Sunteți pe pagina 1din 41

BIOTEHNOLOGII DE OBINERE

A SUBSTANELOR BIOLOGIC
ACTIVE
METABOLII SECUNDARI

BIOTEHNOLOGII DE OBINERE
A ANTIBIOTICELOR
Metabolii secundari microbieni:

Antibiotice
Alcaloizi
Hormoni de cretere (giberiline)
Toxine

Microorganismele produc metaboliii secundari pe


parcursul unei faze de sintez (idiofaza) cnd
creterea este ncetinit, procesele celulare
limitndu-se la sinteza idiolitului.
BIOTEHNOLOGII DE OBINERE
A ANTIBIOTICELOR

Termenul a fost introdus de


Waksman n 1942 pentru a
defini substane chimice
produse de microorganisme
care au proprietatea de a inhiba
dezvoltarea sau distrugerea
bacteriilor sau a altor
microorganisme, n soluii
diluate in vitro sau in vivo.

Reprezint probabil cele mai importante


produse comerciale obinute prin biosintez.
Importana antibioticelor a
crescut dup producerea
pe scar industrial a
penicilinei n 1943, motivul
fiind iniial dictat de motive
militare.

n 1946 se
produce la
scar
industrial
streptomicina.
Antibiotice produse
Antibioticele industrial
folosite ca ageni Antibioticul Microorganismul productor Tipul de
n combaterea microorganism
Bacitracin Bacterii sporulate
maladiilor Cefalosporin
Bacillus licheniformis
Cephalosporium sp. Fungi
infecioase au Cloramfenicol Sintez chimic (obinut la Actinomicete
nceput cu Streptomyces
produs un impact venezuelae)
deosebit asupra Cicloheximid Streptomyces griseus Actinomicete
Cicloserin Actinomicete
practicii Eritromicin
S.orchidaceus
S.erythreus Actinomicete
medicale, Griseofulvin Penicillium griseofulvina Fungi

neputnd fi Kanamicin S. kanamyceticus O


Actinomicete
comparate cu nici Lincomicin S. lincolnensis Actinomicete

un alt produs Neomicin S.fradiae Actinomicete


Nistatin Actinomicete
terapeutic
S. noursei
Penicilin Penicillium chrysogenwn Fungi
existent pn n Polimixin B Bacillus polymyxa Bacterii sporulate

prezent. Streptomicin S. griseus Actinomicete


Tetraciclin S. rimosus Actinomicete
Calitile unui antibiotic

Aciune asupra unui numr ct mai mare de


microorganisme
Absena toxicitii
Solubilitate n ap la un pH convenabil
Stabilitate
Bun toleran
Absena compuilor histaminei
Absena efectelor secundare asupra esuturilor,
serului, hematiilor i leucocitelor
Din numrul total de antibiotice naturale i substane
asemntoare 98% sunt produse de microorganisme
i numai 2% sunt produse de animale: protozoare,
molute, insecte sau forme superioare ale
organismelor animale.

Dintre microorganisme, cei mai activi productori sunt


bacteriile actinomicetele (Streptomyces sp.) i
micromicetele (Penicillium sp.).
Antibioticele pot fi clasificate dup structura
lor chimic i proprietile antibacteriene n
familii.

Antibiotice ce conin glucide

Aminoglicozide: Streptomicina
N-Glicozide: Streptotricina

C-Glicozide: Vancomicina

Glicolipide: Moenomicina
Lactone macrociclice

Macrolide: Eritromicina
Poliene: Candicidina

Quinone
Tetracicline: Tetraciclin

Antracicline: Adriamicin

Naftochinone: Actinorhodin
Benzochinone: Mitomicin
Aminoacizi i peptide
Derivai de aminoacizi: Cicloserine

Antibiotice -lactam: Penicilinele


Peptide: Bacitracina
Cromopeptide: Actinomicina
Peptide chelatate: Bleomicina

Antibiotice heterociclice coninnd azot


Antibiotice nucleosidice: Polyoxine
Antibiotice care conin oxigen
Antibiotice polieter: Monensin

Derivai alifatici

Derivai cicloalcanici: Cicloheximida


Antibiotice steroidice: Cicloheximida
Antibiotice aromatice
Derivai benzenici:
Cloramfenicolul
Derivai cu nucleu aromatic
condensat: Griseofulvina
Eteri aromatici: Novobiocina

Quinolone
4-Quinolona: Acid nalidixic
Fluoro 4-quinolona: Norfloxacina
Clasificarea dup biogenez permite explicarea
mai uoar a mecanismului biochimic de formare
a antibioticelor:

antibiotice derivate din aminoacizi:


cloramfenicol, penicilin, bacitracine,
actinomicine;

antibiotice derivate total sau parial din glucide


simple: streptomicin, kanamicin, neomicin;

antibiotice diverse: novobiocin, vancomicin.


Antibiotice cu nucleu - lactam

Cele mai importante antibiotice din punct de


vedere istoric i medical sunt antibioticele cu
nucleu -lactam: penicilinele, cefalosporinele
i cefamicinele.

Se numesc antibiotice -lactam deoarece


conin n structura lor un nucleu -lactam.
Tipuri de peniciline

Primul antibiotic descoperit a fost penicilina G


activ fa de bacteriile Gram +, nu i fa de cele
Gram -.

n structura de baz a penicilinelor intr acidul 6 -


aminopenicilanic (A-6-AP) care este format dintr-
un inel tiazolidinic, condensat cu un inel - lactam.
La acidul 6 - aminopenicilanic se ataeaz diferite
catene laterale n poziia 6.

Penicilinele naturale se formeaz n fermentaii fr


adaos de precursor.

Fermentaiile pot fi controlate riguros numai prin


adugarea n mediu a catenei laterale ca precursor,
pentru a produce penicilina dorit.

Pe aceast cale au fost obinute peste 100 de


peniciline de biosintez din care numai penicilinele G
i V sunt obinute n scopuri comerciale.
Pentru producerea industrial a unor peniciline active
fa de bacteriile Gram - s-a folosit o combinaie dintre
procesul fermentativ i chimic care a condus la
obinerea de peniciline de semisintez.

Materialul de pornire este penicilina G, care servete


ca surs de A6AP.

Penicilina G este scindat chimic sau enzimatic


(folosind penicilinacilaza), iar A6AP obinut este
condensat chimic la o alt caten lateral.

Penicilinele de semisintez au mbuntit semnificativ


proprietile terapeutice ale acestora.
Producia antibioticelor cu structur
lactam

Producerea penicilinei este un proces puternic


aerob, fiind necesar o aeraie eficient.

Penicilina este un metabolit secundar tipic, n


timpul fazei de cretere producndu-se
cantiti foarte mici de penicilin.
Odat cu epuizarea sursei de carbon ncepe faza
de producere a penicilinei, care poate fi extins
pn la cteva zile, prin adaos de diferite
componente din mediul de cultur.

Sursa de carbon este lactoza - vitez de consum


mai mic n comparaie cu cea a glucozei i nu
induce represie catabolic.

Surs de azot i factori de cretere - extractul de


porumb care permite randamente ridicate de
obinere pentru majoritatea penicilinelor.
Se poate folosi i glucoza ca surs de carbon,
dar n acest caz fermentaia va fi alimentat cu
glucoz treptat, pentru a evita represia
catabolic.

Catena lateral a penicilinei G este radicalul


fenil se adaug n mediu n mod continuu
acid fenoxiacetic ca precursor.

Dac se urmrete obinerea altor peniciline n


mediu, se va aduga ca precursor un alt tip de
caten lateral acilat.
Penicilina va fi excretat n mediu, 1% din
aceasta rmnnd ataat de filamentele
fungice.

Dup nlturarea miceliului prin filtrare, filtratul


va fi acidulat, iar antibioticul va fi extras cu
acetat de amil sau acetat de butil.

n primii ani de producie preul penicilinei era


foarte crescut, dar n prezent se spune c
preul penicilinei este dat de ambalaj i nu de
coninutul flaconului.
Tehnologia obinerii penicilinelor
presupune:

pregtirea mediilor i sterilizarea lor;

fermentaia propriu-zis;

filtrarea soluiilor native;

separarea i purificarea penicilinelor.


Pregtirea mediilor i sterilizarea

Const n dizolvarea n ap a componentelor


mediilor conform reetei pentru fiecare faz a
procesului de fermentaie.

Pregtirea mediilor i sterilizarea lor pentru


inocul (i) i intermediar (I) se poate realiza
direct n fermentatoarele respective.
Compoziia Inoculator (i) Intermediar (I) Regim (R)

Extract de porumb 2 2-3 2,5 - 2,8


Lactoz 0,5 - 0,6 3 - 3,5 6-7
Glucoz 2-3
3 - 3 ,5 1,2
Fin de soia 0,3

CaCO3 0,7 - 0,8 0,7 1,2 - 1,3


KH2PO4 0,7 0,2 - 0,3 0,5 - 0,6
NH4NO3 0,12 0,3
Na2SO4
0,06 0,06
ZnSO4 0,002

MnSO4
0,002
Fenilacetat amid 0,7
0,2

Tiosulfat de Na
0,016 0,8
Ap Adaos pn la 100 ml
Pregtirea mediilor pentru bioreactorul de regim
are loc ntr-un aparat prevzut cu un agitator,
conduct pentru abur viu necesar nclzirii i
serpentin de rcire.

n aparat se introduce apa conform reetei, se


nclzete la 60 - 70C, se adaug extractul de
porumb i se fierbe timp de 0,5 - 1 ore.

Soluia se rcete la 60 - 70C, iar restul


componentelor se adaug n urmtoarea ordine:
carbonat de calciu, azotat de amoniu, sulfai,
fosfat, lactoz, glucoz.
Sterilizarea mediului se realizeaz pe coloan
i n menintor, prin nclzire cu abur direct la
124 - 126C i meninere la aceast
temperatur 10 - 20 min, dup care urmeaz
rcirea la 60 - 65C i trimiterea acestuia n
bioreactorul de regim, unde se continu rcirea
pn la temperatura de 27C - temperatur
optim pentru biosintez.
Fermentaia

Se realizeaz n 3 trepte:

1. inoculator - se produce aclimatizarea


microorganismelor la noile condiii de dezvoltare.

2. intermediar - ncepe creterea exponenial

3. regim - se continu creterea


microorganismelor i se elaboreaz penicilina
Eficiena procesului de biosintez este determinat
de caracteristicile microorganismului productor.

Tulpina utilizat Penicillium chrysogenum, a crui


capacitate productiv a fost ridicat foarte mult prin
procese de mutaie, se caracterizeaz prin:

rat mare de multiplicare;


utilizarea rapid a azotului i a precursorului;
lipsa pigmenilor n biomas;
miceliu fibros.
Procesul de fermentaie cuprinde 3 faze
metabolice distincte:

1. faza de cretere a microorganismului;

2. faza de producere a antibioticului;

3. faza autolitic a microorganismului.


1. Faza de cretere a microorganismului

Se caracterizeaz prin acumulare de biomas


micelian i utilizarea intensiv a componentelor
mediilor de cultur.

Glucoza este asimilat rapid pentru formarea


materialului celular i pentru furnizarea energiei
necesare bioprocesului.

Necesarul de oxigen este maxim, iar activitatea


respiratorie, caracterizat prin degajarea de
dioxid de carbon este ridicat.
2. Faza de producere a penicilinelor

Se caracterizeaz prin ncetinirea creterii


miceliului, scderea consumului de oxigen,
meninerea pH-ului la valoarea de 6,8 - 7,5 i
acumularea penicilinei.

n aceast faz lactoza este folosit lent de


ctre miceliu i furnizeaz energia necesar
proceselor de biosintez sau pentru formarea
constituenilor celulari.
3. Faza autolitic

Microorganismul se epuizeaz datorit activitii


metabolice prelungite, iar sursele de carbon sunt
consumate.

Scade coninutul n N al mediului, ncepe procesul de


autoliz cu eliberare de amoniac i crete pH-ul (>8).

nceteaz producerea de peniciline i apare procesul


de hidroliz alcalin a penicilinelor formate.

Aceast faz nu este permis la nivel industrial.


Cantitatea de peniciline formate este rezultatul
mbinrii urmtorilor factori:

potenialul productiv al tulpinii;

folosirea unor constitueni adecvai n mediu i


un echilibru corect n proporiile acestora;

meninerea pH-ului optim;

un raport corect ntre diferitele surse de carbon;


adugarea de precursori care vor decide natura
catenei laterale i tipul de penicilin produs;

asigurarea necesitilor n substane minerale;

meninerea temperaturii optime.


Pentru faza de cretere a biomasei, pH-ul optim
este de 4,5 - 5,0, iar pentru biosintez este de
7,0 - 7,5.

Peste pH - 7,5 ncepe procesul de autoliz


nsoit de degradarea penicilinei.

Temperatura optim este de 25C.

Aerul necesar este de 1-1,5 1 mediu /min.


Biosinteza unei molecule att de complexe ca
penicilina necesit un flux de energie exterior,
biosinteza se poate realiza numai dac se
desfoar simultan i procese de oxidare ale
glucidelor, care constituie sursa principal de
energie.

glucoza acid lactic lactoz

n faza de cretere a microorganismelor se


consum glucoza, iar n faza de producere a
penicilinei se consum lactoza.
Sursele de azot sunt necesare pentru formarea
gruprilor aminice i pentru obinerea
aminoacizilor.

Se utilizeaz azot mineral din sruri de amoniu i


azot organic furnizat de aminoacizi i peptide din
extractul de porumb.

Substanele minerale sunt vitale afectnd


permeabilitatea membranei celulare, echilibrul
ionic i activeaz sistemele enzimatice sau intr
n structura sistemelor enzimatice.
Controlul fermentaiei se realizeaz prin
determinarea:

sterilitii mediului;

gradului de dezvoltare morfologic a productorului;

pH-ului mediului;

concentraiei de penicilin din mediul de cultur;

consumului de glucide.
Obinerea de substane
antifungice
Substane antibiotice, cu aciune asupra fungilor.

Dei numrul de fungi patogeni este n continu


cretere, substanele antifungice sunt relativ
limitate.

Caracteristic pentru molecula lor este prezena


unui anumit numr de duble legturi.
Microorganisme productoare de
substane antifungice

Actinomicete:

- Streptomyces noursei - nistatina

- Streptomyces griseus -
ciclohexamidele

Micromicete:
- Penicillium griseofulvum griseofulvina