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net/publication/50906627

Un enfoque metaproteomic da una visin funcionales en la

digestin anaerobia

Artculo en Journal of Applied Microbiology Marzo 2011

DOI: 10.1111 / j.1365-2672.2011.05011.x Fuente: PubMed

CITACIONES LEE

34 137

6 autores , incluso:

Catherine Helen Botting

Universidad Nacional de Irlanda, Galway Universidad de St. Andrews

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Gavin Collins vincent O'Flaherty

Universidad Nacional de Irlanda, Galway Universidad Nacional de Irlanda, Galway

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La desinfeccin de las aguas residuales de efluentes Ver Proyecto

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 Journal of Applied Microbiology ISSN 1364-5072

ARTCULO ORIGINAL

Un enfoque metaproteomic da una visin funcionales en la digestin anaerobia

F. Abram 1, A.M. Enright 2, J. O'Reilly 1, CH Botting 3, G. Collins 2 y V. O'Flaherty 1

1 Laboratorio de Ecologa Microbiana, Departamento de Microbiologa, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Nacional de Irlanda, Galway, Irlanda 2 microbiana Ecofisiologa Grupo de

Investigacin, Departamento de Microbiologa, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Nacional de Irlanda,

Galway, Irlanda
3 Centro de Ciencias Biomoleculares, Universidad de St. Andrews, St. Andrews, Fife, Reino Unido

Palabras clave Abstracto

procesos metablicos, filogenia microbiana, la protemica,

lodos, tratamiento de aguas residuales. Objetivos: El objetivo de este trabajo fue proporcionar evidencia funcional de las rutas metablicas clave
importantes para los procesos de digestin anaerbica a travs de la identificacin de protenas altamente
Correspondencia expresadas en un consorcio microbiano anaerobio mixto.
Vincent O'Flaherty, Laboratorio de Ecologa Microbiana,

Departamento de Microbiologa, Facultad de Ciencias Naturales,

Universidad Nacional de Irlanda, University Road, Galway,
Irlanda. E-mail: vincent.o fl aherty@nuigalway.ie
2010 / 1925: Recibido el 26 de octubre de 2010, 9 revisado marzo de
2011 y aceptado el 19 de de marzo de 2011
doi: 10.1111 / j.1365-2672.2011.05011.x
Mtodos y Resultados: Las comunidades microbianas a partir de un biorreactor de tratamiento de aguas
residuales industrial-como anaerbica se caracterizaron utilizando los anlisis filogenticos y
metaproteomics. bibliotecas de clones indicaron que la comunidad bacteriana en el biorreactor fue diversa
mientras que la poblacin archaeal se compone principalmente de Methanocorpusculum- como (76%)
microorganismos. Trescientos ochenta y ocho manchas de protenas reproducibles se obtuvieron en geles
2-D, de los cuales 70 fueron extirpados y 33 se identificaron fi. Las funciones putativas de las protenas
detectadas en el biorreactor anaerbico estaban relacionados con los procesos celulares, incluyendo la
metanognesis a partir de CO 2 y el acetato, la gluclisis y de la va de las pentosas fosfato.
Metaproteomics indic tambin, por la asignacin de protenas, la presencia de mercantiles
microorganismos en el biorreactor. Sin embargo, se observ escasa la coincidencia entre los anlisis
filogenticos y metaproteomic.

conclusiones: Este estudio proporciona alguna evidencia directa de las actividades microbianas que tienen lugar
durante la digestin anaerobia.
Significacin y el impacto de Estudio: Este estudio demuestra metaproteomics como una herramienta til para
descubrir las vas bioqumicas clave espec fi bioprocesos c anaerobias sustentan.

residuos se descargan a temperatura ambiente, o bajas,, lo que resulta en un

Introduccin
La digestin anaerbica (AD) se ha convertido en una tecnologa esencial y bien
establecido para el tratamiento de una amplia gama de residuos y aguas
residuales. El proceso natural de AD es impulsado por mal caracterizado,
interacciones intrincadas, microbianos, que pueden aplicarse para la conversin de
molculas orgnicas biodegradables no deseados complejos en una fuente de
energa renovable (McCarty 2001). Debido a las caractersticas anaerbicas
microbianas de crecimiento, las velocidades de reaccin y ptimos de temperatura,
la mayora a gran escala, anaerbica, sistemas de tratamiento de aguas residuales
industriales se emplean a temperaturas mayores de 18 C (Lettinga et al. 2001;
Hulshoff Pol
et al. 2004). Sin embargo, la gran mayora de los industriales
aumento de los costes de calefaccin necesaria para mantener el tratamiento
mesfila. Por lo tanto, baja temperatura
bioreactores anaerbicos representan una alternativa atractiva y rentable. El
xito de la escala de laboratorio, la digestin de baja temperatura anaerbico
(LTAD) ha sido bien documentado para una amplia gama de procesamiento de
alimentos, fenlicas y otras aguas residuales industriales (Kato et al. 1994,
1999; Rebac et al. 1995, 1999; van Lier et al. 1997; Lettinga et al.
1999; Connaughton et al. 2006; Enright et al. 2007; Scully
et al. 2007; O'Reilly et al. 2009). A pesar de la amplia aplicacin de la EA,
as como la tecnologa emergente de desarrollo LTAD, los
microorganismos implicados todava no se han caracterizado
completamente.

2011 Los Autores

1550 Journal of Applied Microbiology 110, 1550-1560 2011 La Sociedad para la Microbiologa Aplicada
F. Abram et al.
De hecho, se sabe poco acerca de las actividades funcionales de muchos de los
grupos abundantes encontrados en bio anaerbica pelculas (grnulos de lodo) de
biorreactores AD. En consecuencia, el rendimiento y la optimizacin de los
procesos de AD siguen siendo limitados. Hasta ahora, se ha hecho un gran
esfuerzo para elucidar la estructura de la comunidad microbiana de los consorcios
en bioreactores anaerbicos (Godon et al. 1997; Leclerc et al.
2001, 2004; roest et al. 2005; Sotavento et al. 2009; McKeown
et al. 2009; O'Reilly et al. 2009). Sin embargo, estn disponibles en los vnculos
entre la diversidad microbiana y la funcionalidad en bioreactores anaerbicos
de datos limitados.
En este estudio, las comunidades microbianas de un biorreactor anaerobio
tratamiento de un sinttica, las aguas residuales a base de glucosa a 15 C
durante 300 das (O'Reilly et al. 2010) se caracterizaron utilizando bibliotecas
de clones y metaproteomics. Las funciones de las protenas recuperadas de
los biorreactores se han atribuido basado en homologas con otras protenas,
y se discuten sus posibles contribuciones a la biologa de la AD. asignacin
protena tambin indic la presencia de fi c microorganismos especficos en el
biorreactor, y esto se compar con los resultados del anlisis filogentico.
Materiales y mtodos
Fuente de la biomasa
El biorreactor anaerobio, que era la fuente de la biomasa investigado en este
estudio, fue descrito previamente por O'Reilly et al. ( 2010). Brevemente, el
biorreactor tena un volumen de trabajo de 3 5 l y se hizo funcionar a 15 C
durante 300 das para tratar una, las aguas residuales a base de glucosa
sinttica, que fue tamponado a pH 7 1 con NaHCO 3. Las muestras de
grnulos de lodo para los anlisis filogenticos y metaproteomic se
obtuvieron en la conclusin del ensayo (da 300).
extraccin de ADN
El ADN total se extrajo a partir de biomasa granular utilizando un extractor de
cido nucleico automatizado (Magtration 12 GC; PSS Co., Chiba, Japn)
siguiendo las instrucciones del fabricante. Antes de la extraccin, la biomasa
(0 5 g de peso hmedo) fue finamente aplastado utilizando un mortero y
mano de mortero y se resuspendi en 50 ml de agua destilada desionizada.
Una 100- l l alcuota de la suspensin de biomasa fue cargado por extraccin, y
el ADN extrado se eluy en tampn HCl Tris (pH 8 0) y almacenados a) 20 C.
Todas las extracciones se llevaron a cabo por duplicado.
Generacin de bibliotecas de clones de genes 16S rRNA, secuenciacin y
anlisis filogentico
Parciales bacterianas 16S rRNA genes fueron ampli ed fi con cebador
delantero 27F (5 - AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ;
2011 Los Autores
Journal of Applied Microbiology 110, 1550-1560 2011 La Sociedad para la Microbiologa Aplicada
Metaproteomics de lodo anaerbico
Delong 1992) y 1392R cebador inverso (5 - ACGGGCGGTGTGTTRC-3 ; carril
et al. 1985). Parciales archaeal 16S rRNA genes fueron ampli ed fi con
cebador delantero 21F (5 - TTCCGGTTGATCCYGCCGGA-3 ; Stackebrandt
y Goodfellow 1991) y revertir 958R cebador (5 - YCCGGCGTTGAMTCCAATT-3
; Delong 1992). Las concentraciones de los componentes de la PCR y las
condiciones de PCR fueron como se indica por Collins et al. ( 2003). La
clonacin (TOPO SG; Se realizaron Invitrogen, Carlsbad, CA), la restriccin
de longitud de fragmentos polimrficos (RFLP) anlisis de patrones y la
secuenciacin de nucletidos, como se describi previamente (Collins et al. 2003),
Gene Servicio de Anlisis, Berln, Alemania. Los datos de secuencia fueron
seleccionados para la contaminacin vector utilizando el Centro Nacional
de Informacin de Biotecnologa (NCBI) VecScreen,
y
contaminacin vector se elimin a partir de secuencias contaminados. La
presencia de productos de amplificacin fi quimricos tambin se proyect
para usar el Ribosomal Database Project ( chimera_check RDP paquete de
software (Maidak
et al. 2000) y ninguno estaban presentes en los datos generados a partir de este
estudio. Los datos de secuencia resultantes se comparan entonces con las bases
de datos de nucletidos utilizando B ltimo n como se ha descrito previamente
(Altschul et al. 1997). Las secuencias se analizaron usando arb software (Ludwig et
al. 2004) y alineado con los parientes ms cercanos de la B ltimo n base de datos y
una base de datos ARB 16S rRNA (Hugenholtz 2002) descargado de la base de
datos ribosomal Proyecto II (Olsen
et al. 1992). Se construyeron rboles filogenticos usando el algoritmo de
vecino a participar siguiendo el protocolo de Lueders y Friedrich (2000).
Todas las secuencias de genes 16S bacterianas y archaeal rRNA de este
estudio fueron depositados en la base de datos GenBank bajo los nmeros
de acceso GU322883-GU32288,
GU322890-GU322899 y
GU946454-GU946455 para las secuencias bacterianas y GU322876,
GU322880-GU322881 y GU946456-
GU946457 para las secuencias archaeal.
Two-dimensional electroforesis en gel (2-DGE)
Las protenas se extrajeron a partir de 50 ml muestras de lodos granulares por
sonicacin (Abram et al. 2009) y, posteriormente, separados por 2-DGE
utilizando el protocolo de O'Farrell (1975), con modificaciones como se
describe anteriormente por Abram et al. ( 2009). Brevemente, la dimensin
primera consisti en el enfoque isoelctrico utilizando 7-cm tiras IPG con
gradientes de pH lineal (pH 4-7; Amersham, Buckinghamshire, UK). El
segundo acrilamida dimensin (12% [w / v]) geles se corrieron en parejas, junto
con marcadores de peso molecular con un rango de 10 a 225 kDa (protena
Rango amplio marcadores moleculares; Promega, Madison, WI). Los geles se
tieron durante la noche en GelCode reactivo de tincin azul (Pierce, Rockford,
IL) y despus se desti en agua desionizada, destilada durante varias horas.
Gel imgenes fueron capturadas por
1551
Metaproteomics de lodo anaerbico
la exploracin con un escner Perfection V350 fotogrfico Epson (Epson, Long
Beach, CA) a una resolucin de 800 dpi. Seis geles se corrieron
correspondiente a dos extracciones independientes duplicados y tres
repeticiones tcnica. Gel imgenes fueron procesados y analizados con pdquest-
El software avanzado, versin 8.0.1 (BioRad, Hercules, CA). conteos
puntuales se obtuvieron utilizando el asistente de deteccin de puntos que
permite la opcin de modelo de Gauss segn lo recomendado por el
fabricante.
Nano fl cromatografa de ionizacin por electrospray espectrometra de masas
tndem ow lquido (NLC-ESI-MS / MS) y protena identificacin
Las protenas se escindieron de los geles y se sometieron a digestin en gel,
utilizando un investigador ProGest en robot geldigestion (Genomic Solutions,
Ann Arbor, MI) siguiendo protocolos estndar (Shevchenko et al. 1996).
Brevemente, las piezas de gel se desti por lavado con acetonitrilo y se
somete a reduccin y alquilacin antes de la digestin trptica a 37 C. Los
pptidos se extrajeron a continuacin con 10% (v / v) de cido frmico.
mezclas de pptidos se separaron posteriormente usando una nanoLC
UltiMate (LC Packings, Amsterdam, Pases Bajos) equipado con un PepMap
C 18 trampa y la columna, el desarrollo de un gradiente de 5 a 50% (v / v) de
acetonitrilo durante 30 min ya sea o 60 min, dependiendo del peso molecular
de la muestra que se analiza (transicin 40 kDa), seguido por un perodo de
lavado extendido con 95% (v / v) de acetonitrilo. El eluyente se pulveriz en
un espectrmetro de masas en tndem Q-Star XL (Applied Biosystems,
Foster City, CA) y se analiza en el modo de adquisicin
informationdependent. SRA / MS datos para iones precursores cargados doble
y triplemente fueron convertidos a los datos del centroide, sin alisado,
utilizando el QS1.1 Analyst importacin de datos mascot.dll de filtro con la
configuracin predeterminada. la EM / MS fi datos le generado se analiz
utilizando el motor de bsqueda Mascot 2,2 (Matrix Science, London, UK)
contra la base de datos NCBInr (2 feb 2011, 12852469 secuencias) y Trembl
(23 feb 2011, 13499622 secuencias), sin restriccin de especies. La
identificacin de las protenas se bas en la puntuacin Mowse de la
mascota; una puntuacin Mowse de> 55 fue estadsticamente significativo,
con un nivel de confianza del 95%, cuando la MS / MS datos se utilizaron para
consultar tanto NCBInr y Trembl. Adems, un mnimo de dos pptidos tuvo
que ser detectado para la protena positiva identificacin.
resultados
anlisis de la comunidad microbiana del biorreactor de baja temperatura
anlisis del patrn de PCR-RFLP se llev a cabo en 98 clones
bacterianos y 79 clones archaeal. electrofortica nico
1552 Journal of Applied Microbiology 110, 1550-1560 2011 La Sociedad para la Microbiologa Aplicada
F. Abram et al.
patrones de bandas fueron designados como unidades operativas
taxonmicas (Otus), y clones nico representante de clonal UOT superiores
a 1% de bibliotecas de clones respectivos a continuacin se secuenciaron.
Esto implicaba que se seleccionaron representantes de slo el 50% de los
clones bacterianos y 90% de los clones archaeal para la secuenciacin
como la abundancia de los clones restantes fue menor que 1%. Los anlisis
filogenticos claramente agrupa las secuencias clonales bacterianas en el (Planctomycetes
11%), la Verrucomicrobia ( 5%), la proteobacterias ( 2%), el (Bacteroidetes 15%),
el OP11 divisin candidato (2%), el (Firmicutes 11%) y la
thermotogae ( 4%; Higo. 1). Las secuencias clonales archaeal podran
agruparse en el Methanomicrobiales ( 76%), con slo Methanocorpusculum- como
clones, la Methanobacteriales
(11 5%) y la crenarchaeota ( 2 5%; Higo. 2).
Metaproteomics de baja temperatura de lodo anaerbico
granular
Los patrones de protenas de dos, muestras de lodos independientes se analizaron
por 2-DGE. En, 388 puntos promedio de protena reproducibles (SD 17 9; n = 6)
podra ser detectado en los geles 2-D (Fig. 3). Setenta puntos distintos fueron
extirpados para la protena identi fi cacin. Treinta y tres de las 70 manchas de
protenas eran positivamente
identi fi usando nLC-ESI-MS / SRA
(Tabla 1, Fig. 3). Un nmero de protenas, tales como F 420-
N dependiente 5, norte 10- reductasa methylenetetrahydromethanopterin de thermautotrophicu
Methanothermobacter
y el do- subunidad de la reductasa metil-coenzima M de Methanosaeta
thermophila, migr como varios puntos distintos, como se indica en la Tabla 1.
Mltiples puntos de deteccin de un producto gnico es una caracterstica bien
conocida de la tcnica de 2-DGE (O'Farrell 1975; Gygi et al. 2000) y podra ser
el resultado de, por ejemplo, las variaciones de tensin, el procesamiento
diferencial de protenas o modificaciones post-traduccionales.
Tambin podra ser atribuido a artefactual modi fi caciones
impuestas durante los anlisis experimentales de las protenas. Sin
embargo, el origen y la significacin biolgica de la deteccin de mltiples
puntos observada es todava poco clara. En total, se detectaron 18
protenas diferentes, excluyendo redundante
identificaciones pero teniendo en
protenas de la cuenta de la misma funcin sugerido atribuido a diferentes especies
microbianas (Tabla 1). Algunos accesos de protenas no se pueden atribuir de forma
inequvoca a las especies fi c microbianos especficos como los pptidos que se
encuentran emparejados a las regiones de homologa de secuencia a travs de varias
especies.
Resolucin de especies microbianas metaproteomics
El enfoque metaproteomic aplicado aqu permiti la identificacin de protenas a
partir de especies microbianas c espec fi. La asignacin de las protenas a
microorganismos llev a seis situaciones diferentes que se detallan a
continuacin. En primer lugar, en el
2011 Los Autores
F. Abram et al. Metaproteomics de lodo anaerbico

72 B17 GU946454 (3%) de alta mar clon sedimento BD2-16,

52 AB015544 B6 GU322888 (2%)

36 bacteria Uncultured FGL3_B161 clon, FJ437830

Uncultured planctomycetes bacteria QEDQ3CE08, CU923200
Anaerbico clon digestor vadinBA30, U81656 B4 GU322886
(2%) B7 GU3228899 (2%) B5 GU322887 (2%)

78
99 Uncultured clon bacteria VHS-B3_14, DQ394931
Planctomycetes
Planctomyces sp. str. 130, X81952
91 Planctomyces maris, S39798 X Planctomyces
62 limnophilus, S39795 X
Planctomyces sp. AGA / M18, X85249
Planctomyces brasiliensis, X85247 Pirellula sp.
str. 302, X81942
59
staleyi Pirellula, M34126
QEDN7CE07, CU925564
92 Estuario RB24 clon sedimentos, U62845 Uncultured Verrucomicrobia bacteria
Uncultured Verrucomicrobia bacteria cloneC01_WMSP1, DQ450783
Verrucomicrobia
GU322883 B1 (2%)

61

18
delta Uncultured clon proteobacterium B1-0, 3 proteobacterias
GU322885 B3 (2%)
B13 GU322895 (4%)
Uncultured AA26 eubacteria, AF275921 Uncultured Cytophagales clon bacteria TDNP_Wbc97_200_1_88,
TDNP_USbc97_190_1_47,
FJ517044 FJ516914 B18 GU946455 (3%) delta Uncultured clon proteobacterium MS4-91, GQ354944

99 99 B15 GU322897 (7%)

74
clon bacteria Uncultured MS4-31, GQ354928 Uncultured Cytophagales clon bacteria
43

99 GU322890 B8 (2%) clon anaerbico digestor vadinHA17,

63 U81712

40
Anaerbica digestor clon FC27, U81676 acufero contaminado clon Bacteroidetes
WCHB1-29, AF050544
Bacteroides Putredinis, microfusus L16497
79
Rikenella, L16498
Bacteroides splanchnicus, L16496 B2
GU322884 (2%)
Uncultured BS17 clon bacteria, EU358692 Uncultured Bacteroidetes / Chlorobi clon bacteria grupo D1 \ 12_3,
99 EU266837
Anaerophaga sp inculto. MDAF11 clon, EU214540
63
93 divisin candidato inculto OP11clone pLTB-VMAT-84, AB294976
99
GU322891 B9 (2%)
80 De aguas profundas clon de sedimentos BD7-4, AB015580 divisin candidato OP11
98 CL500-13 clon, AF316798
77 De aguas profundas BD5-13 clon de sedimentos, AB015569
Acetivibrio cellulolyticus, L35516 Clostridium
49 papyrosolvens
aldrichii, Clostridium,
X71846 Clostridium X71852 Lago
thermocellum,
L09173
98 57
Clostridium sp inculto. clon 6-2-K, AB198871
Clostridium cellulolyticum, X71847

B12 GU322894 (2%)

99 Uncultured clon bacteria R1p16, AF482434
La cepa de R. Callidus, flavefaciens L76596
Ruminococcus, X83430 Eubacterium siraeum,
99 92 L34625 Fusobacterium prausnitzii, X85022

93 Carnobacterium funditum, S86170 Carnobacterium

mvil, X54271 Carnobacterium alterfunditum, L08623
66 Carnococcus allantoicus, M98448 Lactosphaera
pasteurii, X87150

99
B14 GU322896 (5%)
bacteria Uncultured A59 clon, EU234092
Firmicutes
GU136579

32 B10 GU322892 (2%)

58
Uncultured clon bacteria IIIB-9, AJ488100 Sphaerochaeta sp.
TQ1, DQ833400
89 DCE clon consorcio declorinadora DCE25, AJ249227 Bacillus sp. S110 (18) -1
96 sp Espiroqueta. Amigo, las especies AF357916
51 Espiroqueta, M87055
29 Bajacaliforniensis Espiroqueta, M71239 Espiroqueta
41 africana, X93928
especies Espiroqueta, X79548 clon bacteriano
99 Uncultured, X89043
98 Espiroqueta termfilos, M71240
B11 GU322893 (2%)
Uncultured clon Spirochaetes, QEDN2BE08, CU925939 Treponema denticola,
99 M71236 phagedenis Treponema, M57739 Treponema pallidum, M34266 M Spirochaeta
thermophila, X62809

bacteria Uncultured, AB195923 clon bacteria Uncultured

97
28, FJ462028
89 B16 GU 322 898 (4%) thermotogae
Thermotoga elfii, X80790
Thermotoga subterranea, U22664
Thermotoga maritima, M21774 Ferroglobus

Euryarchaeota
Methanococcus

0 10

Figura 1 Filogenia de secuencias bacterianas obtenidas a partir de baja temperatura de biomasa anaerbica granular (en negrita) junto con los parientes ms cercanos de acuerdo con el NCBI y
ARB (rbol calculado con ARB, mtodo de unin de vecinos). Repeticiones de arranque (de un total de 1000 muestras replicadas) que apoyaron la orden de ramificacin se muestran en los nodos
relevantes en porcentaje. nmeros de acceso de GenBank se proporcionan para secuencias clonales y de referencia, y tambin se indica porcentaje abundancia de bibliotecas de clones relevantes
(entre parntesis). La barra de escala representa 10% de divergencia de secuencia.

casos de manchas 1 y 33, un conjunto de pptidos que coincida con las protenas punto 2, un solo punto dado lugar a la identificacin de un conjunto diferente de

de las mismas funciones de diferentes especies microbianas (spot 1) o gneros pptidos que coincida con protenas de funcin similar (enolasa) a partir de una

(spot 33) fue identi fi ed partir del anlisis de un solo punto (Tabla 1). En segundo amplia gama de gneros de bacterias (Tabla 1). Esta situacin tambin se refera a los

lugar, en el caso de puntos 3, 4 y 7; sin embargo,

2011 Los Autores

Journal of Applied Microbiology 110, 1550-1560 2011 La Sociedad para la Microbiologa Aplicada 1553
Metaproteomics de lodo anaerbico F. Abram et al.

simbionte ciliado anaerbico, parvum M96976

Methanocorpusculum, M59147

bavaricum Methanocorpusculum, Sinense AF042197

48
Methanocorpusculum, AF095268

58 27 24 Methanocorpusclum parvum, AY260435

Methanocorpusculum labreanum, AF095267

Methanomicrobiales
A3 GU946457 (2 5%)

gen archaeon Uncultured para 16S rRNA, AB355102 clon

archaeon Uncultured LTR-A3, FJ347529

A1 GU322876 (73%)
79 58 clon de archaea inculto LTR-A4, FJ347530

Methanoculleus
99

Methanosaeta Methanosarcinales
57
59 Inculto clon archaea OK3, GQ406364
68 80 A5 GU322880 (2 5%)

Archaea enriquecimiento C1-52C clon de la cultura, GU470575 F3

Methanobacteriales
Uncultured clon euryarchaeote, EU910627
89
clon archaeon Uncultured R2 ARC5, FJ005036

37 A6 GU322881 (9%)

Pyrococcus

Thermococcus
Euryarchaeota
62
Ferroglobus

13
Methanococcus

tengchongensis Sulfolobus, shibatae AY135637

56
Sulfolobus, M32504

yangmingensis Sulfolobus, AB010957

Uncultured Sulfolobus MS1, AF1690111
55
Metallosphaera hakonensis, D86414

Metallosphaera prunae, X90482

47 90 Sulfolobus sp H, D14052 Sulfolobus metallicus, pendens crenarchaeota

99 D85519 Thermofilum, X14835 thermofilaceae archaeon

SRI-370, AF255605

55
95 Inculto archaeonP15, EU662668

A2 GU946456 (2 5%)

Inculto archaea metanognicas, SMPFLSS56m_9, FJ982763

Inculto D39 crenarchaeote, EU910615
thermodesulfobacteria
thermodesulfobacteria

0 10

Figura 2 Filogenia de secuencias archaeal obtenidos a partir de baja temperatura de biomasa anaerbica granular (en negrita) junto con los parientes ms cercanos de acuerdo con el NCBI y ARB
(rbol calculado con ARB, mtodo de unin de vecinos). Repeticiones de arranque (de un total de 1000 muestras replicadas) que apoyaron la orden de ramificacin se muestran en los nodos
relevantes en porcentaje. nmeros de acceso de GenBank se proporcionan para secuencias clonales y de referencia, y tambin se indica porcentaje abundancia de bibliotecas de clones relevantes
(entre parntesis). La barra de escala representa 10% de divergencia de secuencia.

para esos puntos, se obtuvieron pptido partidos inferior de puntuacin para los
homlogos de protenas. En tercer lugar, para los puntos 5,
6, 8, 26, 27 y 30, un solo punto del LED para la identificacin de una protena
que podra ser asignado a una de las especies microbianas (Tabla 1). En
cuarto lugar, en los casos de manchas 13-17, 18-22, 28 y 29, una protena
asignado a una de las especies microbianas migrado como mltiples puntos
(Tabla 1). En quinto lugar, para los puntos 9-12, un conjunto diferente de
pptidos coincide protenas de la misma funcin de diversos gneros y se
encontr que migrar como diferentes puntos (Tabla 1). Por ltimo, se observ
la ltima situacin para los puntos 23-25, 31 y 32, donde el mismo conjunto de
pptidos emparejados protenas de la misma funcin de varias especies o
gneros, y migr como mltiples puntos (Tabla 1). La asignacin de mltiples
especies a una protena migra como uno o varios puntos
podra ser el resultado de dos situaciones: o bien una mezcla de protenas
de funciones similares de diferentes microorganismos migrado a un punto o
el punto contena una protena que tiene homologa con las protenas de
todas las diferentes especies microbianas y cuya secuencia real puede no
ser disponible en las bases de datos utilizadas aqu (NCBInr y TrEMBL).
Los datos presentados aqu no nos permiten distinguir entre esas dos
proposiciones.
Discusin
En este estudio, hemos aplicado metaproteomics y anlisis filogentico para
caracterizar las comunidades microbianas de un biorreactor anaerobio EGSB
que tratan a una sinttico, las aguas residuales a base de glucosa a 15 C. En
general, 33 protenas

2011 Los Autores

1554 Journal of Applied Microbiology 110, 1550-1560 2011 La Sociedad para la Microbiologa Aplicada
F. Abram et al. Metaproteomics de lodo anaerbico

225 manera. En tercer lugar, la ARN polimerasa un- subunidad, que muestra una
150

24
supuesta funcin crucial para la activacin de la transcripcin (Ishihama
100
1992), se identific. El conjunto de pptidos identi fi ed para esta protena
9 25
4
5 7
6
10 11 emparejado ARN polimerasa un- subunidad de diversas cepas que pertenecen
75
30
23 1
a ambos
12 26
35 8 Streptomyces y Mycobacterium gneros (Tabla 1). En cuarto lugar, un proteasoma un- subunidad,
13 28 29 27 responsable de la escisin de una amplia gama de protenas, se detect. Se encontr
15 22 21
14 que los pptidos de la subunidad del proteasoma para que coincida con la
16
31 32 33
17
19 correspondiente
18 20

M. thermophila protenas, as como protenas de la misma funcin de

23 diversos Methanosarcina especies (Tabla 1).
Entre las 14 protenas clasificadas como metabolismassociated, se
15 detectaron dos enzimas principales de la va de la gliclisis en nuestras
muestras de protenas, a saber, la gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa
10 (maestro) 25 50 de Sanguibacter

4 5 6 7
keddieii, y enolasa a juego para diversas especies bacterianas (Tabla 1).
La presencia de esas enzimas glucolticas coincide con el hecho de que el
figura 3 Maestro gel 2-D (generada por PDQuest-Advanced 8.0.1) de protenas extradas de baja biorreactor estaba tratando aguas residuales que contienen glucosa, que
temperatura de biomasa anaerbica granular. Las protenas extirpados y fi identificado por anlisis
puede ser utilizado a travs de la gliclisis o la va de las pentosas fosfato.
de espectrometra de masas estn resaltados. numeracin del punto corresponde a la numeracin
La ltima va apareci activo en el biorreactor, como se indica por la
utilizada en la Tabla 1. Los valores de marcador de peso molecular se indican a la izquierda de la
presencia de transcetolasa de P. propionicus ( Tabla 1; Higo. 4), que es una
imagen de gel estn en kilodalton, y la tira de IPG 7-cm utilizado visualiza un gradiente de pH

vari entre 4 y 7 (indicado debajo de la imagen de gel ).

manchas extirpados de geles 2-D fueron exitosamente identi fi correspondiente
a 18 protenas distintas excluyendo redundante identificacin. Catorce de los 18
protenas identi fi ed podran clasificarse en la amplia categora funcional del
metabolismo, con protenas implicadas principalmente en la gluclisis y la
metanognesis (Tabla 1; Fig. 4). Se encontr que las cuatro enzimas restantes
a caer, respectivamente, en la categora de protena de membrana, la oxidacin /
reduccin, la transcripcin, y fi nalmente, la degradacin de protenas (Tabla 1).
En primer lugar, la protena de la familia LamB porina (Tabla 1), lo que facilita la
difusin de maltodextrinas travs de la membrana externa de las bacterias gram
negativas (Schirmer et al. 1995), fue identi fi ed como una protena de membrana
a partir de propionicus Pelobacter. La maltodextrina es un polmero de glucosa
que puede ser fcilmente convertida en glucosa, que se puede utilizar
posteriormente en la gluclisis o en la va de las pentosas fosfato (Fig. 4).
Segundo,
el que contiene hierro-alcohol deshidrogenasa sensible al
oxgeno (Tabla 1) a partir de P. propionicus tambin se detect. Esta
protena puede catalizar la interconversin de alcohol a acetaldehdo. En
muchas bacterias, piruvato producido a travs de la gluclisis se puede
convertir en dixido de carbono y acetaldehdo, que a su vez se puede
reducir a etanol por la alcohol deshidrogenasa (Fig. 4). Este ltimo paso se
acompaa de la oxidacin de NADH que conduce a la regeneracin
necesaria de NAD +. NAD + entonces puede actuar como un aceptor de
electrones para la continua oxidacin del gliceraldehdo-3-fosfato, un
intermedio glucoltica, y por lo tanto permitir la gluclisis a tener lugar en un
continuo
enzima clave que constituye un enlace reversible entre la gluclisis y de la
va de las pentosas fosfato. La va del fosfato de pentosa comienza con un
intermedio de la gluclisis, la glucosa, y termina con la formacin de otros
dos, la fructosa-6-fosfato y D-gliceraldehdo-3-fosfato (Fig. 4). Al final de la
va glicoltica, el piruvato puede ser fermentada para producir CO 2 y
acetaldehdo, o formiato y acetato. El acetaldehdo se puede convertir
adicionalmente a etanol a travs de la actividad de una alcohol
deshidrogenasa (Tabla 1; Fig. 4), y CO 2 puede ser utilizado por los
metangenos para producir metano. Los datos indican que la
metanognesis a partir de CO 2 est teniendo lugar en el biorreactor de
baja temperatura con la identificacin de una enzima clave de esta va, el
F 420- N dependiente 5, norte 10-
reductasa methylenetetrahydromethanopterin de Yo. thermautotrophicus. Nuestros
resultados tambin sugieren que la metanognesis a partir de acetato es otra
va de activo basado en la deteccin de la segundo- subunidad de la acetil-CoA
decarbonylase protena a partir de M. thermophila y Methanosarcina barkeri ( Tabla
1; Higo. 4). La produccin de metano a partir de ambos CO 2 y acetato
correlaciona con la observacin de una relacin temporal en aumento (2 1-3 3
veces) de hidrogenotrfica a acetoclstica valores de actividad metanognicas
durante el ensayo en el biorreactor de glucosa alimentado (O'Reilly et al.
2009). otras dos enzimas de la metanognesis Se identificaron, a saber,
tetrahidrometanopterina S-metiltransferasa a partir de M. thermophila conduce
a la produccin de methylCoM y subunidades de metil-coenzima M
reductasa de
M. thermophila, Yo. thermautotrophicus y marburgensis
Methanothermobacter catalizar la reduccin de methylcoenzyme M a
metano (Tabla 1; Fig. 4).

2011 Los Autores

Journal of Applied Microbiology 110, 1550-1560 2011 La Sociedad para la Microbiologa Aplicada 1555
1556
tabla 1 Identi fi cacin y la funcin putativa de protenas extirpados de geles 2-D a partir de lodos de baja temperatura de biomasa anaerbica granular *

Lugar Mascota pptidos No. secuencia%

etiqueta No la adhesin. nombre de la protena asignacin de las especies puntuacin coincidentes (nica) cubierto fuente de base de datos funcin sugerido

1 gi | 269795306 gliceraldehdo-3-fosfato Sanguibacter keddieii 304 1> Ident 2 <Ident> 20 NCBInr / Trembl gluclisis
deshidrogenasa Homol 6 <Homol
Metaproteomics de lodo anaerbico

2 gi | 229819515 enolasa mltiples especies 306 2> Ident 1 <Ident> 13 NCBInr / Trembl gluclisis
bacterianas Homol 1 <Homol

3 gi | 119715173 enolasa Nocardioides sp. 232 3> Ident 9 NCBInr / Trembl gluclisis
4 gi | 29830076 enolasa Streptomyces avermitilis 247 2> Ident 1 <Ident> 10 NCBInr / Trembl gluclisis
Homol
5 Q3LFH7 enolasa Propionibacterium 385 3> Ident 2 <Ident> 14 NCBInr / Trembl gluclisis
freudenreichii Homol 1 <Homol

6 D5UK74 enolasa Cellulomonas fl avigena 238 2> Ident 3 12 NCBInr / Trembl gluclisis
<Homol
7 A8U6I2 enolasa Carnobacterium sp. A LAS 7 293 2> Ident 1 <Ident> 15 NCBInr / Trembl gluclisis
Homol 3 <Homol

8 gi | 118579459 regin central transcetolasa propionicus Pelobacter 132 1> Ident 1 <Ident> 13 NCBInr / Trembl Va pentosa fosfato
Homol 1 <Homol

9, 10, gi | 116753609 acetil-CoA Methanosaeta thermophila 175 1> Ident 2 <Ident> 7 NCBInr / Trembl La metanognesis a partir

11, 12 decarbonylase / sintasa Methanosarcina barkeri Homol 4 <Homol de acetato

segundo subunidad

13, 14, 15, gi | 1002717 La coenzima F420 dependiente N5, thermautotrophicus 515 5> Ident 1 <Ident> 36 NCBInr / Trembl La metanognesis a partir

16, 17 N10- Methanothermobacter Homol 4 <Homol de CO 2

reductasa methylenetetrahydromethanopterin

18, 19, 20, gi | 116753883 Metil-coenzima M reductasa, M. thermophila 181 6 <Homol diecisis NCBInr / Trembl metanognesis
21, 22 do subunidad

23, 24, 25 gi | 304315293 Metil-coenzima M reductasa, marburgensis 217 2> Ident 1 <Ident> 9 NCBInr / Trembl metanognesis
un subunidad Methanothermobacter / Homol 2 <Homol
thermautotrophicus
26 gi | 517427 Metil-coenzima M reductasa, Yo. thermautotrophicus 406 4> Ident 11 NCBInr / Trembl metanognesis
segundo subunidad

Journal of Applied Microbiology 110, 1550-1560 2011 La Sociedad para la Microbiologa Aplicada
27 gi | 116754675 Tetrahidrometanopterina S- M. thermophila 129 1> Ident 1 <Ident> 2 NCBInr / Trembl metanognesis
metiltransferasa H subunidad Homol
28, 29 gi | 118579324 Hierro que contiene alcohol P. propionicus 269 1> Ident 3 <Ident> 21 NCBInr / Trembl Oxidacin / reduccin

deshidrogenasa Homol 3 <Homol

2011 Los Autores

F. Abram et al.
F. Abram et al. Metaproteomics de lodo anaerbico

No protena de funcin desconocida se identific durante este estudio. Un

La degradacin de protenas
enfoque metaproteomic similar basada en 2-DGE aplica a lodo activado (aerbica)

protena de membrana

Indica que tambin otros pptidos con puntuaciones menores corresponden con protenas homlogos de otras especies. Ident se refiere al umbral de la mascota de identidad de 95% confianza para el partido homologa idnticos o extensa y Homol representa
partidos que son valores atpicos de la distribucin de los partidos al azar, pero no alcanzan el nivel de confianza con fi 95%. NCBInr y Trembl se citan juntos cuando la misma protena apareci en ambas bsquedas; En estas instancias, se informa de la mejor
funcin sugerido
a partir de una planta de tratamiento de aguas residuales municipales dio como

Transcripcin
resultado la deteccin de cuatro protenas de funcin desconocida a partir de los
46 protenas identi fi ed (Wilmes et al. 2008). Uso de 2-DGE como un mtodo de
separacin de protenas es probable que resulte en anlisis sesgado hacia las
protenas ms abundantes, tales como protenas metablicas o de limpieza. En el
estudio de Wilmes et al.
fuente de base de datos

NCBInr / Trembl

NCBInr / Trembl

NCBInr / Trembl
(2008), el trabajo metaproteomic fue apoyada por los datos de
metagenmica, mientras que en el caso de nuestro estudio estaban disponibles
en el biorreactor no hay datos de metagenmica. Adems, la mayora de los
microorganismos que componen las comunidades mixtas que prevalecen en
nuestro biorreactor LTAD es poco probable que se han secuenciado
previamente. Por lo tanto, identificacin de protenas desconocidas a partir de
secuencia%

especies microbianas, cuyos genomas no se han secuenciado y son, por tanto,

cubierto

diecisis

no en las bases de datos NCBInr y TrEMBL, no era posible sin empresa de

15

13

novo anlisis de MS individuo / MS espectros.

* nmero en el espacio se refieren a los de la Figura 3. Los nmeros de acceso a partir de gi | pertenecer a la base de datos NCBInr mientras que otros pertenecen a la base de datos Trembl.
coincidentes (nica)

2 <Ident> Homol 2
2> Ident 1 <Ident>
Homol 3 <Homol

Este estudio es, a nuestro entender, el anlisis metaproteomic primera llev a

pptidos No.

cabo a partir de biomasa granular desde un biorreactor tratamiento anaerbico

2> Ident 2
<Homol

<Homol

de aguas residuales. A pesar de la falta de datos correspondientes

metagenomic, podramos identificar protenas de funciones pertinentes y
resumen de las actividades microbianas que tienen lugar en el fro, anaerbica,
biorreactor el tratamiento de alimentos de procesamiento similares a las aguas
puntuacin
Mascota

residuales, con la degradacin de la glucosa a travs de la gluclisis y de la va

237

183

135

de las pentosas fosfato, y el produccin de metano a travs de la metanognesis

a partir de ambos CO 2 y acetato. El enfoque metaproteomic indic tambin, por
la asignacin de protenas, la presencia de fi c microorganismos especficos. El
33 manchas de protenas con xito identi fi ed correspondi a 18 protenas
Mycobacterium sp.
asignacin de las especies

Methanosarcina sp. /

distintas, de las que seis fueron asignados a la

M. thermophila
Streptomyces y
P. propionicus

Actinobacteria (Sanguibacter keddieii, Nocardioides sp.,

Cellulomonas fl avigena, Streptomyces sp., Mycobacterium
sp. y Propionobacterium freudenreichii), una a la
LA FAMILIA DEL CORDERO protena porina

Firmicutes (Carnobacterium sp.), tres para la proteobacterias

( P. propionicus) y siete a la Arqueas. Dentro de
ARN polimerasa un subunidad

arqueas, cuatro protenas fueron asignados a la Methanosarcinales (M.

proteasoma un subunidad
nombre de la protena

thermophila y Methanosarcina sp.) y tres a la Methanobacteriales

(Methanothermobacter sp.). La protena restante (enolasa) fue asignado a
una amplia gama de bacterias (spot 2). Los anlisis de filogentico indic
que 11% de los clones bacterianos perteneca a la Firmicutes y 2% a la proteobacterias,
y las protenas podran ser asignados a los microorganismos de ambos
filos. Mientras que seis protenas fueron asignados a la actinobacteria, no se
encontr clon bacteriano que pertenecen a este filo. El otro filos de
gi | 302524022
No la adhesin.

bacterias identi fi cado por los anlisis filogenticos no estuvieron

A0B8W6
A1ALD2

puntuacin de la mascota.

representados en las investigaciones metaproteomic, a pesar de la

Tabla 1 ( continuado)

disponibilidad de la secuencia del genoma completo para todos ellos,

aparte de la divisin OP11 candidato.
31, 32
etiqueta
Lugar

30

33

2011 Los Autores

Journal of Applied Microbiology 110, 1550-1560 2011 La Sociedad para la Microbiologa Aplicada 1557
Metaproteomics de lodo anaerbico F. Abram et al.

porina LamB
Pel maltodextrina
Glucosa maltodextrina
reaccin oxidativa intracelular extracelular
Xilulosa-5-P
de la va de las
pentosas fosfato

Ribulosa-5-P La glucosa-6-P

La ribosa-5-P

transcetolasa La fructosa-6-P
Pel

Gliceraldehdo-3- sedoheptulosa-7-P Gliceraldehdo-3-P (2)

Gliceraldehdo-3-P-
deshidrogenasa
San

Eritrosa-4-P fructosa-6-P 1,3-Biphosphoglycerate (2)

xilulosa-5-P

transcetolasa
Pel La fructosa-6-P 2-fosfoglicerato (2)

enolasa
Gliceraldehdo-3-P Noc / Str / Pro / Cel / Car

Phosphoenopyruvate (2)

Piruvato (2)

metanofurano CO 2 + acetaldehdo Formiato + Acetato

alcohol
deshidrogenasa
Pel
Etanol
Acetil-CoA
Acetil CoA
CO 2
decarbonylase
MSA / Msr
5-methyltetrahydrosarcinapterin
5,10-metilen-
tetrahidrometanopterina

dependiente 5, norte 10 - La coenzima M

methylenetetrahydro-
methanopterin reductasa
MTT
tetrahidrometanopterina
S-metiltransferasa
MSA
5-metil-tetrahidrometanopterina F 420- N Metil-com
metil coenzima
La coenzima M
M reductasa
MTT / Msa

COB-com heterodisulfide Metano

La coenzima B

Figura 4 modelo metablico propuesto para la digestin anaerobia de aguas residuales basado en glucosa sinttico deducido de los datos metaproteomic. Las enzimas identi fi cado en este estudio
estn en negrita. No se muestran todos los metabolitos intermedios. P significa fosfato; Pel para Pelobacter; San para
Sanguibacter; Noc para Nocardioides; str para Streptomyces; Pro para Propionibacterium; Cel para Cellulomonas; Coche para Carnobacterium; MSA para

Methanosaeta; msr para Methanosarcina; MTT para Methanothermobacter.

2011 Los Autores

1558 Journal of Applied Microbiology 110, 1550-1560 2011 La Sociedad para la Microbiologa Aplicada
F. Abram et al.
Especficamente, los clones bacterianos se agruparon en las Planctomycetes,
un filo de la que cinco genomas completos se secuencian,
el Verrucomicrobia, que hasta la fecha
abarca 28 genomas completos, las proteobacterias con 657 genomas
completos, la Bacteroidetes con 59 genomas secuenciados, la Firmicutes con
337 genomas completos disponibles y finalmente la thermotogae, con 11
genomas. Cabe sealar sin embargo, que los clones identi fi ed en este estudio
slo estaban relacionadas con micro-organismos con genomas secuenciados
completamente. Para los clones de arqueas, 11 5% perteneca a la Methanobacteriales cin de la extraccin de protenas y 2-DE para metaproteomics de las
y protenas asignados a los microorganismos de esta orden se identificaron fi.
No se encontraron setenta y seis por ciento de los clones de arqueas pertenecer
a la Methanomicrobiales con exclusiva Methanocorpusculum- como organismos,
mientras que ninguna protena identificados en este estudio fue asignado a los
miembros de este orden, a pesar de la disponibilidad de la secuencia del
genoma completo de labraneum Methanocorpusculum. Se encontraron dos por
ciento de los clones de arqueas pertenecer a la crenarchaeota, mientras que
ninguna protena podra ser asignado a los microorganismos de este orden
pesar de la disponibilidad de 34 genomas completos entre las cuales la de Thermo
pendens fi lum ( Higo. 2). Mientras que cinco protenas fueron asignados a la Methanosarcinales,
no se encontr clon bacteriano que pertenecen a este filo. En general, slo un
solapamiento limitado de alguna manera exista entre la filogentica y el anlisis
metaproteomic; las razones de esta observacin an no estn claros.
Esperamos, sin embargo,
que un enfoque filogentico basado en ARN sera mejor
volver a reflejar el componente activo del consorcio y podra permitir una
correlacin ms fuerte con metaproteomics.
En conclusin, metaproteomics se demuestra como una poderosa
herramienta con la capacidad para descubrir las rutas metablicas clave
bioqumicos que se producen en los procesos de biorreactor fi cas.
Metaproteomics se pueden aplicar para caracterizar las comunidades que
sustentan LTAD, que ser un paso necesario para optimizar la aplicacin de
esta tecnologa emergente. El trabajo futuro podra centrarse en la adquisicin
de datos de metagenmica de los sistemas de AD, que aumentaran
considerablemente la utilidad de los datos metaproteomic. El seguimiento de
los patrones de rendimiento y protenas temporal de las comunidades AD
biorreactor en respuesta a parmetros ambientales y operacionales evaluar
an ms el potencial del enfoque de prueba en este estudio. Tambin podra
ser posible identificar marcadores enzimticos, o cambios temporales en los
patrones de expresin de protenas de las comunidades microbianas, que
podran ser utilizados como indicadores predictivos de insuficiencia proceso.
Expresiones de gratitud
Esta publicacin ha emanado de la investigacin llevada a cabo con el apoyo
financiero de la Fundacin Cientfica de Irlanda
2011 Los Autores
Journal of Applied Microbiology 110, 1550-1560 2011 La Sociedad para la Microbiologa Aplicada
Metaproteomics de lodo anaerbico
(Premio al Investigador Principal). Tambin reconocemos el apoyo de la
Wellcome Trust en la financiacin de la compra del espectrmetro de masas
en el Centro de Ciencias biomoleculares, Universidad de St. Andrews.
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