DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Y PARMETROS DE LA ECUACIN DE

MICHAELIS-MENTEN (Vmax Y Km)

DETERMINATION OF ENZYME ACTIVITY AND PARAMETERS OF THE MICHAELIS - MENTEN ( Vmax

AND Km )

Leiny Alvarez1, Lina Arrieta1, Jos Diaz1, Mara Espinosa1, Daniela Medina1, Francisco Martinez1,
Alejandra Navarro1.

RESUMEN

Las alfa amilasas son las enzimas ms estudiadas e importantes en el campo biotecnolgico e
industrial; ya que han reemplazado por completo la hidrolisis qumica del almidn. Estas enzimas
son imprescindibles en la elaboracin de productos alimenticios, combustibles, medicamentos y
detergentes con la finalidad de optimizar procesos y conservar el medio ambiente. En este estudio
se determinaron la actividad enzimtica de la alfa amilasa y los parmetros cinticos Vmx y Km
del biocatalizador a diferentes concentraciones de sustrato 5%, 15%, 25% y 35% y por diferentes
mtodos de linealizacion, en donde el mtodo por LW fue el que se adapt mejor al proceso. Los
resultados obtenidos para la actividad enzimtica fue de 0,000772 UI con una concentracin de
25% siendo este valor mayor que las dems concentraciones, en cuanto los Vmax y Km mediante
LW fueron 1,255/ y 0,322/ respectivamente. En general, segn los datos obtenidos
en los diferentes mtodos, el que mejor se adapta al proceso es el mtodo de Lineweaver Burk,
este presenta una correlacin de 98,51% a comparacin de los dems mtodos.

Palabras clave: DNS, absorbancia, azucares reductores.

ABSTRACT

Alpha amylases are the most studied and important in the biotechnology field and industrial
enzymes; since they have completely replaced chemical hydrolysis of starch. These enzymes are
essential in the production of food, fuel, medicines and detergents in order to optimize processes
and preserve the environment. In this study the enzymatic activity of alpha amylase and the
kinetic parameters Vmax and Km of the biocatalyst at different concentrations of substrate 5%,
15%, 25% and 35% and by different methods of linearization, wherein the method is determined
by LW it was the one that adapted best to the process. The results for enzyme activity was
0.000772 UI with a concentration of 25% being greater value than other concentrations, as the
Vmax and Km were 1,255g by LW / l * min and 0,322g / l respectively. In general, according to data
from the different methods, best suited to the process it is the method of Lineweaver Burk, this
presents a correlation of 98.51% compared to other methods

Keywords: DNS, absorbance, reducing sugars.

INTRODUCCION

Las enzimas son molculas orgnicas producidas por los seres vivos capaces de funcionar fuera de
la clula u organismo que las produce; aceleran las reacciones qumicas. El potencial cataltico de
una enzima es fuertemente afectada por variables ambientales, como PH y temperatura las ms
importante. Estas variables afectan tanto a la actividad enzimtica y la estabilidad de la enzima,
aunque no necesariamente en la misma direccin ni con igual magnitud (Gonzalez, 2008). Las -
amilasas son enzimas que catalizan al azar la hidrlisis de enlaces glicosdicos -1,4 de
polisacridos como el almidn y el glicgeno, para producir maltosa, oligosacridos de diferentes
tamaos y cadenas ms o menos ramificadas llamadas dextrinas lmite (Maheshwari, 2000)

En algunos casos las enzimas requiere para su funcin la presencia de sustancias no proteicas que
colaboran en la catlisis como los cofactores pueden ser iones inorgnicos como el Fe, Mg, Mn, Zn
etc., tambin se presentan como una molcula orgnica a lo cual se le denomina coenzima.
Muchas enzimas obedecen la teora de la cintica enzimtica propuesta en 1913 por Leonor
Michaelis y Maud Mente la cual describe la velocidad de reaccin de muchas reacciones
enzimticas (Gonzalez, 2008), adems de que sirve como un mecanismo de control fundamental
en los sistemas biolgicos permitiendo la regulacin de los caminos metablicos. (Canteros, 2008)

La actividad enzimtica es la cantidad de enzima que cataliza la conversin de 1 mol de sustrato

en un minuto, esta actividad se evala en funcin de la velocidad de reaccin. La cintica
enzimtica estudia la velocidad de la reaccin, los factores que la modifican y el mecanismo de la
misma (Espinel E. et al, 2009)

Con esta prctica de laboratorio se busca determinar la actividad enzimtica de una alfa amilasa y
los parmetros de Michaelis-Menten (Vmax y Km) en diferentes concentraciones de sustrato a
temperatura fija.

MATERIALES Y METODOS

En el laboratorio de bioingeniera de la universidad de sucre, situado en la sede puerta verde, se

determin los azucares reductores por el mtodo DNS(acido 3,5-dinitrosalicilico),previamente
preparamos una disolucin de almidn, la cual se introdujo en un baln aforado y se llev a un
bao de mara a una temperatura de 45c, adems de esto el montaje contaba con un agitador de
dispersin, el cual agitaba la disolucin a 400 rpm, justo despus de que la disolucin alcanzara
dicha temperatura se le agrego 1 ml de la enzima alfa amilasa, posterior a esto con una micro
pipeta se tom una muestra de 1 ml de la disolucin en intervalos de tiempo de 10 min, durante 1
hora, luego agregamos 0,5 ml de la disolucin de almidn en un tubo de ensayo con 14,4 ml de
agua destilada, siguiente a esto con una micro pipeta se agregaron en tres tubos de ensayos 0,25
ml de la muestra y 0,25 ml de DNS, seguido de esto los tubos de ensayo fueron llevados agitacin
en un vortex y se sometieron a calentamiento en un bao de mara durante 5 minutos a
temperatura de ebullicin en un beaker de 500 ml, finalizado el tiempo de calentamiento se
llevaron los tubos de ensayo a enfriamiento en un bao en hielo a una temperatura de 13,5c
durante 5 minutos, terminado este tiempo se le adicionaron 2,5 ml de agua destilada a cada uno
de los tubos de ensayos y se llev agitacin, por ultimo tomamos pequeas muestras de cada uno
de los tubos de ensayo, que fueron adicionadas en las celdas previamente lavadas y secadas, para
ser introducidas en el espectrofotmetro donde se realiz la medicin de absorbancia a 540 nm de
cada una de las muestras a cada uno de los tiempos anteriormente descritos.

Las ecuaciones con las que se determin los resultados son las siguientes:

( )
min
. = (1 1 )() (Ecuacin 1)

Para el modelo de Limeweaver, donde representa la pendiente de la relacin graficada entre

1/v vs 1/[S]
1 1 1

= () + (Ecuacin 2)

Para emplear el mtodo de Eadle-Hofstee, donde representa la pendiente de la relacin

graficada entre 1/v vs 1/[S]

= ( ) (Ecuacin 3)


Para aplicar el mtodo de Eadle-Hofstee, donde representa la pendiente de la relacin

graficada entre 1/v vs 1/[S]
1
=( ) () ( ) (Ecuacin 4)

RESULTADO Y DISCUSIN

La actividad enzimtica viene dada por la ecuacin 1, donde la pendiente corresponde a los
valores que se muestran en la grfica 1 de absorbancia versus tiempo para cada concentracin,
y b se mantienen constante para las diferentes concentraciones siendo 6220 M-1*cm-1 y 1 cm
respectivamente.

Grafico 1. Absorbancia versus tiempo para las concentraciones de 5 % (A), 15 % (B), 25 % (C) y 35
% (D).

Para la concentracin de 5% tenemos que:


0,0008
. = 6220(1
1 )1() . = ,

1000
. = 1,29 107 = ,
1
Tabla 1. Actividad enzimtica de acuerdo a cada concentracin.

Concentracin Actividad enzimtica (UI)

5% 0,000129
15 % 0,000482
25 % 0,000772
35 % 0,000511

Se ha reportado por

De acuerdo a los datos de calibracin del espectrofotmetro en el laboratorio, se procedi a

calcular la curva patrn, la cual es utilizada para obtener las concentraciones de los productos para
cada una de las concentraciones de sustrato, en la grfica 2 se muestra la curva patrn.

y = 0,4719x + 0,0002
CURVA PATRON R = 0,9997
3
2,5
2
ABS

1,5
1
0,5
0
0 1 2 3 4 5 6 7
[GL]

Grafica 2. Representacin de la curva patrn de absorbancia vs concentracin de glucosa.

A partir de la ecuacin se procede a calcular la concentracin de producto de la siguiente manera:

0,0002
[] =
0,4719
La concentracin de producto se halla con el fin de determinar las velocidades iniciales para cada
concentracin de sustrato. Los datos obtenidos se presentan a continuacin.
 Tabla 2. Datos obtenidos para para una de las concentraciones de sustrato (5%, 15%, 25% y 35%)
desde 0 hasta 180 minutos.

5% 15% 25% 35%

Tiempo Abs. dilucin Producto Abs. dilucin Producto Abs. dilucin Producto Abs. dilucin Producto
(min) (g/l) (g/l) (g/l) (g/l)
0 2,248 - 4,764 2,946 10 62,453 0,114 - 0,236 0,949 - 2,008
30 1,259 10 26,658 1,067 10 22,577 2,735 20 115,952 2,001 30 127,206
60 1,654 10 35,046 1,521 20 64,449 1,595 30 101,362 1,631 30 103,654
90 1,664 10 35,259 2,068 20 87,647 1,659 30 105,436 1,766 30 112,247
120 1,726 10 36,567 2,308 20 97,846 1,616 30 102,699 2,249 40 190,656
150 2,299 10 48,718 2,432 20 103,094 1,926 30 122,432 2,322 40 196,851
180 1,745 10 36,963 2,609 20 110,591 1,981 30 125,933 1,428 50 151,220

Se determinaron las velocidades iniciales para cada concentracin graficando tiempo vs

concentracin de producto, donde la velocidad es la pendiente de la recta para cada caso.

[P] VS TIEMPO
[5%] [15%] [25%] [35%]
Lineal ([5%]) Lineal ([15%]) Lineal ([25%]) Lineal ([35%])
250,000

y = 0,8023x + 54,056
200,000

150,000
[P] (G/L)

y = 0,4659x + 54,359

100,000
y = 0,4034x + 42,075

50,000
y = 0,1693x + 16,757
0,000
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
TIEMPO (MIN)

Grafica 3. Concentracin de producto (g/l) vs Tiempo (min) para cada concentracin de sustrato.

Las velocidades iniciales para cada concentracin de sustrato se presentan en la tabla 3.

Tabla 3. Velocidades iniciales (g/l*min) para cada concentracin de sustrato (g/l).

[Sustrato] Velocidad (g/l*min)

(g/l)
0,05 0,1693
0,15 0,4034
0,25 0,4659
0,35 0,8023
Se determinaron los parmetros cinticos de michaelis-menten (Vmax y Km) utilizando los
mtodos de Lineweaver-Burk, Eadi-Hofstee y Langmuir; con la ecuacin 2, 3 y 4 respectivamente.

Lineweaver Burk
10,0000

1/Velocidad
5,0000
0,0000
0 5 10 15 20 25
y = 0,2563x + 0,7966 1/[Sustrato]
R = 0,9851
Grafica 4. Linealizacin mediante Lineweaver Burk para la determinacin de los parmetros
cinticos.

Los parmetros cinticos obtenidos con Lineweaver Burk fueron, : 0,322/ y

: 1,255 .

Eadie-Hofstee
1

0,5
y = -0,2733x + 1,1593
R = 0,4577
0
0,000 1,000 2,000 3,000 4,000

Grafica 5. Linealizacin mediante Eadi-Hofstee para la determinacin de los parmetros cinticos.

Los parmetros cinticos obtenidos con Eadie-Hofstee fueron, : 3,66/ y : 4,24 .

Langmuir
0,4

0,2
y = 0,9379x - 0,1845
R = 0,551
0
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

Grafica 6. Linealizacin mediante Langmuir para la determinacin de los parmetros cinticos.

Los parmetros cinticos obtenidos con Langmuir fueron, : 0,196/ y : 1,066 .
Segn los datos obtenidos en los diferentes mtodos, el que mejor se adapta al proceso es el
mtodo de Lineweaver Burk, este presenta una correlacin de 98,51% a comparacin de los
dems mtodos.
Tabla 4. Comparacin de los parmetros cinticos con la literatura.

Parmetros cinticos
Autores Km (g/l) Vmax (g/l*min)
Valores experimentales 0,322 1,255
Sabariz L. et al. (2009) 12,34 0,0522
Espinel E. et al. (2009) 0,48 -

Sabariz L. et al (2009), realizaron la hidrolisis de una solucin de almidn y midieron la velocidad

de reaccin siguiendo la variacin de concentracin de almidn, los datos obtenidos fueron
mediante la inmovilizacin de la enzima alfa-amilasa, con un rendimiento del 25%. Cabe destacar
que para este estudio, lo que se calcul en realidad fue el Km aparente la cual depende del
espesor de la capa de difusin del sustrato para este estudio.

Espinel E. et al (2009), reportaron la caracterizacin parcial de una alfa-amilasa producida por

Penicillium commune mediante fermentacin en fase slida, empleando yuca blanca colombiana
como soporte. Entre los principales productos obtenidos en la hidrolisis del almidn de yuca se
encontraron la maltosa y la glucosa, lo que evidencia que esta enzima es capaz de romper los
enlaces glucdicos del almidn. De los resultados que se presentan, se observa que, parmetro
como el pH y la temperatura a la que se mantenga el medio influyen en la obtencin del producto
de inters. Los valores de los parmetros cinticos dependern directamente del sustrato que se
le proporcione a la enzima, as como su modo de uso (libre e inmovilizado).

CONCLUSIN

Se requiere una reduccin de azucares hasta llegar a su forma ms simple se hace necesario
utilizar el catalizador adecuado para que se pueda acelerar la reaccin que se desea obtener.
Al aplicar el mtodo DNS para determinar azucares reductores en caldo y medios de fermentacin
se pueden apreciar la presencia de grupos carbonilos libres presentes en la glucosa utilizada en la
prctica. Este mtodo es muy prctico de colorimetra.
La capacidad del DNS en determinar las pautas que se realiza en un procedimiento como el tiempo
en el calentamiento, la temperatura y los reactivos utilizados ya que un mal procedimiento varia
en los resultados.
Segn los datos obtenidos en los diferentes mtodos, el que mejor se adapta al proceso es el
mtodo de Lineweaver Burk, este presenta una correlacin de 98,51% a comparacin de los
dems mtodos.

LITERATURA CITADA

Espinel E., Lpez E., 2009. Purificacin y caracterizacin de -amilasa de penicillium commune
producida mediante fermentacin en fase slida. Universidad Nacional de Colombia

Gonzlez, J. M. (2008). Enzimas. Curso de Biomoleculas.

Maheshwari, R.; Bharadwaj, G.; Bhat, M. (2000). Thermophilic fungi: their physiology and
enzymes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64: 461-488.
Sabariz L., Vazquez M., Chevarria G., 2009. Determinacin del efecto de la inmovilizacin sobre la
actividad enzimtica de -amilasa. Universidad tecnolgica nacional.

Canteros, A. (2008). ANEXO II. Modelo de Michaelis Menten.