne atrage atenia c aciunea dantrolenului a
fost mai intens la loturile cu administrare clasic, comparativ cu lotul MCLD.
Cele mai multe studii de specialitate converg spre ideea conform creia
determinarea greutii este metoda noninvaziv cea mai simpl care poate fi
utilizat pentru a surprinde modul n care funciile organismului se pstreaz sau
nu nealterate pe parcursul derulrii unui experiment(Ullman-Cullere et al, 1999;
Easterly et al, 2001).
Studiul nostru a artat c dantrolenul, n administrare clasic, este asociat
cu degradarea parenchimului hepatic, proces cu att mai accentuat cu ct durata
de administrare a fost mai ndelungat. Se confirm astfel principiul conform
cruia administrarea convenional a unor medicamentelor poate genera apariia
unor intervale nedorite de toxicitate sau chiar de ineficien. Pentru a observa cu
acuratee modul n care evolueaz alterarea hepatic n raport de modul de
administrare a dantrolenului, am analizat mai nti principalii markeri biochimici
care contureaz profilul funcional hepatic.
30
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

Numeroase studii de specialitate confirm hepatotoxicitatea drept una


dintre cauzele majore care afecteaz statusul organismului, cu att mai mult cu
ct reaciile provocate pot fi extrem de severe, iar factorii susceptibili de a
predispune o persoan la reacii adverse la nivel hepatic n urma administrrii
unui medicament nefiind n prezent complet clarificate. Datorit localizrii sale,
ficatul este direct expus efectelor toxice generate de stresul oxidativ, de
administrarea unor medicamente sau de xenobiotice. Dup ce este absorbit n
snge, un medicament poate fi distribuit spre esuturi i organe, prin intermediul
unui cru sau prin intermediul unui conjugat polimeric, genernd efecte
specifice, va fi metabolizat cu precdere la nivel hepatic, dup care n final va fi
eliminat (Liechty et al, 2010). A stabili c un medicament este hepatotoxic
implic un proces de evaluare care s respecte o anumit cronologie, excluderea
altor factori care pot determina alterri hepatice, precum i identificarea acelor
elemente care pot favoriza apariia i evoluia strii toxice, cu ajutorul unui
algoritm sau a unor scale de evaluare (Andrade et al; 2014).
n experimentul pe care l-am derulat, pentru a contura un tablou complet
al disfunciilor hepatice n urma administrrii de dantrolen sub diferite forme,
pentru fiecare dintre cele 4 loturi din studiul nostru am evaluat un numr mare
de parametri: fosfataza alcalin, ALT, AST, bilirubina cu cele dou componente
ale sale, proteinele totale, cu albumine i globuline, precum i markeri ai aprrii
antioxidante, reprezentai de SOD i TAS.
Tot mai multe date din literatura de specialitate atrag atenia asupra
faptului c exist o serie de discuii despre corelaiile care se pot stabili ntre
valorile acestor parametri i degradarea parenchimului hepatic, deoarece efectele
toxicitii unui medicament la nivel hepatic pot merge de la simpla prezen a
unor modificri reduse, nespecifice ale testelor biochimice caracteristice, la
hepatite acute sau cronice, alterri hepatice grave, suferine colestatice,
granuloame, fosfolipidoze, ciroza hepatica sau chiar tumori hepatice.
Diagnosticul se pune pe seama excluderii altor posibile cauze, precum i pe
identificarea unui pattern clinic n care se recunosc anomalii specifice ale
testelor hepatice, durata de laten pn la simptomele manifeste, efectele
ntreruperii terapiei cu medicamentul vizat.
n studiul nostru, determinarea FA a prezentat variaii la loturile analizate;
astfel, cea mai mare cretere s-a nregistrat la lotul DIV, iar cea mai redus la
lotul MCLD. Lotul DO a prezentat o cretere a valorii medii mat mici dect lotul
DIV, dar mai mari dect lotul MCLD. O cretere izolat a FA, fr a fi raportat
la variaii ale celorlali parametri de monitorizare hepatic nu are valoare pentru
studiul nostru, deoarece poate apare i pe fondul unor disfuncii la nivelul
esutului osos sau altor segmente digestive; asocierea unui nivel crescut de FA i
bilirubin, pe fondul valorilor normale pentru ALT ar putea sugera apariia
colestazei, FA fiind eliminat prin secreia biliar.
O serie de studii arat faptul c FA este abundent la nivelul polului
biliar hepatocitar, motiv pentru care leziuni congestive sau obstructive ale
31
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

conductelor biliare pot fi nsoite de creteri ale nivelului FA. n colangite


sclerozante i n ciroze biliare primitive, creterea nivelului FA predomin,
depind cu mult valoriule transaminazelor serice. De obicei, interpretarea
valorilor FA trebuie s se coreleze cu cea a ALT, muli autori considernd
evaluarea FA drept un test complementar celui pentru transaminaze(Singh et al,
2011).
Determinarea ALT pentru cele 4 loturi luate n studiu a relevat diferene
semnificative comparativ cu lotul martor. Toate loturile care au primit dantrolen
au prezentat o cretere semnificativ a valorilor medii ale ALT la sfritul
experimentului, cea mai mare valoare fiind prezent la lotul DIV, apoi la lotul
MCLD i apoi la lotul DO. Am constatat o cretere de aproximativ dou ori a
vlorilor medii ALT pentru lotul MCLD i de aproximativ 3 ori pentru lotul DIV
Cea mai mare parte a studiilor asupra biomarkerilor ce permit evaluarea
funciei hepatice susin faptul c nivelul seric al ALT este considerat cel mai
specific i mai sensibil biomarker al hepatotoxicitii dar n condiiile n care
nivelul ALT nu se coreleaz ntotdeauna cu gradul de extindere a leziunilor
hepatice, se impune i evaluarea altor markeri. Valori crescute ale ALT sunt
asociate cu necroza acut hepatic. Localizat primar n ficat, ALT este
localizat i n miocard, rinichi, muchi striat scheletic, splin, plamn,
eritrocite; eliberarea sa masiv se produce de regul pe fondul unei alterri
hepatice importante(Ozer et al, 2007; Yang et al, 2012).
O serie de studii susin faptul c apariia unor valori crescute comparabile
ale ALT i AST se nregistreaz n cazul hepatitelor acute virale sau toxice sau
al hepatopatiilor non alcoolice(nivelul lor similar fiind rezultatul eliberrii
celulare doar a enzimelor citoplasmatice asociate cu reversibilitatea alterrilor
hepatice produse).
Explorarea biochimic a transaminazelor hepatice, bilirubinei i fosfatazei
alkaline permite relevarea, n cazul creterii concentraiei lor serice, a
hepatotoxicitii unui medicament, prin aplicarea legii Hy: conform acestei legi,
o cretere a ALT la o valoare de 3 ori mai mare dect cea normal, precum i o
cretere a bilirubinei de dou ori fa de valoarea sa normal vor determina o
hepatotoxicitate cert, cu o letalitate asociat care poate fi cuprins ntre 5-
10%(Robles- Diaz et al, 2014).Cu toate acestea, creterea enzimelor serice nu
evalueaz de fapt dect existena i extinderea afectrii hepatocelulare, dar nu
ofer nici un indiciu despre existena sau nu a capacitii ficatului de a funciona
mai departe n noile condiii, motiv pentru care se impune verificarea bilirubinei
serice i a timpului de protrombin(Churchman, 2005)
n studiul nostru, valorile ALT au nregistrat valori deosebit de
crescute la sfritul experimentului, ca semn al unei disfuncii cronice
hepatocelulare, pe fondul absenei unui proces de fibroz, dar cu o evoluie
paralel cu cea a AST. Ca regul general, creterea valorii medii a ALT de 2-4
ori fa de valoarea normal este un semn sigur al suferinei hepatice, n cazul
nostru indicnd hepatotoxicitatea dantrolenului. Din datele rezultate,
32
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

administrarea intravenoas a dantrolenului se asociaz cu cel mai ridicat nivel al


ALT, observaie care concord cu opinii similare din literatura de
specialitate(Yamamoto et al, 2000).
Rezultatele obinute n experimentul nostru n cazul determinrii AST
au relevat valori crescute la lotul DIV, urmat de lotul DO. Creterile cele mai
mici au fost observate la lotul MCLD. Diferena dintre valorile medii ale AST
extrem de crescute att la lotul DIV ct i la lotul DO nu este semnificativ,
ambele ci de administrare corelndu-se cu creterea nivelului seric al AST.
Cele mai mari diferene au fost observate ntre loturile MCLD i respectiv DIV,
extrem de semnificative n cea de a patra sptmn a experimentului.
Studii recente au artat faptul c pot apare creteri ale AST nu numai n
afeciunile hepatice, ci i n emboli pulmonare sau n disfuncii ale musculaturii
striate, dar de regul n suferina hepatic acut, creterea ALT este mai mare
dect cea a AST, deoarece timpul su de njumtire este cuprins ntre 16-24 de
ore. Leziuni colestatice asociate cu alterri intrahepatice determin o cretere
marcat a AST, comparativ cu ALT, n condiiile n care FA nregistreaz o
cretere exploziv.
Raportul AST/ALT propus de unii autori pentru aprecierea alterrii
hepatice se pare c nu ar fi util n relevarea cauzei alterrii hepatice, cu excepia
hepatitei acute alcoolice, n care aceast raie este egal cu 2. Raportul
AST/ALT poate varia n limite foarte largi, devenind sugestiv mai ales n
cazurile n care ALT se menine constant, n timp ce ALT crete considerabil.
Determinarea raportului AST/ALT trebuie realizat pentru a putea aprecia
agresivitatea i evoluia unei alterri hepatice. Cnd aceste modificri ale
transaminazelor sunt determinate de un medicament cu potenial hepatotoxic, se
constat de multe ori c rspunsul pacienilor fa de acelai medicament este,
de asemeni, foarte diferit. Unii nu prezint modificri la nivel hepatic, semn c
tolereaz bine terapia administrat. Alii prezint o serie de alterri hepatice,
care sunt ns moderate, devenind selective i tranzitorii, chiar dac tratamentul
continu, deci pacientul respective se adapteaz terapiei. Alii prezint
modificri clinice evidente, care devin reversibile dup orirea terapiei, deci sunt
susceptibili. Tratamentul care se aplic n cazul toxicitii induse medicamentos
urmrete mai nti diminuarea sau eliminarea complet a expunerii la aceast
terapie, antagonizarea terapiei administrate prin folosirea altor medicamente,
dup o prealabil evaluare a efectelor continurii terapiei cu cele ale riscului
ntreruperii sale (Hoofnagle, 2004).
Analiznd date din literatura de specialitate, am constatat c exist
concordan ntre rezultatele obinute n studiul nostru experimental i alte
referine legate de efectele administrrii de dantrolen asupra ficatului, n sensul
creterii ALT, respectiv AST pe parcursul administrrii sale clasice, pe cale
oral, respectiv intravenoas. De multe ori ns este pus n discuie problema
rabdomiolizei care se instaleaz i care poate contribui ea nsi, n mod
semnificativ, la creterea valorii transaminazelor serice (Shah et al, 2012).
33
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

n studiul nostru, determinarea bilirubinei totale a relevat cea mai mare


valoare medie post tratament cu dantrolen la lotul DIV, urmat apoi de lotul DO
i respectiv MCLD. Dei toate cele 3 loturi care au primit dantrolen au
nregistrat o cretere a bilirubinei totale, hiperbilirubinemia marcat a lotului
DIV contrasteaz cu valoarea moderat rezultat la lotul MCLD, n timp ce lotul
DO a nregistrat o cretere mai accentuate dect lotul MCLD, dar mai redus
dect lotul DIV.
n acelai context, evaluarea bilirubinei directe a relevat creteri
semnificative statistic la loturile DIV i DO, precum i o cretere moderat,
apropiat de cea a lotului DO, la lotul MCLD. n sptmna IV, la lotul DIV
valoarea medie a fost semnificativ mai crescut n comparaie cu cea de la lotul
MCLP.
Evaluarea bilirubinei indirecte la loturile aflate n studiu a relevat o
cretere semnificativ a valorii medii la lotul DIV, urmat apoi de lotul DO. n
sptmna IV, la lotul DIV valoarea medie a fost semnificativ mai crescut n
comparaie cu cea nregistrat la lotul MCLP.
Datele actuale din literatura de specialitate menioneaz rolul
determinrii bilirubinei totale i a celor dou componente ale sale n evaluarea
degradrilor hepatobiliare. Prezent n condiii normale n cantiti mici n
snge, bilirubina total nu mai poate fi excretat ntr-un ritm corespunztor n
condiiile alterrilor la nivel hepatocitar, motiv pentru care se acumuleaz n
snge. Pe fondul unor disfuncii hepatice acute, valorile crescute ale bilirubinei
totale sunt mult mai sugestive dect cele ale ALT(Thapa et al, 2007). De cele
mai multe ori, creterea produciei de bilirubin determin creterea valorii
bilirubinei indirecte, n timp ce scderea excreiei sale la nivel hepatic va
determina creterea valorii bilirubinei directe. Determinarea concentraiei
bilirubinei serice este util n toate situaiile care determin hemoliza
eritrocitar, nefiind o metod sensibil pentru evaluarea disfunciilor hepatice
acute, ci mai curnd a celor cronice(Churchman, 2000).
innd cont de faptul c metabolizarea dantrolenului are loc la nivel
hepatic, microzomal, pe cale oxidativ, prin hidroxilare care conduce la 5-
hidroxidantrolen, respectiv pe cale reductiv, prin formarea de aminodantrolen,
se impune ca biomarkerii utilizai pentru investigarea funciei hepatice s fie
adaptai particularitilor care in de farmacocinetica dantrolenului(Fladmark et
al., 1997).
n studiul nostru experimental, determinarea proteinelor totale la cele 4
loturi investigate a relevat valori medii care au diferit semnificativ ntre loturile
analizate la finalul experimentului; comparativ cu lotul martor, loturile tratate cu
dantrolen au prezentat descreteri semnificative ale valorilor medii de proteine
totale, cea mai mare valoare medie nregistrat n sptmna IV a fost la lotul
MCLD, n timp ce valoarea medie cea mai redus s-a nregistrat la lotul DIV.
Analiznd rezultatele obinute n acest caz, asistm la cea mai coerent
corelaie a valorilor individuale ale proteinelor totale cu greutatea, pe loturi de
34
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

studiu: la lotul DO i la lotul DIV, parametrii au fost independeni, iar la lotul


MCLD, parametrii s-au corelat direct, moderat ca intensitate att la debutul
studiului.
Interpretarea acestor rezultate se bazeaz pe un numr foarte mare de
studii care confirm implicarea ficatului n meninerea homeostaziei, motiv
pentru care, odat cu apariia disfunciilor la nivel hepatic, asistm la afectarea
simultan a verigilor metabolice pe care acesta le coordoneaz. Att timp ct
afectarea ficatului este minor, este posibil ca ea s nu fie nsoit de modificri
decelabile ale reaciilor metabolice. Referitor la proteinele totale, ficatului i
revine capacitatea de a sintetiza un procent foarte mare de proteine, la cea mai
mare rat de sintez din organism. Cu excepia gama globulinelor, ficatul
produce aproape toate proteinele plasmatice(albumine, lipo- i glicoproteine,
factori de coagulare, enzime). Dac celulele hepatice sufer, devin tot mai
ineficiente n sinteza proteic, genernd perturbri grave ale metabolismului
proteic. (Dufour et al, 2000).
Metabolizarea unui medicament n ficat se realizeaz n 2 mari etape: n
prima faz sub influena citocromului P450, are loc un proces de oxidare sau
hidroxilare care va induce polarizarea medicamentului (dei exist situaii n
care aceast etap este scurtcircuitat, medicamentul intrnd direct n faza
urmtoare); se formeaz compui tranzitorii, muli dintre ei mult mai toxici
dect medicamentul iniial. n faza a doua, produii sunt conjugai cu substane
diverse, cum ar fi acidul glucuronic, aminoacizi, sulfai, acetai i eliminai fie
pe cale renal, dac au solubilitate n ap, fie pe cale biliar. Afectarea
hepatocitelor poate determina modificri majore ale procesului de metabolizare
(Bigonyia et al, 2009).
n studiul nostru, rezultatele obinute au evideniat o scdere a nivelului
seric al proteinelor totale pentru toate loturile crora li s-a administrat dantrolen,
ceea ce ne permite s afirmm c efectul hepatotoxic al acestuia a fost prezent
pentru toate cele 3 forme de administrare, dar impactul cel mai redus a fost
observat la lotul MCLD.
Studiul nostru a evaluat nivelul seric al albuminelor la loturile de
animale investigate; Comparativ pe loturi tratate, evaluarea albuminei
nregistreaz scderi semnificative, cea mai important fiind observat la lotul
DIV, iar cea mai redus la lotul MCLD, urmat de lotul DO.
Albuminele sunt sintetizate n ficat, dup care sunt descrcate n snge.
Afectarea ficatului datorit aciunii diverselor toxice duce la perturbarea
capacitii sale de a secreta albumine, iar concentraia lor seric se reduce. Tot
mai multe opinii converg spre ideea conform creia reducerea profilului secretor
al albuminelor la nivel hepatic, printr-o sintez deficitar, este un proces care se
instaleaz lent, astfel nct rezultatele acestei sinteze defectuoase se vor observa
dup un interval de timp mai ndelungat raportat la momentul de debut al
administrrii medicamentului cu presupus potenial hepatotoxic. De aceea,

35
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

scderea nivelului seric al albuminelor este util n evaluarea unei suferine


hepatice cronice.
n studiul nostru, monitorizarea nivelului seric al albuminelor s-a
realizat la sfritul experimentului, dup cele 4 sptmni de administrare de
dantrolen, aa nct am putut surprinde cu acuratee modul n care au evoluat
valorile lor la loturile luate n studiu.
Analiznd studiile de specialitate, am putut corela rezultatele noastre cu
cele obinute n studii similare, descreterea nivelului seric al albuminelor fiind
rezultatul toxicitii dantrolenului administrat diferit. Un element important legat
de evaluarea riscului de hepatotoxicitate este dat de marja de siguran anticipat
dintre concentraia plasmatic a drogului circulant i nivelul ce corespunde unui
efect non advers i respectiv concentraia plasmatic necesar pentru ca
medicamentul s fie eficient la om (FDA, 2009). Vorbim despre un organ care
are o capacitate enorm de a se adapta la schimbarea parametrilor eseniali din
organism, care poate s modifice activitatea enzimelor proprii i a
transportorilor si, i poate cea mai important-are capacitatea de regenerare. De
aici rezult una din cele mai mari dificulti care apar n studiul hepatotoxicitii,
cea legat de faptul c studiile experimentale nu permit ntotdeauna o evaluare
corect, deoarece foarte multe principii biologic active care, la doze considerate
drept terapeutice, se dovedesc a fi hepatotoxice la animale de laborator i pierd
aceast proprietate la om(Urquhart J, 2000).
n cadrul experimentului nostru, evaluarea nivelului seric al globulinelor
a permis relevarea descreterii concentraiei lor serice, cea mai mare valoare
medie nregistrat n sptmna IV a fost la lotul MCLD, administrat intravenos;
cea mai redus valoare medie s-a nregistrat la lotul DIV.
n sptmna IV, valorile medii ale globulinelor nregistrate la loturile
DIV i MCLP nu au nregistrat diferene semnificative din punct de vedere
statistic, fapt care sugereaz o afectare similar a produciei lor, pentru ambele
modaliti de administrare a dantrolenului.
n suferina hepatic cronic creteri ale concentraiei globulinelor pot
fi similare sau pot fi mai mari dect cele observate de exemplu n hepatitele
acute, datorit hipoalbuminemiei, concentraia proteinelor titale fiind normal sau
uor redus. Hipoglobulinemia este asociat cu suferina hepatica cronic, n
condiiile n care se poate presupune c dup preluarea lor din sistemul digestiv,
globulinele nu au fost scindate sau absorbite corespunztor.
De cele mai multe ori se recomand determinarea concentraiilor serice
individuale ale albuminelor i globulinelor, care ofer mult mai multe date dect
raportul albumin/globuline.
n studiul nostru, evoluia globulinelor pentru loturile crora li s-a
administrat dantrolen a urmat un ritm descresctor. n timp ce valori modificate
ale AST, ALT i FA indic alterarea hepatocitelor, nivelul proteinelor serice
ofer informaii despre statusul funcional hepatic, deoarece sunt produse de
hepatocite. Celulele sistemului reticulo-endotelial rezidente n ficat,
36
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

rspunztoare de producerea globulinelor, au n condiii normale o activitate de


sintez nesemnificativ. Producia globulinelor poate deveni ns consistent pe
fondul instalrii unor afeciuni hepatice. Faptul c n experimental nostru nu s-au
nregistrat creteri ale globulinelor poate sugera o reducere a surselor ce stau la
baza producerii lor sau perturbarea transportului lor. De cele mai multe ori, o
afeciune modific profilul celular i tisular al organului sau sistemului afectat,
declannd uneori reacii n cascad, greu de controlat, astfel nct, n condiiile
n care s-a reuit identificarea secvenelor precise ale etapelor moleculare care
stau la baza producerii unei boli, biomarkerii utilizai pentru evaluarea gradului
de alterare indus trebuie corelai cu principalele verigi metabolice
degradate(Taniguchi et al, 2007).
n cazul administrrii unui medicament, mrimea dozei este
determinat de rata la care medicamentul trebuie administrat pentru a dobndi
concentraia plasmatic necesar pentru ndeplinirea efectelor sale; cea mai mare
parte a medicamentelor necesit o rat de administrare de mg/or. De regul,
valoarea clearance-ului plasmatic i rata de eliberare stabilesc concentraia
plasmatic a medicamentulului. n acest context, se extinde i numrul
biomarkerilor care se folosesc pentru explorarea parametrilor funcionali
vizai(Allen, 2002).
Ca o regul general, n prezent se consider c o cretere de peste dou
ori a valorii ALT, comparativ cu cea normal, sau a bilirubinei conjugate, sau
concomitent a valorii AST, FA i respectiv a bilirubinei totale reprezint semne
certe ale alterrii hepatice. Se poate face o distincie ntre alterarea
hepatocelular, (susinut de creteri precoce ale concentraiei serice a ALT,
nsoit de creteri modeste ale FA) i cea colestatic, susinut de o cretere
precoce a valorii FA. Evaluarea enzimelor serice nu reflect perturbarea
funciilor hepatice tot att de relevant cum se ntmpl n cazul evalurii
bilirubinei totale sau conjugate(Navarro et al, 2006).
n cadrul studiului nostru, am dorit s relevm existena unui posibil
potenial antioxidant al dantrolenului, motiv pentru care am determinat 2
markeri specifici ai aprrii antioxidate n organism, reprezentai de SOD i
TAS. Evoluia lor n cadrul loturilor crora li s-a administrat dantrolen ne poate
permite o interpretare clar a verigilor antioxidante implicate.
Rezultatele noastre obinute la determinarea valorilor SOD la loturile
tratate au relevat variaii semnificative ale valorilor medii pentru SOD: cea mai
mare valoare medie nregistrat n sptmna IV a fost la lotul MCLD, iar cea
mai redus valoare medie s-a nregistrat la lotul DI.
n sptmna IV, valorile medii ale SOD au fost semnificativ mai
crescute la lotul DIV n comparaie cu cele nregistrate la lotul MCLP.
O serie de date din literatur au artat faptul c SOD, enzim
antioxidant care are proprietatea de a realiza conversia radicalilor superoxid n
peroxid de hidrogen i oxigen molecular, asigurnd astfel o protecie eficient
mpotriva efectelor stresului oxidativ, intervine n momentul administrii de
37
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

dantrolen, mpreun cu ali factori antioxidani, pentru a modula aprarea


antioxidant.
n studiul nostru, determinarea valorii TAS la cele 4 loturi investigate a
relevat faptul c acest parametru a nregistrat creteri semnificative din punct de
vedere statistic la lotul DO, apoi la lotul DIV i respectiv la lotul MCLD.
n sptmna IV, valorile medii ale TAS nregistrate la loturile DIV i
MCLP nu au nregistrat diferene semnificative din punct de vedere statistic.
Analiza noastr asupra unor date recente din literatura de specialitate a
scos n eviden susinerea tot mai larg a unui posibil potenial antioxidant al
dantrolenului, care l-ar putea face extrem de util n blocarea efectelor generate
de producerea n exces de specii reactive de oxigen. Cumularea proprietilor
sale de antagonist al receptorilor rianodinici i respectiv de factor antioxidant
ar permite utilizarea dantrolenului ntr-o serie de afeciuni(independente de
hipertermia malign pentru care continua s rmn tratamentul de elecie), cu
numeroase beneficii legate de aceast nou modalitate terapeutic. Blocarea
eliberrii ionilor de calciu ar putea fi un proces sincron cu aciunea
antioxidant(Solan, 2005).
Stabilizarea interdomeniilor de interaciune de la nivelul receptorilor
rianodinici ar putea determina la rndul su una dintre posibilitile de a anihila
eliberarea masiv i necontrolat de Ca, dantrolenului revenindu-i un rol esenial
n acest proces (Allen, 2002). Prevenirea sau reducerea modificrilor oxidative
la nivel tisular de ctre dantrolen ar putea fi realizat fie prin mobilizarea
antioxidanilor enzimatici de tipul SOD, aa cum am artat n studiul nostru
experimental, sau prin interaciunea cu factori care sunt implicai n procesul de
activare a stresului oxidativ. Tot mai muli autori consider c pe de o parte se
poate vorbi despre un efect protector al dantrolenului n cazul citotoxicitii
induse de perturbarea homeostaziei calcice, iar pe de alt parte despre efectul
su protector n contextul unui stress oxidativ(Inan et al, 2010).
Deoarece este cunoscut faptul c prezena unei concentraii masive de Ca
intracelular determin producerea de specii reactive de oxigen, se poate afirma
faptul c homeostazia ionilor de Ca este un proces care manifest o sensibilitate
deosebit de crescut fa de statusul redox la nivel celular. Chiar dac
mecanismul complet care duce la implicarea dantrolenului n aprarea
antioxidant nu este elucidat, exist dovezi ale aciunii sale antioxidante la nivel
cerebral sau miocardic(Brookes et al, 2004).
n studiul nostru, explorarea histopatologic a reactivitii hepatice n
urma administrrii de dantrolen ne-a permis aprecierea modului n care fiecare
lot expus acestei terapii a fost afectat, comparativ cu lotul martor. Consistena,
acurateea i obiectivitatea aprecierii reaciilor adverse determinate de un
medicament sunt absolut necesare, iar diagnosticul de sine stttor al
hepatotoxicitii este bazat pe evaluarea histopatologic, la care se adaug
determinarea unor markeri extrem de fideli care s fie utilizai n practica
curent
38
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

Am putut observa faptul c toate cele 3 loturi de obolani care au primit


dantrolen au prezentat o serie de modificri hepatice, variabile ca intensitate n
funcie de modul de administrare a dantrolenului care a fost utilizat, aceste date
fiind n concordan cu rezultate similare publicate n literatura de specialitate.
Studiul nostru a evideniat primele modificri histopatologice la nivelul
esutului hepatic la lotul DO; se pot observa distrucii hepatocitare moderate,
congestii vasculare, distensii sinusoidale extinse. Modificrile histopatologice
sunt cercetate i analizate prin corelarea lor cu parametrii biochimici
determinai.
O serie de articole au legat modificrile hepatice produse de dantrolen
de distrucii ale populaiei celulare hepatocitare; acest proces ar putea avea loc
printr-o fixare covalent a dantrolenului de proteine intracelulare, cu apariia
disfunciilor celulare, urmat de o scdere drastic a nivelului ATP, care va avea
drept consecin distrugerea filamentelor de actin care consolideaz
citoscheletul hepatocitelor. Lipsite de acest suport intracelular, celulele hepatice
se fragilizeaz i se fragmenteaz foarte uor. Aceasta ar fi una dintre ipotezele
care ncearc s explice afectarea parenchimului hepatic de ctre dantrolen,
aciunea sa toxic putnd fi rezultatul medierii accesului acestuia la hepatocite,
prin aa numita hepatotoxicitate direct, care vulnerabilizeaz hepatocitele i
celulele sinusoidale, prin necroze sau apoptoze(Jaeschke et al, 2003; Begriche et
al, 2011).
Dispozitivul vascular al ficatului poate fi, la rndul su, afectat de
administrarea unui medicament toxic, care poate produce focare necrotice la
nivelul venelor centrolobulare, venulelor sau capilarelor sinusoide, ci instalarea
sindromului de obstrucie sinusoidal(boala veno-ocluziv), cu obliterarea venei
centrale, sindromul Budd-Chiari, dilatarea sinusoidelor(Kosanam et al, 2015).
Unii autori susin faptul c alterrile profunde ale parenchimului hepatic
n urma administrrii de dantrolen sunt asociate cu utilizarea unor doze mari,
pentru o perioad ndelungat, fapt care sugereaz intervenia unor metabolii
toxici, precum i administrarea sa sub o form care nu permite eliberarea n
organismul uman n maniera care conduce la cea mai ridicat eficien
terapeutic a acestuia, de regul forma clasic de administrare(Fischer et al,
2015).
n studiul nostru histopatologic, examinarea lotului DIV ne-a permis
observarea celor mai ample degradri ale esutului hepatic. Cele mai frecvente
leziuni sunt cele de steatoz microvezicular. Se ntrerupe ciclul oxidrii acizilor
grai, care se acumuleaz mpreun cu trigliceridele, scade sinteza de ATP i
scade producia de corpi cetonici, care, mpreun cu hipoglicemia, vor determina
o reducere brutal a energiei disponibile pentru esuturile extrahepatice.
Numeroase incluzii lipidice de talie mic se aglomereaz i umplu complet
citoplasma hepatocitului, fr a determina compresia i deplasarea nucleului
ctre periferie.

39
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

Dilatrile sinusoidelor apar ca urmare a afectrii celulelor endoteliale


care tapeteaz lumenul sinusoidal. De multe ori este afectat integritatea
peretelui vascular, cu o uoar congestie i fibroz perisinusoidal.
n condiiile n care se prefer i se recomand utilizarea administrrii
intravenoase de dantrolen pentru un interval mare de timp, n forma clasic de
administrare, este inevitabil apariia leziunilor la nivel hepatic. De cele mai
multe ori s-a constata c odat instalate, acestea evolueaz continuu i devin
ireversibile, compromind funciile hepatice, precum i integritatea
parenchimului hepatic. Numeroase studii susin c riscul hepatotoxicitii poate
crete de la modificri asimptomatice ale nivelului transaminazelor serice pn
la hepatite fulminante, frecvent letale(Chan, 1990). Unii autori au propus n
cazul dantrolenului reducerea numrului de doze administrate-prin administrarea
unei singure doze, durata intervalului de timp n care concentraia
medicamentului depete nivelul minim efectiv, poate fi crescut prin creterea
cantitii administrate; n schimb, procesul poate declana ns o cascad de
efecte care vor culmina cu creterea concentraiei plasmatice, cu impact direct n
generarea unor reacii toxice locale sau generale(Kim, 2011).
Studii de specialitate legate de geneza microsteatozei au precizat c
exist un prim impact la nivel mitocondrial. Mitocondriile sunt o verig cheie n
evoluia hepatotoxicitii; ele pot fi agresate pe numeroase ci, cu deschiderea
porilor de tranziie, urmat de afectarea integritii membranei mitocondriale.
Activitatea porilor este modulat de intervenia unor proteine, dintre care cel mai
frecvent menionate sunt receptorul benzodiazepinic periferic, ciclofilin D,
adenin nucleotid translocaza, la care se mai adaug un canal ionic voltaj
dependent. Odat deschii porii mitocondriali, membrana mitocondrial
devenind discontinu, are loc o pierdere continu de ATP, depozitele
intramitocondriale de ATP se epuizeaz i hepatocitele sunt afectate progresiv
de un proces de necroz. Cu ct sunt mai multe mitocondrii afectate, cu att
expulzia de calciu va fi mai abundent i mai accelerat, proces care are loc n
paralel cu descrcarea unor factori apoptotici de tipul caspazelor, factorul de
inducie apoptotic, citocromul c. Activarea caspazelor poate induce declanarea
unei noi ci apoptotice(Kaplowitz et al, 2002; Kosanam et al, 2015).
Analiznd un numr mare de studii de specialitate, am identificat o serie
de date rezultate n urma ncercrilor de a modula hepatotoxicitatea
dantrolenului, prin afectarea biotransformarii sale, prin iniierea unui
metabolism reductiv, prin depleia glutationului sau prin inhibarea acetilrii, dar
nici unul din aceste procese nu a influenat hepatotoxicitatea dantrolenului.
Acest fapt a permis concluzia legat de absena oricrei posibile legturi dintre
toxicitatea dantrolenului i respectiv biotransformarea sau bioactivarea
acestuia(Durham et al, 1984).
n studiul nostru, examenul histopatologic al lotului MCLD a relevat o
serie de modificri la nivel hepatic, mai reduse ca intensitate i extindere fa de
cele prezente la lotul DIV, fapt ce ne permite s apreciem c sistemul
40
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

microparticulat utilizat de noi n acest experiment i administrat intravenos ar


putea oferi o alternativ mult mai indicat, comparativ cu cea a administrrii
intravenoase obinuite, care, n plus, prezint i dezavantajul asocierii unor
necroze variabile la locul de administrare, fapt care nu se ntlnete n cazul
utilizrii MCLD. Macrosteatoza vezicular nu se asociaz cu alterri
mitocondriale, ci cu creteri moderate ale transaminazelor serice, cu o acumulare
masiv de picturi lipidice, care comprim i mping nucleul la periferia celulei,
n absena manifestrilor colestatice.
Pe fondul alterrii metabolismului lipidic, urmat de apariia steatozei
macroveziculare, apare o cretere marcat a sintezei lipidice i o scadere a
VLDL, prinr-o mobilizare a unor factori transcripionali lipogeni,
hiperinsulinemie i hipoleptinemie. Inflamaia i fibroza sunt de asemeni
frecvente. Macrosteatoza vezicular poate fi reversibil i nu prezint
caracteristicile histologice ale alterrilor celulare specifice de la acest
nivel(Tandra et al, 2012)
Studii recente precizeaz faptul c hepatotoxicitatea indus de
medicamente trebuie s fie privit drept un proces extrem de complex, bazat pe
interaciunea unui numr mare de factori care se intercondiioneaz reciproc, n
care apoptoza codeaz un proces de self distrucie celular programat, prin
aciunea coordonat a mai multor factori de ordin local i general. Calea
intrisec de activare a mecanismelor apoptotice este iniiat de semnale
intracelulare induse fie de medicament, fie de metaboliii acestuia, urmat de
declanarea unei cascade de reacii care au ca rezultat final alterarea ADN
nuclear dar i mitocondrial. Necroza are loc atunci cnd intensitatea agresiunii
toxice nu este suficient de mare pentru a determina moartea celular, dar poate
determina distrucia unor fragmente celulare, prin degradarea lor enzimatic,
pierderea continuitii i integritii membranare i denaturarea proteinelor
celulare. Elaborarea de metabolii toxici este cea de a doua cale de abordare
hepatic, realizat prin trei modaliti distincte: mai nti, sunt alterate
hepatocitele la nivelul funciilor lor eseniale, care sunt puternic perturbate sau
chiar eliminate; organitele celulare ale hepatocitelor sunt profund afectate,
inclusiv nucleul, elementele de citoschelet i cele care constituie reticulul
endoplasmatic sau mitocondriile (Solan, 2005; Cederbaum et al, 2009).).
La nivel hepatic, pe lng hepatocite, care reprezint populaia celular
majoritar, intervin activ n derularea efectelor toxice cu substrat variat i alte
celule locale, de tipul celulelor Kupffer, celulele endoteliale sinusoidale, celulele
Ito(stelate, care stocheaz lipide), acionnd sinergic cu limfocite migrate n
ficat, cu neutrofile i monocite. Declanarea apoptozei hepatocitare, ca rspuns
la administrarea unui medicament cu potenial hepatotoxic, va permite activarea
celulelor Kupffer sau a neutrofilelor, iar coninutul molecular al hepatocitelor
distruse se poate fixa de receptori ai celulelor imune; acestea vor sintetiza
citokine, care ulterior se vor implica drept actori importani ai urmtoarelor
etape ale procesului de alterare celular.
41
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

Date din literatura de specialitate precizeaz c n cazul steatozei


microveziculare, inhibarea beta oxidrii mitocondriale a acizilor grai poate fi
considerat drept trigger lezional; acizii grai neesterificai rmai neoxidai se
acumuleaz progresiv n ficat, iar trigliceridele vor forma progresiv mici
vezicule. Cu ct severitatea procesului steatozic este mai mare, cu att riscul
unei suferine hepatice avansate este mai mare(Lewis, 2000).
n studiul nostru, toate loturile tratate cu dantrolen au prezentat grade
variabile de afectare hepatic, dar reactivitatea tisular a variat de la un lot la
altul; dac steatoza macrovezicular poate fi considerat relativ benign, att
timp ct nu apar alte modificri hepatice, steatoza microvezicular, n special
cea extins pe mari suprafee hepatice, constituie un semn distinctive al unei
suferine metabolice accentuate, care n final poate duce la prbuirea funciei
hepatice sau chiar la deces. Faptul c oxidarea acizilor grai este incomplet
duce la privarea celulelor hepatice de mare parte din energia necesar; acest
deficit de energie devine treptat tot mai sever, n condiiile n care ciclul
respirator va fi la rndul su afectat. Hiperosmolaritatea matricii mitocondriale
determin, prin ruperea membranei mitocondriale externe, eliberarea unui factor
apoptotic specific i a citocromului c, care vor iniia apoptoza celulelor hepatice.
Accentuarea disfunciei mitocondriale se instaleaz rapid i nu mai permite
coalescena micilor incluzii lipidice n picturi mari i bine delimitate, genernd
steatoza microvezicular(Jaeschke et al, 2001).
Alte studii recente argumenteaz reducerea semnificativ a ATP prin
deschiderea porului mitocondrial, care permite astfel acumularea de protoni; se
produce o inhibare a activrii acizilor grai n acetil coA, prevenindu-se o a doua
beta oxidare. Acest process poate interfera cu producerea de specii reactive de
oxigen, care pot oxide acizii grai, cu peroxidarea rezervelor lipidice i apariia
steatohepatitei.
n studiul nostru, am evaluat de asemeni imunohistochimic prezena i
distribuia microparticulelor de chitosan cu dantrolen ncorporat n parenchimul
hepatic, la interval de timp diferite dup injectarea lor intravenoas. Am putut
observa faptul c la 2 ore de la administrarea dantrolenului nu poate fi detectat
prezena microparticulelor n esutul hepatic; la 4 ore reacia este slab pozitiv,
putnd vizualiza microparticule izolate, disparate; la 6 ore reacia devine intens
pozitiv. Se poate evidenia deja un pattern de distribuie intrahepatic, urmrind
conturul sinusoidelor i lumenele venelor centrolobulare. Microparticulele pot fi
observate i pe suprafaa hepatocitelor. La 12 ore, reacia este de asemeni intens
pozitiv, cordoanele de hepatocyte care radiaz de la venele centrolobulare ctre
periferia lobililor hepatici venind n contact cu microparticulele de chitosan cu
dantrolen ncorporat. La 24 de ore, reacia redevine din nou slab pozitiv.
Chitosanul folosit de noi n acest studiu, datorit solubilitii sale n
soluii acide i a capacitii de a forma complexe cu macromolecule anionice,
are un impact major asupra stabilitii microparticulelor care ncorporeaz
dantrolen(Borchard, 2001). Exist cteva elemente importante pentru studiul
42
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

hepatotoxicitii n cazul utilizrii de microparticule: doza administrat, calea de


administrare, extinderea distribuiei tisulare. Biodistribuia microparticulelor,
acumularea, metabolizarea i n final excreia lor sunt influenate major de calea
de administrare. Se poate vorbi i despre un pattern natural de acumulare al
micro/nanoparticulelor, la nivelul splinei, ficatului, plamnilor i mduvei
osoase. n schimb, administrarea lor sistemic este cea care asigur cele mai
prompte i mai rapide efecte. Proprietile biodistributive ale microparticulelor
depind direct de dimensiunile lor.
Microparticulele mai mari de 7 m sunt reinute n plmn, iar cele mai
mici, cum este i cazul microparticulelor utilizate de noi(4,61 m) vor fi reinute
de ficat i splin(Onishi et al, 2008; Xu et al, 2008).
Modul n care aceste sisteme polimerice sunt obinute se rsfrnge direct
asupra proprietilor lor terapeutice, motiv pentru care tehnicile de lucru vor
trebui s urmreasc permanent ca microparticulele s prezinte o eficien de
ncapsulare ridicat, capabil s asigure ncrctura optim cu principiul activ,
permind o eliberare lent iniial i complet corespunztoare profilului
medicamentului administrat. Efectul unui medicament asupra unui pacient
depinde de foarte muli factori, dintre care vrsta, afeciunile preexistente,
profilul genic, doza administrat, asocierea sau nu a altor medicamente n
acelai interval de timp. (Njoku, 2014; Davila et al, 2007).
Rezultatele studiului nostru au artat faptul c lotul de animale cruia i s-a
administrat dantrolen ncorporat n microparticule de chitosan a prezentat o
macrosteatoz vezicular, spre deosebire de lotul DIV, care a prezentat
microsteatoz vezicular; conform analizei studiilor de specialitate, prognosticul
microsteatozei veziculare este nefast, comparativ cu cel de al doilea tip,
deoarece capacitatea de regenerare devine extreme de redus, facilitnd
extinderea apoptozelor(Oleszczuck et al,, 2007
Studiul nostru, pe baza rezultatelor obinute, ne permite s propunem
aceast modalitate de administrare a dantrolenului, cu motivaia unei alterri
hepatice mult mai reduse, comparativ cu administrarea sa pe cale clasic
intravenoas, fapt susinut att de examenul histopatologic, ct i de coroborarea
acestuia cu datele biochimice specifice. Microparticulele de chitosan cu
dantrolen ncorporat utilizate de noi au ameliorat att constantele biologice
determinate, ct i amploarea degradrii parenchimului hepatic. Evalurile
rezultate sunt foarte importante pentru interpretarea in vivo a corelaiilor
medicament-hepatotoxicitate, din perspectiva aprofundrii mecanismelor acestei
toxiciti la nivel hepatic, precum i a legturii dintre concentraia utilizat i
amploarea efectului produs asupra ficatului.

43
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

CAPITOLUL IX
Concluzii

Studiul experimental efectuat a permis relevarea urmtoarelor concluzii:


1.Evaluarea caracteristicilor funcionale ale microparticulelor de chitosan cu
dantrolen ncorporat utilizate n acest studiu a evideniat faptul c procesul de
ncapsulare a fost unul eficient, ambii parametri urmrii, eficacitatea de
ncapsulare i respectiv capacitatea de ncapsulare avnd valori optime
2. Evaluarea hemocompatibilitii microparticulelor a confirmat existena unei
bune compatibiliti cu mediul sanguin, nu exist diferene importante ntre
valorile indicilor de coagulare la lotul martor, comparativ cu lotul cruia i-au
fost administrate microparticule i de asemeni, toi indicii de coagulare evaluai
se situeaz n limitele valorilor normale.
3. Determinarea toxicitii acute a precizat valori ale DL50 peste 5000mg/kg,
fapt care confirm lipsa toxicitii microparticulelor utilizate n studiul
experimental.
4. Studiul biocompatibilitii in vivo a evideniat lipsa toxicitii la nivelul
principalelor organe care coordoneaz funciile vitale (ficat, cord, pulmon,
rinichi), prin lipsa modificrilor morfologice.
5. Determinarea greutii animalelor de laborator din loturile luate n studiu, ca
indicator al statusului biologic, a evideniat faptul c ncepnd din sptmna a
III-a, greutatea obolanilor tratai cu DIV a sczut semnificativ fa de cea
nregistrat la lotul MCLD administrat intravenos, n timp ce greutatea
animalelor din lotul DO a prezentat o scdere treptat i moderat a greutii,
fapt care susine afectarea statusului biologic al lotului DIV ca urmare a
expunerii la dantrolen.
Explorarea biochimic a principalilor markeri ai activitii hepatice a relevat
modificri semnificative ale acestora.
6. FA prezint cea mai mare valoare medie nregistrat n sptmna a IV-a, la
lotul DIV, n timp ce valoarea medie cea mai redus s-a nregistrat la lotul
MCLD, fapt care se coreleaz cu celelalte modificri ale parametrilor
biochimici, mai ales cu ALT, n contextul alterrii hepatice.
7. AST a prezentat la sfritul experimentului cea mai mic valoare medie la
lotul MCLD, comparativ cu lotul DIV, pe fondul unei creteri variabile la toate
loturile tratate cu dantrolen, indicnd existena unei suferine hepatice.
8. ALT a prezentat la lotul DIV valori medii aproape duble la sfritul
experimentului, nregistrndu-se i cea mai mare valoare medie comparativ cu
celelalte loturi analizate; la lotul MCLD s-a nregistrat o cretere semnificativ
fa de cea nregistrat n prima sptmn, dar mai mic dect la lotul cu DIV,
fapt care pledeaz pentru un declin mai accentuat al funciei hepatice pentru
lotul DIV.
9. Bilirubina total a nregistrat creteri semnificative la lotul DO, dar cea mai
mare valoare medie post-tratament se remarc la lotul DIV, n timp ce la lotul
44
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

MCLD se observ cea mai mic valoare medie post-tratament, fapt ce sugereaz
o degradare crescut a funciei hepatice la lotul DIV.
10. Pentru bilirubina direct, cea mai crescut valoare medie n sptmna IV a
putut fi observat la lotul DIV, iar ea mai sczut la lotul MCLP, iar pentru
bilirubina indirect, n sptmna IV, cea mai crescut valoare medie a fost
nregistrat la lotul DIV n comparaie cu cea mai mic, nregistrat la lotul
MCLP; aceste modificri reflect o alterare mai pronunat a funciei hepatice la
lotul DIV, comparativ cu lotul MCLD.
11. Proteinele totale au prezentat cea mai abrupt scdere la lotul DIV i cea mai
mare valoare medie la lotul MCLD, hipoproteinemia lotului DIV fiind
consecina agresiunii crescute a dantrolenului administrat intravenos.
12. Albuminele au prezentat cele mai sczute valori la sfritul experimentului
la lotul DIV, unde valoarea medie a fost semnificativ mai redus n comparaie
cu cea nregistrat la lotul MCLP, fapt care susine o alterare mai accentuat a
funciei hepatice, cu perturbarea sintezei proteice la lotul DIV, comparativ cu
lotul MCLD.
13. Globulinele au prezentat cele mai sczute valori la sfritul experimentului
la lotul DIV, comparativ cu lotul MCLD, reducerea valorii totale corelndu-se
cu declinul sintezei proteice la nivel hepatic.
14. n ce privete capacitatea antioxidant a dantrolenului, valorile nregistrate
de SOD i respectiv TAS, prin creterea lor pe parcursul experimentului nostru
la toate loturile ce au primit dantrolen, pledeaz pentru implicarea dantrolenului
n modularea statusului antioxidant la nivel hepatic.
15. Examenul histopatologic al fragmentelor de esut hepatic prelevate de la cele
4 loturi a relevat modificri la toate loturile tratate cu dantrolen; cele mai reduse
modificri apar la lotul DO (steatoz microvezicular, dilatri sinusoidale), iar
cele mai agresive apar la lotul DIV(steatoz microvezicular, congestii focale i
dilataii sinusoidale), n timp ce lotul MCLD a prezentat modificri reduse la
nivel hepatic, cu apariia de focare diseminate de steatoz macrovezicular, rare
procese congestive.
16. Studiul imunohistochimic a evideniat, n urma evalurii calitative, o curb
ascendent a prezenei microparticulelor marcate cu fluorescein la nivel
hepatic,cu un maxim la 6-12ore, dup care se nregistreaz scderea lent.
Studiul de fa a urmrit relevarea impactului asupra esutului hepatic a
administrrii de dantrolen ncorporat n microparticule de chitosan, comparativ
cu administrarea clasic, demonstrnd faptul c modificrile biochimice i
histopatologice produse prin administrare de MCLD sunt mult mai reduse
comparativ cu cele rezultate prin administrare DO i, mai ales, DIV, fapt ce
sugereaz o eficientizare crescut a administrrii sale n aceast form.
mbuntirea design-ului lor structural i funcional ar putea reprezenta
o modalitate de optimizare i de explorare a noi oportuniti terapeutice pentru
afeciuni fr rspuns cert terapeutic pn n prezent.

45
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

Bibliografie selectiva

1. Agrawal CM. Reconstructing the human body using biomaterials. JOM


1998; 2: 31-35.
2. Agrawal P. A Perspective on Drug Discovery, Development and
Delivery. J Drug Discov Develop and Discov 2012; 1(1): 2.
3. Agrawal P. Significance of Polymers in Drug Delivery System. J
Pharmacovigilance 2014; 3: 1-14.
4. Aithal GP, Ramsay D, Daly AK et al. Hepatic adducts, circulating
antibodies and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac
hepatotoxicity. Hepatology 2004; 39(5): 1430-40.
5. Akilbekova D, Bratlie KM. Quantitative characterization of collagen in
the fibrotic capsule surrounding implanted polymeric microparticles
through second harmonic generation imaging. PLOS 2015; 719-22.
6. Aktan F. iNOS-mediated nitric oxide production and its regulation. Life
Sci 2004; 75(6): 639-653.
7. Allen PD. Leaky feet and sudden death. Circ Res 2002; 91(3):181-2.
8. Allen TM, Cullis MR. Drug delivery systems: entering the mainstream.
Science 2004; 303(5665): 1818-22.
9. Alonso MJ. Nanomedicines for overcoming biological barriers. Biomed
and Pharmacother 2004; 58(3): 168-172.
10.Altschafl BA, Arvanitis DA, Fuentes O et al. Dual role of junctin in the
regulation of ryanodin receptors and calcium release in cardiac
ventricular myocites. J Physiol 2011; 589(Pt 4): 6063-80.
11.Anderson JM. Biological responses to materials. Annu Rev Mat Res
2001; 31: 81-110.
12.Andrade R, Robles M, Fernandez Casta A et al. Assessment of drug-
induced hepatotoxicity in clinical practice: a challenge for
gastroenterologysts. World J Gastroenterol 2007; 13(3): 131-140.
13.Andrade RJ, Lopez-Vega CM, Lucena MI. Drug-Induced Hepatotoxicity.
Hepatol Rev 2007; 4:14-23.
14.Andrews EJ, Taylor Benett T, Clark JD. Report of AVMA panel on
euthanasia. J Am Med Vet Assoc 1993; 202: 229-249.
15.Annabi N, Nichol JW, Zhong J et al. Controlling the porosity and
microarchitecture for hydrogels for tissue engineering. Tissue Eng Part B
Rev 2010; 16(4): 371-83.
16.Augello C, Caruso L, Maggioni M et al. Inhibitors of apoptosis proteins
(IAPs) expression and their prognostic significance in hepatocellular
carcinoma. BMC Cancer 2009; 9: 122-24.
17.Baek S, Singh H, Khanal D et al. Smart multifunctional drug delivery
towards anticancer therapy harmonized in nanoporous nanoparticles.
Nanoscale 2015; 7: 14191-14216.

46
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

18.Balamurugan M. Chitosan: a perfect polymer used in fabricating gene


delivery and novel drug delivery systems. Int J of Pharmacy and
PharmSci 2012; 4(1): 54-56.
19.Baldmin, Saltzman WM. Materials for protein delivery in tissue
engineering. Adv Drug Deliver Rev 1998; 33:7186.
20.BanerjeeG, Nandi G, Mahato SB et al. Drug delivery system: Targeting
of pentamidines to specific sites using sugar grafted liposomes. J
AntimicrobChemother 1996; 38: 145-50.
21.Bantel H, Detection of elevated caspases activation in liver apoptosis.
Eur J Cell Biol 2001; 12: 89-95.
22.Barbu E, Molnr E, Tsibouklis J, Grecki DC. The potential for
nanoparticle-based drug delivery to the brain: overcoming the blood-
brain barrier. Expert Opin Drug Deliv 2009; 6(6):553-65.
23.Barnes SN, Aleksunes LM, Augustine L, et al. Induction of hepatobiliary
efflux transporters in acetaminophen-induced acute liver failure
cases. Drug Metab Dispos2007;35(10):19631969.
24.Barreiro-Iglesias R, Corronila R, Concheiro A, Alvarez-Lorenzo C.
Preparation of chitosan beads by simultaneous cross-
linking/insolubilisation in basic pH. Rheological optimization and drug
loading/release behavior. Eur J Pharm Sci 2005; 24(1): 77-84.
25.Begriche K, Massart J, Robin AM et al. Drug-induced toxicity on
mitochondria and lipid metabolism:Mechanistic diversity and deleterious
consequeces for the liver. J of Hepatol 2011; 54(4): 773-794.
26.Benedetto FD, Fasano V, Persano L et al. Rolling particle lithography by
soft polymer microparticles. Soft Matter 2013; 9: 2206-2211.
27.Betancourt T, Brannon-Peppas L. Micro- and nanofabrication methods in
nanotechnological medical and pharmaceutical devices. Int J
Nanomedicine 2006; 1(4): 483-495.
28.Bhattacharya S, Bunick CG, Chazin WJ. Target selectivity in EF-hand
calcium binding proteins. Biochim Biophys Acta 2004; 1742: 69-79.
29.Bigoniya P, Singh C, Shukla A. A Comprehensive review of Different
Liver Toxicants used in Experimental Toxicology. Int J Pharm SciDrug
Res 2009; 1(3): 124-135.
30.Blizer M, Roggel F, Gerbes AL. Role of Kupffer cells in host defense
and liver disease. Liver Int 2006; 26(10): 1175-86.
31.Boelsterli UA. Diclofenac-induced liver toxicity: a paradigm of
idiosyncratic drug toxicity. Toxicol Appl Pharmacol 2003; 192:307-322.
32.Boncompagni S, Thomas T, Lopez JR et al. Triadin/Junctin Double Null
Mouse Reveals a Differential Role for Triadin and Junctin in Anchoring
CASQ to the jSR and Regulating Ca2+ Homeostasis. PLOS 2012; 38(3):
271-275.

47
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

33.Botta GP, Manley P, Miller A, Lelkes P. Real time assessment of three-


dimensional cell aggregation in rotating wall vessel bioreactors in vitro.
Nature Protocols 2006; 2116-2119.
34.Boulanger CM, Dignat-George F. Microparticles: an introduction.
Arterioscler Tromb Vasc Biol 2011; 31: 2-3.
35.Braet F, Luo D, Spector I et al. Endothelial and pit cells. Gastrohep 2007;
437-448.
36.Branderberger R. Cell therapy bioprocessing: Integrating process and
product development for the next generation of biotherapeutics.
BioProcess Int 2011; 9: 530-537.
37.Brandom BW, Larach MG, Chen MS, Young MC, Complications
associated with the administration of dantrolene 1987 to 2006: a report
from the North American Malignant Hyperthermia Registry of the
Malignant Hyperthermia Association of the United States, Anesth Analg
2011, 112(5): 1115-23
38.Brashear A, Zafonte R, Corcoran M, Galvez-Jimenez N. Inter- and
intrarater reliability of the Ashworth scale and the disability assessments
scale in patients with upper-limb poststroke spasticity. Arch Phys Med
Rehabil 2002; 83:1349-54
39.Bratt-Leal AM, Nguyen AH, Hammersmith AH et al. A microparticle
approach to morphogen delivery within pluripotent stem cell aggregates.
Biomaterials 2013; 34(30): 7227-7235.
40.Brillantes AB, Ondrias K, Scott A et al. Stabilization of calcium ion
channel(ryanodine receptor) function by FK506-binding protein. Cell
1994; 77(4): 513-23.
41.Brookes PS, Yoon Y, Robotham JL et al. Calcium, ATP and ROS: a
mitochondrial love hate triangle. Am J Physiol Cell Physiol 2004;
287(4): C817-C833.
42.Browning JD, Horton J. Molecular mediators of hepatic steatosis and
liver injury. J Clin Investig 2004; 22(4): 132-39.
43.Burja AM, Banaigs E, Abu-Mansour J et al. Marine cyanobacteria-a
profile source of natural products. Tetrahedron 2001; 57(46): 9347-9372.
44.Burkholder T, Foltz C, Karlsson E et al. Health Evaluation of
Experimental Laboratory Mice .Curr Protoc Mouse Biol 2012; 2: 145-
165.
45.Bykokurolu ME, GlIn I, Oktay M, Kfreviolu OI. In vitro
antioxidant properties of dantrolene sodium. Pharmacol Res 2001; 44(6):
491-4.
46.Campbell EA, Korzheva N, Mustaev A et al. Structural Mechanism for
Rifampicin Inhibition of Bacterial RNA Polymerase. Cell 2001; 104(6):
901-912.
47.Canbay A, Friedman S, Gores GJ. Apoptosis: the nexus of liver injury
and fibrosis. Hepatology 2004; 39(2):273-8.
48
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

48.Cao W, Gu Y, Meineck M, Xu H. The Combination of Chemotherapy


and Radiotherapy towards More Efficient Drug Delivery. Chem Assian J
2014; 9(1): 46-57.
49.Cao Y, Langer R. A review of Judah Folkman remarkable achievements
in biomedicine. PNAS 2008; 105(36): 13203-13205.
50.Carpentieri-Rodrigues NL, Zaniuchi NM, Grebogi IH. Percutaneous
absorbtion enhancers: mechanisms and potential. Brazil Arch Biol Techn
2007; 50(6): 107-119.
51.Cederbaum AI, Lu Y, Wu I. Role of oxidative stress in alcohol induced
liver injury. Arch Toxicol 2009; 83: 519-548.
52.Celia E, Darmanin T, Taffin de Givenchi E et al. Recent advances in
designing superhydrofobic surfaces. J Colloid Interface Syst 2013; 402:1-
13.
53.Chakroborty S, Briggs C, Miller MB et al. Stabilizing ER Ca2+ channel
function as an early preventive strategy for Alzheimer disease. PloS One
7, 2012; e52056.
54.Chakroborty S, Stutzmann G. Calcium channelopathies and Alzheimer's
disease: Insight into therapeutic success and failure. J IntBiochem 2013;
45: 613-27.
55.Chalasani N, Fontana RJ, Bonkovski HL, et al. Drug Induced Liver
Injury Network (DILIN). Causes, clinical features, and outcomes from a
prospective study of drug-induced liver injury in the United States.
Gastroenterol 2008; 135: 1924-34.
56.Chan CH. Dantrolene sodium and hepatic injury. Neurol 1990, 40(9):
1427-32.
57.Charman WN, Porter CJH, Mithani S, Dressman JB. Physicochemical
and physiological mechanisms for the effect of food on drug absorbtion:
the role of lipids and pH. J Pharm Sci 1997; 86(3): 123-129.
58.Chattopadhyay P, Pal S, Wahi K et al. Synthesis of crystalline
hydroxiapathite from coral(Gerconacea sp)and cytotoxicity evaluation.
Trends in Biomaterials and Artificial Organs 2007; 20(2): 139-142.
59.Chelu MG, Danil CI, Gilman CP, Hamilton SL. Regulation of ryanodine
receptors by FK506 binding proteins. Trends Cardiovasc Med 2004;
14(6): 227-34.
60.Chen Y, Liu L. Modern methods for delivery of drugs across the blood-
brain barrier. Adv Drug Deliv Rev 2011; 64(7): 640-665.
61.Chen Y, Lu Y, Zhang Z et al. Opposite effect of NF-kappaB and c-Jun N-
terminal kinase on p53 independent GADD45 induction by arsenite. J
BiolChem 2001; 276(14): 11414-9.
62.Cheng H, Wei MC, Weiler S et al. BCL-2, BCL(X)L sequester BH3
domain- only molecules preventing BAX and BAK mediated apoptosis.
Mol Cel 2001; 17(9): 322-29.

49
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

63.Cherednichenko G, Ward CW, Feng W, et al. Enhanced Excitation-


Coupled Calcium Entry in Myotubes Expressing Malignant
Hyperthermia Mutation R163C is Attenuated by Dantrolene, Mol
Pharmacol 2008; 73(4) ): 1203-1212.
64.Cheung YK, Gilette BM, Zhong M et al. Direct psatterning of composite
biocompatible biostructures using microfluidics. Lab Chip 2007; 7(5):
547-9.
65.Churchman N. Hy s rule proven to detect drug-induced liver disease.
Hepatol 2005; 42(2): 481-9.
66.Cohen P. Role for stearoyl-CoA desaturase -1 function protects mice
against adiposity. Science 2002; 297: 240-48.
67.Conrado DJ, Gonzalez D, Derendorf H. Role of drug absorbtion in the
pharmacokinetics of therapeutic interventions for stroke. Ann NY Acad
Sci 2010; 1207: 134-42.
68.Cory S, Adams JM. The Bcl-2 family. Roles in cell survival and
oncogenesis. Oncogene 2003; 22(32): 8590-607.
69.Couvreur P. Dossier: Drug delivery and drug efficacy. Biomed
andPharmacother 2004; 58(3): 141-143.
70.Cragg GM, Newmann M. Natural product drug discovery in the next
millennium. Pharm Biol 2001; 39(1): 17-21.
71.Csovary S, Angyal T, Benko K, Strenger J. Free radical reactions and
cancer. Problems in Med Chem 1992; 38: 48-59.
72.Cunha RA, Soares TA, Rusu VH et al. The Molecular Structure and
Conformational Dynamics of Chitosan Polymers: An Integrated
Pespective from Experiments and Computational Simulations. In The
Complex World of Polysaccharides. Karunaratne DN editor. New York:
In Tech, 2012.
73.Dash M, Chiellini F, Ottenbrite RM, Chiellini E. Chitosan- Aversatile
semi-synthetic polymer in biomedical applications. Prog Polym Sci 2011;
36: 981-1014.
74.Davies JR. Overview of biomaterials and their use in medical devices.
ASM Int 2003, 42: 341-349.
75.Davila J, Xu JJ, Hoffmaster K et al. Current in vitro systems used to
address drug-induced liver injury. In Hepatotoxicity. From genomics to
invitro and in vivo.(S.Sabu. Ed). Wiley &Sons, New York 2007.
76.Davis ME, Chen ZG, Shin DM. Nanoparticle therapeutics: an emerging
treatment modality for cancer. Nat Rev Drug Discov 2008;7: 771-82.
77.De Crescenzo V, Fogarthy FE, Lefkowitz JJ, et al. Type 1 ryanodine
receptor knock in mutation causing central core disease of skeletal
muscle also displays a neuronal phenotype. Proc Natl Acad Sci USA
2012; 109: 610-615.

50
Implicaii ale formulrilor cu eliberare prelungit n reducerea efectelor adverse

78.Dean R. Kinetic Studies with Alkaline Phosphatase in the Presence and


Absence of Inhibitors and Divalent Cations. BAMBED 2002; 30(6): 401-
407.
79.Debbage P. Targeted drugs and nanomedicine: present and future. Curr
Pharm Des 2009; 15(2):153-72.
Delivery systems. Annu Rev Chem Biomol Engineer 2010; 1: 149-173.
80.Demers C, Hamdy D, Corsi K et al. Natural coral exoskeleton as a bone
graft substitute: a review. Bio Med Mat Eng 2002; 12(2): 15-35.
81.Deng W, Carlson N, Takeyama K et al. BH3 profiles identifies three
distinct classes of apoptotic blocks to predict response to ABT-737.
Cancer Cell 2007; 12(2): 121-127.
82.Deng X, Luyendyck J, Ganey PE, Roth RA. Inflammatory stress and
idiosyncratic hepatotoxicity: hints from animal model. Pharmacol Rev
2009; 61: 321-29.
83.Desai KGH, Park HJ. Encapsulation of vitamin C in tripolyphosphate
cross-linked chitosan microspheres by spray drying. J Microencapsul
2005; 22(2): 179-192.
84.Di L. The role of drug metabolizing enzymes in clearance. Expert Opin
DrugMetab Toxicol 2014; 10: 379-393.
85.Ding BH, Cao Z, Lis R et al. Divergent angiocrine signals from vascular
niche balance liver regeneration and fibrosis. Nature 2014; 505:97-102.
86. Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of
22 September 2010 on the protection of animals used for scientific
purposes.
87.Donthamsetty S, Bhave VS, Mitra MS, et al.Nonalcoholic fatty liver
sensitizes rats to carbon tetrachloride hepatotoxicity. Hepatology
2007;45(2):391403.
88.Dos Santos A, Andrade PZ, da Silva CL, Cabral JM. Bioreactor design
for clinical-grade expansion of stem cells. Biotechnol J 2013; 8: 644-654.
89.Drury JL, Dennis RG, Mooney DJ. The tensile properties of alginate
hydrogels. Biomaterials 2004; 25: 3187-3199.
90.Du GG, Sandhu B, Khanna V et al. Topology of Ca2+ release channel of
skeletal muscle sarcoplasmic reticulum(RyR1). PNAS 96(26): 16725-
16730.
91.Duarte ARC, Caridade SG, Mano JF, Reis RL. Processing of novel
bioactive polymeric matrixes for tissue engineering using supercritical
fluid technology. Mater Sci Eng C. Mater Biol Appl 2009; 29: 2110-
2115.
92.Duffy MR, Ferguson C. Role of dantrolene in treatment of heat stroke
associated with Ectasy ingestion. Br J Anaesth 2008; 98(1): 148-152.
93.Dufour RD, Lott JA, Nolte FS et al. Diagnosis and monitoring of hepatic
injury. Performance characteristics of laboratory tests. Clin Chem 2000;
46(12): 2027-2048.
51