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Arch Med Vet 41, 185-195 (2009)

REVISIN BIBLIOGRFICA

Biologa de las clulas madre embrionarias (ES cells) en distintas especies:


potenciales aplicaciones en biomedicina#

Biology of embryonic stem cells (ES cells) in different species:


potential applications in biomedicine

ME Arias, R Felmer*
Laboratorio de Biotecnologa Animal, Instituto de Investigaciones Agropecuarias, INIA-Carillanca, Temuco, Chile.

Summary

Embryonic stem cells (ES cells) are undifferentiated cells that derive from the inner cellular mass (ICM) of blastocyst-stage embryos. These cells can
grow indefinitely in vitro preserving the ability to differentiate into all cell types of an individual. ES cells have become a powerful tool to study the early
embryonic development, in functional genomic, to generate gene targeted transgenic animals and recently in animal cloning and medicine. Furthermore,
current research developed on their biological properties and possible applications in regenerative medicine, due to their enormous potential of repair,
are opening great possibilities that will allow to design, in the near future, revolutionary therapies to diverse human diseases nowadays incurables. In this
review the general aspects of the isolation, derivation, culture, differentiation and transformation of these cells in different animal species are described
as well as their promising applications in biomedicine.

Palabras clave: clulas madre embrionarias, clonacin, terapia de reemplazo celular.


Key words: embryonic stem cells, cloning, cell replacement therapy.

Introduccin Stem Cells) que son las clulas en las que se enfocar esta
revisin. Estas clulas derivan de la masa celular interna
Las clulas madre son clulas indiferenciadas, inmadu- (ICM, del ingls Inner Cell Mass) de un embrin al estado
ras, autorrenovables y capaces de generar uno o ms tipos de blastocisto, esto es, dependiendo de la especie, 4-7
de clulas diferenciadas. En las condiciones adecuadas, das despus de la fecundacin (figura1). Esta estructura
estas clulas pueden dividirse indefinidamente conservando particular surge como resultado de una serie de divisiones
siempre una poblacin estable de clulas madre, que bajo sucesivas de las clulas embrionarias (o blastmeras), las
las condiciones apropiadas y recibiendo los estmulos cuales se especializan para conformar una estructura hueca
adecuados pueden diferenciarse hacia diferentes tipos de constituida por una capa externa de clulas denominada
clulas especializadas de un organismo adulto (Evans y trofoectodermo (TE), e interiormente por clulas en forma
Kaufman 1981, Das y col 2008). Dependiendo de la etapa de racimo (el ICM). La capa externa de clulas contina
de desarrollo, es posible diferenciar cuatro tipos de clulas su desarrollo para formar la placenta y otros tejidos nece-
madre: i) las clulas madre embrionarias totipotenciales, sarios para la implantacin y posterior desarrollo fetal del
ii) las clulas madre embrionarias pluripotenciales, iii) las embrin en el tero, mientras que las clulas internas se
clulas madre multipotenciales y iv) las clulas madre pro- desarrollan y especializan en los tejidos de las diferentes
genitoras unipotenciales. La clula madre por excelencia y capas germinales del embrin, endodermo, mesodermo y
que ocupa el primer nivel corresponde al vulo fecundado ectodermo, formando as todos los tejidos de un organismo
o cigoto, el cual es totipotente ya que puede generar todas (Hooper 1992). Las clulas madre embrionarias se les
las clulas que darn lugar al organismo adulto, incluidas denomina entonces pluripotentes, ya que pueden generar
las clulas somticas, germinales y extraembrionarias todos los tipos celulares del cuerpo, pero no pueden dar
(Gjorret y Maddox-Hyttel 2005). origen a las clulas de la placenta. De esta forma, los
Las clulas del segundo nivel corresponden a las c- embriones preimplantacionales constituyen el material
lulas madre embrionarias (ES cells, del ingls Embryonic de partida de eleccin para el aislamiento de las clulas
madre embrionarias, convirtindose en el principal foco
de controversia para la aplicacin de esta tecnologa en
humanos, ya que para su derivacin se hace necesaria la
destruccin del embrin.
Aceptado: 21.01.2009.
Existen otras dos fuentes a partir de las cuales es po-
# Financiado en parte por proyecto FONDECYT 1080216
sible aislar clulas madre embrionarias: i) las germinales
* Laboratorio de Biotecnologa Animal, Instituto de Investigaciones
Agropecuarias, INIA-Carillanca. Camino Cajn Vilcn s/n, km 10, (EGC, del ingls Embryonic Germ Cells), las cuales se
Casilla 58-D, Temuco, Chile; rfelmer@inia.cl desarrollan en los tejidos gonadales del embrin o feto

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me arias, r felmer

y que dan lugar posteriormente a los gametos (figura1) clasificarse en totipotente si es capaz de generar todas las
(Shamblott y col 2001) y ii) las de carcinoma (ECC, del clulas del embrin y del tejido extraembrionario, pluripo-
ingls Embryonic Carcinoma Cells), las cuales provienen tente si puede crear todos los tipos celulares que formarn
de tumores complejos denominados teratocarcinomas, que el embrin, multipotente si slo es capaz de generar los
derivan de gnadas adultas (figura1) (Skakkebaek y col tipos celulares del tejido de donde proviene, o unipotente
1987). Estas tres fuentes de clulas madre embrionarias si da lugar a un nico tipo celular (Temple 2001).
tienen la capacidad de diferenciarse in vitro, contribuyendo
a la lnea germinal luego de su inyeccin en blastocistos Derivacin y cultivo de clulas madre
en desarrollo. No obstante, dada la naturaleza tumoral y embrionarias en diferentes especies
cariotipo anormal de las clulas embrionarias de carci-
noma, la mayor parte de las investigaciones con clulas Las clulas madre embrionarias fueron aisladas por
madre embrionarias se han realizado a partir de las clulas primera vez desde la masa celular interna de blastocis-
derivadas de la masa celular interna. tos de ratn en 1981 (Evans y Kaufman 1981, Martin
A partir del aislamiento de las primeras lneas de clulas 1981). Estos estudios preliminares fueron la base para
madre embrionarias en ratn (Evans y Kaufman 1981, que aos ms tarde se hayan logrado establecer lneas
Martin 1981), este tipo de clulas han sido investigadas de clulas madre embrionarias a partir de otras especies
intensamente ya que poseen dos caractersticas que las como el hmster (Doetschman y col 1988), cerdo (Evans
convierten en nicas en relacin a otras clulas madre y col 1990, Vackoba y col 2007), bisonte (Sukoyan y
especficas de rganos identificadas hasta la fecha. La pri- col 1993), macaco de la India (Thomson y col 1995),
mera es la capacidad de autorrenovacin in vitro, es decir, marmota (Thomson y col 1996), pollo (Pain y col 1996),
pueden mantenerse en cultivo luego de numerosos pasajes bovino (Stice y col 1996, Cibelli y col 1998, Wang y col
y durante perodos prolongados (quizs indefinidamente) 2005), humano (Thomson y col 1998), perro (Hayes y
como una poblacin homognea de clulas indiferenciadas, col 2008) y gato (Yu y col 2008). Ms recientemente,
conservando un cariotipo normal. La segunda caracterstica en pocas especies se han aislado lneas de clulas madre
es la pluripotencialidad, pudiendo originar, bajo estmulos embrionarias a partir de embriones clonados, generados
adecuados, cada clula de un individuo. Esta capacidad por fecundacin in vitro y/o partenognesis (Wakayama
qued en evidencia cuando Bradley y col (1984) inyectaron y col 2001, Cibelli y col 2002, Wang y col 2005, Byrne y
clulas madre embrionarias de ratn en blastocistos en col 2007, Mai y col 2007).
desarrollo, observando ms tarde la contribucin de estas En un principio, las clulas madre embrionarias de ratn
clulas a todos los tejidos de los ratones quimeras adultos fueron derivadas y mantenidas en cocultivo con clulas
generados, incluyendo la lnea germinal. embrionarias de la misma especie denominadas clulas ali-
En el tercer nivel se encuentran las clulas madre adultas mentadoras, las cuales aportaban los factores de crecimiento
(SC, del ingls Stem Cells) que son clulas multipotenciales, necesarios para que estas clulas crezcan adecuadamente,
ya que poseen una capacidad limitada para diferenciarse, mantengan un cariotipo normal y preserven su capacidad
dando origen slo a las clulas de un rgano concreto en el de autorrenovacin y pluripotencia (Evans y Kaufman
embrin y/o en el adulto (figura1). El ejemplo ms clsico 1981, Martin 1981). Estudios posteriores identificaron una
de estas clulas son las clulas madre de la mdula sea, citoquina derivada de estas clulas, el factor inhibidor de
las cuales pueden generar los tipos celulares de la sangre la leucemia (LIF, del ingls Leukemia Inhibiting Factor),
y del sistema inmune (Lovell-Badge 2001) y las clulas como una de las molculas claves en prevenir su diferen-
madre de la placenta y/o cordn umbilical, que se extraen ciacin y en mantener su capacidad de autorrenovacin
al momento del parto y que en Chile han adquirido gran (Smith y col 1988, Niwa y col 1998, Matsuda y col 1999).
relevancia luego de la reciente creacin del primer banco Este factor es producido por clulas de diferentes especies
pblico de clulas madre1, en el cual se criopreservan estas incluyendo lneas celulares de fibroblastos de ratn (STO
clulas por tiempo indefinido para futuros tratamientos Mouse Fibroblast Cell Line), clulas de hgado de ratas
de enfermedades, sobre todo del tipo hematolgico como bfalo (BRL, del ingls Buffalo Rat Liver), clulas Vero
leucemias, anemias y linfomas. y fibroblastos embrionarios humanos (Smith y col 1988,
Finalmente en el cuarto nivel se encuentran clulas con Pease y col 1990, Talbot y col 1995). De esta forma, para
limitada capacidad proliferativa y ms bien una tendencia a el cultivo de las clulas madre embrionarias de ratn se
la unipotencialidad, es decir, que pueden originar solamente puede utilizar LIF producido por las clulas STO, al igual
clulas terminales. Algunos ejemplos de estas clulas son que medio condicionado BRL combinado con clulas
las clulas progenitoras eritroides o las clulas progenitoras alimentadoras y/o medios libre de clulas empleando
neuronales, las cuales se diferencian exclusivamente en LIF recombinante en combinacin con suero bovino fetal
eritrocitos y neuronas, respectivamente. De esta forma, (Smith y col 1988, Williams y col 1988).
dependiendo del potencial de la clula madre, sta puede En el humano, recientemente se han derivado clulas
madre embrionarias, clulas embrionarias de carcinoma
1 http://www.sochigen.cl/noticias-30-05-2007.htm y clulas embrionarias germinales. Sin embargo, slo las

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clulas madre embrionarias, clonacin, terapia de reemplazo celular

TROFOECTODERMO ADULTO
(TE)
MASA CELULAR FETO TERATOCARCINOMA
INTERNA
(MCI)

FECUNDACIN BLASTOCISTO

Clulas Madre Clulas Embrionarias Clulas Madre Clulas Embrionarias


Embrionarias Germinales Adultas de Carcinoma
(ES cells) (EG cells) (Stem cells) (EC cells)

Modificada de Donovan y Gearhar, 2001.

Figura 1. Origen de los diferentes tipos de clulas madre disponibles. Derivacin de clulas madre embrionarias (ES cells), clulas
madre de carcinoma (EC cells), clulas embrionarias germinales (EG cells) y clulas madre de adulto (Stem cells).
Origin of the different types of stem cells available. Derivation of embryonic stem cells (ES cells), embryonic carcinoma cells (EC cells),
embryonic germ cells (EG cells) and adult stem cells (Stem cells).

clulas madre embrionarias derivadas de embriones pro- como sustrato, incluyendo fibroblastos fetales bovinos
ducidos por fecundacin in vitro parecieran mantener la (First y col 1994), clulas epiteliales de tero bovino (van
mayora de las propiedades pluripotenciales establecidas Stekelenburg-Hamers y col 1995), clulas STO (Talbot y
para las clulas madre embrionarias de ratn (Thomson col 1995), fibroblastos epiteliales de ratn (Cibelli y col
y col 1998, Reubinoff y col 2000). Estas clulas humanas 1998, Mitalipova y col 2001) y fibroblastos humanos de
son denominadas comnmente clulas madre embriona- pulmn (Iwasaki y col 2000). Sin embargo, a pesar de
rias humanas, aunque por razones ticas su capacidad haberse generado hasta la fecha al menos seis lneas de
para reingresar a la embriognesis y/o colonizar la lnea clulas madre embrionarias en esta especie que exhiben
germinal no ha sido probada, por lo que en rigor se las pluripotencia tanto in vitro como in vivo, todas varan entre
debera denominar clulas humanas parecidas a las s en morfologa y en marcadores genticos de expresin
clulas madre embrionarias (hES like cells). Si bien las normalmente asociados a estados de indiferenciacin y
condiciones de cultivo para estas clulas no estn bien pluripotencia de estas clulas en otras especies (Stice
definidas como para las clulas madre embrionarias de y col 1996, Cibelli y col 1998, Kitiyanant y col 2000,
ratn, los protocolos de cultivo desarrollados en los l- Mitalipova y col 2001, Saito y col 2003, Wang y col
timos aos han permitido mantener poblaciones o lneas 2005). Ms an, a pesar de haberse generado quimeras
de estas clulas en cultivo por perodos prolongados, transgnicas, luego de la inyeccin de estas clulas modi-
conservando un cariotipo normal y sus caractersticas in- ficadas genticamente en embriones en desarrollo, no se
cluyendo su potencial de diferenciacin in vitro e in vivo. ha demostrado la contribucin de estas clulas a la lnea
As, actualmente estas clulas pueden crecer sobre clulas germinal y por lo tanto su transmisin a la descendencia
alimentadoras con medio libre de suero y suplementado (Niemann y Reichelt 1993, Cibelli y col 1998, Iwasaki y
con bFGF (del ingls basic Fibroblast Growth Factor), col 2000, Wang y Zhou 2003).
tambin sobre placas revestidas con laminina y medio
condicionado por fibroblastos embrionarios de ratn o con Propagacin de las clulas madre
medio conteniendo LIF recombinante en la presencia de embrionarias in vitro
BMP4 (del ingls Bone Morphogenic Protein 4), la cual
permite sustituir los requerimientos de suero bovino fetal En general, las clulas madre embrionarias se propagan
(Thomson y col 1998, Amit y col 2000, Xu y col 2001, por disociacin enzimtica de las colonias y sembrando
Ying y col 2003). clulas individuales para la formacin de nuevas colonias
En el caso de animales domsticos como el bovino, (Evans y Kaufman 1981, Thomson y col 1995, 1996, Cibelli
para el aislamiento y cultivo de las clulas madre embrio- y col 2002). En el bovino, a diferencia de otras especies, las
narias bovinas, se han utilizado diferentes tipos celulares clulas madre embrionarias no forman colonias despus de

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me arias, r felmer

la disociacin enzimtica y posterior resembrado (Stice y col


1996, Cibelli y col 1998, Mitalipova y col 2001). Adems,
estas clulas son sensibles a las enzimas utilizadas para la
disociacin, incluidas la tripsina empleada para disociar Totipotente
clulas madre embrionarias de ratn y la colagenasa tipo
IV y proteasa E, empleadas para la disociacin de clulas
madre embrionarias humanas (Wang y col 2005). Todas
Pluripotente
estas enzimas intervienen fuertemente en la capacidad de
autorrenovacin y causan diferenciacin espontnea. Sin
embargo, recientemente Roach y col (2006) reportaron
la generacin de clulas madre embrionarias bovinas que Clulas ES

pudieron ser disociadas utilizando una baja concentracin


de tripsina 0,05%/EDTA. Aunque el mtodo necesita ser
optimizado en cada caso, estos investigadores han desa-
Cuerpo Embrionario
rrollado lneas de clulas madre embrionarias bovinas con
morfologa similar a las establecidas para clulas madre
embrionarias humanas y de ratn, as como marcadores Ectodermo Mesodermo Endodermo
de expresin idnticos a los que se expresan en embriones
bovinos en estado de blastocistos (Roach y col 2006).

Diferenciacin de las clulas madre Clulas Nerviosas Clulas Cardacas Clulas Pancreticas
embrionarias
Modificado de Wobus y Boheler, 2005
El gran objetivo de la tecnologa de las clulas madre Figura 2. Diferenciacin in vitro de clulas ES. Las clulas
embrionarias consiste en dirigir los cultivos de clulas in- madre embrionarias pluripotentes se derivan in vitro de la masa
diferenciadas hacia la formacin de tejidos y rganos para celular interna de blastocistos en desarrollo. La prolongacin
terapias de reemplazo celular (Rippon y Bishop 2004). Las del cultivo de estas clulas genera estructuras va formacin de
clulas utilizadas para estos propsitos teraputicos deben agregados tridimensionales denominadas cuerpos embrionarios,
ser seleccionadas por su estabilidad gentica y normalidad, los que bajo estmulos adecuados se diferencian en los tipos
antes de iniciar la aplicacin teraputica en humanos. De celulares de las tres capas germinales, mesodermo, ectodermo
y endodermo.
esta forma, el principal desafo para la aplicacin futura
In vitro differentiation of EG cells. Pluripotent ES cells are
de las terapias de sustitucin celular es el control sobre
derived in vitro from the inner cell mass of developing blastocysts. The
la diferenciacin de estas clulas hacia tejidos especfi- continuation of these cells in culture generates tri-dimensional structu-
cos. Es por tanto necesario desarrollar procedimientos res denominated embryo bodies, which under appropriate stimuli can
que conduzcan eficazmente a la diferenciacin de las differentiate in the cellular types of the 3 germinal layers, mesoderm,
ectoderm and endoderm.
clulas madre embrionarias hacia los tipos especficos de
clulas que se requieran en cada caso. La diferenciacin
in vitro de estas clulas se realiza removiendo del medio ejemplo cido retinoico para la diferenciacin a clulas
de cultivo los factores que las mantienen indiferenciadas neuronales (Ezekiel y col 2007), aFGF (del ingls acidic
y aplicando los estmulos apropiados necesarios para su Fibroblast Growth Factor) y HGF (del ingls Hepatocyte
diferenciacin hacia las tres lneas germinales embriona- Growth Factor) para diferenciacin en clulas hepticas
rias (figura2) (Keller 1995, Smith 2001). Cuando estas (Hu y col 2003), TSH (del ingls Thyroid Stimulating
clulas son cultivadas en suspensin, en ausencia de Hormone) para la diferenciacin en adipocitos (Lu y Lin
factores antidiferenciacin, forman agregados celulares 2008) y en conjunto bFGF, IGF-1 (del ingls Insulin-like
tridimensionales llamados cuerpos embrionarios (EB, del Growth Factor-1) y nicotinamida para su diferenciacin
ingls Embryo Bodies) (figura2), los que luego de 2-4 en clulas semejantes a los islotes del pncreas, entre
das en cultivo forman el endodermo, dando lugar a un otros (Liu y col 2005, Liersch y col 2006).
cuerpo embrionario simple, el cual se diferencia al cuarto Para determinar el potencial de diferenciacin in
da generando una estructura ms compleja con epitelio vivo, las clulas madre embrionarias de origen animal se
columnar y membrana basal (Leahy y col 1999). En esta agregan a embriones de ocho clulas o a embriones en la
etapa, los cuerpos embrionarios son llamados cuerpos etapa de blastocisto para originar una quimera en la que
embrionarios qusticos (Evans y Kaufman 1981, Keller posteriormente es necesario establecer la contribucin de
y col 1993, Ng y col 2005). La continuacin en cultivo estas clulas en la formacin de la masa celular interna y
y la exposicin a los estmulos y/o agentes qumicos del trofoectodermo (Saito y col 2003) y en al menos un
adecuados pueden inducir la diferenciacin de estos porcentaje no inferior al 10% en la formacin de algn
cuerpos embrionarios hacia un linaje especfico, por tejido en los animales nacidos (Stice y col 1996, Cibelli

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clulas madre embrionarias, clonacin, terapia de reemplazo celular

y col 1998). Como por razones ticas esta evaluacin no Las clulas madre embrionarias de ratn exhiben
se puede realizar en humanos, en las clulas madre em- adems actividad fosfatasa alcalina (Resnick y col 1992)
brionarias humanas y tambin en las de algunos animales, y telomerasa (Armstrong y col 2000), al igual que muchas
la pluripotencia in vivo se confirma por la formacin de de las lneas de clulas madre embrionarias humanas
teratomas, luego de su inyeccin en ratones con inmuno- (Smith 2001, Carpenter y col 2003, Ginis y col 2004).
deficiencia combinada (Stojkovic y col 2004). No obstante, en clulas madre embrionarias bovinas esta
actividad es muy variable (Talbot y col 1995, Stice y col
Marcadores de pluripotencia asociados 1996, Strelchenko 1996, Cibelli y col 1998). Adicionalmente
a las clulas madre embrionarias existen antgenos caractersticos asociados a la pluripoten-
cialidad de las clulas madre embrionarias denominados
Los anlisis moleculares han revelado que la cito- marcadores de indiferenciacin y/o pluripotencia. Los
quina LIF acta a travs de la activacin del receptor de antgenos embrionarios especficos de SSEA-1 (del ingls
membrana gp130 del factor de transcripcin STAT3 (del Stage Specific Embryonic Antigen-1) y SSEA-3 se observan
ingls Signal Transducer and Activator of Transcription en clulas madre embrionarias de ratn, mientras que las
3) (Niwa y col 1998, Matsuda y col 1999), mientras que clulas madre embrionarias humanas expresan SSEA-3 y
el efecto de BMP4 estara mediado por la activacin del SSEA-4 (Carpenter y col 2003). En el caso de las clulas
factor de transcripcin SMAD (del ingls Small Mothers madre embrionarias bovinas, estudios inmunohistoqumicos
Against Decapentaplegic) y la subsiguiente induccin revelaron la expresin de SSEA-1 (Saito y col 2003), pero
del factor inhibitorio de la diferenciacin (Id, del ingls se han obtenido resultados contradictorios con respecto
Inhibitory Differentiation Factor) de tipo bHLH (del ingls a la expresin de SSEA-3 y SSEA-4 (Mitalipova y col
basic Helix-Loop-Helix). Adems de STAT3 e Id, otros 2001, Saito y col 2003).
dos factores de transcripcin que han mostrado tener roles
fundamentales en la mantencin del estado indiferenciado Transformacin gentica de las
de las clulas madre embrionarias son Oct-4 (del ingls clulas madre embrionarias mediante
Octamer Transcription Factor-4) (Niwa y col 2000) y recombinacin homloga dirigida (gene
Nanog (Chambers y col 2003, Mitsui y col 2003). targeting)
Oct-4 es esencial para el desarrollo inicial de la pluri-
potencialidad en el macizo celular interno de cigotos de En la dcada de los ochenta se estableci el gran valor
ratn y para mantener la pluripotencialidad de las clulas de las clulas madre embrionarias como herramienta para
madre embrionarias, respectivamente. No obstante, anlisis experimentos de mutagnesis dirigida, al reemplazar o
cuantitativos revelaron que los niveles altos de expresin de eliminar (knock-out) selectivamente un determinado gen
este factor inducen la diferenciacin de las clulas madre en el genoma de un animal. Para llevar esto a cabo, se
embrionarias de ratn hacia lneas del endodermo y meso realiza la modificacin gentica del gen seleccionado
dermo, mientras que niveles bajos de expresin inducen en una copia clonada del mismo, la cual se transfiriere
prdida de la pluripotencialidad y desdiferenciacin hacia posteriormente al genoma de las clulas mediante recom-
clulas del trofoectodermo (Niwa y col 2000). Por esta binacin homloga con una secuencia de ADN similar en
razn, se ha postulado a este factor de transcripcin como el cromosoma. Si estas clulas se inyectan en embriones
regulador maestro de la pluripotencialidad, ejerciendo su de ratn en desarrollo (blastocistos) pueden colonizar el
efecto mediante la regulacin de la expresin de al menos embrin y generar descendencia transgnica, contribuyendo
siete genes necesarios para la diferenciacin (Pesce y col eficientemente hacia la lnea germinal de las quimeras
1998). En otras especies como cerdos, bovinos y humanos resultantes, las que luego de su retrocruzamiento permiten
tambin se ha confirmado la presencia de este factor en el la generacin de una lnea pura de animales homocigotos
macizo celular interno y en el trofoectodermo (van Eijk y para la modificacin gentica deseada (Gossler y col 1986,
col 1999, Kirchhof y col 2000, Saito y col 2003), llevando Robertson y col 1986).
a especular una funcin similar a la de las clulas madre Los trabajos pioneros de recombinacin homloga en
embrionarias de ratn (Mitalipova y col 2003, Reubinoff clulas madre embrionarias de ratn sentaron las bases del
y col 2000). De igual forma, se ha identificado a Nanog primer modelo animal para el sndrome de Lesch-Nyhan, un
como otro factor maestro regulador de la pluripotencia- raro desorden neurolgico caracterizado por la deficiencia
lidad de las clulas madre embrionarias (Chambers y col de la enzima hipoxantina fosforibosil transferasa (HPRT, del
2003, Mitsui y col 2003). La expresin de este factor ingls Hypoxanthine-Guanine Phosphoribosyl Transferase)
se ha observado tanto en clulas madre embrionarias (Doetschman y col 1987, Thomas y Capecchi 1987). De
de ratn como humanas, estando ausente en las clulas esta forma, esta tcnica entreg a los investigadores una
diferenciadas. Sin embargo, Nanog es capaz de mantener poderosa herramienta para generar animales transgnicos
la autorrenovacin de clulas madre embrionarias de ratn con mutaciones precisas en su genoma, contndose hasta
independientemente de la va STAT3/LIF asociada al factor la fecha con ms de 5.000 genes inactivados en el ratn.
de transcripcin Oct-4. Estos modelos estn siendo utilizados para el estudio

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me arias, r felmer

de diversas enfermedades genticas y para comprender utilizados para generar productos biomdicos, tales como
procesos biolgicos incluyndose para el anlisis de la gelatina, colgeno y recientemente protenas humanas en
funcin y regulacin de genes endgenos (Houdebine biorreactores transgnicos, se hace necesario disponer de
2002). Sin embargo, a pesar de su gran utilidad, estos animales resistentes a los priones. Los primeros modelos
modelos knock-out tienen pocas posibilidades reales de ratones generados donde se elimin una copia del gen
para desarrollar tratamientos clnicos o para estudiar los del prion (PrP +/-) no evidenciaron anormalidades en su
efectos a largo plazo en la salud como resultado de estas conducta, mientras que los homocigotos nulos (PrP -/-)
modificaciones. La principal restriccin del modelamiento no desarrollaron las caractersticas clnicas y patolgicas
de patologas humanas en el ratn estn dadas por sus clsicas del scrapie luego de su inoculacin con priones
diferencias fisiolgicas y reproductivas, incluyendo el de ratn (Bueler y col 1994). Estos hallazgos sugieren
nmero de progenie, su menor tamao y corta vida, lo que la eliminacin de este gen en ovejas y bovinos podra
que ha motivado por aos la generacin de animales permitir la generacin de modelos animales resistentes a la
domsticos que puedan constituirse en mejores modelos EEB o al scrapie. Los primeros experimentos tendientes
para ser utilizados para estos propsitos. a demostrar esta hiptesis corresponden a los trabajos
A pesar de los esfuerzos, las aplicaciones de esta tec- recientes de Denning y col (2001) quienes generaron
nologa en especies domsticas se han visto restringidas ovejas heterocigotas para este gen, estando a la espera la
debido a que an no se ha demostrado que las clulas madre generacin de lneas de animales homocigotos nulos, antes
embrionarias generadas en estas especies contribuyan a de que se pueda evaluar la sobrevivencia y resistencia de
la lnea germinal (Niemann y Reichelt 1993, Cibelli y col estos animales a la enfermedad.
1998, Iwasaki y col 2000, Wang y Zhou 2003). No obstante
este desalentador escenario, actualmente la tecnologa de Aplicaciones de las clulas madre
transferencia nuclear de clulas somticas est abriendo embrionarias en Biomedicina
nuevas oportunidades. Mediante el nacimiento de la oveja
Dolly (Wilmut y col 1997), esta tecnologa demostr no desarrollo de nuevas drogas
slo la capacidad de utilizar clulas somticas para generar
un individuo adulto, sino adems la factibilidad de mani- Se ha sugerido que las clulas madre embrionarias
pular genticamente estas clulas para generar animales pueden tener su aplicacin en el descubrimiento y desarrollo
que adems de ser clonados son tambin transgnicos de nuevas drogas con potencial farmacutico (figura3).
(Schnieke y col 1998). Este importante hito cientfico En efecto, algunos tipos celulares como cardiomiocitos y
paviment el camino para los trabajos pioneros de recom- hepatocitos generados desde clulas madre embrionarias
binacin homloga en animales domsticos, permitiendo humanas podran proporcionar una poblacin ideal de
de esta forma la generacin de los primeros modelos de clulas para evaluar con mayor exactitud la efectividad
animales domsticos con mutaciones definidas en su de un determinado frmaco o su toxicidad (Keller 2005).
genoma. Uno de estos modelos busca prevenir el rechazo Este sistema proporcionara ventajas adicionales ya que
hiperagudo que se produce en el trasplante de rganos de las clulas humanas pueden revelar la toxicidad de ciertas
cerdo a humanos, que se cree estara dado por el eptope drogas que no necesariamente se detectan en los anlisis
-1,3-galactosa que est presente en las clulas de cerdo convencionales, como en los ensayos desarrollados con
pero no en las clulas humanas, por lo que su eliminacin lneas celulares de ratn o los ensayos llevados a cabo in
podra aplacar algunos de los aspectos del estmulo de re- vivo en animales.
chazo (Wang y Zhou 2003). Recientemente se ha logrado
la eliminacin de este gen en clulas somticas, las que Terapia de reemplazo celular
fueron posteriormente utilizadas como donantes de ncleo
en experimentos de transferencia nuclear, generndose los La aplicacin de las clulas madre embrionarias
primeros cerdos knock-out para esta mutacin, estando a que ha recibido mayor atencin en los ltimos aos es
la espera las investigaciones de los tejidos y rganos de la terapia de reemplazo celular o medicina regenerativa
estos animales en otros modelos no humanos, que sin duda (figura3), que permitira el tratamiento de una amplia
entregarn valiosa informacin respecto al mecanismo de variedad de enfermedades debilitantes, tales como diabetes
rechazo hiperagudo, acercando las posibilidades para la tipo I, enfermedades cardiovasculares, enfermedad de
utilizacin de estos rganos en trasplantes humanos (Dai Parkinson y enfermedades de las clulas sanguneas (Doss
y col 2002, Phelps y col 2003, Sharma y col 2003). y col 2004). En este caso, lo que se busca es reemplazar
La encefalopata espongiforme bovina (EEB), ms clulas daadas por clulas funcionales que restituyan
conocida como enfermedad de las vacas locas, es una enfer- la funcin normal de los tejidos u rganos de forma ms
medad neurodegenerativa causada por protenas resistentes eficiente que a travs de terapias convencionales como
a proteasas denominadas priones (PrP, del ingls Prion son los trasplantes, las terapias farmacolgicas y/o los
Protein) (van Keulen y col 2008). Debido a que las ovejas y tratamientos con protenas recombinantes. Sin embar-
los bovinos poseen genes funcionales de los priones y son go, hasta la fecha el xito de estas terapias es limitado,

190
clulas madre embrionarias, clonacin, terapia de reemplazo celular

FECUNDACIN TRANSFERENCIA NUCLEAR DE CLULAS


SOMTICAS

clula somtica

Blastocisto estndar Blastocisto clonado ovocito

Clulas Madre
Embrionarias (ES cells)

Manipulacin Gentica Clonacin


Ganancia de funcin (knock in) teraputica
Prdida de funcin (knock out)

Biologa del Desarrollo Terapia de Reemplazo Descubrimiento de Drogas


Celular

Endodermo Ectodermo

Mesodermo Heart Muscle Cells

Modificado de Keller, 2005

Figura 3. Usos potenciales de las clulas madre embrionarias (ES cells) en investigacin y medicina. Generacin de clulas madre
embrionarias desde blastocistos normales (fecundacin) o desde blastocistos clonados (transferencia nuclear de clulas somticas).
Potential use of stem cells (EG cells) in research and medicine. Generation of ES cells from normal blastocysts (fertilization) or from
blastocyst derived from cloning (somatic cell nuclear transfer).

existiendo varias interrogantes que an necesitan ser Clonacin teraputica


resueltas. Una de ellas es el nmero de clulas que deben
ser trasplantadas y su estado de diferenciacin. Adems, Para sobreponer el problema habitual del rechazo
en el trasplante con clulas madre embrionarias existe el del injerto por el sistema inmunolgico del receptor se
riesgo de contaminacin con clulas madre embrionarias han desarrollado numerosas estrategias, la ms reciente
residuales no diferenciadas, las cuales se sabe pueden y conflictiva es quizs la clonacin teraputica, la cual
desarrollar teratomas cuando son trasplantadas (Evans y involucra la obtencin de clulas madre embrionarias
Kaufman 1981, Thomson y col 1998). Esto ha motivado isognicas desde embriones clonados, las que pueden ser
a que actualmente se estn desarrollando tcnicas que diferenciadas especficamente en clulas regenerativas
permitan la purificacin de clulas con un linaje determi- para pacientes que requieren terapia de trasplante celular
nado para ser utilizadas con seguridad en los trasplantes (Han y col 2007). En la clonacin teraputica los ncleos
(Li y col 1998, Doss y col 2004). de clulas somticas de un paciente son fusionados con
Otro obstculo a sobreponer es la compatibilidad do- ovocitos enucleados, cultivndolos in vitro hasta la etapa
nante/receptor y el rechazo al trasplante, para lo cual se ha de blastocistos y derivando de la masa celular interna
sugerido establecer un banco de muchas lneas de clulas lneas de clulas madre embrionarias isognicas humanas
madre embrionarias que incluiran una proporcin signifi- (figura3). Sin embargo, las limitaciones de este procedi-
cativa de los tipos de histocompatibilidad en la poblacin miento estn dadas por la prohibicin que existe en muchos
(Keller 2005). Actualmente existen muchas investigaciones pases para generar embriones humanos clonados y por
enfocadas a descubrir clulas progenitoras que sirvan como la escasez de ovocitos humanos para estos propsitos
banco de clulas para usos teraputicos, evalundose varias (Mombaerts 2003).
estrategias que incluyen terapias celulares derivadas de El apoyo que existe actualmente para generar y utilizar
clulas autlogas, de lneas celulares establecidas desde lneas de clulas madre embrionarias humanas vara entre
una variedad de clulas madre incluyendo la mdula sea, los diferentes pases. En Inglaterra, por ejemplo, la HFEA
cordn umbilical, clulas madre embrionarias, as como (The Human Fertilisation and Embryology Authority)2
clulas de tejidos y rganos de animales genticamente
modificados (Asahara y col 2000, Fodor 2003). 2 www.hfea.gov.uk

191
me arias, r felmer

aprob la generacin de lneas de clulas madre embrio- de su regulacin y diferenciacin in vitro. A pesar de
narias humanas de embriones sobrantes de procedimientos que actualmente no existen terapias basadas en clulas
de fecundacin in vitro, decisin que tambin han impul- madre embrionarias en seres humanos, pues se necesita
sado Espaa y Suiza. En nuestro pas, en cambio, se ha de ms investigaciones y ensayos clnicos antes de que
promulgado recientemente la Ley 20.120 (Diario Oficial estn disponibles, la gran promesa de estas clulas reside
22/09/06) en la cual se prohbe la clonacin de seres hu- en la posibilidad de encontrar cura o tratamientos ms
manos para cualquier fin y la destruccin de embriones eficaces a enfermedades crnicas como diabetes, cncer,
para obtener las clulas madre embrionarias. En Corea Alzheimer, Parkinson y enfermedades cardiovasculares,
del Sur y otros pases asiticos se aprob la utilizacin debido a la capacidad de estas clulas para crecer inde-
de embriones humanos clonados para generar lneas de finidamente y diferenciarse in vitro en mltiples tipos
clulas madre embrionarias (Bavister y col 2005), situacin celulares y/o tejidos. Sin embargo, no obstante el poten-
que gener gran conmocin en la comunidad cientfica cial que encierran estas clulas, an persisten grandes
mundial, cuando en el ao 2004 Woo-Suk Hwang y sus desafos por superar antes de que puedan ser utilizadas
colaboradores anunciaron la obtencin de 11 lneas de efectivamente en terapias celulares, particularmente los
clulas madre embrionarias humanas, que provenan de motivados por preocupaciones ticas y polticas. Se hace
embriones clonados de pacientes con diversas enfermeda- evidente entonces la necesidad de seguir investigando en
des inmunolgicas congnitas, tales como diabetes tipo I la derivacin y caracterizacin de estas clulas en otras
y lesiones en la mdula espinal (Hwang y col 2004). Sin especies animales, antes de que podamos ver cumplidas
embargo, el mismo investigador declar posteriormente las grandes expectativas que se han generado en torno a
que su trabajo publicado en la revista Science haba sido sus prometedoras aplicaciones.
un engao, aunque su laboratorio posea la tecnologa y
capacidades para llegar a hacerlo. Resumen
Una forma de evitar la utilizacin de embriones clonados
Las clulas madre embrionarias (ESC del ingls, Embryonic Stem Cells)
son los resultados promisorios que revelan que ambos ga-
son clulas indiferenciadas que derivan de la masa celular interna (MCI)
metos, ovocitos y espermatozoides, pueden potencialmente de embriones en estado de blastocisto. Estas clulas se caracterizan por su
derivarse desde clulas madre embrionarias crecidas in vitro habilidad para crecer indefinidamente in vitro y conservar la capacidad de
(Hubner y col 2003, Toyooka y col 2003, Geijsen y col diferenciarse hacia todos los tipos celulares de un individuo. Las clulas
2004). Otra estrategia para generar lneas de clulas madre madre embrionarias se han constituido en una poderosa herramienta
para estudios del desarrollo embrionario, genmica funcional, para la
embrionarias isognicas consiste en la fusin de clulas
generacin de animales transgnicos va recombinacin homloga y ms
somticas con clulas madre embrionarias, mtodo que recientemente en clonacin y medicina. Debido a su potencial aplicacin
ha permitido generar lneas celulares hbridas con cierta en la manipulacin especfica de genes, el aislamiento de estas clulas en
conservacin de la pluripotencialidad (Tada y col 2001). especies domsticas como el cerdo y el bovino podra tener numerosas
Ms recientemente, investigadores del Instituto Advanced aplicaciones agropecuarias, farmacuticas y biomdicas. Ms an, las
actuales investigaciones desarrolladas acerca de sus propiedades biolgicas
Cell Technology de EE.UU.3 describieron un mtodo alter-
y sobre sus posibles aplicaciones en medicina regenerativa, debido al
nativo para establecer clulas madre embrionarias usando enorme potencial de reparacin que encierran, estn abriendo grandes
una tcnica de biopsia de clulas embrionarias, similar a posibilidades que permitirn, en un futuro no muy lejano, disponer de
la utilizada para diagnstico gentico preimplantacional, revolucionarias terapias para diversas enfermedades humanas que hoy
que no interfiere con el potencial desarrollo del embrin. en da son incurables. En esta revisin se describen aspectos generales
del aislamiento, derivacin, cultivo, transformacin y diferenciacin
En este caso, blastmeras individuales fueron extradas
de estas clulas en diferentes especies as como tambin algunas de sus
desde un embrin de ratn y/o humano a partir de las potenciales aplicaciones en biomedicina.
cuales se desarrollaron clulas madre embrionarias que
se mantuvieron en cultivo por ms de ocho meses, mos-
trando un cariotipo normal y los marcadores clsicos de Agradecimientos
pluripotencia, incluyendo Oct-4, SSEA-3, SSEA-4, TRA
(del ingls T cell Receptor Alpha)-1-60, TRA-1-81, Nanog La recopilacin de material bibliogrfico as como tambin los
y fosfatasa alcalina (Chung y col 2006, Klimanskaya y costos de publicacin de este artculo fueron financiados por proyecto
FONDECYT 1080216.
col 2006).

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