Metode de determinare a testelor de biochimie generala, proteinelor

specifice si a metabolitilor urinari

Pentru probarea diagnosticului, se recomanda urmatoarele analize si investigatii:

Spectrofotometria
Un spectrofotometru sau un colorimetru utilizeaza transmiterea luminii printr-o solutie pentru
determinarea concentratiei unui solut in solutia respectiva. Spectrofotometrul difera de
colorimetru prin modul in care lumina este separata in lungimile de unda componente.
Spectrofotometrul utilizeaza o prisma pentru separarea luminii, iar colorimetrul utilizeaza filtre.
Ambele se bazeaza pe un model simplu de trecere a luminii de lungime de unda cunoscuta
printr-o proba si masurarea cantitatii de energie luminoasa care este transmisa. Aceasta se
realizeaza prin plasarea unei fotocelule in partea opusa a probei respective. O raza de lumina
este formata din fotoni; cand un foton intalneste o molecula de analit, exista sanse ca analitul
sa absoarba fotonul. Aceasta absorbtie reduce numarul de fotoni din raza de lumina, astfel
reducand intensitatea luminoasa.Toate moleculele absorb energie radianta la anumite lungimi
de unda. Cele care absorb energie in spectrul vizibil sunt cunoscute ca pigmenti. Proteinele si
acizii nucleici absorb lumina in domeniul ultraviolet. Un spectrofotometru implica o sursa de
lumina, o prisma, un suport pentru probe si o fotocelula. Acestea sunt conectate la un sistem
electric sau mecanic care controleaza intensitatea luminii, lungimea de unda si conversia
energiei primite la nivelul fotocelulei in fluctuatii voltmetrice. Fluctuatiile voltmetrice sunt apoi
proiectate pe o scala metrica/digitala si valorile sunt inregistrate intr-un computer.
Intensitatea culorii dintr-o proba depinde de cantitatea de solut din proba respectiva.
Transmisia luminii nu este o functie liniara, ci mai degraba exponentiala. Transmitanta este
procentul relativ de lumina care a trecut prin proba. Transmitanta procentuala este
transformata intr-o functie logaritmica inversa cunoscuta ca absorbanta (sau densitate optica).
Legea Beer-Lambert: absorbanta este minus log10 din transmitanta (A = - log10T). Aceasta
valoare este mai utila decat transmitanta deoarece proiectia absorbantei versus concentratie
determina o linie dreapa, absorbanta crescand odata cu cresterea concentratiei (transmitanta
scade odata cu cresterea concentratiei de analit).
Pentru a utiliza un spectrofotometru este necesara stabilirea unei serii cunoscute de dilutii a
unor cantitati cunoscute de solut. Una din acestea nu contine solut si este cunoscuta ca
blank. Este utilizata pentru ajustarea instrumentului sa citeasca 100% transmitanta pentru
absorbanta 0. O valoare a transmitantei de 0% (absorbanta infinita) este stabilita prin plasarea
unei bariere intre sursa de lumina si fotocelula. Toate celelalte masuratori sunt apoi efectuate
prin simpla plasare a probelor in calea luminii. Dupa inregistrarea absorbantei pentru o serie
de probe standard este efectuata o dreapta absorbanta versus concentratie. Panta dreptei
reprezinta coeficientul de extinctie. Aceasta valoare este o constanta si este utilizata pentru
conversia oricarei absorbante masurate in concentratia corespunzatoare (C = A/).
Un spectrofotometru poate utiliza atat lumina vizibila (de obicei avand ca sursa de lumina o
lampa cu tugsten/halogen), cat si lumina UV. Singura modificare necesara este inlocuirea
tuburilor de sticla cu cuvete de quartz (sticla absoarbe lumina UV si nu este potrivita pentru un
spectrofotometru UV).

Majoritatea testelor de chimie clinica efectuate pe analizorul automat sunt teste colorimetrice,
distingandu-se urmatoarele tipuri de teste:
- teste enzimatice colorimetrice in care substanta de analizat este tratata cu una sau mai multe
enzime specifice, in urma reactiei rezultand hidrogen peroxid, care in prezenta unui substrat,
sub actiunea peroxidazei duce la formarea unui pigment iminoquinonic care este determinat
fotometric, intensitatea culorii formate fiind proportionala cu concentratia analitului respectiv
(ex: determinarea acidului uric cu utilizarea uricazei);
- teste colorimetrice in care substanta de analizat se cupleaza specific cu reactivul cu formarea
unui produs conjugat colorat care este determinat fotometric (ex.: bilirubina se cupleaza cu
ionul diazoniu in mediu puternic acid cu formarea azobilirubinei de culoare rosie); in cazul
determinarii enzimelor, acestea cliveaza enzimatic un substrat specific, produsul rezultat fiind
colorat/ se cupleaza cu un cromogen si formeaza un complex colorat;
- teste UV: NADH/NADPH care este fie produs, fie consumat in timpul reactiilor care au loc
este determinat fotometric in lumina ultravioleta, concentratia sa fiind direct, respectiv invers
proportionala cu concentratia analitului de determinat (ex: determinarea ALT si AST).
- teste kinetice: produsul final este determinat kinetic (in timp fix), ceea ce ofera o linearitate
mai mare (ex.: test kinetic UV pentru determinarea ureei).

Turbidimetria si nefelometria: se bazeaza pe formarea de complexe antigen-anticorp in

solutie. Solutiile de antigen si anticorp sunt mixate, fiind necesare cantitati foarte mici de
reactiv; formarea de agregate survine rapid. Turbidimetria masoara cantitatea de lumina
transmisa nedeviata prin solutie; fotosenzorul este plasat in linie dreapta cu sursa de lumina; o
solutie complet limpede va transmite 100% din lumina; cu cat concentratia de particule este
mai mare, cu atat mai putina lumina este transmisa. Ca si in colorimetrie se aplica legea Beer-
Lambert.
Nefelometria masoara cantitatea de lumina dispersata in unghi drept fata de raza de lumina,
fotosenzorul fiind plasat la un unghi de 90 fata de sursa de lumina; o solutie complet limpede
nu disperseaza lumina. Deoarece masuratorile nefelometrice vizeaza cresterile peste un nivel
de baza zero (spre deosebire de turbidimetrie care vizeaza reduceri ale transmisiei sub 100%),
nefelometria este mai sensibila la concentratii mici ale analitilor.
Nefelometria de rata reprezinta masurarea kinetica a formarii agregatelor. Timpul in care panta
curbei lumina dispersata timp este maxima, este proportional cu concentratia de antigen.
Aplicatii ale turbidimetriei si nefelometriei: determinarea albuminemiei si microalbuminuriei, a
imunoglobulinelor IgA, IgG, IgM si a fractiunilor complementului C3c, C4.

ISE (Ion Selective Electrodes electrozi ioni-selectivi). Un ISE este un transductor

(senzor) care converteste activitatea unui anumit ion dizolvat intr-o solutie printr-o membrana
intr-un potential electric care poate fi masurat de un voltmetru sau pH-metru. Membrana este
atasata la capatul unui tub care contine electrodul intern. Modificarea de potential este
masurata fata de un electrod de referinta extern cu potential constant. Diferenta de potential
dintre cei doi electrozi depinde de activitatea ionului in solutie, care este legata de concentratia
ionului respectiv, permitand in final masurarea sa analitica. Au fost realizate cateva varietati de
ISE pentru diferiti ioni: cu membrana de sticla (cu selectivitate pentru cationi monovalenti: H+,
Na+ si ioni metalici divalenti: Pb2+), cu membrana cristalina (cu selectivitate atat pentru
cationi: Pb2+, Cu2+, cat si anioni: Cl-, F-), cu rasini schimbatoare de ioni (ex.: electrod potasiu-
selectiv), electrozi cu tuburi capilare de sticla, electrozi enzimatici (ex.: electrod glucozo-
selectiv), electrozi gazo-sensibili (masurarea gazelor dizolvate: NH3, CO2). ISE functioneaza
pe principiul celulei galvanice: potentialul celulei este echivalent cu potentialul ISE minus
potentialul electrodului de referinta. Solutii standard de concentratii cunoscute sunt masurate
de pH-metru/voltmetru, iar valorile obtinute sunt proiectate intr-un grafic concentratie
microvoltaj; microvoltajul unei solutii necunoscute este apoi localizat pe grafic si este
determinata concentratia corespunzatoare a solutiei. Determinarile ISE nu sunt influentate de
interferente cum ar fi culoarea probei.
Surse de eroare: interferente ale altor ioni cu proprietati similare ionului de testat; diferente in
rata de difuzie a ionilor in functie de marimea acestora (pentru compensarea acestui tip de
eroare este importanta asigurarea unui flux pozitiv al solutiei spre electrod); incarcatura ionica
totala a probei afecteaza coeficientul de activitate (este utilizat un ajustant al incarcaturii ionice,
aceasta ajustare fiind larga astfel incat variatia intre probe sa fie mica); temperatura:
modificarea temperaturii probei cu un singur C poate duce la erori de masurare de >4%; pH-
ul.
Aplicatiile ISE in laboratoarele Synevo: ionograma serica si urinara sodiu, potasiu, clor.

Reactii de latex-aglutinare: sunt teste serologice care se bazeaza pe reactia antigen-anticorp

microparticule de latex invelite in molecule de antigen/anticorp aglutineaza in urma cuplarii
cu anticorpul, respectiv antigenul corespunzator din serul de testat. Latex-aglutinarea a fost
adaptata pentru teste cantitative care utilizeaza turbidimetria/nefelometria, asigurand cresterea
sensibilitatii.
Aplicatii in laboratoarele Synevo: determinarea ASLO, CRP, factor reumatoid.

Cromatografia reprezinta un grup de metode de laborator care se bazeaza pe adsorbtia

selectiva, prin care componentele unui amestec complex pot fi identificate si/sau purificate
(adsorbtia reprezinta aderenta moleculelor la suprafata unei alte substante). Metoda a fost
utilizata initial de botanistul rus Mikhail Tsvett pentru separarea de produsi intens colorati, de
unde denumirea de cromatografie.
Cromatografia in coloana implica o faza mobila (lichid sau gaz) care curge peste o faza
stationara (solida sau lichida). In cromatografia in coloana un amestec de molecule este
separat pe baza afinitatii fiecarei molecule pentru faza mobila sau stationara: daca o molecula
are o afinitate mai mare pentru faza stationara decat o alta molecula, atunci cea din urma va
migra prin coloana mai rapid decat prima molecula. Solutia de analizat este adaugata prin
partea superioara a coloanei si este apoi eluata cu solvent; fractiunile sunt colectate prin
partea inferioara a coloanei. Exista mai multe varietati de cromatografie in coloana:
cromatografia cu gel filtrare (excludere moleculara), cromatografia cu schimb de ioni,
cromatografia cu faza inversa, cromatografia cu gaz-lichid, cromatografia cu interactiuni
hidrofobe, cromatografia cu afinitate, cromatografia cu separare.
In cromatografia cu gel-filtrare (excludere moleculara) moleculele dintr-o solutie sunt separate
in functie de marimea lor pe masura ce trec printr-o coloana de bile legate intre ele intr-o retea
tridimensionala. Aceste bile polimerice (dextran, agaroza sau acrilamid) prezinta pori de
anumite dimensiuni. Pe masura ce o proba trece prin coloana, moleculele mai mari decat
dimensiunile porilor nu vor patrunde in ochiurile retelei ramanand in solutie, astfel incat ele vor
elua primele din coloana. Moleculele mai mici vor patrunde prin pori in ochiurile retelei si astfel
se vor deplasa mai lent prin coloana si vor elua ultimele din solutie. Pe masura ce proba
elueaza la capatul coloanei fractiunile sunt colectate in tuburi. Fractiunile eluate sunt apoi
testate pentru determinarea compozitiei si cantitatii componentelor respective prin
spectrofotometrie, electroforeza sau teste functionale. Cromatografia cu gel filtrare este
utilizata in primul rand pentru a purifica proteine sau alte molecule si poate fi utilizata pentru
estimarea marimii unor proteine necunoscute (coloane calibrate cu proteine cu GM
cunoscuta).
In cromatografia cu schimb de ioni moleculele sunt separate pe baza incarcaturii lor ionice.
Faza stationara este reprezentata de o rasina cu incarcatura fixa; daca aceasta incarcatura
este negativa (carboximetil celuloza), procesul se numeste cromatografie cu schimb de cationi,
iar daca incarcatura este pozitiva (dietilaminoetil celuloza), este cromatografie cu schimb de
anioni. Faza mobila este reprezentata de o solutie tampon. Atunci cand o proteina trece prin
coloana se poate lega de matrice si poate fi in continuare eluata prin cresterea concentratiei
ionice a solutiei tampon (elutia poate fi privita ca o competitie pentru situsurile de legare ale
matricei; pe masura ce puterea ionica a tamponului creste, o sare ionica din tampon va ocupa
un situs al matricei si proteina va fi eluata din coloana). pH-ul solutiei tampon este critic in
cromatografia cu schimb de ioni. Exista doua cai de efectuare a elutiei: prin gradient, in care
concentratia salina creste constant si gradual in timpul procesului de elutie si elutia brusca, in
care modificarea in concentratia salina este abrupta.
Electroforeza, ca si cromatografia cu schimb de ioni, poate fi utilizata ca un instrument eficient
pentru analiza unui amestec de ioni. O fasie de hartie sau gel polimeric saturata cu un
electrolit este asezata astfel incat sa traverseze doua solutii care contin electrozi. Amestecul
de analizat este aplicat pe hartie/gel si cei doi electrozi sunt conectati la o sursa de inalta
energie (~5000 volti). Ionii pozitivi vor migra intr-o directie, iar cei negativi in cealalta directie.
Cu cat este mai mare incarcatura ionului, cu atat va migra mai departe. Metoda este in mod
special utila pentru separarea amestecurilor proteice.
In cromatografia cu faza inversa moleculele sunt legate de o matrice hidrofoba (hidrocarburi cu
lant lung legate de o matrice de silicon) intr-un tampon hidrofil. Moleculele pot fi apoi eluate
prin scaderea polaritatii tamponului, de exemplu prin cresterea concentratiei de alcool sau alt
solvent nepolar din tampon.
Cromatografia cu afinitate este utilizata mai mult in scop de cercetare; moleculele sunt
separate pe baza unor aspecte specifice ale structurii si activitatii lor biologice. Sunt utilizati
liganzi care sunt imobilizati intr-o matrice de suport, din care este efectuata o coloana; peste
coloana se toarna proba care contine proteina de interes si care se leaga de liganzii continuti
in coloana; proteina este apoi eluata, fie prin modificarea conditiilor din coloana (modificarea
pH-ului sau concentratiei saline), fie prin utilizarea unei alte molecule care va intra in
competitie cu molecula de interes pentru situsurile de legare ale liganzilor. Exemple de liganzi
in functie de substanta de purificat: substrat, inhibitor, cofactor (pentru enzime), antigene
(pentru anticorpi), secvente de baze complementare (pentru acizi nucleici).
Cromatografia lichida de inalta performanta utilizeaza pompe care furnizeaza presiuni inalte
care imping solventii prin coloane metalice. Aceasta creste viteza procesului de separare si
previne raspandirea solutiilor care poate aparea in cromatografia in coloana gravitationala.
Separarea are loc in minute in loc de ore si este net superioara. Utilizand cromatografia cu
faza inversa pot fi separate doua proteine a cate 100 aminoacizi fiecare care difera printr-un
singur aminoacid.
Cromatografia cu gaz utilizeaza un lichid cu punct de fierbere inalt impregnat intr-un suport
solid inert ca faza solida si heliu ca faza mobila, intregul sistem fiind incalzit. Solutul este
injectat in coloana si se volatilizeaza imediat, heliul indepartand componentele din coloana,
fiecare component fiind inregistrat de un detector care determina cantitatea relativa a acestuia.
Polaritatea si volatilitatea componentelor determina timpul cat acestea sunt retinute de
coloana. Capacitatea coloanei in cromatografia cu gaz fiind foarte mica, aceasta este utilizata
in principal ca un instrument analitic.
In cromatografia in strat subtire si cromatografia cu hartie coloana este inlocuita cu un strat
adsorbant (silicon, aluminiu, celuloza) aplicat pe un suport de sticla/plastic/folie de aluminiu.
Solutul este aplicat cu un tub capilar, iar solventul este lasat sa se evapore. Apoi
componentele sunt eluate cu un solvent care este lasat sa urce pe placuta prin actiune
capilara, antrenand componentele amestecului in grade diferite. In final se aplica un agent
oxidant, astfel incat fiecare component apare ca o pata intunecata pe placuta, localizarea si
marimea fiecareia dintre acestea servind pentru identificarea si masurarea cantitatii relative a
componentelor.
Aplicatii ale cromatografiei in laboratorul Synevo: determinarea acidului vanilmandelic,
metanefrinelor si 17-cetosteroizilor urinari.