Sunteți pe pagina 1din 118

Ministerul Sntii al republicii Moldova

Proiectul USAID Prevenirea HIV/SIDA i Hepatitelor B i C

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Instruciuni metodice

Chiinu 2007

ADNOTARE
Punctele de vedere ale autorilor exprimate n aceast publicaie nu ntotdeauna reflect opinia Ageniei Statelor
Unite pentru Dezvoltare Internaional (USAID) sau a Guvernului SUA
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

CZU: 616.36-002.1+616.36-002.2+614.4+658.562

Aprobate la edina Consiliului de Experi al Ministerului Sntii


al Republicii Moldova nr. 2 din 14 iunie 2007

Instruciunile metodice au fost elaborate de grupul de autori (n ordine alfabetic):

Calancea Alexandru Universitatea de Stat de Medicin i Farmacie Nicolae Testemianu


Caragia Svetlana Universitatea de Stat de Medicin i Farmacie Nicolae Testemianu
Cojocaru Radu Centrul Naional tiinifico-Practic de Medicin Preventiv
Cotici Alexandru Universitatea de Stat de Medicin i Farmacie Nicolae Testemianu
Crudu Valeriu Proiectul Prevenirea HIV/SIDA i hepatitelor virale B i C
Gudumac Valentin Universitatea de Stat de Medicin i Farmacie Nicolae Testemianu
Holban Tiberiu Universitatea de Stat de Medicin i Farmacie Nicolae Testemianu
Iarovoi Petru Centrul Naional tiinifico-Practic de Medicin Preventiv
Isac Marina Centrul Naional tiinifico-Practic de Medicin Preventiv
Niguleanu Vasile Universitatea de Stat de Medicin i Farmacie Nicolae Testemianu
Plugaru tefan Universitatea de Stat de Medicin i Farmacie Nicolae Testemianu
Popa Mariana Centrul Republican de Diagnosticare Medical
Rmi Constantin Centrul Naional tiinifico-Practic de Medicin Preventiv
Romancenco Elena Centrul Naional tiinifico-Practic de Medicin Preventiv
Rotaru Liliana Universitatea de Stat de Medicin i Farmacie Nicolae Testemianu
Spnu Constantin Centrul Naional tiinifico-Practic de Medicin Preventiv
Varticean Ana Universitatea de Stat de Medicin i Farmacie Nicolae Testemianu
Vrnceanu Angela Centrul Naional tiinifico-Practic de Medicin Preventiv

Instruciunile metodice au fost avizate de ctre experii naionali:

Dumbrava Vlada-Tatiana Dr. hab. n medicin, profesor universitar, Catedra medicin intern nr.
4, USMF N. Testemianu
Obreja Gabriel Dr. n medicin, confereniar, Facultatea de perfecionare a Medicilor,
Catedra igien i epidemiologie, USMF N. Testemianu
Ghinda Sergiu Dr. hab. n medicin, profesor cercettor, Laboratorul imunologie i
imunochimie, IMSP Institutul Ftiziopneumologie Chiril Draganiuc
Lsi Leonid Dr. hab. n medicin, profesor universitar, Catedra biochimie i
biochimie clinic, USMF N. Testemianu

Proiectul Prevenirea HIV/SIDA i Hepatitelor virale B i C este finanat de ctre Guvernul SUA
prin intermediul Ageniei Statelor Unite pentru Dezvoltare Internaional (USAID).

Proiectul USAID PHH, 2007

 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Cuprinsul
Nr. Denumire Pag.

CONSIDERAII GENERALE.......................................................................6

1. ETIOLOGIA...............................................................................................9
1.1. Virusul hepatitei B (VHB)................................................................................................................................... 9

1.2. Virusul hepatitei C (VHC)................................................................................................................................ 23

1.3. Virusul hepatitei D (VHD)............................................................................................................................... 29

1.4. HEPATITELE VIRALE PARENTERALE NON B, NON C..................................................................32

2. EPIDEMIOLOGIA....................................................................................34
2.1. Epidemiologia hepatitelor virale pe plan global...........................................................................................34

2.2. Epidemiologia hepatitelor virale B, C i D n Republica Moldova...........................................................36

2.3. Date epidemiologice..........................................................................................................................................38

3. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE....................43


3.1. Diagnosticul serologic al hepatitelor virale..................................................................................................43

3.2. Diagnosticul biochimic al hepatitelor virale.................................................................................................54

4. METODE DE DIAGNOSTIC DE LABORATOR...........................................76


4.1. Metoda ELISA...................................................................................................................................................... 76

4.2. Diagnosticul molecular biologic al hepatitelor ...........................................................................................82

4.3. Metode de testare rapid.................................................................................................................................88

4.4. Teste de confirmare........................................................................................................................................... 89

4.5. Metode de diagnostic clasice........................................................................................................................... 90

5. CONTROLUL CALITI INVESTIGAILOR DE LABORATOR..................91

6. CERINE DE SECURITATE BIOLOGIC PENTRU


LABORATOARE MEDICALE....................................................................99
6.1. Codul de practici................................................................................................................................................ 99

6.2. Echipamentele de laborator...........................................................................................................................101

6.3. Manipularea deeurilor....................................................................................................................................102

SURSE BIBLIOGRAFICE..............................................................................104

Anex. ALGORITMUL DE DIAGNOSTIC AL HEPATITELOR VIRALE...........108

Instruciuni metodice 
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

SUMAR
Actualitatea instruciunilor metodice DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATI-
TELOR VIRALE B, C i D este argumentat prin analiza ampl a datelor literaturii de specialitate
din care se constat, c n ultimii ani, se atest creterea prevalenei prin hepatitele virale B, C i
D n plan global. n acest context, Organizaia Mondial a Sntii (OMS) a declarat fenomenul
n cauz de o importan primordial, iar cercetrile efectuate n direcia dat de o semnificaie
major. OMS recomand, ca n rile cu o morbiditate nalt a hepatitelor virale s se efectueze o
monitorizare complex a hepatitelor virale, n special a celor parenterale, cu declararea datelor
obinute n aceast instan pentru aprecierea impactului problemei n plan mondial.
n aceste instruciuni sunt descrise metodele actuale a diagnosticului de laborator al hepati-
telor virale B, C i D, cu reflectarea i unor aspecte ce in de epidemiologia, etiologia i patogene-
za hepatitelor virale. Ele au drept scop punerea la dispoziia specialitilor din domeniu materialul
documentar necesar adoptrii i utilizrii unei metodologii tehnice unificate i corecte de dia-
gnosticare a hepatitelor virale, ceea ce, n consecin, va contribui la consolidarea sistemului de
diagnostic i supraveghere epidemiologic a hepatitelor virale, fcnd posibil aplicarea msurilor
de prevenire i control precoce i eficiente.

DESTINAIA
Instruciunile metodice DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B,
C i D sunt destinate pentru specialitii instituiilor medico-sanitare publice, departamentale,
private i din cadrul Centrelor de Medicin Preventiv. Aceste instrucii metodice au menirea
de a fi un suport n lucrul de rutin pentru medicii microbiologi, medicii laborani, infecioniti,
hepatologi, epidemiologi, rezideni i ali specialiti care se preocup de problemele de diagnostic
de laborator al hepatitelor i n special de metodele contemporane de testare imunologic i
supraveghere epidemiologic a hepatitelor virale. Instruciunile metodice, de asemenea, vor fi
utilizate ca material didactic pentru instruirea cadrelor postuniversitare n diagnosticul de labo-
rator al hepatitelor virale la facultatea de perfecionare a medicilor, a rezidenilor i studenilor
n instituiile medicale de nvmnt superior i mediu.
Instruciunile date vor putea fi ulterior modificate i adaptate la cerinele curente ale insti-
tuiilor medicale de profil, reieind din evoluia situaiei epidemice prin hepatitele virale, ct i
apariia de metode noi de diagnostic al hepatitelor virale cu performarea lor, pe msura acumu-
lrii de noi informaii privind metodele de diagnostic, profilaxie i tratament.

 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

ABREVIERI
nr. abrevieri Denumire deplin
1. Ac anticorp
2. ADN acidul dezoxoribonucleic
3. ADCC antibody dependent cell cytotoxicity = citotoxicitate dependent de anticorpi
4. ADN-CCC covalently closed circular ADN circular nchis covalent
5. Ag antigen
6. AgHBs antigen HBs
7. AgHBc antigen HBc
8. AgHBe antigen HBe
9. AgHCV antigen HCV
10. AgHDV antigen HDV
Ag pre-S1, pre-
11. antigen pre-S1, pre-S2
S2
12. AgHBx antigen HBx
13. AgHBpol antigen HB polimeraza
14. ALT alaninaminotrasferaza
15. Anti-AgHBs anticorpi AgHBs
16. Anti-AgHBc anticorpi AgHBc
17. Anti-AgHBe anticorpi AgHBe
18. Anti-HCV anticorpi HCV
19. ARN acidul ribonucleic
20. AST aspartataminotransferaza
21. BL bilirubina liber
22. BC bilirubina conjugat
23. e.c.p. efect citopatic
24. EIA enzime immunoassay teste imunoenzimatice
25. ELISA enzyme linked immunosorbent assay - test cu enzime legate de imunosorbeni
26. FA fosfataza alcalin
27. GGT gamaglutamiltranspeptidaza
28. HA hemaglutinare
29. HAI hemaglutinoinhibare
30. HAP hemaglutinare pasiv
31. IB indicele bilirubinei
32. IFA imunofluorescen
33. IFN interferon
34. IRES internal ribosome entry site situs intern de ncepere a translaiei
35. Ig imunoglobulin
36. IME imunomicroscopie electronic
37. LDH lactatdehidrogenaza
38. NK natural killer
39. ME microscopie electronic
40. PCR (polymeraze chain reaction) reacie de amplificare genomic cu ajutorul polimerazei
41. RFC reacie de fixare a complementului
42. RIA (radioimmunoassay) - radioimunoanaliz
43. RHAI reacia hemaglutinare indirect
44. RIF reacia imunofluorescent
45. TNF- Tumor necrosis factor-alpha
46. TP timpul protrombinic
47. TTP timpul tromboplastinei pariale
48. UI uniti internaionale
49. UDF enzima uridilfosfat
50. VHA Virusul hepatitei A
51. VHB Virusul hepatitei B
52. VHC Virusul hepatitei C
53. WB Western blot
Instruciuni metodice 
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

CONSIDERAII GENERALE
Importana serviciului de laborator i necesitatea investigaiilor de laborator.
Particularitatea principal a medicinii clinice contemporane devine vdit prin utilizarea pe
larg a tehnologiilor diagnostice de laborator nalt performante, care sunt vertiginos implemen-
tate n practica medical.
Utilizarea pe larg a metodelor noi de diagnostic, suficient de diversificate i modernizate, a
schimbat totalmente conceptul privind etiologia i patogeneza multor maladii infecioase. Mai
mult dect att, baza tehnologic curent de diagnostic permite medicului contemporan de a
efectua operativ modificrile de rigoare n schemele de tratament, de a crea i elabora programe
eficiente pe termen lung, aplicnd msuri curative i de reabilitare mult mai eficiente, n special
pentru pacienii cronici cu recidive, infecii autoimune i procese tumorale.
Necesitatea elaborrii, aplicrii metodelor noi de diagnostic de laborator este dictat i de faptul
c n ultimul timp profilul bolnavilor infecioi se schimb esenial. Crete numrul formelor clinice
terse, atipice, trenante, tot mai des se depisteaz pacieni cu infecii mixte bacteriene i virale.
Astfel, medicina contemporan pune n faa medicului de laborator mai multe probleme:
1. stabilirea diagnozei n baza rezultatelor investigaiilor de laborator;
2. controlul eficacitii tratamentului (monitorizarea tratamentului);
3. determinarea gradului de rezisten la medicamentele utilizate i corijarea schemelor
de tratament;
4. evaluarea eficienei tratamentului i elaborarea pronosticului.
La toate etapele lor, aceste probleme n mare msur pot fi rezolvate prin efectuarea tes-
telor de laborator contemporane, nalt performante, la care se afiliaz metodele de imuno i
genodiagnostic, reflectate n aceste instruciuni metodice.

HEPATITELE. Definiie.
Hepatitele (inflamaia ficatului) constituie una dintre problemele majore de sntate public,
datorit rspndirii globale, endemicitii, morbiditii i mortalitii crescute, ct i ratei nalte
de invaliditate consecutiv cronicizrii infeciei.
Hepatitele virale reprezint o grup de infecii, rspndite larg, cu mari variaii n diferite
regiuni. Ele depind, n mare msur, de factorii socioeconomici i de starea sistemului medico-
sanitar; ct i de factorii mediului extern (ap, alimente ex. HAV i HEV), cu un impact socio-
economic inestimabil.
Infecia viral a ficatului, caracterizat prin tabloul clinic de tip infecios (febr, anorexie, stare
general alterat nsoit de sindrom icteric) poate fi cauzat de numeroase virusuri. ncepnd cu
1970, cnd a fost identificat virusul hepatitei B, pn n prezent au fost descoperite i caracteri-
zate circa 10 forme nozologice independente, cu tropism primar specific pentru hepatocit, ns
cu diferit apartenen taxonomic, denumite virusuri hepatotrope.
Unele virusuri hepatotrope, precum v. hepatitei F i v. hepatitei G nc nu au fost sufici-
ent caracterizate.
Hepatita poate fi provocat i de ali ageni de origine viral, precum v. herpetic, v. citomegalic,
v. rubeolic, v. amaril, etc. - virusuri non-hepatotrope.
Cele cinci tipuri de hepatit viral acut, dei cu simptomatologie clinic, leziuni histologice
i teste biochimice hepatice similare se deosebesc esenial prin modul de transmitere, prin
gravitatea procesului patologic i, n special, prin potenialul evolutiv spre hepatit cronic, ciroz,
hepatocarcinom.

 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Conform datelor OMS, hepatitele virale B sunt unele din cele mai rspndite patologii infec-
ioase din lume.Aproximativ 30% din populaia globului (circa 2 mlrd de oameni) prezint semne
de infecie, induse de VHB. La nivel global, se estimeaz peste 350 milioane de purttori cronici
ai VHB, echivalentul a mai mult de 5% din populaia globului. Dintre ei, 25% (cca 1 milion) dece-
deaz anual din cauza hepatitei virale B sau a complicaiilor asociate cu aceasta. Totodat, VHB
este responsabil, n 80% de cazuri, de carcinom hepatocelular, constituind, dup tutun, al doilea
agent cancerigen. Hepatita viral B este considerat a 9-a cauz a mortalitii n lume.
Nu mai puin distrugtor este rolul VHC, virus transmis parenteral, unul din factorii de risc
principali fiind utilizarea intravenoas a drogurilor. OMS estimeaz c actual circa 3% din popu-
laia globului este infectat cu VHC, care, de asemenea, prezint o problem major a sntii
publice. Majoritatea persoanelor infectate cu VHC nu prezint simptome sau acuze n fazele
timpurii ale maladiei i, astfel, nu cad sub incidena supravegherii, ns ele prezent un risc i o
surs de infectare major pentru alte persoane. Existena diferitor subvariante a VHC, distribuite
neuniform pe tot globul, cu o sensibilitate diferit fa de tratamentele antivirale, creeaz dificul-
ti mari n vederea stabilirii unei diagnoze corecte i la timp a HVC.
Pentru Republica Moldova hepatitele virale reprezint mai mult dect o prioritate a domeniului s-
ntii publice. Acestea constituie o problem complex, care afecteaz toate componentele societii i
la soluionarea creia este necesar mult competen, nalt profesionalism suplinit cu o baz material
i tehnic eficient.

Scurt istoric
Primele meniuni despre hepatitele virale, denumite iniial i ca icter cataral, icter contagi-
os au aprut cu foarte mult timp n urm, ele datnd din anul 750 (e.n.). Pe parcursul secolelor
au fost observate ictere febrile care se declanau epidemic n timpul rzboaielor i care erau
denumite boal militar sau icter soldesc. Ulterior, afeciunea a fost observat i ntre pe-
rioadele de epidemii, fiind cunoscut sub numele de icter infecios benign.
n 1883, Lurman descrie pentru prima dat hepatita cu transmitere parenteral. n paralel,
studii mai ample, privind geneza hepatitelor, au fost fcute i de medicul rus Botchin, care a re-
cunoscut caracterul contagios al hepatitelor. Astfel, o perioad ndelungat, toate hepatitele de
origine infecioas erau denumite Boala Botchin.
n cel de-al doilea rzboi mondial, hepatita viral a provocat o adevrat epidemie (a cuprins
foarte multe teritorii i ri) - numai n armata german au fost depistate peste 6.000.000 de
cazuri. Acestea, de multe ori, fiind asociate cu vaccinarea antiamaril (febra galben), ce coninea
ser uman care, probabil, provenea de la un purttor aparent sntos de virus hepatic B.
n a 2 jumtate a sec. XX se face deja diferenierea dintre hepatitele care se transmit enteral
cu hepatitele care se transmit parenteral (prin sngele infectat).
Un aport enorm n studierea genezei hepatitelor virale a adus-o B. Blumberg. n 1963 el
descoper n sngele unui aborigen din Australia un antigen nou, denumit antigen australian,
care, mai trziu a fost identificat ca antigen viral de suprafa (AgHBs).
Consecutiv, la bolnavii hemofilici au fost descoperii i anticorpii fa de AgHBs. Sistemul Ag-
Ac detectat a fost asociat cu hepatita, care aprea foarte des la aceti pacieni dup transfuzii de
snge. n 1976, Blumberg primete Premiul Nobel pentru aceast descoperire i pentru aportul
adus n studiul hepatitelor virale.
Civa ani mai trziu, Prin a expus prerea precum c, antigenul australian reprezint mar-
cherul serologic al hepatitei virale B.
n sfrit, n anul 1970, la microscopul electronic a fost descoperit i vizualizat direct n serul
sangvin al unui pacient virusul hepatitei virale B (VHB) cu antigenul de suprafa, ulterior fiind
numit particula Dane, dup numele cercettorului care l-a descoperit.

Instruciuni metodice 
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

n 1973 este descoperit AgHBe.


n 1974 a fost izolat genomul VHB. Iar la sfritul anilor 70 a fost descifrat consecutivitatea
primar a nucleotidelor n genomul VHB.
n paralel, au fost descoperite celelalte virusuri hepatice: A, C, D, E i altele, care sunt nc n
studiu.
Astfel, n anul 1989 a fost descoperit virusul hepatitei C (VHC) i n anul 1990 virusul hepa-
titei E (VHE), care au dus la dezmembrarea i la sfritul noiunii de hepatit non-A, non-B.
n 1991 s-a stabilit un nou cadru nozologic al maladiilor hepatice, care include cinci entiti
distincte de hepatite virale (HVA; HVB; HVD; HVC; HVE), determinate de cinci virusuri particu-
lare, cu marcheri specifici proprii:VHA,VHB,VHD,VHC i VHE.

Tabelul 1. Agenii cauzali ai hepatitelor virale


Fam. Fam. Fam. Fam.
V. defectiv
Picornaviridae Hepadnaviridae Flaviviridae Caliciviridae (?)
v. hepatitei A v. hepatitei B v. hepatitei C v. hepatitei v. hepatitei E
(VHA) (VHB) (VHC) delta (VHD) (VHE)

Tabelul 2. Principalele caracteristici ale infeciilor provocate de virusurile hepatice

Virusul VHA VHB VHC VHD VHE VHG


Evoluia Acut Cronic Cronic Cronic Acut Nedefinit
Descoperirea 1973 1965 1989 1977 1990 1996
Fecalo- Parenteral,
Calea de Sexual, Parenteral
oral, Parenteral Fecalo-oral posibil
infectare parenteral sexual
sexual sexual
Indirect prin
Vaccin Da Da Nu Nu Nu
vaccin VHB
Purttor, Purttor, Neclar.
ciroz, ciroz,
Poate
Simptome cancer cancer Pn
exacerba
Pronostic pn la 6 hepatic. hepatic. la 20% Neclar
hepatita
luni Simptome Simptome mortalitate
viral B.
extra- extra- la femei
hepatice hepatice gravide

 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

1. ETIOLOGIA
1.1.Virusul hepatitei B (VHB)
Primul component al VHB a fost evideniat n anul 1963 de ctre B. Blumberg n sngele unui
aborigen din Australia fiind denumit antigen australian i care mai trziu a fost identificat ca
antigen viral de suprafa (AgHBs). Virionul complet a fost observat prima dat n anul 1970, n
serul sangvin, de ctre Dane i colaboratorii si, ulterior fiind denumit particula Dane.
Caractere morfologice i structurale
VHB este un virus ADN (reieind din apartenena acidului nucleic viral), de form sferic, cu
diametrul de 42 nm, compus din nucleocapsida core (AgHBc), acoperit cu un nveli extern lipopro-
teic (peplos) ce conine antigenul de suprafa (AgHBs).
Figura 1. Microscopia electronic al particulelor VHB.
Virioni infecioi de 42 nm (1) (Particulele Dane). Formaiunile sferice (3) i filamentoase (2) neinfecioase. Desen
preluat www.molecular-virology.uni-hd.de

Clasificare
VHB aparine familiei Hepadnaviridae (Hepar ficat, tropism pronunat fa de hapatocite; ADN
acidul nucleic viral; viridae sufixul care determin denumirea familiei), genul Orthohepadnavirus.
Tabelul 3. Clasificarea VHB

Familia Hepadnaviridae
Genul Orthohepadnavirus (ortho drept) Genul Avihepadnavirus (avium pasre)
- v. hepatitei B (VHB) virus care provoac - v. hepatitei B al raei de Peking DHBV (duck
hepatita viral la om i animale; hepatitis B virus);
- v. hepatitei marmotei WHV (wood-chuck
- v. cocostrcului gri HHBV (heron hepatitis B
hepatitis virus);
virus).
- v. hepatitei veveriei GSHV (ground squirrel
hepatitis virus).

Particularitatea principal a tuturor virusurilor din familia Hepadnaviridae este prezena vi-
rionului cu un nveli extern, ce conine ADN circular bi-catenar, parial monocatenar
i prezena ADN-polimerazei virale care are activitate de reverstranscriptaz. Manifest un
tropism nalt pentru celulele hepatice (hepatocite), cantiti mici de virusuri hepatice ADN, ns,
pot fi gsite i n rinichi, pancreas i celulele mononucleare.

Instruciuni metodice 
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Relaii virus celul gazd


A. Cultivare (In vitro) Pn n prezent nu s-a reuit cultivarea VHB n culturi celulare. S-au
fcut unele ncercri, utilizndu-se:
- culturi primare de hepatocite umane adulte i fetale, dar ele au fost utile doar pentru studierea etapelor
de nceput al replicrii virale;
- linii stabilizate de hepatom celular (HepG2, HuH7), transfectate cu clone de ADN VHB re-combinant.
S-a observat eliberarea n mediul de cultur a proteinelor HBs, HBe, HBc, a nucleocapsidelor i
particulelor Dane. n aceste sisteme au fost investigate secvenele transcrierii VHB.
Pe motiv, c celulele infectate cu VHB nu prezint alterri tipice sau e.c.p., iar nivelurile de
virus sunt minime, pentru moment, cultivarea VHB nu este utilizat n scopuri de diagnosticare.
B. Animale (in vivo). Virusurile hepatice au un spectru de gazde foarte limitat. Gazda natu-
ral pentru VHB este omul. Sunt susceptibile infeciei experimentale i unele specii de maimue
(cimpanzei, giboni). Hepatita care apare la cimpanzei este similar celei din cazul omului, dar are o
severitate medie, cu prezena AgHBs n ser; AgHBs i AgHBc n ficat; secvenelor de ADN VHB
n extractele hepatice.
Morfologia i proprietile fizicochimice a VHB
VHB este un virus pleomorf. n serul unui bolnav cu hepatit viral B, cu ajutorul microsco-
pului electronic, se pot determina 3 forme morfologice distincte:
a) Virionul complet (particula Dane) particule de form sferic, cu dimensiuni de 42 nm,
nvelit cu o membran extern bilipidic de aproximativ 4 nm grosimea, ce conine lipide deriva-
te din celula gazd i toate genele polipeptidei S; proteinele de suprafa L (largi), M (mijlocii) i S
(mici). Uneori, n formele tubulare ale virionului, proteina de suprafa se poate amplasa la margi-
nea particulei virale. Virionii complei reprezint circa 7% din numrul total al particulelor virale
i pot atinge o concentraie de 1010 virioni infecioi/ml n serul bolnavilor sau purttorilor.
Particulele Dane sunt structuri infecioase, prezena lor n ser reprezint un
indicator de multiplicare viral activ.
Figura 2. Formele morfostructurale a VHB
Virion complet,
form tubular

Particule sferice
Particule
filamentoase Virion complet

Hepatocitele infectate pe lng virionul complet, infecios mai poate produce n exces i alte
forme virale neinfecioase compuse din structuri ale nveliului viral (AgHBs). Astea sunt:
b) Particulele sferice cu dimensiuni mici, de 17-25 nm, formate din structuri ale nveliului
viral (HBs), goale n interior. n serul bolnavilor structurile date se observ cel mai frecvent. n
unele cazuri de hepatit cronic fiind singurul tip de particule detectate, ating o concentraie de
1013 particule/ml ser, depind cu mult cantitatea particulelor virale complete.
c) Particulele filamentoase de 22 nm n diametru i 50-230 nm n lungime, identice cu
formele tubulare de virion, formate n rezultatul agregrii particulelor sferice. Se ntlnesc n
cantiti mult mai mici. Ele pot conine AgHBs.

10 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Particulele sferice i filamentoase, spre deosebire de particulele Dane sunt lipsite de acid
nucleic, de aceea sunt neinfecioase. ns ele sunt nalt imunogene, astfel prezena lor n organis-
mul persoanelor infectate induc formarea/sinteza anticorpilor neutralizani anti-HBs n titre de
protecie. Anume acest antigen este utilizat n producerea vaccinurilor mpotriva hepatitei virale
B, care asigur o nalt protecie.
Titrul virusului n sngele pacientului poate varia de la < 104/ml i >109/ml.
Particule infecioase

Particul 42-47 nm. Membrana extern conine lipide i


trei forme de AgHBs;
1.Virion complet (Particula Dane)
Nucleocapsida de 27 nm conine circa 180 de copii de
proteine core, ADN VHB i ADN-polimeraza.

Particule neinfecioase

Filamente sau sfere de 22 nm de diferit lungime,


2. Particule sferice conin lipide i, n special, una din formele AgHBs, de
3. Particule filamentoase obicei, prezent n exces de 10 000 - 1 000 000 mai
mult dect particulele Dane

Virionul complet
Virionul complet (particula Dane) este format din dou subuniti structurale: nucleoca-
psida (centrul viral) i nveliul viral, care se pot desface n pri componente sub aciunea
detergenilor neionici.
Figura 3. Modelul 3-D (tridimensional) al particulei virale complete VHB
VHB este de mrime mare de circa 3 ori mai mare dect
molecula de hemoglobin uman. Ca i genomul uman, ge-
nomul VHB este compus din ADN circular bicatenar, parial
monocatenar, inclus ntr-o membrana proteic - capsida de
simetrie icosaedric, nvelit la rndul su de o membra-
na extern, supracapsid, format din dublu strat lipidic cu
spicule (proeminene) glicoproteice, derivat din comparti-
mentele celulei gazd.
www.molecular-virology.uni-hd.de

1. Nucleocapsida viral (core) reprezint centrul electronodens cu contur


hexagonal, cu dimensiuni de 28 nm i include genomul viral (ADN), enzima ADN-polimeraza (cu
funcie i de reverstranscriptaz) i proteina principal a centrului viral - o fosfoprotein bazic-
C de 21 kD denumit antigenul core al VHB (AgHBc).
Genomul viral
Este reprezentat de o molecul mic de ADN circular, bicatenar, parial monocatenar
de 3,2kb. Catena de sens negativ mai lung (L) conine 3200 nucleotide. Catena de sens pozitiv mai
scurt (S) conine numai 1100-2600 nucleotide. Diferena de lungime dintre ambele catene de-
termin existena unui segment monocatenar.
Capetele 3 i 5 ale catenei L sunt constante, iar captul 3 ale catenei S poate fi variabil. Ca-
tenele sunt complementare n poziiile fixe 5 (regiune coeziv) aceasta asigurnd circularizarea
genomului. Ambele capete coezive ale extremitii 5 prezint secvenele repetitive DRs (direct

Instruciuni metodice 11
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

repeat), comune tuturor hepadnavirusurilor. Ei servesc ca iniiatori ai replicrii, fiind primeri pen-
tru sinteza secvenelor ADN respective i asigur integrarea n hepatocite. Captul 5 a catenei
S este legat de o secven ARN capuonat, care are rolul de iniiator al sintezei celei de a doua
caten ADN. Genomul VHB se afl de regul extracromozomial ca epizom liber, dar i integrat n
cromozomul gazdei. Secvenele integrate sunt caracteristic prezente n cancerul primar i rareori
n hepatitele cronice.
Organizarea genomului
Genomul VHB are o organizare foarte compact i conine 4 gene care se suprapun par-
ial i sunt exprimate ca 4 ORF (open reading frames) - regiuni deschise citirii: S, C, P i X, care
codific mai multe proteine, 4 fiind mai importante, precum proteinele nucleocapsidei virale (core), po-
limerazele virale, antigenii de suprafa (preS1, preS2 i S) i proteina X (proteina nonstructural).

Figura 4. Structura genomului VHB

Cele 4 ORFs (pre-C/C, pre-S1/pre-S2/S, P i X)


indicate n centru:
Gena core (C) codific capsida proteic.
Gena P codific ADN polimerasa viral.
Gena X codific proteina X cu funcii complet neelucdate.
www.molecular-virology.uni-hd.de

Gena S codific proteinele de suprafa a nveliului viral - AgHBs. Este format din trei regiuni:
S, pre-S1 i pre-S2. Regiunea S codific proteina SHBs (small- mic), regiunile pre-S2 i S codific
proteina MHBs (middle - mijlocie), regiunile pre-S1, pre-S2 i S - proteina LHBs (large - larg).
Regiunea S este mult mai stabil dect regiunile pre-S1 i pre-S2 n care pot aprea mutaii punc-
tiforme, deleii i rearanjamente. Aceste fenomene apar mai frecvent n hepatitele cronice.
Gena C codific proteinele structurale a nucleocapsidei virale HBc (core) i AgHBe. ORF-ul
corespunztor genei C; conine 2 codoni start, ce constituie regiunea pre-C i un codon stop
comun. Primul codon start codific proteina precursoare HBe, care este secretat n ser ca AgHBe.
Mutaiile din regiunea pre-C duc la dispariia AgHBe din ser, dei multiplicarea viral poate exista.
Al doilea codon start codific proteina capsidal P22C/HBc. Mutaiile n regiunea C i pre-C sunt
asociate cu o evoluie grav a infeciei hepatice, n special cu hepatit fulminant.
Gena P codific ADN-polimeraza viral, particip la copierea ARN n ADN i ADN n ARN, joac rol
de reverstranscriptaz i de ribonucleaz, ns nu poate ndeplini funcii i de integraz (spre deosebire
de reverstranscriptaza HIV). Posed o regiune terminal care este legat covalent de ADN genomic.
Gena X codific proteina HBX, legat de captul 5 al catenei L, prezent numai la hepadna-
virusurile mamiferelor, rolul creia pe deplin nu este elucidat.
Genomul viral mai conine i regiuni de reglare a expresiei sale: 4 promotori activatori, semnal
de poliadenilare, secvene DR1 i DR2.
Capsida
Capsida este de simetrie icosaedric, conine 180 sau 240 capsomere, format dintr-un
singur tip de protein, proteina centrului viral HBc (P22C), care se leag de genomul viral, cu funcii
de proteinkinaz i rol de autofosforilare. Structural este format din dimeri legai prin puni
disulfidice.

12 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Capsida conine ADN-polimeraza viral care funcioneaz ca reverstranscriptaz ce transcrie


ARN pregenomic n catena de sens negativ a ADN. Alte roluri al ADN-polimerazei: a) iniierea
replicrii; b) enzim tip ARN-az pentru degradarea hibridului ARN ADN.
2. nveliul viral (supercapsida) are o grosime de 7 nm i se evideniaz la exteriorul
virionului. Este constituit din dublul strat lipidic i glicoproteine (proteinele de suprafa), proemi-
nente pe suprafaa membranei ca nite spiculi.
a) Dublul strat lipidic este derivat din compartimentele celulare interne. Asamblarea virioni-
lor are loc la nivelul reticulului endoplasmatic i nu din membrana plasmatic;
b) Proteinele de suprafa HBs:
1. Proteina mic S (small) SHBs (24kD) conine doar domeniul S (de suprafa) care
poate fi ca o structur glicozilat (GP27) sau neglicozilat (P24 kDa). Proteina conine trei seg-
mente hidrofobe, dintre care dou traverseaz stratul bilipidic i dou segmente hidrofile, unul
din care conine determinanii principali (antigenici) de grup i de subtip.
AgHBs - este un dimer alctuit din dou molecule de SHBs legate prin puni disulfidice. Este
partea component a particulelor sferice goale din ser i responsabilul major al antigenicitii.
2. Proteina mijlocie M (middle) MHBs (31kD) conine doar domeniile S i pre-S2,
este glicozilat i prezent n dou forme GP33 i GP36. Domeniul pre-S2 favorizeaz ataarea
virionului de celul prin intermediul serumalbuminei i posed un epitop cu imunogenitate
nalt.
3. Proteina mare L (large) LHBs (39kD) conine domeniile S, pre-S1 i pre-S2. Se g-
sete n form glicozilat GP42, ct i neglicozilat P39, lungimea proteinei fiind variabil n func-
ie de subtip. Domeniul S1 contribuie la ataarea virusului de hepatocit. Proteina L, se presupune,
c particip la asamblarea viral i este responsabil de infeciozitatea viral.
Aceste trei glicoproteine ale nveliului viral au o distribuie neuniform la particulele
virale ale VHB. Particulele subvirale (filamentoase sau sferice) de 22 nm sunt compuse predo-
minant din proteinele S, cu cantiti variabile de proteina M i foarte puin proteina L (circa
300-400 proteine S i 40-80 proteine M i L). n schimb, particulele virale complete sunt pre-
dominant compuse din proteinele L. Proteina L conine un domeniu, creea i revine funcia
de receptor de recunoatere, care faciliteaz ataarea eficient de receptorii superficiali ai
celulei gazd.
Proteinele HBs (de suprafa) sunt structurale, dar datorit reproducerii lor n exces,
(n cantiti de 103 mai mult dect virionii) sunt secretate n ser, unde circul liber i pot fi con-
siderate ca proteine secretate.
Proteinele nestructurale
Proteina HBe nu face parte din structura virionului, fiind protein secretat, sintetizat de
regiunea genomic pre-C i nu este necesar pentru multiplicarea VHB. Este eliberat din celul
n form de structuri polipeptidice de 22 kDa i 16 kDa, nu are tendin spre autoasamblare.
Mutaiile n regiunea pre-C nu inhib replicarea viral. Rolul proteinei HBe: imunomodulator al
rspunsului fa de hepatocitele infectate. De asemenea, proteina HBe poate fi implicat n regla-
rea expresiei, asamblrii i secreiei proteinelor centrului viral.
Proteina HBx este prezent doar n genomul hepadnavirusurilor proprii mamiferelor.
Acioneaz ca transactivator, asigurnd creterea expresiei AgCMH I i AgCMH II. Este stimulator,
n nivel sczut, al oncogenezei VHB.
Structura antigenic
Proteinele virale alctuiesc un complex de antigene, prezena crora n organism evolueaz
specific, n dependen de etapele i formele clinice al infeciei, n funcie de rspunsul imun al
gazdei.

Instruciuni metodice 13
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

1) AgHBs - antigenul de suprafa corespunde celor trei proteine membranare de su-


prafa HBs, este foarte imunogen i induce producerea de anticorpi anti-HBs. AgHBs, un
antigen foarte heterogen, este format din dou tipuri de antigene:
a) Ag specifice comune de grup a, localizate pe secvena aminoacizilor 124-137 i 139-147 a AgHBs
sub forma a dou bucle, inta Ac neutralizani.
b) Dou perechi de antigene de subtip:
- d/y specifice aminoacidului n poziia 122;
- r/w specifice poziiei 160 de arginin sau lizin. Subtipul w include i cteva subvariante: w1, w2, w3, w4.
Perechile d/y i r/w se exclud reciproc una pe alta, iar prin combinarea lor se formeaz
9 serotipuri majore, dintre care mai frecvent ntlnite sunt patru: adw, ayw, adr i ayr.
Determinarea serotipurilor are importan epidemiologic, ele avnd o distribuie geografi-
c diferit. n SUA, Europa de Nord, Asia i Oceania se ntlnete frecvent determinanta d,
mai rar - determinanta y. n Japonia, determinanta d practic domin prezena determinantei y.
n Africa, Australia (regiunile aborigene), India, regiunea Mrii Mediteraneene - determinanta
y e ntlnit mai frecvent, n timp ce d - foarte rar. n Europa, SUA, Africa, India, Australia
i Oceania - predomin determinanta w. n Japonia, China i Asia de Sud-Est - predomin
determinanta r.
Subvariantele adw, ayw i adr sunt cele mai rspndite geografic. Subvarianta ayr se ntl-
nete foarte rar, fiind comun doar pentru o mic populaie din Oceania.
Variaiile n antigenele nveliului VHB reprezint mutaii punctiforme, aprute n gena S,
prezente, n special, la persoanele vaccinate sau tratate cu anticorpi specifici mono sau po-
liclonali. Aceasta explic eecul n vaccinare a unor persoane; apariia hepatitelor cu AgHBs
negative i dificultile ce survin n diagnosticarea acestor mutaii.
AgHBs apare n ser la a 4-6 sptmn dup infectare i dispare la aproximativ 3 luni
de la debut, ce coreleaz cu nsntoirea. Se determin n toate secreiile organismului, n
esutul hepatic, limfatic i lipidic. Prezena AgHBs pe o durat mai mare de 6 luni confirm
persistena infeciei.
2) AgHBc antigen unic, se gsete n virionul complet i n nucleocapsidele neasam-
blate din nucleul hepatocitelor infectate. Poate fi detectat la purttorii sntoi cu hepatite
cronice active n nucleul i citoplasma hepatocitelor. n ser nu se determin n stare liber,
doar ca component intern al particulelor virale. Rar poate fi evideniat sub form de com-
plexe imune Ag-Ac. n nucleul hepatocitelor infectate AgHBc este determinat la aproximativ
10 zile de la infectare.
3) AgHBe asociat nucleocapsidei, identificat i ca antigen solubil. Este reprezentat
de dou tipuri de antigene: AgHBe1 i AgHBe2. Epitopii AgHBe1 sunt expui pe suprafaa
capsidei, iar epitopii AgHBe2 sunt situai n centrul nucleocapsidei, astfel c anticorpii fa
de AgHBe1 reacioneaz numai cu proteina asamblat, iar cei fa de AgHBe2 recunosc
proteina numai dup distrugerea centrului viral. Mutaiile din regiune genomic pre-C/C se
ntlnesc rar, aceste secvene fiind bine conservate. n special, mutaiile n regiunea dat se
observ n cazurile cu infecie cronic cu VHB. AgHBe este prezent n ser n perioada de
incubaie, imediat dup apariia AgHBs i dispare dup 2-4 sptmni, nainte de dispariia
AgHBs. Prezena AgHBe indic o replicare viral activ. Persistena ndelungat n ser determin
pronostic nefavorabil.
4) AgHBx este mai puin studiat. Posibil este implicat n transformarea oncogen a he-
patocitelor.
5) ADNul viral - persistena ndelungat indic infecie cronic. ADNul viral apare
n ser odat cu antigenele virale. Dispare din ser la nceputul celei de a doua sptmni a
perioadei de stare a infeciei acute.

14 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Tabelul 4. Nomenclatura infeciei cu VHB


Virion complet (particula Dane) de 42 nm, const din
anvelopa extern (peplos, supracapsida) de 7 nm grosime
Virusul hepatitei B
VHB i un centru viral (nucleocapsida, core) de 27 nm.
(virion infecios complet)
Centrul viral este compus din ADN circular bicatenar,
parial monocatenar i polimeraza ADN viral.
Complexul determinantelor antigenice, denumit i antigen
Antigenul de suprafa australian (Au) sau antigen asociat hepatitei virale (HAA).
AgHBs
al virusului hepatitei B Se gsesc pe suprafaa VHB sub form de particule sferice
de 22 nm sau particule tubulare.
Antigenul core al Antigenul specific asociat centrului viral al VHB (core) de
AgHBc
virusului hepatitei B 27 nm.
Determinanta antigenic este strns asociat cu
Antigenul e al virusului
AgHBe nucleocapsida VHB. De asemenea circul ca protein
hepatitei B
solubil n serul bolnavului.
Anti-HBs
Anticorpi fa de AgHBs, Anticorpii specifici care sunt produi ca rspuns la
Anti-HBc
AgHBc, AgHBe determinantele antigenice (epitopii) respective.
Anti-HBe

Variabilitatea genetic
Genomul VHB este relativ stabil, ns secvenierea ADN-ului mai multor virusuri hepatice
din diverse regiuni ale globului a confirmat existena mai multor genotipuri, care difer dup
structur i funcie i dup distribuia geografic. Actual, se cunosc minimum 8 genotipuri, care
difer dup proprietile de replicare, dup modul de expresie i recunoatere a epitopilor
imuni, i care, la rndul su, difer dup formele de manifestare a infeciei. Genotipurile A, B,
C i D sunt preponderent rspndite n Europa Central i SUA, pe cnd genotipurile B i C
prevaleaz n Asia, iar genotipul D se nregistreaz n regiunea Mediteranean i India. Genotipul
A i E prevaleaz n Africa, iar F-H se detecteaz n America Central i de Sud. Genotipurile A
i F sunt segregate la rndul su n 2 subgenotipuri, iar B i C n 4 subgenotipuri.
n caz de confecie simultan cu diferite variante, recombinri ntre genotipuri pot avea loc
n regiunile pre-core i core al VHB. Mutaii minore de tip shift antigen pot avea loc n diferite
regiuni ale genomului, ele modificnd ntr-un fel sau altul formele infeciei. Mutaiile n genomul
VHB pot influena seroconversia AgHBe i, n general, evoluia infeciei. La pacienii AgHBe
pozitiv, genotipurile A i B sunt mai sensibile la interferon dect genotipul D i C.
Repartizarea genotipurilor VHB n lume

Instruciuni metodice 15
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Variaiile virale apar mai frecvent n infecia hepatic cronic n urma mutaiilor sau deleiilor
genetice n regiunile pre-C/C. Unele mutaii pre-C/C se asociaz cu hepatite fulminante i fluctua-
ii mari ale aminotransferazelor. n infecii cauzate de tulpini mutante ale VHB, AgHBe poate lipsi.
n cazurile de exces de anticorpi serici (nou-nscui de la mame purttoare de AgHBs, per-
soane vaccinate sau crora li s-au administrat -globuline) se determin variante virale mutante
ce scap de supravegherea imun i ele pot fi transmise accidental, prin transfuzii sau transplant
de organ ctre alte persoane.

Importana cunoaterii genotipurilor hepatice reiese din rspunsul diferit


pe care acestea o atest fa de tratamentul antiviral. Hepatitele cauzate de
genotipurile asiatice B i C rspund mai greu la tratamentul cu IFN i derivatele
sale, n timp ce hepatitele cauzate de genotipurile europene i americane rspund
mai bine la terapia antiviral.

Multiplicarea viral
Datele referitor la replicarea VHB au fost obinute prin transfecia in vivo a unor animale
sensibile inoculate intrahepatic cu ADN VHB (cimpanzei, rae) i in vitro prin infectarea unor linii
celulare continue de hepatom celular (Hep G2, Hu H7, LMH). Se disting urmtoarele etape a
replicrii virale:
Figura 4. Ciclul de replicare al VHB

Sursa: http://content.nejm.org/cgi/content/full/350/11/1118

A. Adsorbia i ptrunderea n celul. Ligandul viral care asigur ataarea la celul este
considerat proteina HBs de nveli, rolul principal aparinnd domeniului pre-S1 al proteinei
LHBs i mai puin domeniul pre-S2 al proteinei MHBs. Receptorii hepatocitelor pentru VHB
nc nu sunt identificai. Se consider c, liganzii virali se leag de albuminele serice umane po-

16 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

limerizate i ataate pe membrana hepatocitelor. n acest proces sunt implicate serumalbumina


uman, fibronectina sinusoidelor hepatice, endonexina 2 i apolipoproteina H. Apoi urmeaz
ptrunderea virionului n celul prin endocitoz, dezasamblarea virionului i capsidei, trecerea n
nucleu prin porii membranei nucleare a complexului ADN polimeraza viral.
B. Biosinteza componentelor virale. Intracelular, ADN-ul viral este convertit n form
bicatenar complet, nchis covalent, circular i suprarsucit. Transcrierea, translaia i sinteza
proteinelor se realizeaz astfel. Catena L de sens negativ este transcris n ARNm cu participa-
rea polimerazei celulare ARN II, cu funcii de:
- ARNm care codific proteinele suprafeei virale (S i X);
- ARNm, denumit pregenomic (pgARNm), care ndeplinete dou funcii: translaia proteinelor HBc,
HBe, a polimerazei virale i funcia de matri pentru ADN-ul viral. ARNm transportat n citoplasm
la nivelul ribozomilor se transleaz asigurnd sinteza proteinelor virale.
Replicarea genomului decurge n interiorul capsidei preformate, concomitent cu asam-
blarea proteinelor capsidale adunate n jurul pregenomului, inclusiv cu polimeraza viral i o
proteinkinaz. Sinteza ADN L de sens negativ are loc cu participarea ADNpolimerazei virale
pe matricea ARNm pregenomic prin reverstranscriere. Iar ARNm pregenomic este dezintegrat
de ribonucleaz i eliminat, apoi are loc sinteza catenei ADN S de sens pozitiv cu circularizarea
moleculei de ADN.
C. Asamblarea i eliberarea din celul. Asamblarea complet a virionului i obinerea
nveliului viral are loc n structurile interne ale celulei gazd. Formarea supercapsidei i mbrca-
rea nucleocapsidelor virale cu proteinele HBs decurge ntr-un compartiment intermediar ntre
reticulul endoplasmatic i aparatul Golgi pe membrane care conin proteinele HBs agregate.
Proteinele LHBs n virionul integru predomin n raportul 4/1 fa de SHBs i MHBs. Eliberarea
din celul a virionilor are loc prin exocitoz.
O particularitate a replicrii VHB este sinteza n exces a proteinelor HBs organizate ca par-
ticule sferice de 20-22 nm sau ca forme filamentoase, goale n interior, neinfecioase.

Patogeneza i imunitatea
Perioada de incubaie variaz de la 45 pn la 180 zile, n mediu 60-90 zile. Variaiile de-
pind de cantitatea virusului, modul de transmitere i rspunsul gazdei.
VHB ptrunde n organism prin diverse ci. Nimerind n torentul sangvin, virusul ptrunde
n ficat, celula hepatic devenind gazda de replicare primar. Replicarea viral dureaz circa 10-12
zile, dup care virusul se rspndete n organism, fie prin contiguitate de la celul la celul, fie pe
cale sangvin. Virusul este eliberat n torentul sangvin cauznd o viremie masiv. Hepatotro-
pismul specific nu exclude replicarea viral i n alte esuturi, organe, celule (endoteliu, epiteliu
biliar, celule acinare pancreatice, mononucleare sangvine, celule stem, mduv, suprarenale, ri-
nichi, splin, ganglioni etc.). Evoluia patogenic a infeciei este determinat de statusul imun al
organismului. Intensitatea i tipul rspunsului imun determin severitatea bolii.
Dup o perioad de incubaie ce variaz ntre 6 sptmni i 6 luni, intervin mecanismele
aprii nespecifice. IFN este responsabil de apariia febrei, mialgiei, cefaleei. Celulele NK vor
induce sinteza de IFN i apariia n niveluri crescute a IL2.

Instruciuni metodice 17
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Figura 5. Procesele imune n infecia cu VHB

Sursa: http://content.nejm.org/cgi/content/full/350/11/1118

Rspunsul celular
Iniial sunt activate limfocitele T citotoxice, activitatea crora este ndreptat spre lichidarea
hepatocitelor infectate, ca rezultat se dezvolt leziuni necroinflamatoare, aprute n urmtoarele
etape: a) declanarea apoptozei, ca urmare a interaciunii specifice Ag-limfocit; b) apariia de
focare inflamatoare, ca rezultat al secreiei de IFN de ctre limfocitele citotoxice; c) prin inter-
mediul IFN se activeaz macrofagele intrahepatice i induc un rspuns de hipersensibilitate de
tip tardiv cu aciune distructiv hepatic.
Rspunsul umoral
Imunitatea umoral este asigurat de anticorpii anti-HBs, anti-HBc i anti-HBe.
Anticorpii anti-HBs sunt Ac protectori de tip neutralizani, sintetizai fa de AgHBs, n
special fa de domeniul major, situat pe una dintre cele dou bucle a la aminoacizii 139 i 147.
Anti-HBs cauzeaz blocarea ligandului viral de ataare la receptorii celulari i n consecin indu-
ce neutralizarea infectivitii particulelor virale. Anti-HBs mpreun cu Ag virale alctuiesc com-
plexe imune care asigur eliminarea virusului, ns depunerea acestor complexe imune n esuturi
cauzeaz procese patologice extrahepatice ca urticarie, artrit, glomerulonefrit i vasculit.
Anti-HBs apar dup dispariia AgHBs, iar intervalul de timp dintre aceste dou evenimente fiind
denumit fereastr serologic.
Anticorpii anti-HBc nu posed efect neutralizant. Ei se formeaz ca rspuns la structurile
HBc exprimate pe suprafaa hepatocitelor sau eliberate dup liza hepatocitelor.
- anti-HBc de tip IgM indic replicarea viral activ i se determin spre sfritul perioadei de incubaie,
atingnd concentraie maxim n perioada de stare, disprnd n perioada de convalescen;
- anti-HBc de tip IgG apar la sfritul perioadei de stare, ating concentraie maxim n perioada de
convalescen i persist toat via.
Anticorpii anti-HBe apar dup dispariia AgHBe, decelndu-se consecutiv apariiei anti-
corpilor anti-HBc IgM.

18 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Citokinele
Citokinelor le revine un rol antiviral deosebit n reglarea rspunsului imun. mpreun cu
interferonii, interleukinele IL-2, IL-12 i TNF-, prin aciune comun, inhib replicarea viral.
Experimental, s-a determinat la oarecii transgenici infectai cu VHB, c tratamentul cu IL-12
inhib replicarea hepatic a VHB, inducnd niveluri crescute de IFN- i TNF-, cu efect extins i
extrahepatic, de ex. n rinichi. ADN viral, precum i nucleocapsidele i alte particule intermediare
de multiplicare, dispar din citoplasma hepatocitelor i celulelor renale.
Componenta autoimun rspunsul fa de structurile proprii ale hepatocitului (complexe
lipoproteice de membran) ar fi prezente n hepatitele virale, n special de tipul ADCC. Ele duc la
distrugere tisular, citoliz.

Persistena infeciei
Vindecarea este rezultatul eliminrii antigenelor virale din circulaia sangvin i dispariia
virusului din esutul hepatic (a ADN-ului, formelor replicative intermediare i al antigenelor).
Prezena n snge a AgHBs mai mult de 6 luni confirm cronicizarea infeciei.
Cauzele persistenei virale nu sunt pe deplin cunoscute, dar depind de particularitile:
a) Gazdei, i anume:
- vrsta: sugarii nscui de mame infectate devin n 90% purttori cronici de VHB, ca rezultat al
imaturitii sistemului imun (prelucrare inadecvat a Ag, absena rspunsurilor inflamatorii), expresiei
sczute a IFN i a activitii intense a celulelor supresoare, posibil i al instalrii toleranei imune
mediate de AgHBe. La aduli, doar n 10% de cazuri survine cronicizarea infeciei, cauzele nefiind
elucidate pe deplin;
- imunodeficiena congenital (sindromul Dawn) sau achiziionat (infectarea cu HIV) determin portajul
cronic de VHB.
b) Virusului (proprietile biologice ale virusului): ADN viral se determin n hepatocite nu numai
n form replicativ epizomal (infecie activ productiv), dar i n form integrat n ADN cromozomial
(provirus) cu infectivitate redus i perioade de reactivare. Persistena ar evolua prin faza de hepatit
cronic la cancer primar de ficat.

- variabilitatea viral: mutaiile virale cauzate de deleii sau mutaii punctiforme n domeniul pre-C al
genei C cu replicare n titre joase au fost determinate n cazul hepatitei cronice. Se presupune, c
acest fapt ar duce la apariia unor tulpini virale noi de VHB, responsabile de formele de hepatite
cronice;
- particulariti de replicare a VHB: n nucleul hepatocitelor este meninut permanent un stoc de ADN
CCC, fie prin transportarea napoi n nucleu a ADN VHB nou sintetizat, fie prin reinfecie. Mrimea
constant a cantitii de ADN-CCC este reglat prin feed-back de sinteza Ag de suprafa (AgHBs
inhib formarea ADN-CCC).
Prezena continu a ADN-CCC n nucleul hepatocitelor asigur persistena in-
feciei n doz infectant mic i conduce la infecie subclinic.

Spectrul infeciei cu VHB. Aspecte clinice i histopatologice.


Infecia cu VHB se poate manifesta foarte variat de la forme asimptomatice pn la forme
grave (fulminante sau oncogene), dependente de doza particulelor virale care ptrund n orga-
nism, de vrsta la care persoana s-a infectat cu VHB, de faza n care infecia este depistat i nu
n ultimul rnd, de rspunsul imun al persoanei.

Instruciuni metodice 19
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Figura 6 . Spectrul infeciei hepatice cu VHB

HEPATITA VIRAL B

Simptomatic
Asimptomatic
Hepatita acut B

Imunitate sigur Infecie cronic Imunitate sigur Infecie cronic

Ciroz Ciroz
Asimptomatic Asimptomatic
Cancer hepatic Cancer hepatic

Sursa: CDC. Division of Viral Hepatitis

Hepatita acut
Hepatita acut clasic autolimitant este rezultatul reaciilor imune unice,
puternice, cu eliminarea virusului circulant i a hepatocitelor infectate, ceea ce
duce la vindecare.

Vindecarea se determin la 90% pacieni, fiind nsoit de dispariia AgHBs i apariia anti-
HBs. Formele acute de infecie cu VHB se pot rezolva spontan dup 4-8 sptmni de boal.
Majoritatea pacienilor se reabiliteaz fr consecine semnificative i fr reactivri ulterioare.
n majoritatea cazurilor, persoanele infectate nu necesit tratament sau diet special.
Serologic se determin AgHBs (prezent chiar n perioada de incubaie), apoi anti-HBc IgM. n
evoluie favorabil simptomele treptat dispar timp de 2-3 sptmni.
Prezena Ac protectori HBs este un indice imun favorabil, dispariia lor avnd loc n aproxi-
mativ 2-3 luni. Paralel cu aceasta, transaminazele revin la valori normale. n caz de reactivare a
hepatitei cronice asimptomatice, fapt care deseori este dificil de difereniat, se constat persis-
tena AgHBs, prezena AgHBe i ADN viral n ser i rar anti-HBc IgM n titruri nalte.
Evoluia fulminant a hepatitei acute se ntlnete n aproximativ 0,2% cazuri, cu insufici-
en hepatic acut i sfrit letal n 63-93% cazuri. Un indice al unei evoluii severe a bolii este
scderea timpului de protrombin sub 50%.

20 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Figura 7. Evoluia hepatitei virale B n dependen de vrst

Infecia asimptomatic
Se consider c pe plan global exist peste 350 mln. purttori de AgHBs, la care continuu are
loc multiplicarea viral, iar reacia gazdei este nul i lipsit de simptome clinice. Purttorii, de
obicei, sunt depistai ocazional. n caz de detectare la un pacient asimptomatic a AgHBs, obliga-
toriu se vor efectua examinri suplimentare a markerilor hepatici.

Hepatita cronic
Este o manifestare a infeciei persistente asociat cu replicarea continu a VHB i rspun-
suri imune slabe, cu instalarea toleranei imune. Se cronicizeaz numai 10% din formele acute,
caracteristic fiind absena simptomelor clinice sau nespecificitatea lor. Existena lor se descoper
ocazional, n cursul unor investigaii de laborator sau tardiv, dup perioade ndelungate, prin
apariia insuficienei hepatice, a cirozei, ascitei, hemoragiilor sau a carcinomului hepatic. Riscul
de cronicizare a hepatitei crete la 90% pentru nou-nscuii provenii de la mame infectate, 30%
pentru copiii infectai la vrsta pn la 5 ani, 2-10% la aduli.

Ciroza hepatic
Se dezvolt la circa 2% pacieni cu hepatit cronic, mai frecvent n caz de prezena a anti-HBe
dect n prezena AgHBe. Este caracteristic multiplicarea viral. Histopatologic, se determin
hepatit cronic activ, iar clinic, se manifest cu insuficien hepatic i sfrit letal. Aproximativ
la 6% din pacieni ciroza evolueaz spre carcinom hepatocelular.

Carcinomul hepatocelular
VHB se consider agent etiologic al carcinomului hepatocelular primar (CHP) n baza date-
lor epidemiologice (inciden nalt de CHP n zonele geografice cu hepatit B endemic) i ex-
perimentale pe animale infectate cu hepadnavirusuri (apariia de CHP pe fondul de portaj cronic
de virus n hepatite, evolund cu distrugeri i regenerri hepatice). Mecanismele procesului de
instalare a CHP insuficient sunt cunoscute, ns e clar, c malignizarea este favorizat de evoluia
lent, ce decurge ani de zile.

Instruciuni metodice 21
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Semne histopatologice
Pentru hepatita acut forma clasic, histologic, sunt caracteristice leziuni degenerative pa-
renchimatoase (hepatocite balonizate cu contur ters i nuclee mari) i inflamatoare (edem, in-
filtraie cu neutrofile, eozinofile i activare de celule Kupfer) nsoite de modificri regenerative
(mitoze, diminuarea inflamaiei).
n funcie de localizarea i rspndirea necrozelor, se deosebesc urmtoarele forme histo-
patologice:
- necroz n focare i inflamaie intralobular (hepatita acut clasic);
- necroz zonal periportal n asociaie cu leziunile de mai sus;
- necroz confluent n jurul venulelor hepatice;
- necroz masiv, multilobular.
Distrugerile hepatice la peste 65% dintre formele supraacute sunt letale.

22 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

1.2.Virusul hepatitei c (VhC)


n anul 1988, M. Houghton cu colaboratorii si a efectuat clonarea reuit a VHC i descri-
erea genomului viral detectat din plasma cimpanzeilor infectai cu acest virus. ncepnd cu anul
1989, n rezultatul cercetrilor efectuate de Choo Q.L. i colab., hepatita C a fost determinat ca
o unitate nozologic de sine stttoare din grupul hepatitelor virale, predominnd n majoritatea
cazurilor n hepatitele non A, non B. Descoperirea agentului a fost posibil graie aplicrii teh-
nicilor de biologie molecular, inclusiv clonarea secvenelor genomice virale i a investigaiilor
experimentale.
Clasificarea
La baza clasificrii au fost luate n consideraie caracterele similare, comune virusurilor cu
genom ARN de sens pozitiv, n special ale reprezentanilor familiilor Flaviviridae i Pestiviridae.
Comitetul Internaional de Taxonomie a Virusurilor a propus ca VHC s fie inclus n familia
Flaviviridae, genul Hepacivirus.
Tabelul 5. Clasificarea VHC

Familia Flaviviridae
Genul Flavivirus Genul Pestivirus Genul Hepacivirus
v. encefalitei japoneze encefalit
v. encefalitei West-Nile - boal febril,
encefalit v. diareei bovine
v. hepatitei C hepatita virala C
v. denga boal febril hemoragic, v. febrei porcinelor
eruptiv
v. febrei galbene (v. amaril) febra
galben

Relaii virus celul gazd


A. Cultivare (In vitro) Pn n prezent nu s-a reuit cultivarea VHC n culturi celulare. Multi-
plele ncercri de cultivare n hepatocite de cimpanzeu, celule umane fetale hepatice nu au dat
rezultate preconizate. La creterea in vitro n linii celulare Daudi (derivate din celulele B) sau
MT2 (celule leucemice T-umane) s-au obinut niveluri joase de replicare cu apariia de cvasispecii
genomice.
B. Animale (In vivo). La infectarea experimental, cimpanzeul dezvolt o hepatit acut, clinic
i histopatologic asemntoare celei umane.
Caractere morfostructurale
Virionul VHC are form sferic i diametrul de 40-60 nm. Nucleocapsida viral este
nconjurat de o anvelop constituit dintr-un strat lipidic, la suprafaa creia se observ nite
spiculi fini de 6 nm n lungime (glicoproteienele E1 i E2 de suprafa), codificate de ARN
VHC. n interiorul virionului este localizat nucleocapsida, cu dimensiunile de 30-35 nm.

Instruciuni metodice 23
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Figura 8. Organizarea genomului VHC. ARN monocatenar, liniar, de sens pozitiv.

ARN genomic 9,5 kb

VHC Nucleocapsida Metaloproteinaza


E1 Proteasele serinice ARN Polimeraza
E2 Helicaza ARN


ORF
Structurale Nestructurale

C - C-core, proteina core; E1, glicoproteina 1 a nveliului viral; E2, glicoproteina 2 a nveliului viral; NS2, proteina 2
nestructural; NS3, proteina 3 nestructural; 4A, proteina 4A nestructural; 4B, proteina 4B nestructural; NS5A, proteina 5A
nestructural; NS5B, proteina 5B nestructural; 3-UTR, regiunea 3- necodificant; 5-UTR - regiunea 5- necodificant

Genomul
Este de tip ARN monocatenar, liniar, de sens pozitiv, constituit din 9400 de nucle-
otide. n organizarea sa se observ dou 2 zone distincte care codific proteinele structurale
i nestructurale (funcionale). Genele VHC ce codific proteinele structurale se amplaseaz n
regiunea 5 (5NTR) a genomului viral, cele nestructurale n regiunea 3 (3NTR).
Organizarea genomic
ARN-ul viral conine un singur ORF ce codific o poliprotein precursoare de 3008-3037 de
aminoacizi, care respectiv se va cliva n proteine virale individuale: structurale i nestructurale.
ARN viral este constituit din urmtoarele domenii:
- regiunea 5 necodificant (5NTR), de cca 340 nucleotide, ea fiind cea mai stabil regiune a genomului,
utilizat ca marker n PCR. Aceast regiune conine structuri secundare extensive, ce execut controlul
i iniierea translaiei cap independent, cu un mecanism intern de iniiere. Ea ncepe n regiunea IRES,
localizat n interiorul secvenelor ce codific proteina C;
- regiunea C (core): codific proteina capsidei virale, extrem de stabil;
- regiunile E1 i E2 NS1: codific glicoproteinele nveliului viral E1 (Gp35) i E2 (Gp72) cu caracter
hipervariabil;
- regiunile NS2, NS3, NS4 i NS5: exprim proteinele funcionale;
- regiunea 3necodificant (3NTR): are o lungime variabil, de o structur tripartit constituit din: secvena
3 (o regiune scurt, slab conservat de cca 28-42 nucleotide), regiunea poli (U)/polypyrimidine i
secvena 3 X terminal foarte bine conservat. Una din funciile acesteia ar fi finisarea translaiei.

CAPSIDA
Este de simetrie icosaedric, constituit din proteina C PC (20-21 kDa). Proteina cap-
sidal situat la regiunea N a poliproteinei precursoare se formeaz consecutiv clivrii de ctre
proteazele celulare. Este localizat intracelular n reticulul endoplasmatic i n nucleol.
Proteina C are urmtoarele proprieti:
- posed un caracter bazic puternic datorit coninutului de aminoacizi ca arginina, lizina, prolina;
- posed regiuni nalt hidrofobe la poriunea terminal C, implicate n translocarea glicoproteinelor n
reticulul endoplasmatic, unde se finiseaz glicozilarea; induce semnale de clivare a poliproteinei;
- se presupun funcii imunomodulatoare; proteina C suprim specific apoptoza i interacioneaz cu
receptorul pentru limfotoxin.

24 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

NVELIUL VIRAL
nveliul viral (anvelopa) este constituit din dou glicoproteine - E1 (Gp35) i E2 (Gp72),
codificate de genomul viral.
Glicoproteina E1 (33-35kDa) este obinut prin clivaj proteolitic posttranslaional de c-
tre peptidazele celulei gazd semnalaze. Aceast glicoprotein este intens hidrofob, ceea ce-i
permite de a interaciona cu membrana celulei gazd, fixarea n membrana celulei gazd i trans-
miterea semnalelor ctre enzimele celulare ce o separ de proteina C.
Glicoproteina E2 (68-73kDa) este asociat cu membrana celular. La exteriorul regiunii
N-terminale sunt expuse numeroase secvene hipervariabile (HVR1, HVR2), fiind cel mai instabil
domeniu al genomului VHC. Este sediul pentru mutanii ce scap de supravegherea imunologic.
Proteine nestructurale
NS2 este o metaloproteinaz (Zn2 dependent) cu rol de scindare a NS2 de NS3.
NS3, multifuncional, acioneaz ca serinproteaz ce cliveaz poliproteina precursoare n
secvene proteice mai mici. Concomitent, funcioneaz ca helicaz/NTP-az. Proteina NS3 par-
ticip activ la replicarea VHC, prin desfacerea i expunerea matriei ARN pentru a fi copiat de
ARN-polimeraza.
NS4, codificat de regiunea NS4, se divizeaz n alte dou proteine: NS4a ce aparine regi-
unii N terminale i NS4b aparinnd regiunii C terminale. Ambele alctuiesc o protein hetero-
dimeric cu specificitate genotipic.
NS5 se cliveaz n 2 proteine: NS5a localizat n extremitatea N terminal i NS5b n re-
giunea C terminal. Se presupune, ca NS5b posed activitate de ARN-polimeraz ARN-dependent.
Antigenele virale
Antigenele VHC au fost studiate n baza peptidelor sintetizate artificial, reconstituite i
obinute prin inginerie genetic. n rezultatul investigaiilor au fost obinute urmtoarele antige-
ne virale:
-Ag C100-3, sintetizat de fragmentul C100-3 al genei NS4. Asigur sinteza a 80-90% de Ac,
ns preponderent n stadiile tardive ale infeciei.
-Ag C22-3, derivat din regiunea nucleocapsidal C, permite depistarea infeciei cu VHC la
6-9 sptmni de la debut. Antigenul dat este reactiv cu serurile de la pacienii cu tulpini virale
genotipic diferite. Reprezint structuri epitopice imunodominante.
-Ag C33-c, codificat de regiunea NS3. Este nalt imunogen, primul permite evidenierea
seroconversiei.
-Ag C-200, obinut prin asocierea Ag C100-3, Ag C22-3 i Ag C33-c. Creterea numrului
epitopilor reactivi mrete pn la 99,5 % sensibilitatea testelor de diagnostic.
-Ag NS5, codificat de domeniul NS5. A fost inclus n asocierile de antigene pentru eviden-
ierea infeciei, dar nu a crescut considerabil specificitatea testelor de diagnostic.

VARIABILITATEA GENETIC A VHC


VHC are o variabilitate genetic nalt, frecvena mutaiilor fiind de 1,4-1,9x103 per
nucleotid pe an, existnd diferene, att n lungimea genomului, ct i deosebiri importante n
nucleotidele genomice. n genomul viral s-au constatat:
- regiuni constante - secvenele extremitii 5 NTR i a regiunii C;
- regiuni hipervariabile - domeniile genomice care codific proteinele nveliului E1 i E2. E2 este
considerat cea mai variabil regiune a genomului.
n funcie de similaritatea secvenelor nucleotiodice,VHC se clasific (dup Simmonds et al.)
n grupe genetice mari, denumite genotipuri, n cadrul creia se ncadreaz tulpini virale cu o

Instruciuni metodice 25
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

omologie nucleotidic pn la 70%. n prezent se cunosc 11 genotipuri, numerotate n ordinea


descoperirii cu cifre arabe (genotipul 1, genotipul 2......., genotipul 11).
Subtipurile, tulpinile VHC au o similaritate viral de 70-80%, denumite conform descope-
ririi cu litere alfabetice (a, b, c etc.). Actual, se cunosc cca 100 subtipuri.
Cvasispeciile, un complex de variante virale genetic distincte, existente la un singur pacient
infectat, cu o similaritate de cca 90%. Compoziia cvasispeciilor VHC, este rezultatul acumulrii
mutaiilor pe parcursul replicrii virale n celulele gazd. Prezena lor indic faptul, c un subiect in-
fectat nu prezint o populaie viral omogen, ci un spectru heterogen de variante genomice, care
confer virusului un avantaj de supravieuire prin selecia mutanilor cei mai bine adaptai condiiilor
de mediu.Variabilitatea genetic ar fi modalitatea prin care VHC reuete s persiste n organismul
uman, evitnd aciunea sistemului imun i determinnd evoluia cronic a hepatitei virale.
Variabilitatea genetic nalt a VHC face posibil infectarea succesiv a gazdei cu
mai multe tulpini virale i este ntr-o direct corelaie cu severitatea maladiei, rs-
punsul la terapia cu interferoni i dificultile n prepararea de vaccinuri eficiente.
Tabelul 6. Terminologia comun utilizat pentru definirea heterogenitii VHC

Terminologia Definiia % similaritii nucleotidice

Heterogenitatea genetic ntre diferite


Genotip 65 - 68%
izolate a VHC

Izolate strns legate n cadrul unui


Subtip 74 - 80%
genotip major

Un complex de variante genetice n


Cvasispecii 90 - 99%
cadrul izolatelor unui singur individ

Tabelul 7. Rspndirea geografic a genotipurilor VHC

Subtipul Aria geografic


1a frecvent n America de Nord i Sud, Australia
1b frecvent n Europa i Asia;
2a comun pentru Japonia i China
2b comun n SUA, Europa de Nord
2c comun n Europa de Sud i de Vest
3a predomin n Australia (40% cazuri) i Asia de Sud
4a predomin n Egipt
4c predomin n Africa Central
5a doar n Africa de Sud
6a ocazional n Hong Kong, Macao,Vietnam
7a i 7b comun pentru Thailanda
8a, 8b i 9a predomin n Vietnam
10a i 11a depistat n Indonezia

26 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

MULTIPLICAREA VIRAL
Este prea puin cunoscut n absenei unor sisteme de cultivare in vitro.
A. Absorbia i ptrunderea n celul. Virusul se ataeaz de receptorul specific membranar
CD81, fiind mediat de proteina viral E2. Dup ataarea de receptorul CD81, au loc modificri
conformaionale ale E2, ceea ce permite legarea de un coreceptor specific hepatic, favoriznd
ptrunderea virusului n celul prin endocitoz. Mediat de proteina E1, virusul fuzioneaz cu
membrana endozomal cu eliberarea virionului n citosol.
B. Biosinteza componentelor virale. Se presupune, c dup ptrunderea n citoplasm replicarea
viral evolueaz n urmtoarele etape:
Translaie - sintez de proteine.Sinteza poliproteinei precursoare are loc pe matria ARN
genomic, care funcioneaz i ca ARNm, determinat de prezena structurii IRES la regiunea 5
a ARN viral. Ulterior, poliproteina este clivat de proteazele celulare semnalaze n proteine
structurale C, E1 i E2 i de serinproteinazele virale n proteinele funcionale NS3/NS4a/NS4b
i NS5a/NS5b. Metaloproteaza NS2 asigur clivajul ntre NS2 i NS3.
Replicarea genomului. Pe matria ARN de sens pozitiv cu ajutorul ARN-polimerazei ARN
dependente are loc replicarea genomului. n rezultat, se produc molecule intermediare ARN de
sens negativ, care la rndul lor vor servi pentru sinteze multiple de ARN genomic de sens pozitiv,
ce vor contribui la codificarea de proteine virale necesare pentru sinteza proteinelor structurale
i incapsidrii.
C. Asamblarea i eliberarea virusurilor din celul. Replicarea are loc n citoplasma hepatocitelor.
Asamblarea se face la nivelul membranei reticulului endoplasmatic i aparatului Golgi. Un rol
important n asamblare l au interaciunile specifice dintre ARN, regiunea 5 NTR i proteina C
intens bazic, capabil de multimerizare i care se asociaz specific cu genomul viral. Eliberarea
virusului din celul probabil are loc prin nmugurire i nvelirea n membrana celular n care au
fost inserate glicoproteinele E1 i E2.
Figura 9. Multiplicarea VHC

Sursa: www.tibotec.com/.../Life_Cycle_HCV.jpg

Instruciuni metodice 27
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Patogeneza i imunitatea
Interaciunea dintre virus i organismul gazd sunt prea puin cunoscute i presupuse prin
analogii cu hepatita B.
Dup o perioad de incubaie lung, n medie de 6-7 sptmni (uneori pn la 26 sptmni),
manifestrile clinice evolueaz lent, asimptomatic sau n 90% cazuri cu simptome atipice. For-
mele icterice sunt rare, n aproximativ 5% de cazuri. Severitatea infeciei este determinat de
intensitatea viremiei. Virusul nu determin efect citopatic, dar n rezultatul multiplicrii virale se
constat modificri n funcia hepatocitelor, intensitatea crora este dependent de reactivitatea
gazdei, fr a fi cunoscute mecanismele care influeneaz gravitatea procesului.
Replicarea VHC are loc n hepatocite, mononucleare, limfocitele T i B, fiind
integrat n genomul celulei gazd.

Rspunsul imun umoral


Este slab i inconstant, Ac se evideniaz la a 5-6 sptmn n cazul infectrii post-
transfuzionale sau mai trziu, dup 6-9 luni. Nu se cunoate pe deplin dac aceti anticorpi au
o aciune protectoare i neutralizant. Anticorpii fa de proteina C indic eliminarea VHC din
organism, iar cei de tip IgM nu semnific n mod cert o infecie acut.
Rspunsul imun nespecific n rspunsul nespecific particip neutrofilele, macrofagii, ce-
lulele dendritice, celule NK, limfocitele T i citokinele. Dup activarea acestor celule, urmeaz
creterea nivelului de sintez a citokinelor imunomodulatoare, ca interferonul (IFN), care joac
un rol important n blocarea replicrii VHC. Efectul imunomodulator al IFN se manifest prin
creterea expresiei moleculelor complexului major de histocompatibilitate (CMH) de clasa I i
stimularea celulelor NK i a limfocitelor T. Celulele NK determin citoliza hepatocitelor infecta-
te, activitatea i proliferarea lor fiind dependente de interferon. Aceste celule produc IFN, avnd
un rol important imunoregulator. Interaciunea dintre VHC i rspunsul imun nespecific joac un
rol important n evoluia infeciei.

SPECTRUL INFECIEI CU VHC


Hepatita acut se caracterizeaz printr-o perioad de incubaie de lung durat (6-7 sp-
tmni) i variaz n dependen de calea de transmitere, perioada de incubaie fiind mai scurt
n cazul transfuziei de snge. La 80% de pacieni infecia evolueaz subclinic i numai n aproxi-
mativ 20% cazuri se determin forma clinic clasic (icteric).
Nivelul transaminazelor este moderat crescut, cu valori variabile. Viremia se evideniaz n
primele faze ale bolii prin PCR. Diferenierea formei acute de cea cronic este complicat din
cauz c anticorpi VHC IgM apar n perioade tardive ale bolii, fiind depistai i n cazul hepatitei
cronice.
Formele acute severe se ntlnesc rar, iar formele fulminante nu sunt caracteristice pentru
HVC. Evoluia spre cronicizare se nregistreaz aproximativ n 70% cazuri.
Hepatita cronic decurge asimptomatic sau cu simptome nespecifice, infecia de regul,
progreseaz lent, cu instalarea cirozei pe parcursul unei perioade de 5-20 ani.
Cronicizarea poate fi confirmat prin evidenierea unui nivel crescut al transaminazelor, a
viremiei i a anticorpilor specifici. Forme grave predomin la pacienii imunodepresivi, de vrst
naintat, cu alcoolism cronic. n formele agresive, de regul, se pun n eviden genotipurile 1b,
2, de obicei, ca urmare a infeciei posttransfuzionale.
Carcinomul hepatocelular frecvent asociat cu ciroza, apare tardiv (la 15-30 ani de la
infecie) la 60-90% bolnavi cu ciroz.Virusul nu posed structuri genomice oncogene i mecanis-
mele dezvoltrii carcinomului hepatocelular nu sunt cunoscute.

28 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

1.3.virusul hepatitei D (VHD)


Antigenul viral a fost evideniat de M. Rizotto i colab. n anul 1977 prin metoda de imuno-
fluorescen n nucleele hepatocitelor pacienilor, n timpul izbucnirii unei erupii neobinuit de
serioase de hepatit seric n Europa de Sud. Iniial s-a considerat c este vorba de o variant
antigenic a VHB i a fost denumit antigen delta. Prezena anticorpilor specifici n serul paci-
enilor infectai i datele obinute n urma infeciei experimentale pe cimpanzei, au confirmat
existena unui nou agent hepatotrop. Studiile ulterioare au evideniat la acest agent (VHD) par-
ticulariti cu totul deosebite, nespecifice virusurilor animale.
Particulariti biologice
VHD este foarte apropiat de viroizi (virusuri ale plantelor) i are urmtoarele caractere co-
mune: posed ARN monocatenar circular (caracteristic numai pentru viroizi), tipul de replicare
este asemntor viroizilor i decurge cu participarea polimerazei II celulare prin autoclivare i
autoreglare.
ns, spre deosebire de viroizi, genomul VHD este de dimensiuni mai mari (viroizii pose-
d 250-300 nucleotide) i necesit participarea unui virus helper (ajuttor) pentru biosinteza
componentelor structurale care i asigur infeciozitatea. n prezent, taxonomia VHD nu a fost
definitiv determinat.VHD este un satelit subviral al VHB, ultimul servind ca helper.
Caractere morfologice i structurale
VHD are form sferic, dimensiuni de 35-38 nm. Genomul este n complex cu o singur pro-
tein viral. La suprafa este nvelit cu elemente de structur care aparin virusului helper VHB
sau WHB (v. hepatitei marmotei).

GENOMUL
n celulele infectate se determin cteva tipuri de ARN:
a) ARN-ul genomic monocatenar de 1,7 kb i circular (capacitate unic pentru virusuri ARN animale).
n celulele infectate ARN-ul se rearanjeaz n filament bicatenar, n form de bastona. Structura
circular nu este activ n interiorul celulei.
b) ARN antigenomic este complementar ARN-ului genomic, fiind prezent n cantiti mai mici. ORF5 al
ARN antigenomic codific proteina HD.
c) ARNm este identic cu ARN-ul antigenomic, ns este poliadenilat. Spre deosebire de ARN-urile genomic
i antigenomic, care se afl n nucleu, ARNm se localizeaz n citoplasm i este responsabil de
translaia proteinei HD.

Proteine virale
Proteina HD, unica protein codificat de VHD, fosforilat i cu proprieti bazice puternice,
se depoziteaz n nucleele hepatocitelor. n ficat i n serul bolnavilor se determin sub dou
forme:
- proteina HD mic (greutatea molecular 24000), se leag de ARN, regleaz poliadenilarea i
poteneaz autoreplicarea.
- proteina HD mare (greutatea molecular 27000) se formeaz n cursul replicrii, regleaz acest proces,
fiind inhibitorul ei. Simultan, determin mpachetarea ARN VHD n proteinele helperului VHB.

NVELIUL VIRAL
Ribonucleoproteina VHD este acoperit cu proteinele de suprafa ale VHB proteina S,
proteina pre-S1 i proteina pre-S2, proporia proteinelor fiind asemntoare celei din particulele
sferice de 22 nm.

Instruciuni metodice 29
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

MULTIPLICAREA VIRAL
Adsorbia la receptorii celulari are loc prin intermediul AgHBs (pre-S1), iar receptorul
celular definitiv nu este cunoscut.
Strategia de replicare a genomului este similar viroizilor. Sinteza ARN-ului se realizeaz
cu ajutorul polimerazei ARN II celular. Structurile multimerice formate prin clivare i ligaturare
succesiv se transform n structuri monomerice circulare.
ARN-ul antigenomic servete ca matri pentru ARN progen i codific proteina HD
(ORF5).
ARN-ul genomic la nucleotidul 1012 poate conine uridin sau citozin. n prima variant
n urma proceselor de transcriere-translaie se va forma o protein avnd 195 aminoacizi. Mo-
dificarea poziiei 1012 n varianta doi va determina sinteza unei proteine cu 214 aminoacizi. n
dependen de aceste modificri n genomul VHD se determin sinteza a dou forme de prote-
in viral cu funcii diferite:
- p 24 HD (mic-195 aminoacizi) necesar pentru replicarea VHD.
- p 27 HD (mare-214 aminoacizi) inhib replicarea, asigur mpachetarea VHD cu AgHBs.

Relaii virus celula gazd


Culturi celulare. n culturi celulare primare de hepatocite umane, de cimpanzei sau de
marmot se determin replicarea genomului VHD ntr-un numr mic de celule, limitat la un sin-
gur ciclu replicativ. Deci, replicarea VHD nu necesit prezena de helper. Prin transfecie de ARN
VHD are loc sinteza de virioni complei, ns, doar n prezena proteinelor de suprafa ale VHB.
Animale. La cimpanzei hepatita determinat cu VHD poate fi cauzat prin infectarea aces-
tora cu ser de la purttori cronici umani, care conin VHB i VHD, cauznd o coinfecie; sau cim-
panzeilor purttori de VHB a serului ce conine VHD, obinndu-se o suprainfecie. Boala variaz,
avnd o evoluie de la stare moderat la sever, cu prezena AgHBc i AgHD n hepatocite. n
coinfecie, AgHD se detecteaz dup ce AgHBs apare n ser.
Marmota suport o infecie similar cimpanzeilor n prezena WHV.
oarecii infectai experimental nu se mbolnvesc.

Patogeneza imunitatea
Ptrunderea VHD n organism are loc pe cale parenteral i evoluia ulterioar a bolii depin-
de de procesul de infectare, fie prin coinfecie, fie prin suprainfecie.
n coinfecie are loc infectarea concomitent cu VHB i VHD i infecia se manifest ca o
hepatit acut dup o incubaie de 6-12 sptmni. Coinfecia poate fi confirmat prin detecta-
rea AgHD la 1-10 zile de la debutul clinic al bolii (16-86% din pacieni) i apariia anti-HD IgM la
2-3 sptmni. Rspunsul imun poate avea dou variante:
a) de tip IgM tranzitoriu, fr rspuns imun de tip IgG;
b) de tip IgM de scurt durat, urmat de anti-HD IgG pentru perioade ndelungate. Prezena Ac nu
cauzeaz eliminarea antigenelor virale, acestea fiind detectate n hepatocite.
Replicarea VHD n hepatocit reprim replicarea VHB, exprimat prin niveluri sczute de
ADN VHB n ser i supresia sintezei de AgHBs. Diagnosticarea coinfeciei se face n baza de-
terminrii anti-HBc IgM i anti-HD IgM. n hepatita autolimitant anticorpii vor aciona asupra
ambelor virusuri, determinnd dispariia AgHBs i AgHD din ser i hepatocite. Anti-HBs confer
protecie, att pentru VHB, ct i pentru VHD.
Suprainfecia are loc dup infectarea unui purttor cronic de VHB cu VHD. La interval de
2-6 sptmni, la 50-70% dintre pacieni se declaneaz o hepatit acut, n rezultatul multipli-
crii VHD, fapt asigurat de prezena n hepatocite a VHB. Suprainfecia pe fondul persistenei
AgHBs i a AgHBe se caracterizeaz prin prezena n hepatocite a AgHD, iar n ser a ARN VHD,

30 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

a AgHD i anti-HD IgM, ns nu i a anticorpilor VHB de tip IgM (probabil datorit fenomenului
de interferen). S-au descris suprainfecii cu caracter autolimitant, cnd au disprut marche-
rii infeciei cu VHB, apoi i cu VHD, cu eliminarea ambelor virusuri. Infecia latent cu VHD se
observ la pacienii cu ciroz, infectai cu VHD, crora li se face transplant de ficat. Noul esut
hepatic se infecteaz la rndul su, dar infecia este neproductiv, fr eliberare de virioni. O
infecie inaparent latent cu VHD poate fi activat prin suprainfecia cu VHB.
Mecanismele patogenetice, indiferent de modalitatea de infectare, nu sunt pe deplin
cunoscute. Intensitatea i tipul leziunilor hepatocitelor, evoluia diferit spre hepatit fulminant
sau cronic depind de diferii factori, ca:
a) cile prin care se realizeaz funcia de helper a VHB i interferena replicrii lui de ctre VHD;
b) activitatea rspunsului imun la procesele de hepatocitoliz i eliminarea VHD;
c) intensitatea i tipul rspunsului imun anti-VHB: un rspuns imun slab duce la hepatit cronic B,
favorizeaz persistena VHD i progresul spre ciroz; un rspuns imun excesiv anti-VHB, asociat cu
prezena VHD n hepatocit, duce la forme clinice fulminante.

Instruciuni metodice 31
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

1.4. HEPATITELE VIRALE PARENTERALE NON B, NON C


Pe plan mondial, o parte important din hepatitele virale cu mecanism parenteral de trans-
mitere (10% posttransfuzionale i 20% n comunitate) nu sunt cauzate de virusurile hepatotrope
VHB, VHC, VHD. Prin tehnici de amplificare genic, n sngele pacienilor cu hepatite acute sau
cronice, au fost depistate o serie de alte virusuri, transmise parenteral, precum virusul he-
patitei GB (VHGB), virusul hepatitei TT (VTT), virusul P.M. (V.P.M.), virusul SEN
(VSEN) etc.

VIRUSUL HEPATITEI GB (VHGB)


A fost denumit astfel, dup iniialele numelui unui chirurg, bolnav de hepatit, al crui ser a
fost utilizat pentru transmiterea experimental a hepatitei la tamarin (Deinhardt, 1967). Virusul
face parte din familia Flaviviridae i include trei subtipiri: VHGB-A, VHGB-B (virusuri ale tamari-
nului) i VHGB-C - virus uman, cu un grad de omologie genic ntre subtipuri de 95% i un grad
de omologie genic de 25% cu VHC. Genomul virusului VHGB conine ARN monocatenar,
liniar, de sens pozitiv, ce codific aproximativ 2900 aminoacizi. Sinteza proteinelor structurale
este codificat la captul 5, a celor nestructurale la captul 3. Genomul mai conine dou pro-
teaze i ARN-polimeraz ADN dependent.
Pn n prezent nu s-a stabilit replicarea VHGB n ficat, respectiv i rolul etiologic al acestuia
n hepatitele virale. Asocierea cu VHC este destul de frecvent, VHGB-C fiind determinat la 30-
50% din pacieni cu hepatit cronic C, ns aceast asociere nu pare s influeneze severitatea
maladiei. Se presupune, c VHGB poate fi un virus defectiv i replicarea acestuia necesit pre-
zena VHC.
Transmiterea parenteral se efectueaz prin transfuzii repetate de snge, hemodializ sau
utilizare intravenoas a drogurilor. Nu s-a confirmat existena cazurilor de transmitere a bolii
pe cale sexual. Ca marker al replicrii virale servete ARN-ul viral, prezent n serul pacienilor
din primele zile dup infectare, a anticorpilor IgM, detectai dup 10-12 zile de la infectare i a
anticorpilor IgG, detectai mai trziu (dup o lun).

VIRUSUL HEPATITEI TT (VTT)


A fost detectat n serul pacienilor cu hepatit non A-G, caracterizat prin niveluri cres-
cute de transaminaze i denumit TT dup iniialele numelui pacientului de la care a fost prima
dat izolat (Nishizawa i colab. 1997), fiind cunoscut i sub denumirea de virus transmis prin
hemotransfuzie.
VTT, avnd unele caractere comune i cu virusurile din familiile Parvoviridae, i cu cele din
Circoviridae a fost repartizat ntr-o familie nou Paracircoviridae.
Virionul are dimensiuni de 30-50 nm, capsid de simetrie icosaedric, este nenvelit.
Genomul conine ADN liniar, monocatenar, de sens negativ, circular nchis covalent. Mri-
mea genomului variaz ntre 3808-3853 nucleotide. Este constituit dintr-o regiune necodifica-
t-NTR (cu rol n replicare) i a doua codificat, ce cuprinde 3 ORF-uri. Se consider c ORF1
codific proteinele structurale identice proteinei VP1 a circovirusurilor, iar ORF2 codific prote-
inele funcionale. Tulpinile izolate de VTT prezint o heterogenitate destul de nalt comparativ
cu alte virusuri ADN.
Etapele replicrii virale nu sunt cunoscute definitiv. Se presupune, c replicarea decurge
cu participarea intermediarilor de tip ARN, ns reverstranscriptaza nu a fost determinat. VTT
nu se cultiv n culturi celulare. La cimpanzeii infectai experimental, dup o perioad de viremie
se constat dispariia virusului. Virusul se replic n ficat i titrul ADN-ului viral din hepatocite
este de zeci de ori mai mare fa de ADN-ul seric. Viremia variaz n concentraii de 103-108
particule/ml. Concomitent, VTT poate fi gsit n mononuclearele periferice, n secreiile nazo-

32 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

faringiene, saliv, laptele matern, materiile fecale. Investigarea unui numr mare de pacieni cu
afeciuni hepatice i donatori de snge, presupune c VTT este un agent infecios larg rspndit,
cu patogenitate redus i cu infecie persistent.
Rspunsul imun umoral cu formare de Ac este minimal i incapabil de eliminare a viru-
sului din organism. La pacienii cu infecie cronic se determin n circulaia sangvin complexe
imune VTT IgG.
Diagnosticul de laborator nu este de uz curent, deoarece rspunsul imun este slab, i
datorit variabilitii virale nalte, prin metoda PCR este puin posibil de a cuprinde spectrul
complet de variante virale. Infecia este larg rspndit, cu ratele de prevalen cele mai nalte n
Africa i America de Sud, cele intermediare n Asia i cele mai mici n SUA i nordul Europei.
Transmiterea virusului se realizeaz parenteral (se detecteaz la 36% donatori de snge),
dar i pe cale enteric, virusul fiind eliminat cu materiile fecale.

VIRUSUL P.M. (V.P.M.)


A fost detectat n serul unui pacient (P.M.) cu hepatit acut non A-E. O secven de ADN
a V.P.M. s-a constatat identic cu VTT, ns comparndu-se genomurile celor dou virusuri, s-a de-
terminat existena separat a acestora, iar V.P.M. fiind apropiat genomic de familia Circoviridae.
Exist informaie insuficient despre acest virus.

VIRUSUL SEN (VSEN)


A fost descoperit n anul 1999, este un nou virus posttransfuzional, implicat n hepatopatiile
virale. Poart denumirea dup iniialele primului pacient, n al crui ser a fost depistat. Este un
virus ADN, monocatenar, fr nveli. Este asociat cu hepatitele acute sau cronice de etiologie
neprecizat. Prezena n ser a VSEN a fost demonstrat prin constatarea viremiei ADN SEN. La
nivel de hepatocit, virusul nc nu a fost detectat.VSEN este prezent la aproximativ 30% din paci-
enii cu HIV, la 68% cu hepatite virale cronice, la 83% de hepatite posttransfuzionale i n sngele
stocat cu 5-10 ani n urm. Tratament antiviral adecvat nu exist.

Instruciuni metodice 33
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

2. EPIDEMIOLOGIA
2.1 Epidemiologia hepatitelor virale pe plan global
Conform estimrilor Organizaiei Mondiale a Sntii (OMS), 2 miliarde din populaia glo-
bului au contractat infecia cu virusul hepatitei B (VHB), dintre care 350-400 milioane de
persoane sunt infectate cronic, cu riscul de a se infecta cu virusul hepatitei D (VHD). Ei prezint
o surs potenial de infecie pentru restul populaiei. Circa 170 milioane persoane sunt infectai
cu VHC i mai mult de 10 milioane cu virusul hepatic D (VHD). n fiecare an apar, n diferite arii
geografice, peste 100 mii cazuri de hepatit fulminant, 400 mii hepatite cronice (HC), 700 mii
ciroze hepatice (CH) i aproximativ 300 mii cazuri de carcinom hepatic primar (CPH). Astfel,
numai hepatita viral B (HVB) determin anual 500 mii1,2 milioane decese, reprezentnd a 9-a
cauz de deces n lume i a 2-a cauz de mortalitate prin cancer dup tutun.
Prevalena infeciei cu VHB n populaia general variaz considerabil n diferite teritorii i
evideniaz 3 zone de endemicitate. Aproape 45% din populaia lumii locuiete n regiuni cu en-
demicitate nalt prin HVB (frecvena decelrii marcherului AgHBs ajunge ori depete 8%,
riscul de infectare pe parcursul vieii depete 60% i exist un risc major de contaminare n
copilrie): Africa Subsaharian, Asia de Sud-Est, Bazinul Amazonian.
Alte 43% locuiesc n regiuni cu endemicitate medie (frecvena decelrii AgHBs variaz
n jur de 2-7%, riscul de infectare pe parcursul vieii este de 20-60% pentru toate grupele de
populaie: Orientul Mijlociu, America de Sud i Central, Asia Central, Europa de Sud-Est.
Restul populaiei (12%) locuiete n teritorii cu endemicitate redus (frecvena decelrii
AgHBs este sub 2%, iar riscul de infectare pe parcursul vieii ajunge la 20%: America de Nord,
Europa de Nord-Vest, Australia, America de Sud, Canada.
Actualmente, Republica Moldova, poate fi calificat ca o zon cu endemicitate nalt, deoare-
ce, testarea donatorilor primari a determinat un nivel de portaj al AgHBs de peste 10%.

Figura 10. Distribuia geografic a prevalenei AgHBs

Endemicitatea AgHBs
8% i mai mult - nalt
2% - 8% - Medie
< 2% - Sczut

Sursa: World Health Organization. Introduction of hepatitis B vaccine into childhood immunization ser-
vices, 2001 Geneva, WHO, WHO/V&B/01.31

n Europa, anual, se infecteaz de la 900 mii pn la 1 mln. de persoane, fiecare a patra persoa-
n dezvoltnd o form manifest. Evoluia infeciei cu VHB este invers proporional cu vrsta: cu
ct persoana infectat este mai tnr, cu att probabilitatea cronicizrii hepatitei virale este mai
nalt. La copiii infectai, pn la vrsta de 1 an, riscul apariiei infeciei acute simptomatice este

34 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

de doar 1%, pe cnd riscul cronicizrii infeciei reprezint 90%. Printre copii infectai cu VHB
avnd vrsta cuprins ntre 1 i 5 ani, de la 25 la 50% vor deveni purttori cronici, iar printre cei
mai mari de 5 ani 6-10%.
Din datele epidemiologice ale OMS s-a stabilit, c la nivel mondial, infecia viral C afec-
teaz 3% din populaie. Din punct de vedere al repartiiei geografice, se individualizeaz 4 arii
de prevalen:
a) prevalen foarte joas Anglia, rile Scandinave;
b) prevalen joas (0,2-1%) rile din vestul Europei, America de Nord, Australia;
c) prevalen intermediar (1,1-5%) rile din estul Europei, bazinul Mediteranean, Asia, Egiptul;
d) prevalen nalt (5-10%).
n rile din Europa de Vest se apreciaz c aproximativ 5 milioane de oameni au infecie
cronic cu VHC. n SUA s-a estimat, c aproximativ 3,5 milioane de persoane au infecie cronic
cu virus hepatic C, anual, nregistrndu-se peste 150.000 cazuri noi.
Virusul hepatitei D are o rspndire geografic general, cu predominan n unele zone
geografice, unde poate fi endemic (bazinul Mrii Mediteraneene, Europa de Est, teritoriile Ama-
zonului i n unele zone subtropicale ale Africii).
Rata de cronicizare a infeciilor virale hepatice provocate de VHB se estimeaz la 15-20% i
VHC la 85%.
Tabelul 8. Spectrul serologic al diferitor hepatite virale acute n diferite zone geografice

ara Tipuri de hepatite virale %


HVA HVB HVC
Danemarca 39 55 6
Italia 52 30 18
Suedia 62 25 13
Grecia 70 14 16
Marea Britanie 59 28 13
Moldova 46 38 16

Instruciuni metodice 35
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

2.2 EPIDEMIOLOGIA HEPATITELOR VIRALE b, c i D


n republica moldova
Pentru prima dat ca form nozologic independent, hepatita viral B (HVB) n republica
noastr a nceput a fi nregistrat n anul 1966 la nivel de 34,3 cazuri la 100.000 populaie. n anii
urmtori, morbiditatea treptat crete, atingnd n 1974 nivelul maxim de 85 la 100 mii populaie.
Ulterior incidena scade pn la 47,9 la 100 mii populaie n anul 1979, dup care urmeaz o
alt faz de cretere a incidenei, pn la 76,6 la 100 mii populaie n anul 1987. ncepnd cu anul
1988, urmeaz a doua faz de reducere a nivelului de morbiditate, care continu pn n prezent,
constituind n anul 2006 indicele de 7,48 la 100 mii populaie.
Figura 11. Dinamica morbiditii prin hepatita viral B n Republica Moldova, anii 1981-2006

Indicii morbiditii prin hepatita viral B, depesc cu mult indicii nregistrai n majoritatea
rilor europene (de la 0,2 la 100 mii populaie n Luxemburg pn la 1,8 n Olanda), ceea ce
contribuie la sporirea numrului de bolnavi cu hepatit cronic, ciroz hepatic i cancer primar
hepatic. Indicele morbiditii prin hepatite virale cronice i ciroze hepatice crete de la 772,9
n anul 1989 pn la 1693,7 n anul 2005. Conform datelor statistice, n Republica Moldova,
anual se nregistreaz circa 2700 purttori ai AgHBs noi depistai, circa 7000 persoane cu HCr i
CH, circa 200 cazuri CPH. n urma HCr, CH, anual decedeaz peste 3000 persoane, iar n urma
CPH- circa 300 bolnavi.
Morbiditatea populaiei prin hepatite acute i cronice duce la consecine socio-economice
extrem de grave.
Morbiditatea prin HVB acut n Republica Moldova dup vrst i sex
Unii din factorii biologici ce ar putea influena morbiditatea prin diferite infecii sunt sexul i
vrsta, ce servesc ca criterii n determinarea grupurilor de risc. Pentru morbiditatea prin HVB
factorul de vrst a jucat un rol semnificativ, servind i ca unul din argumente n implementarea
vaccinrii totale contra HVB n rndul nou-nscuilor n Republica Moldova, ncepnd cu anul
1994. n rezultat, ponderea morbiditii prin hepatite virale B n grupele de vrst 0-2 ani i 3-6
ani pe parcursul celor 12 ani (1995-2006) a sczut de la 238 la cazuri unice. Persoanelor de sex
masculin le revine o pondere mai mare n morbiditatea prin HVB, constituind 55,8% n raport
cu 44,2% n rndul persoanelor de sex feminin.
Repartizarea teritorial a morbiditii prin HVB
Repartizarea teritorial a incidenei hepatitei virale acute B n Europa poart un caracter
neuniform, crescnd de la Nord la Sud i de la Vest la Est.

36 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Pentru Republica Moldova, morbiditatea prin HVB variaz n dependen de zone. Cu acest
scop toate raioanele republicii (cu excepia celor transnistrene) au fost repartizate n 3 zone
landafto-geografice: Nord, Centru i Sud. Cea mai semnificativ scdere a incidenei prin HVB
s-a constatat n zona de Centru de la 40,0o/oooo n anul 1996 pn la 19,6o/oooo n 1999, o sc-
dere de 2 ori. n zona de Nord descreterea a fost de 1,7 ori (de la 19,1o/oooo n 1996 pn la
11,5o/oooo n 1999), iar cea mai lent scdere s-a semnalat n zona de Sud, doar de 1,1 ori (de la
29,5o/oooo n 1996 pn la 22,9o/oooo n 1999).

Hepatita Viral C
Figura 12. Dinamica morbiditii prin VHC i VHD acute n Republica Moldova, anii 1991-2006
8 o/oooo
7,6

7
6,2 6,1

6 6 6,1

4,3
4
3,6 3,4
3,7
3 3,09
2,9 2,9
3 2,8

1,9
2
1,6 1,5 1,5
1,5 1,2 1,5 0,92
1,5 1,2
1
0,9 0,9 1 0,66
0,6 0,7 0,7
0 0,1
1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006

HVC HVD

Fig.5. Dinamica morbiditii prin HVC i HVD acute n Republica Moldova, anii 1991-2006

Hepatita viral C, a fost oficial nregistrat n RM n anul 1991. Datele prezentate n figura
12 ne demonstreaz faptul c morbiditatea prin aceast infecie a crescut treptat pn n 1996
- de la 1,62o/oooo la 7,6o/oooo, o cretere de 4,7 ori. ncepnd cu anul ulterior, 1997, cifra este n
descretere de 2,5 ori, atingnd n 2006 indicele de 3,09o/oooo. Cei mai avansai indici se nregis-
treaz n localitile urbane. Analiza i evaluarea cazurile de HVC acute nregistrate n raioanele
i municipiile RM pe parcursul anilor 1996-2000, cu determinarea grupelor de vrst cel mai
frecvent atacate de infecia cu VHC demonstreaz, c ponderea acestei infecii crete odat cu
creterea vrstei de la 1,2% n grupa de vrst 0-2 ani pn la 62% n grupa de vrst 20-49 ani,
dup care urmeaz o scdere pn la 9,5% la persoanele ce au depit vrsta de 60 ani. Deci, n
cazul HVC, grupa de risc major o constituie persoanele de vrsta 20-50 ani.

Hepatita viral D
Ponderea grupelor de vrst n morbiditatea prin HVD crete odat cu vrsta de la 0,5%
pentru persoanele de 0-2 ani i 3-6 ani pn la 46,6% n grupa de vrst 20-29 ani, cu o reducere
ulterioar pn la 0,5-1,0% n grupele de vrst 50 i mai muli ani. n ceea ce privete sexul,
mai frecvent afectai de aceast infecie, ca i n cazul virusurilor hepatice B i C, sunt brbaii,
constituind 66,3%, n raport cu 33,7% fa de populaia feminin.

Instruciuni metodice 37
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

2.3. DATE EPIDEMIOLOGICE


Perioada de incubaie
a. Hepatita viral B
Perioada de incubaie a infeciei cu VHB variaz de la 45 pn la 180 zile.
b. Hepatita viral C
Perioada de incubaie variaz de la 14 pn la 110 zile, avnd valori medii de 28-43 zile.
Divergenele care totui se semnaleaz, sunt argumentate de existena mai multor genotipuri
ale VHC.
c. Hepatita viral D
Perioada de incubaie n HVD variaz de la 21 pn la 90 zile, iar debutul bolii este, de
regul, insidios.

Populaia receptiv
a. Hepatita viral B
Sunt considerate receptive la infecia cu VHB toate persoanele care nu au suportat hepatita
B n nici una din formele sale i, deci, la care nu sunt depistai urmtorii marcheri ai hepatitei
B: AgHBs, anti-HBs i/sau anti-HBc. Indivizii cu HBs-antigenemie sunt deja infectai, iar cei anti-
HBs seropozitivi sunt imuni. Persoanele cu anticorpi anti-HBc au suportat HVB n trecut; aceti
anticorpi nu au caliti protectoare, dar cazuri de reinfectare cu VHB la posesorii acestora nu
sunt atestate.
b. Hepatita viral C
Sunt considerate receptive la infecia cu VHC toate persoanele care nu au suportat HVC n
una din formele sale i, deci, sunt anti-VHC seronegative.
c. Hepatita viral D
Populaia receptiv este reprezentat de persoanele anti-HBs i/sau anti-HBc pozitive, inclu-
siv de cele cu HBs-antigenemie. Pentru coinfecia VHB i VHD sunt considerate receptive toate
persoanele care nu au suportat hepatita D i/sau B n una din formele sale i, deci, la care nu sunt
depistai urmtorii marcheri ai hepatitei B: AgHBs, anti-HBs i/sau anti-HBc. Pentru suprainfec-
ia VHB i VHD sunt considerai receptivi toi bolnavii cu hepatita acut sau cronic B, inclusiv
persoanele cu HBs-antigenemie.

Sursa de infecie
a. Hepatita viral B
Drept surs de infecie cu VHB sunt bolnavii cu diferite forme de hepatita B acut i cronic,
inclusiv purttorii antigenului de suprafa al VHB (AgHBs), care sunt considerate persoanele cu
HBs-antigenemie persistent pe parcursul a minimum 6 luni. Un pericol deosebit de infectare
prezint purttorii de AgHBs la care concomitent n snge se depisteaz antigenul e al VHB
(AgHBe). Persoana infectat devine contagioas cu 2-8 sptmni pn la debutul semnelor
clinice ale hepatitei B, astfel prezentnd n aceast perioad un risc de infectare cu VHB pentru
membrii familiei, partenerii sexuali. Fiind donator, prezint risc pentru recipienii sngelui, deri-
vatelor din snge, spermei i organelor. Bolnavii cu hepatita cronic viral B i purttorii AgHBs
pot pstra importana epidemiologic ca sursa de infecie pe parcursul ntregii viei.
b. Hepatita viral C
Drept surs de infecie cu virusul hepatitei C (VHC) servesc pacienii cu diferite forme de
hepatita C acut i cronic, inclusiv purttorii VHC, care sunt considerate persoanele la care se
deceleaz anti-VHC n snge.
Cile artificiale de transmitere au un rol dominant n procesul epidemiologic al HVC. Cea mai
important surs de infecie prezint persoanele anti-VHC pozitive, ARN pozitive sau cu indici
ALT sporii i/sau bolnavi cu hepatomegalie, internai n seciile de boli chirurgicale, somatice sau

38 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

hemodializ, unde se efectueaz un numr considerabil de manipulaii parenterale; donatorii de


snge, sperm, organe i esuturi; narcomanii ce i administreaz droguri intravenos. Persoana
infectat de asemenea, prezint risc de infectare cu VHC pentru membrii mediului habitual,
partenerii sexuali etc. Gravidele anti-VHC seropozitive prezint risc potenial de infectare cu
VHC pentru nou-nscui. Bolnavii cu HVC cronic i purttorii virusului i pot pstra importana
epidemiologic ca surs de infecie pe parcursul ntregii viei.
c. Hepatita viral D
Sursa de infecie este reprezentat de bolnavii cu HVD acut sau cronic i purttorii
VHD, drept care sunt considerate persoanele cu persistena AgHBs i anti-VHD total n snge
pe parcursul a minimum 6 luni.

Mecanismul i cile de transmitere


Hepatita viral B
La bolnavii cu hepatit acut sau cronic B i purttorii de AgHBs virusul persist n mediile
fiziologice ale organismului. Cantitatea de material infectat, suficient pentru producerea infeciei
cu VHB, poate fi de 0,00004 ml. Volumul mediu de snge inoculat n timpul unei nepturi cu
acul este de aproximativ 0,0001 ml i poate conine pn la 100 doze infecioase de virus al
hepatitei B.
Realizarea procesului epidemic al hepatitei B, asigurnd existena VHB ca specie, are loc prin
mecanismul parenteral de infectare pe diferite ci stabilite pe parcursul evoluiei. Nominalizarea
acestor ci i clasificarea lor n dou grupuri naturale i artificiale - are o importan epidemi-
ologic considerabil n ceea ce privete aplicarea corect a msurilor de profilaxie i combatere
a infeciei prin HVB.
Cile naturale:
Perinatal (vertical): transmiterea de la mama infectat la ft n timpul naterii (intranatal) i
intrauterin (cnd sunt leziuni ale placentei).
Orizontal: transmiterea ca rezultat al contactelor habituale directe cu persoane infectate, n lipsa
intermedierii prin vectori artificiali.
Sexual: transmiterea ca rezultat al contactelor sexuale cu persoane infectate.
Cile artificiale:
1. Nozocomial transmiterea infeciei prin intermediul interveniilor medicale:
Pacient-medic: Infectarea personalului medical de la pacienii infectai.
Pacient-pacient: Infectarea pacienilor receptivi de la pacienii infectai prin intermediul
echipamentului medical contaminat n timpul acordrii asistenei medicale cu aplicarea
manipulaiilor parenterale n unitile medico-sanitare (manipulaii stomatologice, operaii
chirurgicale, hemodializ, transfuzii de snge sau derivate sanguine, transplant de organe, injecii,
colectarea probelor de snge sau alte medii fiziologice pentru investigaii de laborator, cercetri
instrumentale endoscopice etc.)
Medic-pacient: infectarea pacienilor prin contact direct cu personalul medical infectat.
Pacient-societate: Infectarea ocazional a persoanelor receptive din afara instituiei medicale prin
intermediul acelor i a altor instrumente medicale ascuite utilizate care, fiind decontate, nu au fost
nimicite definitiv.
2. Habitual-comunal transmiterea agentului patogen n mediul habitual ca urmare a
prestrii serviciilor cosmetice populaiei prin intermediul unor vectori artificiali (obiecte de igie-
na personal: trusa pentru brbierit, periua de dini, prosoape, truse de manichiur i pedichiur,
epilatoare i alte dispozitive pentru manipulaii cosmetice etc.).
Utilizarea intravenoas a drogurilor (AIVD)

Instruciuni metodice 39
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

VHB nu se transmite pe cale aerogen, alimentar, hidric sau prin intermediul insectelor
hematofage.
n rile unde se respect strict regulile de dezinfectare i sterilizare a instrumentelor medi-
cale de multipl folosin, virusul nu se transmite pe aceast cale.Totodat, n instituiile medicale
unde regulile antiseptice se ncalc, transmiterea VHB are loc prin instrumente, utilaj medical i
soluii perfuzante contaminate. Au fost depistate cazuri de infectare cu VHB prin intermediul
acelor de acupunctur, lanete pentru colectarea sngelui. n practic sunt cunoscute cazuri cnd
soluiile perfuzante n ambalaj mare pentru mai muli bolnavi au fost contaminate prin interme-
diul seringilor prelucrate neadecvat, fapt ce a condus la infectarea a sute de pacieni n seciile
unor uniti medicale.
n diferite teritorii rolul dominant l joac diferite ci de transmitere. n zonele economic
dezvoltate o importan primordial o dein cile parenterale i sexuale de transmitere, iar n
rile n curs de dezvoltare cea orizontal i perinatal. Schimbrile n modul de via i obi-
ceiuri, starea i educaia sanitaro-igienic, factorii economici i sociali n mod esenial determin
prevalena anumitor ci de transmitere.

Caracterizarea cilor naturale de transmitere a VHB.


Transmiterea perinatal
Transmiterea perinatal a VHB de la mama infectat copilului este una din cele mai impor-
tante ci de transmitere a hepatitei virale B, din acele considerente, c anume la nou-nscui
riscul de cronicizare a infeciei acute este maximal. Din aceti purttori se formeaz o populaie
de indivizi cu infecie persistent, care, la rndul su, va servi drept surs de infecie pentru ali
oameni, inclusiv i pentru copiii lor.
Prin termenul de transmitere perinatal se subnelege, att infectarea congenital sau antena-
tal (intrauterin), ct i infectarea intranatal, ce se realizeaz n timpul actului naterii. Aproxi-
mativ 98% de cazuri de infectare perinatal au loc intranatal i doar circa 2% din nou-nscui se
infecteaz congenital. Depistarea AgHBs la gravid nu este un indiciu pentru ntreruperea sarcinii
sau pentru natere Cezarian.
Figura 13. Evoluia i sechelele infectrii perinatale cu VHB

Mama cu AgHBs +
antigenemie

AgHBe pozitiv AgHBe negativ

Frecvena infectrii Frecvena infectrii


perinatale cu VHB 70-90% perinatale cu VHB 10-30%

Portajul cronic al VHB se Portajul cronic al VHB se


dezvolt la 90% nou-nscui dezvolt la 10-15% nou-nscui

40 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Transmiterea perinatal poate avea loc n dou cazuri:


Cnd femeia se mbolnvete de HVB acut n timpul graviditii, n special n ultimul trimestru;
Cnd dnsa este purttoare cronic al VHB (purttor de AgHBs).
Varianta a doua este cea mai frecvent ntlnit i valoroas din punct de vedere epidemiolo-
gic. Dac femeia face HVB acut n primul trimestru al graviditii, riscul de infectare pentru copil
este minimal, cu excepia cazurilor cnd dnsa n continuare devine purttor al AgHBs. n al doi-
lea trimestru al sarcinii nivelul riscului constituie circa 6%, dar crete considerabil (pn la 67%)
dac femeia se mbolnvete n al treilea trimestru. Termenii de mbolnvire n timpul graviditii
i prezena markerilor infectivitii nalte (AgHBe) sunt factori determinai n transmiterea peri-
natal. Evoluia i sechelele infectrii perinatale sunt prezentate n schema din figura 13.
Transmiterea orizontal
Un numr considerabil de cazuri de HVB i portaj al AgHBs este strns legat de transmite-
rea agentului patogen de la copil la copil sau de la adult la adult sau adult-copil i invers cale
care deseori este numit orizontal. Importana relativ a diferitor factori ai cii orizontale de
transmitere a VHB nc nu este definitivat. n general, se poate spune c are loc realizarea con-
tactelor directe ale persoanelor receptive cu microcantiti de snge sau alte fluide fiziologice
ale persoanelor infectate n mediul habitual. Se consider c pn i cantitile microscopice de
snge pe pielea purttorilor de AgHBs cu impetigo, leziuni de scabie, zgrieturi pot provoca m-
bolnvirea cu VHB la persoane receptive cu leziuni ale pielii. Transmiterea orizontal are loc mai
frecvent printre copiii mici i adolesceni.
De asemenea, calea orizontal poate fi realizat i n alte vrste. n special o astfel de in-
fectare are loc n mediul habitual al familiilor purttorilor de AgHBs. Chiar i n teritoriile cu
endemicitate joas a infeciei cu VHB a fost demonstrat elocvent rspndirea infeciei n familii,
att printre copii, ct i de la aduli la copii i invers. Aceast concepie a fost confirmat n re-
petate rnduri prin erupiile de HVB n familiile purttorilor cronici ai AgHBs i colective nchise
de copii orfelinate, internate, case de copii. Aadar, n republica noastr, nu poate fi neglijat
importana cii orizontale de transmitere a VHB.

Factorii de risc asociai cu transmiterea virusului


a. Hepatitei B
Transfuzii sau transplante de la donatori AgHBs pozitivi;
Multiple manipulaii parenterale;
Naterea de la mam infectat cu VHB;
Administrarea intravenoas a drogurilor;
Hemodializa;
Traume profesionale cu instrumente medicale contaminate;
Contacte sexuale / habituale cu indivizi AgHBs pozitivi;
Parteneri sexuali multipli;
Examinarea pacienilor cu instrumentar stomatologic contaminat.

Grupele populaionale de risc pentru infecia cu VHB sunt:


personal medical i paramedical
copii nscui din mame infectate cu VHB
homosexuali sau heterosexuali cu parteneri multipli
contacii familiali ai purttorilor de AgHBs
imigrani din zone hiperendemice

Instruciuni metodice 41
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

hemofilici i politransfuzai
personalul din serviciile de psihiatrie
deinui i personalul de supraveghere
utilizatorii de droguri intravenoase, toxicomani
persoanele instituionalizate.

b. Hepatitei C
Transfuzii sau transplante de la donatori infectai. Hemodializa;
Administrarea intravenoas a drogurilor;
Traume profesionale cu instrumente medicale contaminate;
Contacte sexuale / habituale cu indivizi anti-VHC pozitivi;
Parteneri sexuali multipli;
Naterea de la mam infectat cu VHC.

Mediile fiziologice ale organismului potenial infectate cu VHB,VHC i VHD


Sngele i derivatele din snge
Lichidul cefalo-rahidian, pleural, pericardial etc.
Exudatul din plgi
Sperma, secretul vaginal, sngele menstrual
Organele prevzute pentru transplantare
Saliva, secreiile nazofaringiene
Laptele mamar, lacrima, sputa, sudoarea, urina, fecalele (fiind contaminate cu microcantiti de snge).

testarea donatorilor de snge i grefe


Testarea donatorilor de snge i grefe la AgHBs
Tot sngele i produsele sangvine recoltate necesit a fi testate obligatoriu la AgHBs prin
metoda imunoenzimatic, cu teste care asigur detectarea minimal a AgHBs la nivel de 0,025-
0,5 ng/ml. Se admite utilizarea reagenilor prestai n form de set (varianta pe microplci sau cu
bile) de la productori autorizai de ctre Ministerul Sntii. Se recomand a include n afara
martorilor din seturi, un martor intern, slab pozitiv, obinut prin diluarea serului i verificat pen-
tru reproductibilitate la valorile de limita minimal.
Serurile primar pozitive vor fi supuse verificrii repetate n duble probe, efectuate dup ace-
iai tehnic. Dac n testarea repetat rezultatul este dublu negativ, proba se considera negativ.
Rezultatele pozitive pot fi confirmate prin metoda de neutralizare specific (testul confirmativ)
i/sau depistarea anti-HBc i anti-HBe.
Testarea donatorilor de snge i grefe la anti-VHC
Principiul i cerinele tehnice de testare la anti-VHC sunt asemntoare cu cele pentru
depistarea AgHBs. Reactivele trebuie s depisteze anticorpi la cel puin 2 antigeni VHC (NS3 i
NS4). Pentru confirmarea rezultatelor pozitive, se poate aplica metoda de imunoblot. Donatorii
de snge i derivatele lui vor fi supui, peste fiecare 6 luni, controlului la prezena virusurilor VHB
i VHC prin metoda reaciei de polimerizare n lan (RPL).

42 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

3. Diagnosticul de laborator al hepatitelor virale


Pentru depistarea agenilor cauzali ai infeciilor virale se utilizeaz urmtoarele metode de diagnostic

testele
teste specifice
nespecifice
I. Directe - depistarea direct a II. Indirecte TESTE BIOCHIMICE
agentului cauzal. - indic indirect
Virusologice izolarea agentului prezena Ag n
Activitatea bilirubinei
propriu-zis - regula de aur a organism.
diagnosticului de laborator. Metoda este Activitatea GGT
laborioas i de durat (5-10 zile). Activitatea fosfatazei
Metodele serologice
Citologice - studierea agentului determinarea alkaline
cauzal n frotiuri colorate. Este slab Activitatea AST i ALT
anticorpilor formai n
sensibil. Exist un anumit subiectivism
procesul rspunsului Timpul protrombinei
n aprecierea rezultatelor de ctre
examinator. imun al organismului
Amoniacul
la ptrunderea
Imunocitologice evidenierea
agentului infecios.
antigenului n frotiuri cu ajutorul
anticorpilor specifici (reacia Teste funcionale
imunofluorescent direct). Este o RFC - reacia
metod sensibil, dar se obin des de fixare a
rezultate fals pozitive sau fals negative.
complementului
Metode molecular biologice
determinarea unui sector specific
al ADN/ARN din genomul virusului IFA - reacia de
(reacia de polimerizare n lan-PCR). imunofluorescen
Sunt metode nalt sensibile, se apropie indirect
de standardul de aur.
Metode serologice - determinarea ELISA - reacia
agentului cauzal prin metoda
imunofermentativ
imunofermentativ (ELISA).

Actualmente nu exist nici o metod de diagnostic de laborator care ar permite stabilirea


unui rezultat cert de 100% privind prezena agentului cauzal. De aceea, n multe cazuri, este
necesar de a se efectua 2 sau mai multe metode de diagnostic; deseori se impune efectuarea
repetat a investigaiilor de laborator.
3.1. Diagnosticul serologic al hepatitelor virale
Indicii ce determin prezena virusului hepatitei n organism se numesc marcheri hepatici.

Diagnosticul de laborator al hepatitei virale A


Pentru diagnosticul imunologic al hepatitei virale A este utilizat metoda ELISA cu depistarea
anticorpilor anti-VHA IgM n stadia precoce i anti-VHA IgG, ultimul fiind marker al imunitii
protective eficace la o infecie ulterioar i metoda PCR cu detecia ARN-VHA. Anticorpii anti-
VHA IgM apar n perioada de incubaie cu 3-5 zile nainte de apariia primelor simptome clinice,
circulnd n snge pe parcursul perioadei manifeste i mai trziu (circa 4 luni).
Detecia anticorpilor anti-VHA IgG caracterizeaz finisarea procesului infecios activ, sana-
rea organismului. Testarea anticorpilor anti-VHA fr difereniere pe clase nu este informativ.

Instruciuni metodice 43
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Figura 14. Infecia cu VHA


Rspuns

Acidul ribonucleic al VHA (ARN-VHA)


Detecia ARN-VHA a fost posibil datorit introducerii n practica medical a PCR. ARN-
VHA se depisteaz n snge, chiar din faza iniial a procesului infecios i se nregistreaz la
pacienii cu un titru nalt anti-VHA IgM. Indicarea ARN viral n snge n faza precoce a procesului
infecios este metoda de elecie al diagnosticului i aprecierea activitii replicative a virusului.

Diagnosticul de laborator al hepatitei virale B


Diagnosticul pozitiv de hepatit viral, suspectate n baza datelor clinice i epidemiologice se
precizeaz numai cu ajutorul testelor specifice de laborator.
Testele specifice pun n eviden numeroi marcheri ai prezenei infeciei hepatice cu VHB
i anume antigenii:
AgHBs, pre-S1,
AgHBc, pre-S2,
AgHBe, AgHBx

La toi aceti antigeni se secret anticorpii respectivi:


anti- HBs, anti- pre-S1
anti- HBc-IgM i IgG; anti-pre-S2
anti- HBe anti- HBx

Aceti antigeni i anticorpii lor respectivi prezint complexul de markeri specifici ai VHB, detec-
ia crora difer dup importan n diagnosticul, prognosticul hepatitei virale i aspectul epidemi-
ologic. Aprecierea rezultatelor indicaiei anti-HBx i anti-HBpol este studiat insuficient. Pentru uz
clinic (diagnosticul de hepatit viral B acut, urmrirea evoluiei clinice, vindecarea sau tendina la
cronicizare) sunt necesare mai multe complexe de teste (cel puin primele 3 categorii de markeri).
Pentru diagnosticul imunologic al hepatitei virale B este utilizat metoda ELISA cu de-
tecia antigenelor i anticorpilor respectivi, testul radioimun (RIA), imunodifuzia n gel,
RHAI. Metodele generaiei a III (ELISA i RIA) sunt cele mai sensibile comparativ cu RHAI (de
10-60 ori) i imunodifuzia n gel (de 1000 ori). Actualmente, testul ELISA s-a impus ca indispen-
sabil pentru diagnosticul infeciei cu VHB.
n mod uzual, pentru diagnostic se cerceteaz prezena AgHBs.
AgHBs n evoluia hepatitei virale B acute este detectabil n snge din perioada de incubaie,
n ultimele 2 sptmni de incubaie nainte de debutul bolii clinice i de apariia semnelor bio-
chimice, apoi persist n primele 4-6 sptmni ai perioadei clinice, ulterior formeaz complexe

44 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

cu anti-HBs i n form liber nu se testeaz. Depistarea AgHBs mai precoce arat la infeciozi-
tate mai majorat, spre exemplu la hepatitele posttrasfuzionale, iar circulaia lui mai prelungit
arat la o concentraie iniial mai nalt i gravitatea bolii. AgHBs uneori se menine n perioa-
da de boal pn la 21 sptmni.
Persistena lui mai mult de 6 luni de la debutul bolii prezint semnificaie, fie de
trecere n stare cronic, fie n acea de purttor de antigen i se asociaz de obicei
cu prezena de particule Dane i de ADN VHB.
Dac AgHBs nu se apreciaz, aceasta nu mrturisete despre sanaie i nsntoire, la majo-
ritatea pacienilor, uneori continuu se testeaz ADN-VHB, ce caracterizeaz poteniala infecio-
zitate. Depistarea AgHBs nu n mod obligatoriu demonstreaz replicarea activ a VHB.
Obinerea unui rezult negativ pentru AgHBs nu nseamn i infirmarea diagnosticului de
hepatit viral B. n acest caz sunt posibile urmtoarele eventualiti:
Decelarea antigenului a fost ncercat prea trziu, dup ce acesta a disprut ctre sfritul bolii.
Ag este blocat n complexul antigen-anticorp (n hepatitele virale severe i n hepatita fulminant). n
aceste cazuri, antigenul poate s reapar ulterior n snge sau este demascat prin corticoterapie.
Posibil metoda utilizat este insuficient de sensibil pentru decelarea antigenului.
Existena n unele cazuri (5%-10%) a ferestrei serologice, perioada n care AgHBs a disprut din
snge, iar anticorpii anti-HBs nu au aprut nc (apar mai trziu, n convalescen).
n aceste cazuri numai decelarea de anticorpi anti-HBc IgM, martori ai unei infecii active,
permit un diagnostic indubitabil de hepatit viral acut B.
Fa de AgHBs apar anticorpii respectivi anti-HBs.
Anti-HBs la pacienii cu hepatita B acut se testeaz tardiv, dup dispariia AgHBs. n pe-
rioada de convalescen prezena anti-HBs semnific vindecarea sigur a bolii i imunitatea
postinfecioas (fiind singurii anticorpi din cursul acestei infecii cu aciune protectiv).
n majoritatea cazurilor, anticorpii anti-HBs apar dup trecerea unui anumit interval de timp
de la dispariia (negativarea) AgHBs rezultnd astfel (pentru diagnostic) o fereastr serologic.
Durata perioadei ferestrei serologice negative constituie circa 3-4 luni cu variaii pn la un an.
Termenul apariiei anti-HBs e dependent de statutul imun al pacientului. Titrul anti-HBs
rareori este nalt i cu timpul scade pn la concentraii nedectabile. La reconvalesceni, n 10-
15%, cazuri dup hepatita acut B, chiar dup muli ani de la dispariia AgHBs, nu se determin
anticorpii anti-HBs. De altfel, anti-HBs pot persista pe parcursul vieii.
n plan diagnostic, determinarea anti-HBs poate servi ca criteriu de confirmare retrospectiv
a hepatitei virale B n anamnez. Dac la controlul primar al pacientului, cu complexul simp-
tomatic al hepatitei acute, AgHBs lipsete n snge i se detecteaz anti-HBs, aceasta nu numai
c nu confirm, dar dimpotriv exclude diagnosticul HVB acute. Concomitent s-a constatat, c
n HVB la o parte din bolnavi cu anti-HBs se determin o antigenemie (AgHBs) continu. Anti-
HBs se detecteaz la cercetrile de screening ale populaiei aparent sntoase, mai ales la aduli,
confirmnd postinfecia HVB.
Controlul sistemului AgHBs - anti-HBs n dinamic are importan clinic pentru aprecierea
evoluiei procesului infecios i deznodmntul lui. Detecia anticorpilor anti-HBs, ndeosebi
n combinaie cu anti-HBe se consider ca criteriu veridic al dezvoltrii imunitii protective
postinfecioase, nsntoirii dup hepatita B acut. Creterea anti-HBs n snge este un test
control destul de informativ ce confirm eficacitatea vaccinrii mpotriva infeciei HVB. Cu totul
altfel, este apreciat apariia precoce al anti-HBs, detecia lor n faza acut a HVB, imediat dup
dispariia AgHBs. O aa dinamic a sistemului AgHBs-anti-HBs este considerat ca un prognostic
nefavorabil i prevestete riscul apariiei HVB cu evoluie fulminant i com hiperimun.
AgHBc (AgHBcor) poate fi depistat numai n bioptatul ficatului n nucleele hepatocitelor.
n snge n form liber nu se testeaz, dar amplasarea lui cordial apreciaz imunogenitatea

Instruciuni metodice 45
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

lui major. n serul sangvin al pacienilor cu HVB acut apar precoce anticorpi anti-HBc IgM,
indicaia crora are o importan diagnostic major, fiind indicatorul principal de infec-
ie acut.
Anti-HBc IgM n serul pacienilor cu hepatit viral B acut apar foarte precoce, de-
tecia lor au o mare importan diagnostic. Anti-HBc IgM se determin deja n perioada
de incubaie, la debutul fazei acute a hepatitei virale, odat cu creterea maximal a ALT, n
perioada icteric, confirmnd replicarea activ a virusului. Pentru controlul neinvaziv anti-HBc
poate fi apreciat i n saliv avnd mare importan n medicina pediatric; n special n stadiile
tardive, cnd rezultatele testrii AgHBs sunt negative. Detecia anti-HBc IgM este un criteriu
de diagnostic a hepatitei virale B foarte important, n special n perioada ferestrei serologice
de la dispariia AgHBs i pn la apariia anti-HBs. Anti-HBc IgM poate circula n snge pe
parcursul a ctorva luni, apoi dup finisarea procesului infecios, dispare ca criteriu de elibe-
rare a organismului de VHB (vindecarea bolii). Persistena lui n snge n titre mici semnific o
infecie persistent activ sau acutizarea procesului cronic.
Anti-HBc IgG. La bolnavii cu HVB n faza acut, concomitent cu anti-HBc IgM apar i an-
ticorpii clasei IgG. Apariia anti-HBc IgG poate fi detectat de la debutul procesului infecios,
care corespunde fazei de incubaie. Dup dispariia anticorpilor IgM a VHB, ei pot circula timp
ndelungat n snge, posibil toat viaa, fiind un marcher al postinfeciei.
La reconvalesceni, dup suportarea hepatitei virale acute, anti-HBc IgG se depisteaz
concomitent cu anti-HBc IgM. La unii bolnavi cu HVB, anti-HBc IgG pot fi abseni, ceea ce
presupune o imunitate slab la infecie.
AgHBe n hepatita B acut se testeaz n snge la etapele precoce a procesului infec-
ios, la primele manifestri clinice ale hepatitei virale; frecvent la evoluia ciclic cu acutizri
a HVB. n formele uoare ale hepatitei virale, circulaia lui e tranzitorie. AgHBe, de regul,
nu se testeaz n snge la o antigenemie (AgHBs) continu. n formele grave a hepatitei B
circulaia AgHBe este mai ndelungat, ns depistarea AgHBe mai precoce dect AgHBs este
imposibil.
S-a constatat, c spre deosebire de AgHBs, depistarea AgHBe caracterizeaz activitatea
replicativ nalt a VHB. Titrele nalte ale AgHBe corespund activitii replicative nalte a ADN
viral i ntotdeauna se mbin cu detecia corpusculilor complete Dane.
AgHBe este considerat ca marcher al infeciozitii nalte a sngelui. S-a de-
monstrat, c la ptrunderea serului, care conine AgHBe n singhele persoanei aparent s-
ntoase, riscul infectrii este de cteva ori mai nalt, dect la contaminarea sngelui dup
seroconversie (dispariia AgHBe i apariia anti-HBe). Deci, indicaia AgHBe are nsemntate
nu numai diagnostic, dar i epidemiologic.
Anti-HBe n HVB acut cu evoluie ciclic se testeaz n snge n stadiile precoce. De
obicei, la un control primar la majoritatea pacienilor, AgHBe n form liber nu se apreciaz.
Peste puin timp apar anti-HBe. Ca regul, aceasta are loc la a 2-3 sptmn a perioadei ic-
terice i poate rezulta o alt fereastr serologic cu dispariia AgHBe i apariia anticorpilor
anti-HBe. Dimpotriv, persistena AgHBe constituie un indice al evoluiei bolii ctre croniciza-
re a unui proces activ (valoare predictiv nefavorabil). Anti-HBe circul n snge mai frecvent
pe parcursul a 2-5 ani, mai rar cteva luni.
Apariia seroconversiei (AgHBe - anti-HBe) indic scderea brusc a activitii procesului
infecios. Cu toate acestea, i dup apariia anti-HBe, replicarea VHB nu se stopeaz complet.
Circulaia ndelungat a anti-HBe la purttorii cronici ai AgHBs poate fi rezultatul mutaiei
VHB n zona precor cu formarea tulpinii VHBe. Este important, c seroconversia AgHBe -
anti-HBe deseori coreleaz cu creterea ALT, iar uneori i cu acutizarea procesului clinic.

46 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Figura 15. Hepatita viral B acut.

Sptmni dup expunere


Aprecierea sumar a complexului de marcheri.
Aprecierea sumar a complexului de marcheri ai HVB permite caracteristica mai ampl i
mai sigur a fazelor debutului procesului infecios, cu aprecierea profilului serologic al pacien-
ilor. La o investigare primar, diagnosticul de VHB se confirm prin detecia n snge a AgHBs,
anti-HBc IgM. n dependen de gravitatea bolii se vor testa AgHBe i ADN VHB. Rezultatele
indicrii AgHBe - anti-HBe sunt variabile. La pacienii gravi se pstreaz AgHBe, la pacienii uori
pot aprea anti-HBe sau poate s lipseasc.
n faza de reconvalescen n formele uoare a HVB cu evoluie ciclic, AgHBs deja nu se
depisteaz. n formele grave se pstreaz i se depisteaz anti-HBc IgM i IgG. La un debut pro-
gredient al infeciei HVB, se observ o circulaie stabil n snge a markerilor ADN VHB, AgHBs
i AgHBe.
Tabelul 9. Diagnosticul serologic al hepatitei virale B

Marker Perioada de Infecia acut Postinfecie Infecia Vaccinarea


incubaie cronic

AgHBs +a + - + -
AgHBe + + - +/- -
ADN-VHB + + -b +/- -
anti-HBc total - + + + -
anti-HBc IgM - + - +/-c -
anti-HBe - - +/- +/-d -
anti-HBc - - + - +

+a detectabil, +/- poate fi detectabil, -b PCR negativ, c poate fi pozitiv n 10-15% cazuri, d pacienii cu HB cronic se
detecteaz AgHBe sau anti-HBe.

Instruciuni metodice 47
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Tabelul 10. Combinarea tipic a markerilor hepatitei B i importana lor clinic

nti- nti- Anti- ADN-


AgHBs AgHBe Concluzie (diagnosticul )
HBs HBc VHB

Hepatita B acut de infeciozitate


+ - IgM + - +
majorat.
Hepatita B cronic de infeciozitate
+ - IgG + - +
majorat.
Hepatit B cronic cu infeciozitate
+ + IgG - + - /+
micorat.
Infecie cu dou subtipuri VHB sau
+ + + +/- +/- +
Seroconversie. Se ntlnete rar.
- - IgM +/- +/- + /- Hepatita acut.
Purttori de AgHBs cu replicare
- - IgG - +/- -
joas.
- + IgG - +/- - Hepatita B acut. nsntoire.
Hepatita B tratat. Reacia la
- + - - - - vaccinare mpotriva hepatitei B.
Posibil diagnostic greit.

ADN-ul virusului hepatitei virale B (ADN VHB)


Detecia ADN VHB a fost posibil n ultimii ani datorit descoperirii metodei PCR. Scopul
metodei const n efectuarea replicrii virusului in vitro. Cu ajutorul PCR se permite detectarea
cantitilor minimale de virus pn la o molecul.Volumul mediu de snge infectat, suficient pen-
tru depistarea ADN VHB a fost de 0,082 ml. ADN VHB se detecteaz la pacienii i donatorii cu
AgHBs negativi n 4,4-7,8%.
La un debut ciclic a hepatitei virale acute, ADN VHB se detecteaz n snge chiar din perioa-
da incipient a bolii. La un debut progredient, circulaia ADN HVB se depisteaz timp ndelungat.
Nivel majorat al ADN VHB la majorarea nensemnat a ALT prezint markerul unei imuniti
slabe. Indicarea prezenei ADN VHB a permis confirmarea replicrii virusului n monocite i de-
pistarea tulpinilor mutante, posibil nu numai n plasma sngelui, dar i n celulele mononucleare
circulante. ADN viral pate fi decelat i n genomul hepatocitelor, precednd dezvoltarea cance-
rului hepatic, chiar n situaia unor reacii serologice negative.
Determinarea ADN viral s-a obinut i n diferite secreii a persoanelor infectate cu VHB
(saliva, sperma).
Pentru HVB, PCR este o metod de referin care completeaz diagnosticul ELISA de scree-
ning primar, fiind un criteriu de apreciere a activitii replicative a VHB, aprecierea prognosticului,
precum indicarea i aprecierea eficacitii tratamentului cu interferon. Este necesar de menio-
nat, c PCR ca i alte metode pot da rezultate fals-pozitive. Pentru a minimaliza numrul acestor
reacii, este necesar de respectat condiiile i controlul calitii acestei reacii.
Marcherii hepatitei virale B cronice.
Depistarea markerilor specifici ai HVB are o valoare diagnostic major n diagnosticul for-
melor cronice. Persistena AgHBs timp de 6 luni i mai mult este un indice de apariie a hepatitei
virale B cronice.

48 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Figura 16. Detecia markerilor hepatitei B evoluie cronic

Criteriu de difereniere a formelor HVB cronice i aparine deteciei AgHBe. Circulaia


AgHBe n snge mai mult de 6 luni de la debutul bolii, confirm HVB cu activitate replicativ
nalt (AgHBe-pozitiv sau replicativ). Apariia seroconversiei (lipsa AgHBe i prezena anti-HBe)
concomitent cu detecia AgHBs duce la dezvoltarea HVB cronice cu activitate replicativ joas.
(AgHBe negativ - hepatit cronic negativ).
n HVB cronic cu activitate replicativ joas, n dependen de nivelul ALT, se deosebesc
hepatit viral B de tip integrativ i hepatit viral B de tip mixt -integrativ.
Tabelul 11. Criteriile de difereniere a HBV cornice de tip replicativ i integrativ
anti-HDV
Tipul
ADN-VHB AgHBe Anti-HBe Anti-HBc AgHBs ALT anti-HCV
hepatitei
anti-HAV
Replicativ + +/- -/+ + + + +
Integrativ - - + - + - -
Integrativ-
- - + - + + +
mixt

Diagnosticul hepatitei virale de tip replicativ confirm circulaia stabil a AgHBe, testarea
ADN VHB n concentraii mari (mai mult de 50pg/50l), nregistrarea n ser a anti-HBc clasa IgG
i IgM (concentraii mai mici).
Circulaia continu a anti-Hbc IgM, ndeosebi n concentraii eseniale ntr-o msur oareca-
re corespunde indicelui activitii nalte al alterrilor morfopatologice a ficatului. Dintre testele
serologice caracteristice hepatitei virale B cronice cu evaluare replicativ nalt este necesar
testarea anticorpilor anti-HBe, a ADN VHB i concentraiei CIC (AgHBe - anti-HBe). Hepatita
viral cronic B de tip integrativ decurge cu HBs-antigenemie persistent cu diferite concentra-
ii, n absena AgHBe.

Diagnosticul de laborator al hepatitei virale C


La hepatita viral C diagnosticul este bazat pe testarea markerilor antigenici i anticorpilor
respectivi, precum i detecia ARN VHC. n HVC marcherii se detecteaz prin metoda imuno-
enzimatic.
Antigenii VHC pot fi identificai numai n bioptatul ficatului. Cu ajutorul anticorpilor mo-
noclonali folosii mpotriva AgHC s-a descoperit AgHCcor n citoplasma hepatocitelor la 60-90%
bolnavi de hepatit viral C cronic. Acest antigen este codat de zonele NS3 i NS4 a genomului
ARN-VHC. Mai trziu, s-a demonstrat, c antigenul poate fi detectat numai n 5% de hepatocite.

Instruciuni metodice 49
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Antigenii VHC chiar dac i ptrund n snge, n majoritatea cazurilor, nu pot fi depistai de
ctre ELISA, datorit concentraiilor minore (nu depete 105 /ml). ns datorit test-sisteme-
lor de ultim generaie, depistarea antigenului VHC este posibil i n snge. Datorit acestor
test sisteme s-a demonstrat:
Posibilitatea deteciei AgHCcor n ser sau plasm;
Specificitatea deteciei AgHCcor;
Depistarea persoanelor cu antigen n snge la depistarea anti-VHC negativ;
Depistarea majorat (90,3%) a AgHCcor n ser la pacienii cu anti-VHC i ARN-VHC;
Corelaia direct ntre concentraia de ARN-VHC i depistarea AgHCcor;
Micorarea fazei ferestrei serologice - de la momentul infectrii pn la depistarea anti-VHC
pozitiv.
S-a determinat c, AgHCcor se detecteaz n 83% la urmtoarea zi dup depistarea ARN-
VHC i cu 26 zile pn la apariia anti-VHC.

Anticorpii VHC.
Se depisteaz anti-VHC sumar (IgM+IgG), anti VHC IgG, anti VHC IgM i anti-
NS4 (anticorpi fa de proteinele nestructurale). Pentru cercetrile de screening a
anticorpilor VHC se utilizeaz metoda imunoenzimatic, dar pentru confirmare - imunoblot.
n cazurile tipice anti-VHC apar la sfritul procesului infecios, peste 4-9 luni dup infectare
sau la 20-150 zi de boal. ns, n unele cazuri anti-VHC se depisteaz la 2-4 sptmni dup
transfuziile de snge infectat. n unele cazuri seroconversia are loc dup un an dup infec-
tare. Datorit tendinei hepatitei C spre cronicizare, anticorpii se depisteaz n snge timp
ndelungat. Anti-VHC, cu excepia anticorpilor la proteina C (anti-core clasa M) nu indic la
replicarea virusului, nu caracterizeaz activitatea lui i pot arta la o postinfecie. Trebuie de
menionat, c la recipienii de snge, pot fi identificai anti-VHC ai donatorului care la o unic
transfuzie nu n mod obligatoriu manifest despre o infectare posttransfuzional. Identificarea
anticorpilor anti-VHC, de regul, rezolv diagnosticul etiologic, dar nu caracterizeaz debutul
infeciei (acut, cronic) i nu rezolv prognosticul ei. La pacienii cu HCV cronic anti-HCV
se depisteaz n snge nu numai n form liber, ci i n componena complexelor imune cir-
culante. Concentraia este mai mare la o evaluare concomitent a hepatitelor provocate de
HBV i HCV. Anticorpii se secret la fiecare protein viral, amplasat n regiunile structurale
i nestructurale. Investigaiile de o singur dat nu ntotdeauna sunt convingtoare, avnd n
vedere posibilitatea ferestrei serologice negative. Monitorizarea procesului este destul de
important pentru stabilirea fazei acute i celei cronice a HVC. La pacienii n faza acut, la con-
trolul primar, pot fi depistai anticorpi anti-HCcor IgM i IgG, ca regul, n absena anticorpilor
la proteinele nestructurale. Investigaiile ulterioare demonstreaz dispariia anti-HCcor IgM i
creterea frecvenei depistrii anticorpilor anti-NS4 (fiind un indice favorabil al nsntoirii).
n faza de activare a HVC cronice n snge se identific anti-HCcor IgG i IgM i anticorpi la
proteinele nestructurale. Determinarea anti-HC IgM n snge n perioada acut nu depete
2 luni de la evoluia benign. Aprecierea cantitativ a concentraiei anti-HC IgM, spre deose-
bire de anti-HBc IgM este dificil datorit cantitii minore a anticorpilor i nu este utilizat
n clinic.

50 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Figura 17. Infecia acut VHC cu progresarea n infecie cronic


Titru

Figura 18. Infecia acut HCV cu nsntoire


Titru

Determinarea cantitativ a coninutului anti-HCV este important n evaluarea eficacitii


tratamentului pacienilor cu interferon. n absena markerilor antigenici a VHC pentru stabilirea
diagnosticului infeciei este necesar determinarea ARN VHC prin reacia de polimerizare n
lan (PCR).
Acidul ribonucleic al VHC (ARN VHC) - determinarea n snge a ARN VHC este cri-
teriul cel mai important n depistarea viremiei, care demonstreaz replicarea activ continu a
VHC. Determinarea ARN VHC n snge a fost numit standardul de aur al diagnosticului i
diferencierea diferitor variante ale evoluiei HVC. n faza acut a hepatitei, ARN se determin
n snge peste 1-2-sptmni dup infectare, cu mult pn la apariia anti-HC. Depistarea ARN
VHC n faza latent cu anti-HC negativ, prognozeaz spre cronicizarea procesului. Determinarea
ARN-VHC n serul sangvin i n bioptatul ficatului are o mare nsemntate n confirmarea rolului
VHC n formarea carcinomului hepatocelular.

Instruciuni metodice 51
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Tabelul 12. Combinarea tipic a markerilor hepatitei virale C i importana lor clinic
nti HCcor nti HCcor
nti - NS-IgG Interpretarea rezultatelor cu ajutorul ELISA
IgM IgG

+ + Se presupune hepatit C acut.

1. nsntoire
+ 2. Stadiul de trecere n hepatit C cronic (faza
latent)
1. nsntoire
+ +
2. Faza latent a hepatitei C cronice
1. Acutizarea n faza latent a hepatitei C virale
+ + +
2. Faza de reactivare

Tabelul 13. nsemntatea diagnostic a markerilor hepatitei C virale


Confirmare
Diag- Monito Prognostic Examinri
Serviciul diagnostic
Marker nosticul rizare eficacitate epidemio
snge poz. anti
maladiii tratament. tratament logice
HC

Anti-HC + + +

Spectrul anti-HC + + + +

anti-HC IgM + + + +

AgHCcore + + + + +

ARN-VHC + + + + +
A R N - V H C
+ +
Cantitatea
Genotipul VHC + +

Serotipul VHC + +

Diagnosticul de laborator al hepatitei virale D


Evoluia VHD este dependent de prezena/absena VHB n materialul infectat sau n organis-
mul susceptibil. n organismul uman infecia cu VHD se poate ntlni n dou forme principale
- coinfecie (infectarea concomitent cu ambele virusuri - VHB i VHD) i suprainfecie (in-
fectarea cu VHD la prezena deja a infeciei cu VHB).
Diagnosticul hepatitei virale D se confirm prin detectarea markerilor infeciei cu VHD:
a) antigenul viral al VHD (AgHD) n ser prin metodele RIA, ELISA i Western-blot; n probele bioptice
prin IFA n nucleul sau citoplasma hepatocitelor infectate.
b) anticorpi anti-HD de tip IgM i IgG sunt detectai prin ELISA sau RIA.
c) ARN VHD. ARN VHD se detecteaz prin metoda PCR sau prin hibridizarea in situ. Prezena ARN VHD
n ser este indicator de viremie. ARN-VHD se depisteaz n snge n toate variantele HVD Coinfecie
i HVD Suprainfecie. Indicarea ARN- VHD n snge i mai ales n bioptatul ficatului prezint metoda
de elecie a diagnosticului de HVD, comparativ cu testele serologice.

n hepatita acut rezultat prin coinfecie se va urmri apariia AgHD n prima perioad de
boal, apoi aceea a anti-VHD IgM i anti-HBc IgM (marker de infecie cu VHB). n coinfecie,
prezena anti-VHD IgM este tranzitorie.

52 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Consecutiv, suprainfeciei, se va constata c markerii infeciei cu VHD se vor suprapune markeri-


lor indicatori de infecie cronic cu VHB. Astfel, la AgHBs existent n ser se va determina prezena
AgHD, anti-HD IgM i anti-HD IgG. Anti-HD IgM poate persista perioade ndelungate. Caracte-
ristic este absena de anti-HBc.
n hepatitele fulminante, markerii VHD nu sunt detectabili n ser, ci numai n hepatocite.
Figura 19. Detecia markerilor HBV-HDV Coinfecie

Figura 20. Detecia markerilor HBV-HDV Suprainfecie

Acidul ribonucleic al VHD (ARN VHD).


Indicarea ARN VHD ca i n HVB poate fi identificat n snge n faza iniial cu ajutorul PCR.
ARN VHD se depisteaz n snge n toate variantele VHD - Co-i Suprainfecie. Indicarea ARN
VHD n snge i mai ales n bioptatul ficatului prezint metoda de arbritaj a diagnosticului de
HVD i aprecierea activitii procesului infecios.

Instruciuni metodice 53
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

3.2 Diagnosticul biochimic al hepatitelor virale


Pentru identificarea tulburrilor funcionale celulare ale ficatului se folosesc investigaii bio-
chimice, care cuprind:
Teste enzimatice;
Testele metabolismului bilirubinei,
Testele de disproteinemie.

Aceti indici sunt nespecifici i nu caracterizeaz etiologia hepatitelor virale, ns prezint


importan n diagnosticul primar al hepatitelor virale i monitorizarea lor, fiind folosite pentru
punerea n eviden a modificrilor patobiochimice ce se produc la nivelul celulelor hepatice.

Testele enzimatice
Dozrile de enzime serice i gsesc o larg aplicabilitate n bolile ficatului, n esen, astfel de
determinri pot oferi informaii cu privire la urmtoarele aspecte ale patologiei hepatice:
1) Detectarea unei creteri patologice a permeabilitii membranei hepatocitului (AST, ALT, GLDH,
LDH4-5).
2) Depistarea unei insuficiene a sintezei de proteine n hepatocite (pseudocolinesteraza seric i
enzime cu rol n coagularea sngelui).
3) Indicii cu privire la existena unui proces de colestaz (FA i GGT).
4) Indicii cu privire la o eventual inducere de enzime (ca exemplu tipic GGT)

Aminotransferazele
ALT seric B. 10-40UI/l); F. 7 35 UI/l;
AST seric B. 15-40UI/l); F. 13 35 UI/l;

Alaninaminotransferaza (ALT) i aspartataminotransferaza (AST) sunt pe larg rs-


pndite n celulele ntregului organism.
AST se gsete n special n ficat, miocard i muchii striai. Cantiti mai reduse de enzim
se gsesc i n rinichi, pancreas, plmni i eritrocite.
ALT se gsete n cantiti mari n citoplasma celulelor hepatice i n cantiti mai reduse n
musculatura striat, miocard, rinichi i pancreas. Activitatea AST i ALT n ficat este de aproxi-
mativ 7000 i 3000 ori respectiv mai mare dect activitatea n serul sanguin. ALT se ntlnete
exclusiv n form citoplasmatic; AST n hepatocite se gsete att n citozol (60% activitate), ct
i n mitocondrii (40% activitate). n norm se determin doar forma citozolic a AST, nu i cea
de provenien mitocondrial. AST este mai rapid metabolizat avnd un timp de njumtire
(T/2) de numai 17 5 ore, pe cnd ALT are T/2 de 47 10 ore.
Activitatea AST i ALT poate fi influenat de un ir de ali factori, diferii de bolile hepatice,
care vor fi luai n consideraie la interpretarea rezultatelor de laborator. La persoanele adulte,
activitatea AST i ALT este mai nalt la brbai dect la femei. Pn la vrsta de aproximativ 15
ani, activitatea AST este mai nalt dect cea a ALT, cu schimbarea situaiei ctre vrsta de 15 ani
la brbai i 20 ani la femei cnd nivelul AST tinde a fi mai diminuat dect cel al ALT, iar dup 60
ani ele devin aproape egale. Activitatea ALT la femeile de vrst fertil poart un caracter ciclic,
fiind corelat de ritmurile lunare ale hormonilor sexuali. La femeile sntoase increia maximal
a estradiolului se constat n vrful ovulator (a 12-a zi de la nceputul ciclului menstrual). Di-
namica activitii ALT este asemntoare cu cea a estradiolului. n vrful ovulator al ciclului
menstrual activitatea ALT depete valorile normale aproape de 1,5 ori. O anumit corelaie
dintre nivelul activitii ALT i increia estrogenilor a fost depistat i la pacientele cu hepatit

54 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

viral, fapt ce trebuie luat n consideraie la externarea din staionar i dispensarizarea lor ulte-
rioar. Pentru excluderea eventualelor erori la interpretarea valorilor sporite ale ALT n aceste
cazuri se recomand de a nu efectua dozarea ALT n perioada vrfului ovulator.
Tabelul 14. Factorii ce afecteaz activitatea AST i ALT n lipsa afeciunilor hepatice

factorii AST ALT COMENTARII


Nu sunt diferene
n 45% cazuri variaz pe semnificative pe parcursul
n timpul parcursul zilei, fiind mai zilei ntre orele 9
-
zilei nalt nainte de mas i dimineaa i 9 seara, att
mai sczut seara n afeciunile hepatice, ct
i la cei sntoi
Variaii similare se
Variaiile de la o zi constat, att n
Variaiile de la o zi la alta
Din zi n zi la alta constituie afeciunile hepatice, ct i
constituie 10-30%. la cei sntoi, vrstnici i
5-10%
tineri
Valori mai mari la brbai, Aceeai corelaie dintre
dect la femei. La femeile nivelul activitii ALT
Valori mai mari la
de vrst fertil crete i increia estrogenilor
Sexul brbai dect la
de 1,5 ori n perioada a fost depistat i la
femei pacientele cu hepatit
vrfului ovulator al
ciclului menstrual. viral

Indicele Corelaie direct ntre


Valori cu 40-50% Valori cu 40-50% mai
de mas masa corporal i
mai sporite la cei mare la cei cu IMC
corporal transaminazele AST i
cu IMC majorat majorat ALT
(IMC)
Cu 20% mai sczut
la persoanele supuse
Crete de 3 ori Efectul efortului fizic este
efortului fizic obinuit
la persoanele mai evident la brbai;
Efortul fizic dect la cei care nu se
ocupate cu lucrul diferene foarte mici la
ocup cu lucrul fizic sau femei (<10%)
fizic intens
supuse efortului fizic
intens
- stabil la
temperatura - stabil la temperatura Stabil n cazul separrii
Modul de camerei 24 ore; camerei - 24 ore; serului de celulele
pstrare - la +4 0C- 21 sanguine
- la +4 0C timp de 21 zile
zile,descrete cu descrete cu 10-15%
<10%
Valorile depind de gradul
Hemoliza, hemolizei, ele fiind de
Induc creteri Induc creteri
anemia obicei, de cteva ori mai
semnificative semnificative reduse dect creterea
hemolitic
LDH
Afeciuni Crete Proporional cu gradul
Crete moderat
musculare semnificativ creterii CK

Instruciuni metodice 55
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Bolile hepatice sunt cea mai important cauz a activitii sporite a ALT i o cauz frecvent
a majorrii AST, de aceea aceti indici pot fi folosii ca marcheri ai sindromului citolitic, deoarece
aceste enzime sunt eliberate n urma leziunilor hepatocelulare. ALT i AST pot fi apreciate ca
un adevrat seismograf al leziunilor hepatice (Bruhl). De menionat c, ALT este mai specific
pentru afeciunile hepatice dect AST, de aceea ea este deseori numit transaminaza hepatic.
Modificrile enzimatice din bolile ficatului depind de acuitatea procesului, de meca-
nismul de producere a leziunii (inflamaie sau necroz), de gradul n care, parenchimul hepatic
a fost nlocuit cu esutul conjunctiv, de funcia proteosintetic a ficatului i de terapia aplicat.
n majoritatea bolilor de ficat, activitatea ALT este mai nalt dect cea a AST, excepie este
hepatita alcoolic, n care se determin activitatea mai nalt a AST.
Hepatitele acute virale se caracterizeaz prin creterea progresiv a transaminazelor serice i
n special a ALT, fenomen care se constat i n caz de hepatit anicterogen. Se poate afirma c
nu exist hepatit acut, fr modificri ale transaminazelor. Creterea acestor enzime ncepe
n perioada de prodrom, nainte de creterea bilirubinei, iar n cursul primelor dou sptmni
ale perioadei icterice atinge valori maxime: ALT creste de 25-50 de ori dect valorile normale,
iar AST de 15-30 ori dect valorile normale. Creterea ALT nu implic numaidect o necroz a
celulelor, ci doar o cretere a permeabilitii membranei hepatocitului. Valori excesiv de mari i
n special o cretere la fel de exprimat a AST i a ALT denot existena unei hepatite severe cu
zone extinse de necroz. In astfel de cazuri crete i GLDH (enzima mitocondrial).
n hepatitele virale acute valorile enzimelor cresc la peste 400 UI ajungnd la cifre de 1000-
2000 UI. n hepatita viral A transaminazele ajung cifre nalte chiar de la nceputul bolii i scad
rapid. n hepatita viral B creterea transaminazelor este moderat, cifrele cresc lent pe parcur-
sul unei luni sau a ctorva luni de zile. Importana testelor enzimatice, n special dozarea ALT
i AST const n aceea c acestea prezint criterii precoce de confirmare a diagnosticului de
hepatit acut, n special n focarul epidemiologic. Determinrile seriate reflect evoluia clinic
a afeciunii hepatice.
O importan prognostic mai mare dect gradul de cretere al transaminazelor se atribuie
duratei acestei creteri.
Lipsa tendinei de normalizare a ALT-ului dup 8-10 sptmni de boal este un
indiciu de trecere spre hepatita persistent.
Nu se poate vorbi despre o vindecare a hepatitei acute, dect atunci cnd transaminazele
s-au normalizat i rmn normale, chiar i dup eforturi moderate.
Creterea rapid i marcat a AST i ALT (> 600 UI/l i adesea > 2 000 UI/1), urmat de o
scdere abrupt n decurs de 12-72 ore, este considerat caracteristic pentru obstrucia acut
a ductelor biliare. Creterea brusc a AST poate aprea i n hepatita acut viral fulminant (rar
> 4 000 UI/1, dar scade mai lent; n plus, testele serologice sunt pozitive) i n leziunile acute de
etiologie chimic.
Creterea uoar a nivelurilor AST i ALT (de obicei < 500 UI/1) asociat cu creterea FA
> 3 ori fa de valoarea normal sugereaz icter colestatic, iar o cretere mai important a AST
i ALT (mai ales > l 000 UI/1) asociat cu o cretere a FA < 3 ori comparativ cu norma indic
icter hepatocelular.
Determinarea concomitent a ambelor enzime permite aprecierea genezei hiperenzine-
miei, deseori calculndu-se coeficientul AST/ALT, n norm acesta fiind egal aproximativ cu
1,0-1,3.
micorarea lui (0,7) confirm geneza hepatic a hiperenzinemiei.
majorarea acestui indice (1,3) are alt genez.
De menionat totui c, atunci cnd leziunile celulelor hepatice capt un caracter necroti-
zant, raportul amintit crete, ntruct majorarea activitii ALT se asociaz cu o cretere i mai
exprimat a AST, fiind mrite i valorile enzimei mitocondriale GLDH.

56 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Aceste distorsiuni ale rapoartelor AST/ALT se explic prin urmtoarele:


n cazul unor leziuni moderate care afecteaz doar permebilitatea membranei hepatocitelor se
produce scurgerea din celule a enzimelor citozolice, aa cum este ALT, pe cnd n cazul unor leziuni
cu caracter necrotizant se elibereaz din celule i enzimele mitocondriale (de exemplu GLDH), iar
AST, cu localizare bilocular (citozolic i mitocondrial), crete mai mult dect ALT;
timpul de njumtire (T/2) al ALT este mai prelungit, de aceea aceast enzim persist n ser mai
mult dect AST, al crui timp de njumtire este mai scurt. Ca urmare, n hepatita acut viral, cnd
survine o lezare destul de rapid dar relativ moderat a unui mare numr de hepatocite, dup cum
s-a menionat mai nainte, creterea transaminazelor depete de 15-100 de ori limita superioar a
normalului (n mediu de 50 ori), iar de regul ALT > AST.
n hepatita cronic progresiv transaminazele cresc de cel mult 20 ori fa de limita superi-
oar a normalului (valori ntre 5-20), iar n procesele necrotice AST > ALT.
Hepatita cronic stabilizat se nsoete de regul de creteri mai puin exprimate ale aces-
tor enzime (2-3 ori de la limita superioar a normalului) i de obicei ALT > AST.
AST crete n infarctul de miocard acut (IMA) i n afeciunile musculare, situaii n care ALT este
normal.

Recomandri:

Se impune standardizarea valorilor de referin ale ALT ntre diferite laboratoare, o necesitate
prioritar pentru evaluarea pacientului i interpretarea rezultatelor investigaiilor. Se consider
adecvate pentru uzul clinic urmtoarele performane ale dozrii transaminazelor: eroarea
analitic a valorilor limitei superioare de referin a dozrii ALT 10%, iar pentru AST eroarea
total 15-20%.

Laboratoarele vor folosi valori de referin separate att pentru maturi - brbai i femei,
ct i pentru copii i vrstnicii de peste 60 ani. Activitatea ALT la femei este supus influenei
ciclurilor lunare, de aceea pentru excluderea eventualelor erori la interpretarea rezultatelor
nu se recomand dozarea ALT n perioada vrfului ovulator

Cazurile cnd se depisteaz creterea inexplicabil ale ALT i/sau AST vor fi evaluate prin
testri repetate; n cazurile individuale de expunere la un efort fizic major se va efectua
testarea repetat dup o perioad de sistare a efortului fizic. Pentru a determina intervalul
necesar de timp sunt necesare studii suplimentare.

GLUTAMATDEHIDROGENAZA (GLDH) este o enzim localizat cu predominan n


ficat i mai precis la nivelul mitocondriilor acestui organ. Creteri exprimate ale GLDH survin
n caz de necroze ale celulelor hepatice. Creteri moderate pot surveni n primele zile ale unei
colici biliare.

PSEUDOCOLINESTERAZA

Pseudocolinesteraza seric (PCE) 130-300 UI/L (la t 25 0C)

Pseudocolinesteraza (acilcolinacil hidrolaza, PCE) este o enzim care catalizeaz reacia de


hidroliz a esterilor colinei, se sintetizeaz n ficat, fiind apoi secretat activ n plasma sangvin.
De menionat, c modificrile serice ale enzimelor celulare nu dau indicii asupra strii func-
ionale a ficatului. Aceasta poate fi ins explorat prin urmrirea nivelului pseudocolinesterazei
serice, care reflect funcia proteosintetic a ficatului.

Instruciuni metodice 57
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Hepatita acut este nsoit de o scdere moderat a PCE serice, fenomen care denot o alterare
a funciei proteosintetice a ficatului, dnd indicii asupra gravitii procesului. In perioada de vindecare a
unei hepatite acute se constat de regul o cretere a pseudocolinesterazei care adeseori depete
valorile normale i indic un prognostic favorabil. Dimpotriv scderea progresiv a acestei enzime
indic un proces de atrofie a celulelor hepatice i anun instalarea comei hepatice.
PCE scade mult n insuficienele hepatice (hepatite, ciroze), n insuficiena cardiac cu ficat de
staz, n intoxicaiile cu organofosforice (unele insecticide) i la bolnavi cu denutriie proteic grav.
Scderi moderate se pot ntlni n anemii severe (mai ales megaloblastice), precum i n reacia de
faz acut (n infecii acute, postoperator sau dup un infarct miocardic).
n tabelul 15 sunt trecute principalele situaii care duc la modificri ale activitii PCE serice.
Tabel 15 Modificrile activitii serice a pseudocolinesterazei n diverse situaii i stri patologice

Scderi Creteri
- Insuficiena hepatic (hepatite, ciroze) - Perioada de vindecare a unei hepatite acute
- Ficat de staz - Sindromul nefrotic
- Denutriie proteic - Hipertiroidism (fr caexie)
- Malabsorbie - Diabet cu suprapondere
- Anemii severe (mai ales megaloblastice) - Obezitate (mai ales android)
- Hipotiroidism sever - Hiperlipoproteinemie tip II b sau IV
- Reacie de faz acut (infecii acute,
postoperator, infarct miocardic)
- Impregnare tumoral
- Intoxicaii cu pesticide organofosforice
- Sarcin
- Contraceptive orale
- Scderi cu caracter genetic

Indicatorii cei mai utilizai pentru depistarea unei reduceri a proteosintezei hepatice n afar
de PCE sunt albumina seric i factorii coagulrii dependeni de vitamina K.
Testarea altor enzime ca fosfataza alcalin, gama-glutamiltranspeptidaza, 5-nu-
cleotidaza, lactatdehidrogenaza sunt utile pentru diagnosticul difereniat al hepati-
telor virale cu alte hepatite i patologii de origine diferit.

Fosfataza alcalin
FA seric (metoda de referin recomandat de CLIA i IFCC, substrat
para-nitrofenilfosfat, AMP, 37 0C).
B.( 25-50 ani)- 53-128 UI/l;
F. (25-50 ani) - 42-98 UI/l;
copii (3-17 ani) pn la 350 UI/l.
Fosfataza alcalina (FA) fosfohidrolaza monoesterilor acidului ortofosforic hidrolizeaz
fosfaii organici la un pH alcalin. n norm valorile FA difer puin ntre brbaii i femeile adulte
ntre 25 i 60 ani. Dup 60 ani, valorile de referin cresc la femei, dei studiile nu au determinat

58 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

o corelaie elocvent ntre osteoporoza (frecvent ntlnit la femei la aceast vrst) i sporirea
activitii fosfatazei alcaline n serul sanguin.
Agenii helatori, cum ar fi citratul, oxalatul sau EDTA leag cationii de zinc i magneziu, co-
factori necesari ai activitii FA i pot cauza valori fals sczute, chiar pn la zero. Transfuziile de
snge (coninnd citrat) conduc, printr-un mecanism similar, la o micorare tranzitorie a FA.
Determinrile efectuate de rutin n clinic msoar o sum a activitii mai multor izoenzi-
me de provenien hepatic, osoas, renal, precum i eliberate din peretele intestinal. La femei
fosfataza alcalin poate proveni i din glanda mamar i din placent.
Tabelul 16. Factorii ce afecteaz activitatea fosfatazei alcaline n lipsa afeciunilor hepatice

factorii Fosfataza alcalin COMENTARII


Variaii similare se constat n
Variaiile de la o zi la alta constituie
De la zi la zi afeciunile hepatice i n lipsa
5-10% lor; la vrstnici i cei tineri
n special la persoanele cu
Primirea grupa de snge B i O valorile
Crete pn la 30 UI/l
alimentelor rmn crescute pn la 12 ore
dup ingerarea alimentelor.
Indicele
de mas Valori cu 25% mai mare la cei cu IMC
-
corporal mrit
(IMC)
Stabil la pstrarea la 0 - +4 0C pn La dezghearea probelor
Modul de la 3 zile; ngheate valorile pot crete
pstrare cu 30%.
Stabil la -25 0C 30 zile
Hemoglobina inhib activitatea
Hemoliza -
enzimei
Creterea este determinat
Sarcina Crete de 2-3 ori n al 3-lea trimestru de prezena izoenzimelor
placentei i oaselor
Fumatul Crete valoarea cu 10% -
Contracep
Descresc valorile cu 20% -
tivele orale
Valori crescute se constat Natura hepatic a FA poate
n afeciunile osoase, tumori fi confirmat prin dozarea
Altele (marcher nespecific al tumorilor). izoenzimelor ei i a altor
Descrete dup enterite severe la enzime colestatice - GGT, LAP,
copii i n hipofosfatemie 5-nucleotidaza

Cea mai mare parte din FA seric deriv din oase. Fosfataza alcalin osoas este produs n osteo-
blati i are rol n formarea esutului osos. Aceast fosfataz alcalin osoas cu masa molecular mare
nu se elimin prin bil, fiind probabil catabolizat n celulele sistemului de macrofage fagocitare.
n absena afeciunilor osoase sau a sarcinii, creterea FA serice indic afectarea funciei
excretorii hepatice. Creterile activitii fosfatazei alcaline n afeciunile biliare se datoreaz
reteniei FA produse de celulele care mrginesc cile (ductele) biliare. FA atinge valori de peste
3-10 ori n obstrucia biliar extrahepatic, colestaza intrahepatic sau ciroza biliar primar.

Instruciuni metodice 59
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Este cel mai bun marker al obstruciei biliare, dar nu difereniaz colestaza intrahepatic de
obstrucia extrahepatic.
n hepatita viral sau alte hepatopatii parenchimatoase, fosfataza alcalin depete de 1,5 - 2
ori norma. Creteri de peste 2-10 ori fa de norm, pe fonul celorlalte teste funcionale hepa-
tice normale, sugereaz existena unor metastaze hepatice sau boli infiltrative hepatice maligne
de tipul leucemiei, limfomului sau infecii hepatice cu fungi sau Criptosporidium.
Creterile de fosfataza alcalin n afeciunile hepatobiliare se nsoesc de o cretere a gama-
glutamiltransferazei (GGT), 5-nucleotidazei (5-NT) i leucinaminopeptidazei (LAP) care se eli-
min tot prin bil. n aceste cazuri, nivelurile serice ale GGT, 5 -NT i LAP cresc n paralel cu
nivelul seric al FA, dar GGT i 5-NT sunt normale n sarcin i n afeciunile osoase, n timp ce
LAP este crescut n sarcin, dar este de obicei normal n afeciunile osoase.
Principala metod de difereniere a sursei fosfatazei alcaline crescute este fracionarea sa. Se-
pararea formelor tisulare nespecifice de FA (os, ficat, i rinichi) este dificil, acestea fiind similare
ca structur. Fraciunea hepatic este termostabil, iar cea osoas termolabil. FA specific osoas
poate fi determinat prin inactivare cu cldur, prin metode imunologice i electroforetice.
Atunci, cnd nu sunt condiii pentru diferenierea izoenzimei hepatice de cea osoas se
recomand explorarea activitii serice a gama-glutamiltransferazei. Astfel, creterea concomi-
tent a FA i GGT atrag atenia spre o origine hepatic a FA n cadrul unei colestaze, pe cnd o
cretere izolat a FA poate sugera izoenzima de origine osoas.

Recomandri:
Valori de referin vor fi stabilite separat n dependen de vrst i sex, pentru femeile
nsrcinate.
Probele pentru dozarea fosfatazei alcaline se vor colecta dimineaa pe nemncate. n caz
contrar, pacienii cu valori uor elevate vor fi reevaluai repetat pe nemncate.
Atunci cnd sursa activitii sporite a fosfatazei alcaline nu este evident din datele clinice i
de laborator este necesar de a determina activitatea altor enzime indicatoare ale colestazei
GGT, 5-nucleotidaza, leucinaminopeptidaza.

Gama - GlutamilTransferaza
Gama-glutamiltransferaza seric B - 8-35 UI/l); F - 5-25 UI/l)
Gama-glutamiltransferaza la copii nou-nascui este de 3-5 ori mai mare

Gama-glutamiltransferaza (gama-glutamiltranspeptidaza, GGT, CE 2.3.2.2) - catalizeaz


transferul gruprii gama-glutamil de pe un peptid pe un alt peptid sau pe un aminoacid. Prin acest
mecanism enzima intervine n sintezele proteice i n retroresorbia tubular a acizilor aminai
din filtratul glomerular. Enzima este localizat mai ales n rinichi, veziculele seminale, ficat, cile
biliare i pancreas (ductulii i celulele acinare), intestine.
Valoarea diagnostic a GGT const n special n creterea impresionant a activitii sale n
serul bolnavilor cu retenie biliar. Astfel, n timp ce fosfataza alcalin creste de aproximativ trei-
cinci ori fa de limita superioar a normalului, GGT depete aceast limit de 10-30 ori, fr
a prezenta modificri n afeciunile osoase. Titrul GGT este normal n afeciunile osoase i n
sarcin. n schimb, creteri ale GGT se ntlnesc i n suferine ale hepatocitului, ca de exemplu
n hepatite cronice, neoplasm primitiv sau metastatic al ficatului, ficat gras, insuficien cardiac
cu staz hepatic precum i boli ale pancreasului. Creterile moderate constatate n infarctele
miocardice par a fi secundare unei congestii hepatice cauzat de tulburrile circulatorii.

60 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Creterea izolat a GGT este un test sensibil de screening i de monitorizare n


cazurile de alcoolism. De menionat c creterea nivelului GGT determinat de alcool sau de
anticonvulsivante nu este nsoit de creterea FA. Se consider c aceste modificri ale GGT
n ser reprezint un rezultat al inducerii microzomale de enzim. Cu alte cuvinte staza biliar,
alcoolul sau barbituricele ar stimula sinteza de enzim n ficat crescnd eventual permeabilitatea
membranelor microzomale. Merit semnalat i faptul c GGT este uor crescut (1,5-2 ori
fa de limita superioar a normalului) i n serul subiecilor cu hipertrigliceridemie sugernd o
stimulare a proteosintezelor hepatice la aceti subieci. n acest sens, trebuie artat c n cirozele
atrofice cu deficit exprimat de proteosintez (pseudocolinesteraza mult sczut), activitatea
GGT n ser este mai joas dect n cirozele compensate care evolueaz cu ficat mrit.

Tabelul 17. Factorii ce afecteaz activitatea GGT n lipsa afeciunilor hepatice


factorii modificrile COMENTARII
Modificri similare se constat,
att n afeciunile hepatice, ct i
De la zi la zi Variaiile constituie 10-15%
n lipsa lor, la persoanele n vrst
i cei tineri
Valori mai mari cu 25% la cei cu IMC
Indicele de mas moderat crescut; Diferene similare att la brbai,
corporal (IMC) Valori mai mari cu 50% la cei cu IMC > ct i la femei
30
Stabil la pstrarea la 0-4 0C pn la 3 zile;
Modul de pstrare -
la - 25 0C - 30 zile
Valori mai sczute cu 25% n perioada
Sarcina -
timpurie a graviditii
Crete la administrarea carbamazepinei,
Valorile cresc de 2 ori comparativ
cimetidinei, furosemidei, fenobarbitalului,
Preparatele cu limitele de referin generale.
ibuprofenului, methotrexatului,
medicamentoase La phenytoin poate crete de 5 ori
phenitoinei, contraceptivelor orale, acid
i mai mult.
valproic, etc.
Crete cu 10% la 1 pachet/zi;
Fumatul aproximativ de 2 ori mai mare n fumatul
intens
Nivelul poate fi crescut pentru
Relaii directe ntre consumul de cteva sptmni dup stoparea
Consumul de alcool
alcool i GGT consumului de alcool n
alcoolismul cronic

Creteri importante ale GGT i FA se ntlnesc n leptospiroza icterohemoragic (boala


Weil), n intoxicaia cu clorpromazin i n tumorile primitive sau metastatice ale ficatului.
Creterea progresiv de FA i GGT la un bolnav fr icter sugereaz dezvoltarea unui proces
malign care trebuie documentat prin imagistic i explorarea radiologic a tubului digestiv. Pe de
alt parte, n cazurile n care tumora hepatic comprim sau obstrueaz coledocul se vor dez-
volta toate manifestrile unei colestaze extrahepatice (icter mecanic), iar creterea progresiv a
GGT i FA se asociaz cu hiperbilirubinemie (bilirubin conjugat) i cu creterea acizilor biliari
n ser.
n bolile obstructive ale ficatului GGT crete n mediu de 12 ori, pe cnd FA - n mediu de
3 ori. Creterea GGT se constat la 80-95% de pacieni cu diverse forme de hepatit acut.
Pacienii cu diabet, hipertiroidism, artrit reumatoid i boli pulmonare obstructive deseori au

Instruciuni metodice 61
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

valori crescute ale GGT, cauzele acestui fapt sunt neclare. GGT poate rmne anormal timp
de sptmni dup un infarct miocardic acut. Cele relatate mai sus mrturisesc despre valoarea
predictiv i specificitatea joas a GGT pentru bolile hepatice.
GGT este considerat cel mai senzitiv test de screening pentru alcoolism, totodat, GGT este un
indicator mai sensibil n comparaie cu fosfataza alcalin n afeciunile hepatice la copii.

Recomandri:
Se recomand ca probele pentru determinarea GGT s se colecteze dimineaa pe nemncate.
Se vor stabili valori de referin separate pentru brbaii aduli, pentru diferite categorii de
vrst la femei i copii.
Din cauza specificitii joase, dozarea GGT se va efectua doar cu scopul determinrii sursei
de fosfataz alcalin majorat, atunci cnd este necesar de a confirma originea hepatic a FA.

Lactatdehidrogenaza
Lactatdehidrogenaza seric aduli 130-300 UI/L; nou-nscui - 415 690 UI/l

Lactatdehidrogenaza (LDH) (L-lactat-NAD-oxidreductaza. CE 1.1.1.27) este o enzim care


conine zinc i catalizeaz reversibil oxidarea lactatului n piruvat.
LDH se gsete n cantiti mari n muchiul striat, ficat, miocard, rinichi i ganglionii limfatici
i n cantiti mai reduse n pancreas, eritrocite i plmni. Din aceast cauz creterea activitii
LDH se ntlnete n mai multe boli, cea ce face dificil interpretarea rezultatelor obinute.
LDH poate fi separat n cinci izoenzime, iar determinrile spectrului izoenzimatic au o impor-
tan diagnostic mai mare, deoarece fiecare organ sau esut are un spectru izoenzimatic specific.
Creteri marcate ale activitii serice ale LDH se constat n necroza toxic a ficatului, tu-
mori hepatice, ficatul metastazat, infarctul miocardic i unele boli hematologice (anemia perni-
cioas, leucemiile acute).
Creteri moderate se noteaz n hepatita virotic, boli ale musculaturii scheletice, infarct
pulmonar, mononucleoza infecioas, hemoliza acut i, uneori, n accidente cerebrale. Studiul
izoenzimelor arat o cretere a fraciunilor LDH1 i LDH2 n afectarea miocardului i a fraciu-
nilor LDH4 i LDH5 n leziunile hepatice.
Pentru investigarea diferitor leziuni ale hepatocitelor n afar de cele menionate, se deter-
min i activitatea enzimelor organospecifice ale ficatului:
Sorbitoldehidrogenaza;
Fructoza-1-monofosfat aldolaza;
Ornitincarbamoiltransferaza;
Urokinaza.
Spre deosebire de aminotransferaze aceste enzime se localizeaz numai n hepatocite, n alte
esuturi ele sunt prezente n cantiti foarte mici sau lipsesc totalmente. Prin urmare, creterea
tuturor acestor enzime n snge constituie un indiciu de leziune celular hepatic. ns, ca teste
diagnostice sunt mai puin sensibile comparativ cu ALT. Provenind n special din ficat, ele nu ofe-
r mult n plus fa de datele furnizate de enzimele celulare determinate de rutin i de aceea
sunt rar utilizate. Interpretate n lumina datelor clinice, determinrile de transaminaze sunt ns
suficiente pentru diagnostic.
Modificrile testelor enzimatice serice n unele disfuncii hepatice
Leziunile toxice ale ficatului (intoxicaii cu tetraclorur de carbon, intoxicaii cu ciuperci, into-
xicaii alcoolice) se nsoesc de creteri majore ale enzimelor celulare n ser. Gradul de cretere

62 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

al enzimelor celulare n ser n astfel de intoxicaii este LDH >AST >ALT>GLDH, pe cnd n
afeciunile inflamatorii ale ficatului (hepatite), ordinea este ALT > AST > LDH> GLDH.
Hepatitele cronice se caracterizeaz prin valoarea moderat crescut a transaminazelor serice
(20-100 UI/l). n aceste situaii trebuie efectuate i testele de disproteinemie pentru explorarea
mezenchimului hepatic.
n cirozele hepatice creterea enzimelor este de regul moderat, deoarece masa celular
este redus. Diminuarea sintezelor proteice la nivelul ficatului n ciroz duce la o srcire a ce-
lulelor n ALT astfel nct n formele avansate ale unor ciroze aceast enzim nu mai crete nici
mcar n cursul exacerbrilor acute.
Tumorile hepatice nu dau modificri enzimatice caracteristice, dar n ficatul metastazat se
constat o cretere moderat a transaminazelor i totodat o cretere marcat a LDH i GGT.
Fosfataza alcalin i bilirubina cresc n funcie de gradul n care se perturb eliminarea bilei.
n bolile sistemice, precum LES, sarcoidoza,TBC, bruceloza, siclemia se nregistreaz anomalii
ale testelor funcionale hepatice.

Testele metabolismului PIGMENILOR BILIARI


Bilirubina seric: total 8,5-20,5 mkmoli/l
conjugat, direct 2,2-5,1 mkmoli/l
Bilirubina, componenta cea mai important a bilei, provine din distrugerea hemoglobinei, care
are loc n sistemul macrofagal n diferite organe i esuturi ale organismului, inclusiv i n ficat.
Conversia hemoglobinei n bilirubin se face prin urmtoarele etape:
desfacerea inelului tetrapirolic al hemului sub aciunea unui sistem enzimatic denumit hemoxigenaz,
cu formare de verdoglobin sau coleglobin de culoare verde la nivelul sistemului macrofagal;
pierderea fierului de ctre coleglobin, cu formarea biliverdin-globinei;
detaarea globinei din complexul biliverdin-globina i eliberarea biliverdinei, albastr-verzuie, care este
redus de ctre biliverdin-reductaz n bilirubina neconjugat (indirect) de culoare roie. Bilirubina
neconjugat (indirect) format la nivelul macrofagelor trece n snge. Ea este toxic i insolubil n
ap, dar solubil n lipide i solvenii organici. Transformarea hemului n bilirubin decurge rapid n
decurs de 2-3 ore;
n snge bilirubina se leag reversibil cu albuminele plasmatice i este transportat spre ficat.
Legarea bilirubinei de albumina poate fi inhibat de o serie de medicamente (sulfanilamide, unele
antiinflamatoare, substane de contrast utilizate n colangiografie, etc) i, de asemenea, de prezena
n plasm a unor cantiti mari de acizi grai liberi. Acetia determin modificri conformaionale
n structura albuminei serice, avnd ca rezultat diminuarea capacitii de legare a bilirubinei. Din
motivele menionate, capacitatea de legare a bilirubinei de ctre albumina seric este limitat (circa
25 mg bilirubina legat n sngele unui adult). Dac bilirubina produs n alte esuturi dect n ficat
depete capacitatea de transport de ctre snge, ea difuzeaz n esuturi.
Urmtoarele etape de transformare a bilirubinei neconjugate (indirecte) au loc n hepatocite:
ntrnd n contact cu celula hepatic, bilirubina se detaeaz de albuminele plasmatice, fiind fixat de
anumite proteine din membrana celular notate Y (nimit ligandin) i Z i transportat n interiorul
celulei. Prin complexarea bilirubinei de ctre cele dou proteine este mpiedicat att ieirea ei din
hepatocite ct i ptrunderea n organitele celulare; acest din urm aspect are o mare importan,
deoarece bilirubina inhib respiraia mitocondrial, efect complet prevenit de prezena ligandinei.
sub influena enzimei glucuroniltransferaza, localizat la nivelul microsomilor celulelor hepatice,
bilirubina se conjug cu acidul glucuronic. Se obin bilirubinmonoglucuronidul i bilirubindiglucuronidul
care la un loc poart numele de bilirubina conjugat. Bilirubina conjugat (direct) este hidrosolubil
i este apoi eliminat din hepatocite n canaliculele biliare printr-un mecanism de transport
energodependent. Capacitatea de transport este mic n raport cu cea de conjugare, astfel nct ea se
constituie ca un mecanism limitativ cu rsfrngere asupra ntregului metabolism al bilirubinei.

Instruciuni metodice 63
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

De menionat c, fixarea bilirubinei pe albumin i implicit meninerea ei n compartimentul


intravascular, captarea selectiv n hepatocite i glucuronoconjugarea au o deosebit importan
fiziologic ntruct bilirubina neconjugat produs n macrofage, fiind liposolubil, ar putea difuza prin
membranele lipoidice ale celulelor, exercitnd efecte toxice n special asupra celulelor nervoase din
nucleii cenuii de la baza creierului.

Figura 21. Schema metabolismului de conjugare a bilirubinei


BNC - bilirubina neconjugat;
BC - bilirubina conjugat;
UDFAG- acidul uridildifosfat
glucuronic;
UDFGTF - uridindifosfatglucuronid-
transferaza;
Sistemele enzimice de transport a
bilirubinei necongugate:
prin membrana celular n
hepatocit;
conjugarea bilirubinei;
eliminarea bilirubinei conjugate
din hepatocit.

Etapa intestinal de metabolizare a bilirubinei:


Eliminat n intestin, bilirubina conjugat este supus aciunii microflorei bacteriene. Sub aciunea
unei b-glucuronidaze bacteriene n jejun i ileon are loc hidroliza bilirubindiglucuronidului, iar
bilirubina eliberat este supus unor reacii de reducere succesive catalizate de reductaze produse
tot de bacterii. Primul compus obinut prin reducere este mezobilirubina (bilirubina + 4 H) i apoi
mezobilirubinagenul numit destul de impropiu urobilinogenul (mezobilirubina + 4 H), care trece
apoi n stercobilinogen (urobilinogen + 4 H).
Mezobilinogenul (urobilinogenul) format n intestinul subire se reabsoarbe parial prin mucoasa
intestinal i ptrunde n circulaia portal. Ajuns n ficat este parial distrus pn la mono- i
dipiroli. O mic parte de mezobilinogen ( 10%) este eliminat din hepatocite n canaliculele biliare
i apoi n intestin, formnd un circuit entero-hepatic.
Cea mai mare parte a mezobilinogenului trece apoi n intenstinul gros i se elimin prin fecale sub
form de stercobilinogen care oxidndu-se n stercobilin impim scaunelor culoarea brun (cantitatea
de stercobilin n decurs de 24 de ore oscileaz la subiecii normali ntre 50-280 mg).
O cantitate mica din derivaii de reducere ai bilirubinei resorbii n snge prin peretele intestinal
scap ciclului entero-hepatic i sunt excretai de rinichi sub form de urobilinogeni sau corpi urobilinici
n proporie de 0,6 mg/24 de ore. Aceast cantitate crete atunci cnd scade capacitatea ficatului de
a capta din snge i de a distruge urobilinogenul, de aceea exagerarea urobilinuriei este un semn de
insuficien hepatic.
Principalele cauze ale urobilinogenuriei sunt ns reprezentate de hiperproducia de bilirubin n cursul
icterelor hemolitice i de leziunile hepatice care limiteaz procesele de captare i eliminare prin bil
a urobilinogenilor reabsorbii din intestin. Pe de alt parte, absena stercobilinogenului n fecale i
urobilinogenilor n urin indic o obstrucie complet a canalului biliar.
De menionat, c pigmenii biliari nu ndeplinesc careva funcii fiziologice. Organismul se
debaraseaz de acetia, ca de orice produs de deeu, excepie fcnd doar fierul, care este recuperat
de organism pentru a fi utilizat la sinteza hemoglobinei, proces ce se desfoar ncontinuu pe
parcursul ntregii viei.

64 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Figura 22. Schema metabolismului normal al D-urobilinogenului i stercobilinogenului

------- urobilinogen
stercobilinogen

n pofida eficienei remarcabile a mecanismelor de captare, conjugare i eliminare n bil a


bilirubinei, aceste mecanisme pot fi depite cnd aportul de bilirubin spre ficat este excesiv.
De menionat, c suferina hepatocitelor perturb mai rapid i n mai mare msur procesele de
excreie a bilirubinei i de formare a fluxului biliar apos dect procesul de glucuronoconjugare.
n hepatitele virale acute anume funcia de eliminare, excreie este cea mai
afectat, apoi se deregleaz captarea, prelevarea bilirubinei de ctre hepatocite, iar
funcia de conjugare se afecteaz n ultimul rnd.
Tabelul 18. Factorii ce influeneaz asupra nivelului bilirubinei n lipsa afeciunii hepatice

factorii modificrile COMENTARII


De la zi la zi Variaiile constituie 15-30% -
Bilirubina crete n mediu de 1-2 n mediu cu 20-25% mai mult
Alimentaia ori dup 48 ore i mai mult de dup alimentaia de sear
postire comparativ cu alimentaia de zi
Induce creteri cu 30% mai mare
Efortul fizic Fr efecte semnificative la femei
la brbai
Lumina afecteaz bilirubina
Expunerea la Valorile descresc cu 50% timp de
neconjugat mai mult dect cea
lumin 1 or de expunere la lumin
conjugat.
Induce descreterea valorilor cu Modificri similare n trimestrul
Sarcina
33% n trimestrul 2 al sarcinii 2 i 3
Hemoglobina absoarbe lumina
Hemoliza Reacii ncruciate n unele teste la aceeai lungime de und ca i
bilirubina
Contraceptivele
Valori cu 15% mai sczute -
orale
Anemia Provoac creterea bilirubinei
-
hemolitic neconjugate

Instruciuni metodice 65
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Acumularea pigmenilor biliari n snge se soldeaz cu apariia icterului (coloraia galben a pie-
lii, mucoaselor i a sclerelor datorat pigmenilor biliari), nsoit de decolorarea materiilor fecale.
Icterul devine vizibil cnd bilirubinemia este mai mare de 34-43 mkmol/l. De
menionat c creterea bilirubinei conjugate (hidrosolubile) produce un icter mai intens de ct
aceeai concentraie de bilirubin neconjugat, hidrofob.
Creterea bilirubinei conjugate este extrem de specific pentru bolile hepatice sau a ductu-
rilor biliare. Creterea bilirubinei conjugate se poate, de asemenea, ntlni n dereglrile excreiei
de bilirubin (proces energodependent) n sepsis, nutriie parenteral total i dup intervenii
chirurgicale.
Cele mai mari creteri ale bilirubinei totale se semnaleaz n hepatita acut viral, valoarea
ei n serul sanguin putnd atinge chiar 340 mkmol/l, n aceast boal paralelismul concentraiei
bilirubinei cu activitatea unor enzime serice (ALT, AST i GLDH) este evident: creterea con-
centraiei bilirubinei i a activitii acestor enzime n perioada de 10-14 zile de la debutul bolii i
revenirea treptat la normal dup 6-8 sptmni. Dac hepatita viral este nsoit de fenomene
colestatice pronunate, scaunele devin palide i urobilinogenul dispare din urin (n lipsa coles-
tazei el este decelabil la acest nivel). Reapariia urobilinogenului n urin coincide cu reluarea
fluxului biliar i reflect nceputul vindecrii.
Creterile bilirubinei n puseele hepatice cronice i n ficatul gras de etiologie alcoolic sunt
rareori peste 34,2-51,3 mkmol/l; n ciroz, bilirubina total seric variaz ntre valoarea normal
i 51,3-68,4 mkmol/l.
Testele de laborator pentru explorarea bilirubinei n diagnosticul precoce a hepatitelor acute
cedeaz testelor enzimatice. O informaie mai ampl poate fi obinut la determinarea fraciilor
bilirubinei: neconjugate i conjugate i calcularea indicelui bilirubinic (IB), care constituie
raportul dintre fracia bilirubinei conjugate la bilirubina total i constituie 24-25%. S-a consta-
tat, c la sfritul perioadei preicterice, coninutul bilirubinei totale poate fi n limitele normei
fiziologice pe cnd fracia conjugat se majoreaz.
Tabelul 19. Metodele de laborator de control al diferitor verigi a metabolismului bilirubinei

Norma
Indicii cercetai Metodele de determinare
(mkmol/l)
Nivelul bilirubinei totale n serul sanguin Metoda Iendraec 8.5-20.5
Nivelul bilirubinei conjugate (directe) Metoda Iendraec 2.1-5.1
Nivelul bilirubinei neconjugate (indirecte) Metoda Iendraec 6.4-15.4
Indicele bilirubinic (IB) - Pn la 25%
Testul la bilirubin n urin Proba Rozina, Fue Negativ
Proba cu reactivul Erlih sau
Testul la urobilin n urin Negativ
uroteste
Proba cu reactivul Erlih sau
Testul la stercobilin n masele fecale Negativ
uroteste
Not: Bilirubina neconjugat a fost numit indirect, iar cea conjugat direct, dup comportamentul
n timpul reaciei Van der Bergh (reacie pozitiv n prezena bilirubinei conjugate directe).

Recomandri:
Pentru brbai i femei se vor utiliza valori de referin separate.
Deoarece limitele superioare a valorilor de referin ale bilirubinei se micoreaz la
persoanele adulte odat cu vrsta, la copii se vor utiliza valori de referin separate.

66 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Un rol important n diagnosticul precoce al hepatitelor virale aparine examinrii urobilinoge-


nilor n urin. Este important de menionat c, creterea coninutului de urobilinogeni n urin
poate fi stabilit pn la apariia icterului.
Examinarea stercobilinei n materiile fecale prezint un test valoros de diagnostic. n caz de
obstrucie biliar bila nu ptrunde n intestin. Lipsa stercobilinei indic nceputul fazei de acolie,
pe cnd reacia pozitiv este un indice al dispariiei acoliei.
Pentru diagnosticul precoce a formelor icterice ale hepatitelor acute sunt importante de-
terminarea n urin a urobilinogenilor i a bilirubinei, iar n snge - creterea bilirubinei conjugate.
Controlul dinamic al indicilor metabolismului bilirubinei are o importan primordial pentru
depistarea sindromului colestatic, precum i diagnosticul diferenial al icterelor de diferit gene-
z (tabelul 20).
Tabelul 20 Diagnosticul difereniat al icterelor

Hiperbilirubinemia Lipsa sterco


Tipurile Biliru Urobili bilinei n
icterului gene binuria nogenuria masele fecale
IB25% IB25%
ral (acolia)
Prehepatic
+ - + - ++ -
(hemolitic)
Hepatic
(parenchi ++ + - + +/- +/-
matos)
Posthepatic
++ + - + - +
(obstructiv)
Not: ++-majorare nsemnat, +- majorare moderat, +/-se depisteaz n diferite faze ale hepatitei virale,
-lipsesc, IB-indicele bilirubinic.

Figura 23. Patogeneza hiperbilirubinemiilor.

Instruciuni metodice 67
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

I conjugarea normal a bilirubinei. cea mai mare parte a bilirubinei neconjugate (sgeat plin)
ajuns n ficat este captat, glucoronoconjugat la nivelul microsomilor i eliminat n bil sub
forma bilirubinei conjugate (sgeat haurat), fiind apoi ndeprtat din canaliculele biliare sub
aciunea fluxului biliar apos.
II - hiperbilirubinemia hemolitic (icterul hemolitic): bilirubin neconjugat produs n exces
depete capacitatea de captare i glucuronoconjugare a ficatului i crete n snge; ntruct
aceste procese nu sunt deficitare, ci doar depite, se produc cantiti sporite de bilirubin
conjugat care ajunge n bil fr a crete n snge.
III - hiperbilirubinemiile obstructive (icterele mecanice) - bilirubina conjugat ajuns n canalicu-
lele biliare nu poate fi eliminat din cauza obstacolului mecanic i se revars in snge, cea ce face
s creasc bilirubina conjugat.
IV - hiperbilirubinemia parenchimatoas (icterul parenchimatos): lezarea celulelor hepatice i
reducerea funcionalitii acestora face ca n snge s creasc att bilirubina neconjugat ct i
cea conjugat.
V - icterul fiziologic neonatal: activitatea micorat a glucoroniltrasferazei i hemoliza accele-
rat corelat cu o imaturitate a ficatului de a prelua, conjuga i excreta bilirubina condiioneaz
conjugarea numai a unei pri de bilirubin neconjugat i creterea nivelului acesteia n snge.

Diagnosticul difereniat al diferitor forme de icter


La prima etap se efectueaz diagnosticul difereniat al icterului parenchimatos cu icterul
hemolitic, mecanic i bilirubinopatii ereditare, confirmndu-se originea hemolitic a icterului.
Rolul hotrtor la aceast etap aparine datelor de laborator.

Icterul hemolitic

Icterele prehepatice (hemolitice) apar n anemiile hemolitice. Ele se manifest nu numai prin
ictericitate, dar i prin sindromul anemic. La toi pacienii cu acest sindrom n analiza sngelui
periferic se depisteaz micorarea numrului de eritrocite i a concentraiei de hemoglobin,
asociate de reticulocitoz. O parte de eritrocite sunt policromatofile, se observ anizocitoz
i poikilocitoz. n perioada crizelor hemolitice poate aprea o leucocitoz cu devieri n
hemogram de tipul reaciilor leucemoide.
n analiza biochimic se depisteaz o hiperbilirubinemie pe seama bilirubinei neconjugate,
urobilinogenurie. Cauza depirii nivelului normal al bilirubinei serice - creterea vitezei de
formare a bilirubinei (deci a degradrii hemoproteinelor). Testele enzimatice ale ficatului sunt
normale.

Icterul parenchimatos

Icterul parenchimatos apare la pacienii cu hepatite virale. La pacienii cu icter parenchimatos


sindromul anemic lipsete. Reticulocitoza nu se depisteaz. Concentraia bilirubinei este
majorat pe seama fraciei conjugate. n icterul parenhimatos sunt majorate testele enzimatice
hepatice. Dac icterul parenchimatos este nsoit de fenomene colestatice pronunate, scaunele
devin palide i urobilinogenul dispare din urin. Reapariia urobilinogenului n urin coincide
cu reluarea fluxului biliar i reflect nceputul vindecrii.

68 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Icterul obstructiv

Icterele obstructive se ntlnesc n cazul blocrii pariale sau totale a canalelor biliare
prin formarea de calculi (litiaz biliar) sau datorit tumorilor, congestiilor n aceast zon. n
icterul obstructiv concentraia bilirubinei este majorat pe seama fraciei conjugate. Crete
activitatea fosfatazei alcaline, GGT, 5-NT. Dac obstrucia canalului biliar este total, n intestin
nu se mai afl urobilinogen, scaunul este decolorat. Aceti derivai ai bilirubinei nu se elimin
nici prin urin, de aceea urobilinogenuria lipsete. O alt particularitate a icterelor colestatice
i n special a colestazelor extrahepatice este reprezentat de creterea colesterolului liber i
a fosfolipidelor care, nemaiputnd fi eliminate prin bil se acumuleaz n plasm i formeaz un
complex denumit lipoproteina X. Analiza general a sngelui este normal.

Bilirubinopatiile ereditare

Se va efectua diagnosticul difereniat cu maladia Gilbert ce evolueaz cu bilirubinemie


neconjugat,care este unicul simptom de laborator.Enzimele hepatice i indicii hemoleucogramei
sunt n limitele fiziologice normale.

Testele proteice
Probele de disproteinemie, utilizate ca probe hepatice n hepatitele virale acute au un carac-
ter global de tipul inflamaiei, sunt lipsite de specificitate i nu sprijin clinicianul n formularea
unui diagnostic specific de boal hepatic.
Proteinele serice
Albumina i - si -globulinele ca i alte multe proteine sunt sintetizate de hepatocite. Imu-
noglobulinele ns, sunt produse de plasmocite i nu vizeaz direct funcia hepatic. Dac pro-
teinele din prima categorie sunt adesea sintetizate n cantiti reduse n prezena hepatopatiei,
imunoglobulinele sunt variabile, fiind influenate de inflamaie i infecii.

Albumina

Valorile serice normale


Aduli - 35 -50g/l, respectiv 500-725 mol/L
Copii - 45-54 g/l

Albumina este o protein plasmatic, cu masa molecular de 69 kDa, cantitatea cea mai mare
este produs de ctre hepatocite. Sinteza hepatic de albumin este relativ constant (n jur de
20 g/zi) putnd fi ns dublat sau chiar triplat la nevoie, respectiv n caz de pierderi. Rata de
sintez depinde de un ir de factori, inclusiv suplimentarea cu aminoacizi, presiunea oncotic
plasmatic, nivelele de citokine inhibitoare (n special IL-6) i numrul de hepatocite funcionale.
Nu exist o diferen semnificativ ntre valorile de referin la brbai i femei.
Principala funcie const n meninerea presiunii coloidosmotice a plasmei intervenind astfel
n reglarea schimburilor ntre plasm i lichidul interstiial. Albumina intervine i n transportul
acizilor grai, bilirubinei, a unor hormoni, ioni metalici (Ca, Cu, Zn) precum i a unor medi-

Instruciuni metodice 69
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

camente. Totodat albumina constituie o important surs de aminoacizi eseniali, utilizat n


procesele de regenerare a esuturilor.
Modificrile nivelului de albumin:
creterea albuminei se datoreaz de obicei hemoconcentraiei, cauzate fie de deshidratare, utilizarea
ndelungat a garoului n timpul colectrii, fie evaporrii probei.
micorarea albuminei este cauzat de pierderile de proteine (sindrom nefrotic, combustii,
enteropatiile cu pierdere de protein), schimbul sporit de albumin (stri catabolice, glucocorticoizi),
ingestia insuficient de proteine (malnutriie, diete hipoproteice) i bolile hepatice.
sinteza albuminei este inhibat n inflamaia cronic, infecii, consum excesiv de alcool sau neoplazii.
Datorit timpului su mare de njumtire (17-23 zile), albumina plasmatic este rareori
micorat n hepatit acut, n hepatit cronic, ns, albumina descrete treptat odat cu progre-
sarea spre ciroz. Hipoalbuminemia de cauz hepatic apare relativ trziu n cursul evoluiei bolii,
deoarece parenchimul hepatic are o capacitate deosebit de mare de amplificare a sintezei chiar i
n condiiile unei reduceri a numrului de celule funcionale. Scderea aportului de aminoacizi din
malnutriie i malabsorbie constituie o alt cauz de reducere a sintezei hepatice de albumin.
Hipoalbuminemia apare n destrucia masiv (n multe boli hepatice) sau nlocuirea (prin fi-
broz) a parenchimului hepatic n ciroza hepatic. Concentraiile de albumin sunt un marker de
decompensare i pronostic n ciroz. Utilizarea clinic a valorilor de albumin n bolile hepatice
este, n primul rnd, pentru recunoaterea cirozei i pentru determinarea severitii acestei pa-
tologii. O cretere cu 20-30 g/l n timpul tratamentului cirozei hepatice semnific mbuntirea
statusului general i un prognostic mai favorabil dect absena acestei evoluii sub tratament.
Dozarea albuminei cel mai frecvent se efectueaz prin metodele colorimetrice, i anu-
me, cu verde de bromcrezol i rou de bromcrezol; actualmente, majoritatea laboratoarelor
folosesc una din aceste metode. Aprecierea albuminei prin electroforeza proteinelor nu este
recomandat din cauza supraestimrii albuminei, datorate colorrii mai intense. Exist metode
imunologice de determinare a albuminei, ns acestea sunt utilizate mai rar.
Concentraiile diverselor proteine plasmatice se modific n numeroase stri patologice. Inter-
pretarea acestor modificri este facilitat de faptul c ele pot fi ncadrate n cteva tipuri de dis-
proteinemie, care la rndul lor pot fi difereniate prin simpla electroforez a proteinelor serice.
Disproteinemia din afeciunile hepatice realizeaz aspecte diferite n funcie de etiolo-
gie i de stadiul evolutiv al hepatopatiei.
Modificrile proteinogramei din hepatita viral acut sunt puin exprimate i necaracte-
ristice, avnd o valoare diagnostic redus, mai ales n comparaie cu creterea impresionant a
transaminazelor ALT i AST.
Hiperglobulinemia reflect adesea inflamaia cronic i poate avea valori ridicate n he-
patita autoimun; -2-globulinele sunt crescute n hepatopatiile inflamatorii i neoplazice; beta-
globulinele cresc adesea semnificativ n obstrucia biliar. Ca i n alte inflamaii cronice, creterea
gama-globulinelor la bolnavii cu hepatit cronic poart un caracter policlonal. De notat c,
hipergamaglobulinemia policlonal nu este specific hepatopatiilor cronice i se poate ntlni n
orice proces inflamator cronic (de ex. n poliartrita reumatoid, endocardita infecioas sau un
proces tuberculos).
n hepatita acut, creterea imunoglobulinelor i respectiv a fraciunii electroforetice gama
este variabil, n funcie de durata bolii i de rspunsul individual la infecia viral. De regul, astfel
de creteri nu sunt att de accentuate ca ntr-o hepatit cronic i se caracterizeaz mai ales
printr-un nivel ridicat de IgM.
Se consider c n hepatita cronic de natur viral ar crete mai ales IgG. n cirozele bili-
are creterea ar interesa cu predominan IgM, iar n ciroza alcoolic ar surveni o cretere a IgA.
De notat c n angiocolite i n cirozele biliare se evideniaz o cretere moderat a alfa-2
globulinelor n timp ce creterea gama-globulinelor este mai puin exprimat dect n hepatitele cronice.

70 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

n stadiile de debut ale neoplaziilor hepatice electroforeza proteinelor serice are o va-
loare diagnostic redus, dar n adenocarcinomul hepatic cu ciroz, scderea albuminelor i
creterea gama-globulinelor se asociaz o cretere exprimat a fraciunii electroforetice alfa-1
globulinelor. Metodele imunologice permit evidenierea unei alfa-1 globuline fetale - alfa-fetopro-
teina care, dac prezint valori mult crescute sau atunci cnd cresc de la o examinarea la alta,
sugereaz un carcinom hepatic primar.
Un rol important n patologia hepatitei l joac mediatorii endogeni, citokinele - interleukina-1
(IL-1), factorul de necroz tumoral (TNF) i interleukina-6 (IL-6) care intervin n declanarea
reaciei de faz acut, iar ficatul stimulat de aceti mediatori sintetizeaz i secret aa-zisele
proteine de faz acut: alfa1- antitripsin, fibrinogenul, proteina C reactiv i al. Dei gradul de
contribuie al diferitor celule din ficat la producerea de citokine este diferit, s-au adus dovezi
certe privind creterea TNF, IL-6 i a altor citokine n plasma bolnavilor cu hepatit cronic, ci-
roz hepatic, precum i n cazuri de insuficien hepatic fulminant.
Astfel de creteri pot fi cauzate att de o producie sporit n cursul puseurilor inflamatorii,
ct i de o scdere a proceselor de clearance hepatic al citokinelor, atunci cnd se instaleaz o
insuficien hepatic.
n pofida faptului c, multe laboratoare clinice au astzi posibilitatea de a separa proteinele
plasmatice prin metode electroforetice i a le doza difereniat prin metode imunochimice, aa-
zisele teste de disproteinemie sau de labilitate coloidal nu i-au pierdut o oarecare utilitate
practic, fiind uor de executat i furniznd rezultate n decurs de 15-30 de minute. Testul cu ti-
mol este mai puin fundamentat biochimic i se pozitiveaz n caz de cretere a unor globuline cu
migrare beta sau gama, precum i a unor lipoproteine care reduc stabilitatea coloidal a serului,
dnd rezultate fals pozitive n cazurile cu hipetrigliceridemie i plasm lactescent.

Recomandri:
Se consider adecvat pentru uzul clinic atingerea urmtoarei performane la dozarea
albuminei serice: eroarea analitic a valorii limitei de jos de referin 10%.
Determinarea albuminei la pacienii cu boli hepatice se va efectua utiliznd verdele de
bromcrezol. Dozarea albuminei cu rou de bromcrezol i prin electroforez poate fi inexact
la pacienii cu boli hepatice.

Amoniacul (NH3)
Amoniacul seric - 11-38 mol/L, respectiv < 0,65 mg/l
testul optic 340 nm

Amoniacul este un produs al metabolismului aminoacidic; cea mai mare parte a amoni-
acului (NH3), rezultat din dezaminarea acizilor aminai n ficat i n alte esuturi i mai ales
sub aciunea bacteriilor intestinale este transformat n uree la nivelul hepatocitelor. Datorit
eficienei procesului de ureogenez, nivelul amoniacului sanguin se menine, n norm, n li-
mite joase. n bolile hepatice nivelul sporit de NH3 este, de obicei, un semn al insuficienei
hepatice.
Hiperamoniemia poate aprea la orice pacient cu afeciune hepatic sever (necroz he-
patic sever, ciroz n stadiu terminal, dup hepatectomie). n caz de insuficien hepatic i
mai ales n caz de untare a circulaiei portocave, nivelul amoniemiei poate depi de 5 ori
limita superioar a normalului, valorile putnd fi mai ridicate atunci cnd la un bolnav cu ciro-
z hepatic survine o hemoragie digestiv superioar. Valorile snt crescute n cele mai multe
cazuri de com hepatic, considerndu-se c amoniacul ar avea un efect toxic asupra sistemu-

Instruciuni metodice 71
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

lui nervos central. Dar amoniacul nu este singurul i nici principalul compus toxic implicat n
producerea manifestrilor neuropsihice la bolnavii cu ciroz hepatic. Aa de ex., aminele re-
zultate n intestin prin decarboxilarea aminoacizilor aromatici (tirozin, fenilalanin), nedegra-
date n ficat i avnd o structur similar catecolaminelor (de exemplu feniletanolamina), pot
interfera cu aceti mediatori chimici la nivelul receptorilor adrenergici, putnd astfel explica,
att hipotensiunea, ct i fenomenele neuropsihice ale bolnavilor cu insuficien hepatic.
Tabelul 21. Factorii ce influeneaz asupra nivelului amoniacului n lipsa afeciunii hepatice
factorii modificrile Comentarii
Vrsta Valori de 4-8 ori mai mari la nou-nscui;
de 2-3 ori mai mari la copiii < 3 ani;
amplitudine mai mare la aduli dect la
adolesceni

Proba de Cercetarea sngelui arterial ofer rezultate Doar amoniacul din sngele arterial
material mai precise dect probele venoase; coreleaz cu modificrile funciei ficatului.
Aplicarea garoului strns sau ncletarea
biologic probele din sngele capilar pot induce creteri
puternic a pumnului poate provoca
false ale NH3 din cauza perspiraiei n cazul
creterea amoniacului din sngele venos.
prelucrrii inadecvate a pielii.

Efortul fizic Creteri de 3 ori i mai mult dup efortul fizic Creterea este mai evident la brbai
intens dect a femei
Fumatul Crete cu 10 mol/L dup 1 igar

Modul de pstrare Amoniacul crete cu 20% dup 1 or i cu Utilizarea gheii, centrifugarea i separarea
100% dup 2 ore la pstrare la temperatura rapid a plasmei minimalizeaz creterea
camerei. amoniului la pstrare. Rata de cretere
este mai mare n afeciunile hepatice.

Ali factori Cretere n leucemia acut, transfuzia


sanguin, transplantul osos.

Preparatele Acidul valproic, glycina (utilizat n irigare


medicamentoase la rezecia prostatei, endometriului) crete
producerea amoniacului

Hiperamoniemia este, de asemenea, caracteristic i pentru enzimopatiile ereditare i do-


bndite legate cu deficiena enzimelor ciclului ornitinic, Creteri nensemnate a NH3 n plasm
se constat la pacienii cu hepatit cronic, proporional cu progresarea bolii.
n encefalopatia hepatic nivelul crescut al amoniacului se constat la 90% dintre pacieni, dar
el nu reflect gradul comei. Reducerea concentraiei amoniemiei poate fi predictiv ns pentru
evoluia favorabil a manifestrilor neurologice ale encefalopatiei hepatice.
Cele mai bune rezultate pentru msurarea amoniemiei se obin din sngele arterial. Plasma
va fi separat de celule n limitele unei ore de la colectare; la pacienii cu boli hepatice, este ideal
separarea n limitele a 15 minute. Pentru msurarea nivelului de amoniac se utilizeaz un ir de
metode, cea mai precis este metoda enzimatic.

72 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Recomandri:
Dozarea amoniemiei nu este un marcher sigur pentru stabilirea diagnosticului de rutin a
encefalopatiei hepatice la pacienii cu boli hepatice acute sau cronice; ea poate fi util la
pacienii cu encefalopatie de etiologie neclar.
Pentru msurri mai exacte se vor utiliza probe de snge arterial i nu venos. Pentru a
preveni sporirea artificial a amoniacului plasma trebuie separat de celule n limitele a 15
minute de la colectare.
Se impune dozarea amoniacului n toate cauzele inexplicabile de encefalopatie sau la orice
nou-nscut cu deteriorare neurologic de cauz incert.

Factorii de coagulare.Timpul de protrombin


Factorii de coagulare. Deosebit de importante sunt tulburrile n sinteza factorilor de
coagulare, care depind de ficat. Ficatul sintetizeaz urmtorii factori de coagulare: fibrinogenul
(factorul I), protrombina (f. II), factorii V (proaccelerina), VII (proconvertina), IX (f. Christmas),
XII (f. Hagheman) i XIII (f. fibrinstabilizator). Dereglrile n sistemul acestor factori reprezint i
un semn fidel i precoce de gravitate i prognostic grav imediat n hepatitele virale acute. Nive-
lul factorului V este folosit adesea ca martor al capacitii de biosintez n insuficiena hepatic
acut/fulminant. Cu acest scop uzual se determin timpul Quick (denumit n mod curent timp
de protrombin).
Timpul normal de protrombin (TP) depinde att de capacitatea normal de sintez hepatic
a protrombinei, fibrinogenului, factorilor V, VII si X, ct i de prezena unei cantiti adecvate de
vitamina K, deoarece factorii activi biologic (factorii II, VII, IX i X) necesit pentru sinteza lor
vitamina K. Deficitul de vitamina K poate aprea n icterul obstructiv cu malabsorbia vitamine-
lor liposolubile, secundar la alterarea florei intestinale prin antibioticoterapie i n deficienele
de diet. Modificrile patologice ale TP nu sunt ns specifice numai pentru diverse hepatopatii;
de pild, deficienele congenitale ale factorilor de coagulare (hemofilia sau boala Christmas) i
consumul excesiv de factori de coagulare care survine n sindromul de coagulare intravascular
diseminat (CID). Cu scopul diferenierii cauzelor hepatice i nonhepatice ale prelungirii TP, se
va administra parenteral vitamina K. Persistena TP prelungit orienteaz spre o afectare hepatic,
mai ales dac sunt modificate i alte teste coagulologice. TP este util i ca test de prognostic n
hepatita alcoolic acut sau necroza hepatocelular acut cu potenial de evoluie spre insufici-
ena hepatic fulminant (de exemplu, hepatita virala sau intoxicaia cu acetaminofen), dar i n
hepatita cronic progresiv. Scderea sub 50% a indicelui protrombinic (timpul Quick) constituie
un criteriu sigur de hepatit sever, valori de 10-30% indic o hepatit foarte grav, o scdere
sub 10% indic o gravitate extrem cu exitus letales. TP prelungit care nu se corecteaz prin
administrarea de vitamina K, indic un risc major chirurgical. Atunci cnd interveniile invazive
sunt necesare, pentru corectarea TP se va administra ntotdeauna plasma proaspt congelat. Pe
lng TP i timpul de tromboplastin parial activat (TTPA) care reflect activitatea factorilor I,
II,V,VIII, IX, X, XI si XII, poate fi prelungit n hepatopatiile avansate.
Timpul de protrombin (TP) msoar timpul necesar pentru coagularea plasmei dup ad-
ugarea de Factor tisular i fosfolipid; el este influenat de modificrile n activitatea factorilor X,
VII, V, II (protrombina) i I (fibrinogen). TP este deseori nregistrat n secunde i n comparaie
cu valorile de referin ale pacientului. Timpul necesar pentru coagularea unei probe este invers
proporional cu cantitatea Factorului tisular prezent n reageni.
n hepatita acut ischemic i toxic, TP este mrit reproductibil, de obicei cu cel puin 3 sec
peste media din populaie, n hepatita viral sau alcoolic, ns,TP este rareori mrit mai mult de-
ct cu trei secunde. TP este deseori mrit n icterul mecanic, i poate rspunde la administrarea

Instruciuni metodice 73
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

parenteral de vitamin K. n hepatit cronic, TP se afl, de obicei, n limitele de referin, dar


sporete odat cu progresarea spre ciroz i este mrit la pacienii cirotici.
Recomandri: pentru exprimarea rezultatelor timpului de protrombin la pacienii cu boli
hepatice, trebuie utilizat de preferin TP (n secunde).
Tulburrile metabolismului lipidelor se manifest prin scderea coles-
terolului total i mai ales a fraciunii esterificate a acestuia. Trigliceridele cresc semnificativ la
nceputul bolii i revin la normal n a 4-a sptmn de boal. n formele colestatice apare n ser
o lipoprotein anormal - lipoproteina X. Nivelul plasmatic de LpX este evident mai ridicat la
bolnavii cu colestaz extrahepatic dect la cei cu colestaz intrahepatic.
Tulburrile metabolismului glucidic se manifest prin apariia de curbe
patologice ale glicemiei, slab utilizare a glucozei i afectarea utilizrii galactozei, precum i o
cretere a cetonemiei.
n cursul hepatitei virale crete fierul seric probabil prin leziunile hepatocitelor i cupremia.
Tulburrile METABOLISMULUI HIDRIC i al electroliilor se ma-
nifest prin apariia unei retenii hidrice i sodice n perioada de stare edem infraclinic, care
apare spre declinul bolii, cnd se produce o criz poliuric. Cazurile de edem frust (hepatit
edematoas) se ntlnesc rar n formele severe sau cu tendina de cronicizare. n forma uzual
nu se constat o retenie hidric, apa total rmnnd nemodificat.

Modificrile analizei generale a sngelui


Se constat o leucopenie cu limfocitoz uoar, monocitoz, apariia de cteva celule plasmati-
ce, i o uoar eozinofilie. O parte din limfocite prezint unele particulariti: vacuole citoplasmati-
ce, bazofilie intens i granulaie azurofil a citoplasmei (aspect de virocite). n formele severe se
constat leucocitoz cu neutrofilie pronunat, anemie i trombocitopenie (de genez aplastic).
VSH este crescut. Este necesar de evideniat o analiz de rutin cum ar fi numrtoarea
reticulocitelor, fiind un indice foarte important n diferenierea tipului de icter.

Sindroamele principale de laborator n hepatita


viral acut
Tabloul biologic poate fi mai mult sau mai puin modificat. Astfel, exist hepatite cronice cu
un tablou biologic minim modificat, iar altele (de obicei formele active ) au modificri evidente.
Sindroamele biologice cercetate n hepatita viral acut sunt reprezentate de:
1. Sindromul de disproteinemie (inflamator nespecific). Sindromul inflamator se traduce
prin creterea gama-globulinelor (IgA, IgM i IgG), proteinelor fazei acute a inflamaiei existnd
o oarecare corelaie ntre nivelul lor i activitatea histologic a bolii.
Testele utilizate sunt aceleai ca i n hepatita viral acut A, deosebirea constnd n prezena
unor valori normale sau uor crescute la debutul i n prima parte a perioadei de stare. Evoluia
spre vindecare a hepatitei B se nsoete de o cretere moderat a valorilor la testul cu timol, la
sfritul perioadei de stare i n prima parte a convalescenei, pentru ca, la 3-4-6 luni de la debu-
tul bolii acute, acestea s revin n limite normale. Formele prelungite i infecia cronic cu VHB
pot prezenta valori crescute ale acestor teste, oarecum superpozabile valorilor crescute ale
gama-globulinelor n electroforeza proteinelor serice (testele de disproteinemie se pozitiveaz
prin scderea sintezei de albumin i creterea concentraiei serice a globulinelor, n special a Ig).
Afar de aceste modificri se constat o leucocitoz cu neutrofilie, majorarea VSH.
2. Sindromul de hepatocitoliz: dozarea transaminazelor (AST, i ALT) n perioada de
stare a hepatitei virale acute B duce la obinerea unor valori crescute (200-300 UI/l pn la
1000-3000 UI/l, fa de 12-35 UI/l valori normale). Nivelul seric al acestor enzime nu este direct
proporional cu extinderea proceselor de distrucie hepatocitar (enzimele pot trece n circu-
laie i atunci cnd hepatocitele sunt integre din punct de vedere morfologic, dar au permeabi-

74 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

litate crescut prin expunere la hipoxie sau ischemie). Cu toate acestea, n formele severe, prin
destrucia masiv a celulelor hepatice, titrul ALT poate ajunge la nceput la valori de 1000-3000
UI/l. Sunt ns i forme de hepatit fulminant n care determinrile repetate ale transaminazelor
duc la obinerea unor valori de zeci pn la 100 de UI/l, prbuirea valorilor datorndu-se proba-
bil epuizrii enzimatice a ficatului. Depistarea unei leziuni hepatice minime se poate face prin do-
zarea gama-glutamil-transpeptidazei (GGT). Valori crescute ale acestei enzime sunt descrise n
toate tulburrile hepato-biliare i mai ales n cursul hepatitei etanolice n care creterea nivelului
seric al GGT precede modificrile tuturor celorlalte teste hepatice. Determinrile altor enzime
(LDH, OCT) nu este uzual n clinica hepatitelor acute mai ales c acestea prezint modificri i
n afectarea altor esuturi (muchi, miocard, rinichi, intestin).
3. Sindrom de retenie biliar: Creterea concentraiei serice a bilirubinemiei (din con-
tul fraciei conjugate) determin apariia n urin a pigmenilor biliari (bilirubina direct trecnd
prin filtrul renal, n timp ce bilirubina neconjugat nu se regsete n urin deoarece nu este
solubil). Formele colestatice de hepatit viral acut se nsoesc i de o cretere marcat a
fosfatazei alcaline prin alterarea funciei excretoare a ficatului, GGT, 5-nucleotidazei, leucinami-
nopeptidazei, precum i de creterea colesterolului, acizilor colici, trigliceridelor, fosfolipidelor,
-lipoproteidelor.
4. Sindromul hepatopriv (de insuficien hepato-celular): pune n eviden scde-
rea capacitii de sintez a ficatului, ca o consecin a necrozei hepatice. Se cunoate faptul c
albumina, fibrinogenul, protrombina, proaccelerina sunt proteine sintetizate exclusiv de hepato-
cite. Hipoalbuminemia se ntlnete mai ales n necrozele hepatice subacute masive, n hepatitele
cronice active, ciroze hepatice, fiind un indice util n prognosticul i terapia acestor afeciuni. n
schimb, informaiile asupra capacitii de sintez a protrombinei, fibrinogenului i factorilor de
coagulare V, VII i X prin determinarea timpilor de coagulare (timp Quick, timp de protrombi-
n, timpul de proaccelerin i de proconvertin) orienteaz asupra evoluiei i prognosticului
imediat n formele severe, precomatoase sau comatoase. Prelungirea marcat a acestor timpi se
ntlnete n necroza hepatic acut grav (diferena ntre pacient i martori depind 10-20 sau
chiar 100 de secunde). O cretere moderat a timpului de coagulare (5-10 secunde) se poate
ntlni i n hepatitele B colestatice (colestaza intrahepatic prelungit mpiedicnd absorbia
intestinal a vitaminei K) i n hepatitele cronice active sau cirozele hepatice AgHBs pozitiv (prin
existena unui deficit de sintez hepatic a acestor proteine, paralel cu scderea sintezei de
albumin).

Instruciuni metodice 75
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

4. metode de diagnostic de laborator


4.1 Metoda ELISA
Metoda ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) este o tehnic imunohistochimic,
utilizat cel mai des n imunologie pentru detecia prezenei antigenului sau anticorpului n proba
testat. Tehnica ELISA este utilizat, att cu scop de diagnostic n medicin, ct i n alte domenii
industriale pentru detecia diverselor substane.
Metoda ELISA reprezint o metoda n faza solid, la care se folosete un ligand
marcat cu o enzim (peroxidaza, fosfataza alcalina), complexul format fiind identi-
ficat colorimetric dup adugarea unui substrat specific enzimei.
Pe un suport (de obicei microplanete de poystyrene) este adsorbit, fie un antigen, fie un
anticorp cunoscut. La antigenul imobilizat se adaug anticorpul necunoscut, se formeaz comple-
xul Ag-Ac. Detecia lui se poate face, fie cu ajutorul anticorpilor marcai cu enzime, sau el nsui
poate fi detectabil prin utilizarea unui anticorp secundar, unit covalent prin bioconjugare cu o
enzim. Dup fiecare etap microplanetele sunt splate cu o soluie slab de detergent pentru a
ndeprta toate proteinele sau anticorpii care nu s-au unit specific. Dup ultima etap de splare,
complexul format se detecteaz prin adugarea substratului enzimatic pentru producerea unei
reacii vizibile, care este direct proporional cu cantitatea antigenului/anticorpului din proba
testat.
Utilizarea metodei n faz solid, d posibilitate de a simplifica procesul de separare a com-
ponentelor reaciei prin imobilizarea unui component pe faza solid i ndeprtarea componen-
telor n exces prin splare, care nu particip la reacie.

ELISA reprezint o tehnic prin care se poate identifica substana necunoscut,


att calitativ, ct i cantitativ, dar n ambele cazuri sunt necesari ANTICORPI
nalt specifici i nalt sensibili pentru antigenii particulari.

Aplicarea
Aceste criterii au contribuit la utilizarea tehnicii ELISA n toate domeniile medicinii cu scop
diagnostic, profilactic i tiinific pentru detecia prezenei i/sau concentraiei anticorpilor i an-
tigenelor hepatitelor virale , , i D; produse de diverse firme comerciale, n diverse variaii
i modificri.
Istoria
Tehnica ELISA a evoluat din metoda RIA (analiza radioimun) prin care s-a observat c an-
tigenul sau anticorpul poate fi absorbit pe un substrat solid i n paralel poate participa n uniri
specifice de nalt afinitate cu ali componeni. Cu toate c metoda RIA este o tehnic nalt
sensibil, ns pe motiv c ea prezenta un anumit pericol pentru medicin, s-a impus gsirea unei
alte metode neradioactive pentru detecia Ag sau Ac din mostrele testate. Ulterior, ca alternati-
v, s-au gsit unele enzime (de tipul peroxidaza), care pot reaciona cu un substrat apropiat (ex.
ABTS sau 3,3,5,5 Tetramethylbenzidine), reacia fiind urmat de schimbarea culorii soluiei,
proprietate ce poate fi considerat ca un semnal chimic i citit de anumite aparate. ns acest
semnal trebuia asociat cu complexul Ag-Ac format, de aceea enzima va fi unit de anticorpul de
detecie prin bioconjugare. Acest proces de unire a Ac cu o anumit enzim a fost descoperit
independent de ctre Stratis Avrameas i G.B. Pierce
Pe motiv, c este necesar nlturarea oricrei particule neunite (AG sau Ac) era necesar,
ca complexul Ag sau Ac s fie fixat pe o suprafa solid pentru a nu fi ndeprtat la splare. Un
astfel de imunosorbent, a fost propus de ctre Wide i Porath in 1966. n practic, metoda ELI-

76 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

SA pentru prima a fost introdus n 1971 de ctre Eva Engvall i Peter Perlmann (Universitatea
din Stockholm, Suedia) i publicat independent ca o metod/tehnic nou de ctre Shuurs and
Bauke van Weemen din Olanda. Iniial, a fost aplicat pentru determinarea IgE, apoi extins i
pentru identificarea anti-HBs.
Avantajele ELISA comparativ cu alte metode:
- sensibilitate nalt, posibilitate de detecie a concentraiei de pn la 0,05 ng/ml. Aceasta
reiese din capacitatea unei molecule de ferment s catalizeze transformarea a mai multor mo-
lecule de substrat;
posibilitatea utilizrii unei cantiti minime de materialul studiat (ser, plasma);
stabilitate la pstrarea tuturor ingredientelor, necesare pentru efectuarea ELISA (pn la un an i mai
mult);
uurina executrii reaciei;
posibilitatea vizualizrii rezultatului reaciei, att instrumental (varianta cantitativ i calitativ), ct i
vizual;
posibilitatea automatizrii tuturor etapelor reaciei;
comparativ, un pre destul de redus al reagenilor de diagnostic.

Dezavantajele
Una din limitele tehnicii ELISA este c ea furnizeaz informaii doar despre prezena sau
absena substanei cercetate, dar nu ne poate oferi informaie privind proprietile biomedicale,
precum greutatea molecular sau distribuia spaial a substanei cercetate n esuturi. Pentru a
afla aceste lucruri este nevoie de efectuat i alte metode de laborator. Ex. imunoblottul este o
metod combinat de detecie a prezenei sau absenei markerului studiat, ct i de studiere/
analiz a proprietilor fizice a substanei (greutatea molecular, etc), ns este mai costisitoare
ca ELISA.
Figura 24. Test sistemele pentru metoda ELSA.

Variantele tehnicii ELISA


Virtual, toate virusurile i microbii au cel puin un antigen unic, specific doar speciei, tulpinii
date. Acest antigen, poate fi purificat (obinut separat de celelalte componente a virusului) i
utilizat pentru generarea anticorpilor monoclonali specifici. Ambele, att antigenul purificat,
ct i anticorpul monoclonal propriu Ag dat pot reaciona ntre ei formnd un complex stabil,
care servete ca criteriu de diagnostic.

Instruciuni metodice 77
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

ELISA reprezint un test serologic care permite identificarea antigenului sau anticorpului
necunoscut.
Exist 2 variante a tehnicii ELISA
1. Metoda ELISA direct care utilizeaz Ac monoclonali pentru detecia prezenei anti-
genelor particulare n probele de testare.
n metoda ELISA direct Ac monoclonali sunt absorbiii din start pe suprafaa intern a go-
deurilor microplanetelor.
n godeuri se adaug serul testat.
Dac Ag specific este prezent n serul testat el se va uni complementar cu Ac monoclonali imobilizai
pe peretele intern al godeului.
Se spal godeurile pentru a fi nlturate componentele nelegate.
Se adaug o soluie cu anticorpi monoclonali secundari. Aceti anticorpi sunt alipii cu o enzim.
Aceast enzim produce colorarea soluiei cnd reacioneaz cu substratul su specific.
Din nou se spal godeurile pentru a fi nlturate componentele nelegate. Dac Ag din proba de
testare este prezent, atunci pe suprafaa godeului se formeaz un complex din: Ac, imobilizai de
godeu Ag cercetat din proba pacientului - Ac conjugat cu enzim. Dac Ag nu este prezent, atunci
Ac cuplat cu enzima va fi splat i nlturat.
Se adaog substratul specific enzimei. Schimbarea culorii demonstreaz unirea Ac marcai cu enzim
de Ag cercetat, indic un rezultat pozitiv. Lipsa culorii indic lipsa Antigenului din proba testat
- rezultat negativ.

1. Metoda ELISA indirect, utilizat pentru detecia anticorpilor necunoscui din proba
de testare.
n acest caz, Ag specific este absorbit pe suprafaa intern a godeurilor microplanetelor ELISA.
n godeuri se adaug serul testat.
Dac Ac specific este prezent n serul testat el se va uni complementar cu Ag imobilizat pe peretele
intern al godeului. Dac proba va conine anticorpi nespecifici, ei nu se vor uni cu Ag de pe godeuri.
Se spal godeurile pentru a fi nlturate componentele nelegate, anticorpii care nu s-au unit specific
cu Ag din godeuri.
Dac Ac s-a unit cu Ag specific, ei pot fi detectai cu ajutorul anticorpilor secundari conjugai cu
o enzim. Aceti Ac se vor uni cu imunoglobulinele (de obicei, clasa IgG) din serul testat. Ca Ac
secundari se utilizeaz IgG anti-specie (anti-uman) conjugat cu o enzim. Aceast enzim produce
colorarea soluiei, cnd reacioneaz cu substratul su specific.
Din nou se spal godeurile pentru a fi nlturate componentele nelegate.

Dac n proba de testare este prezent Ac, atunci pe suprafaa godeului se formeaz un com-
plex din Ag, imobilizai de godeu Ac din serul prob Ac anti-specie conjugai cu o enzim.
Dac Ac nu este prezent atunci toate componentele necuplate vor fi splate i nlturate.
Se adaug substratul specific enzimei. Schimbarea culorii demonstreaz prezena Ac din se-
rul testat, indic un rezultat pozitiv. Lipsa culorii indic lipsa Anticorpului n roba testat - re-
zultat negativ.

78 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Figura 25. Etapele tehnicii ELISA

Anticorpii Reagentul marcat


Enzima
Centru de Substratul
legtur Anticorpul
secundar Produsul
Antigenul
Antigenul
studiat

Proba

Faza solid

Unirea Splarea Marcarea Citirea

ECHIPAMENTUL NECESAR
Cititor ELISA cititor automat de plci ELISA Spectrofotmetric multicanal cu filtru de 492 nm.
Spltor - Spltor automat de plci ELISA cu rezervor pentru soluia de splare i rezervor
pentru deeuri.
Incubator sau termostat orice tip de incubator care poate menine temperatura n limitele
37C - 39C.
Agitator
Pipete multicanal ajustabile pentru volume mai mici de 50 l i volume reglabile ntre 50 i 200 l.
Pipete monocanal ajustabile pentru volume mai mici de 50 l i volume reglabile ntre 50 i 200 l.
Distilator de ap (purificator de ap) minimum 1 pahar de ap distilat sau deionizat
Placi ELISA de microtitru cu suprafaa plat
Hrtie de absorbie
Benzi adezive
Refrigerator - orice tip de refrigerator care poate menine temperatura n limitele 2C - 6C.
Congelator ce poate menine temperatura de -20C, preferabil -70C.

REACTIVII, REAGENI
Anticorpi monoclonali: (furnizat sub forma de supernatant de cultur tisular hybridoma);
Conjugat: globulin antispecie (iepure, oarece), conjugat cu peroxidaza din hrean i ps-
trat la loc ntunecos la +40C;
Substrat i cromogen: 0,2 g de ortofenil diamin (OPD), divizat n alicote de 25 ml sau
pastile i pstrate la loc ntunecos la temperatura de +40C,
ATENTIE! A se utiliza OPD cu atenie, a se purta mnui din cauciuc, produs suspect de a
fi mutagen.
Soluie de stopare a reaciei - acid sulfuric de 1 mol
Control pozitiv supernatant de cultur tisular infectat cu antigenul respectiv, calibrat

Instruciuni metodice 79
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

i standardizat. Este inactivat contagiozitatea, dar se vor pstra toate precauiile de procesarea
materialului dat ca presupus material contagios.
Control negativ proba ce nu conine markerul studiat. Este negativ, testat i la alte infec-
ii nalt periculoase (Hepatite virale, HIV, sifilis).
Buffer de adsorbie - bufer fosphate saline 0.01 M pH 7.4 (PBS).
Buffer de blocare - PBS suplimentat cu 0.05% Tween-20.
Soluie de splare -PBS diluat 1/5 n ap distilat suplimentat cu 0.05% Tween-20.
Not! Sunt prezentate doar cteva variante de reactivi, ei pot varia n dependen de productor.

Prepararea reagenilor
Reagenii ce necesit pstrare la nghe vor fi resuspendai (dizolvai) n 1 ml de ap
distilat sau deionizat i pstrai la -20C pn la utilizare.
Substratul i cromogenul. Orthophenylene diamine (OPD) este dispus n pastile. Resus-
pendai pastilele de OPD tablete n 75 ml de ap distilat, astfel obinei soluia de OPD. Soluia
OPD neutilizat poate fi pstrat la -20C pn la 1 lun.
Acid Sulfuric. Pentru prepararea 1 M de acid sulfuric, atent adugai 55 ml de acid la 945
ml de ap distilat. Not: Tot timpul adugai acid n ap i nu invers.
Tipul planetelor pentru ELISA
Pentru montarea ELISA n faz solid n majoritatea truselor comerciale se utilizeaz plan-
ete de polysterene sau derivai de polysterene obinui prin modificri chimice sau prin ira-
dierea suprafeei. Configuraia expus de productori cel mai des sunt planete cu 96 godeuri,
organizate /divizate n 8 bare/strip-uri separate a cte 12 godeuri fiecare. Aceasta permite ca s
fie utilizate n dependen de necesiti: fie planeta integr, fie strip-uri separate. Fiecare godeu
are un volum de aproape 350 l i o suprafa intern de cca 2,5 cm2. Recent, au nceput a se
produce planete a cte 384 i 1536 godeuri, cu dimensiuni i volume identice, ca i planetele
cu 96 de godeuri, utilizate ntr-un numr mare de analize concomitent. Alte modificri recente:
planete cu 96 godeuri cu din volumul tradiional; planete cu godeuri, fundul godeului fiind n
unghi de 90 grade, pentru o splare a godeurilor mai eficient.
Condiiile principale pentru utilizarea lor sunt:
rezistena planetelor la diveri solveni, utilizai n reacie;
prezena unui volum nalt specific, adic posibilitatea de sorbie la suprafaa godeurilor de
polysterene a Ag i Ac n cantiti suficiente pentru montarea reaciei corelat cu sorbia minim
nespecific a altor proteine din materialul examinat i din conjugat.

Figura 26. Planete utilizate la montarea reaciei ELISA

Planetele din polysterene sunt conductori de temperatur foarte slabi.


Asigurai-v c planetele i toi reagenii au aceeai temperatur, preferabil
temperatura camerei.
Adsorbia
Polysteren-ul are capacitatea de adsorbi pe suprafaa sa diverse tipuri de particule, substane, adsorbia
fiind n dependen de concentraia substanei din soluia supus adsorbiei. Adsorbia are loc pe contul
interaciunilor hidrofobice, forelor van der Vaals, legturilor ionice i legturilor hidrogenice prin care

80 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

particulele se alipesc de suprafaa solid a polysterene-ului. Pentru marcarea fermentativ a Ag i Ac se pot


utiliza diferite tipuri de fermeni: peroxidaza de hrean, fosfataza alcalin, beta-galactozidaza, .a. De fapt,
practic n toate test sistemele se utilizeaz peroxidaza de hrean, alegerea ei este dictat de activitatea cata-
litic foarte nalt, disponibilitate, stabilitate i uurina deteciei. n calitate de reageni pentru substrat se
utilizeaz orto-fenilendiamin (OFD) cu peroxid de hidrogen, produsele de oxidare ale crora se citesc i se
nregistreaz instrumental prin citire fotometric. Pentru stoparea reaciei de fermentare se utilizeaz
stop-reageni, care se introduc, att n probele testate, ct i probele control n cantiti egale. Cel mai
des se utileaz acidul sulfuric. Citirea se efectueaz spectrofotometric la lungimea de und 490 nm.

Interpretarea rezultatelor

Figura 27. Interpretarea rezultatelor metodei ELISA.

Negativ
Pozitiv Control

Pacient A Pacient C
Pacient B

Antigene/anticorpi HBV parial purificat adsorbit de suprafaa


intern a godeului planetei ELISA.

Serul pacientului ce conine Ac. Dac pacientul este HBV+, serul lui va
conine anticorpi sau antigene i se va uni specific cu Ag /Ac absorbite
pe planeta.

Imunoglobulin anti-specie cuplat cu enzim. Sunt anticorpi secundari


i se vor uni de anticorpii umani.

Cromogen sau substratul care-i schimba culoarea cnd este fermentat


de enzima ataat de Ac secundari.

Pozitiv Negativ
ELISA ELISA

Control Positiv Control Negativ Pacientul A Pacientul B Pacientul C Controlul metodei


1.689 0.153 0.055 0.412 1.999 0.123

Exemplu: Orice prob care are valoarea DO mai mare ca proba control pozitiv standard
este considerat pozitiv Valoarea DO este citit la 450 nm.Valorile pozitive certe vor fi repeta-
te suplimentar sau confirmate prin alte metode de diagnostic de laborator.

Instruciuni metodice 81
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

4.2. Diagnosticul molecular biologic al hepatitelor


Reacia de polimerizare n lan
Depistarea i izolarea agentului patogen n bolile infecioase este una din problemele de
baz a microbiologiei medicale contemporane. Folosind investigaiile microbiologice se creeaz
situaii, cnd metodele tradiionale culturale i de asemeni metodele contemporane imunochi-
mice nu sunt suficiente, ceia ce impune implementarea metodelor noi de identificare i izolare
a agentului patogen.
n ultimul timp are loc dezvoltarea intens a metodelor genetice de diagnostic a bolilor in-
fecioase, bazate pe depistarea consecutivitii nucleotidice specifice a agentului infecios.
Lider printre aceste metode este reacia de polimerizare n lan (PCR) i modificrile ei. Ea
face posibil n mare msur mrirea eficacitii depistrii agentului patogen, majornd posibilit-
ile diagnosticului de laborator i stabilirea diagnozei clinice corecte.
Reacia de polimerizare n lan, adic sinteza moleculelor noi de ADN cu ajutorul enzimei
ADN-polimeraza n celul a fost descoperit mai mult de 30 de ani n urm de A. Kronberg, care
mpreun cu alt laureat al premiului Nobel D. Lederberg a presupus c cineva va putea primi
cantiti mari de ADN cu ajutorul acestei reacii. Aceast idee a fost realizat peste 20 de ani
de K. Miulis, laureat al premiului Nobel n chimie anul 1993. K. Miulis, bazndu-se pe procesul
natural de replicare a ADN-ului, a elaborat metoda datorit crei putem primi copii ale genelor
n cantiti mari n eprubet. A numit aceast metod - reacia de polimerizare n lan. Ea a
devenit una dintre cele mai comode i desvrite metode de diagnosticare a ADN-ului, ARN-
ului microorganismelor.
Caracteristicile principale a metodei PCR:
sensibilitate nalt
specificitate nalt
metod direct de determinare a agentului patogen

Principiul metodei:
PCR este modelul in vitro al replicrii ADN-ului n celul, repet destul de exact principiile
replicrii naturale a ADN-ului n celula vie.
La baza acestei metode este procesul care const din mai multe cicluri, ce amintete repli-
carea natural a acizilor nucleici, totodat fiecare ciclu const din cteva etape succesive, are loc
multiplicarea artificial a ADN-ului microorganismului prezent n proba testat.
Etapele reaciei de polimerizare n lan
I. Extragerea ADN-ului/ARN-ului
La aceast etap se extrage ADN-ul sau ARN-ul din materialul biologic testat. n final primim
soluie de ADN/ARN purificat. Putem folosi metoda manual, semiautomat sau automat de
extragere.
II. Amplificarea
Este un proces ciclic n care are loc clonarea (multiplicarea) unui fragment de ADN testat ce
face posibil identificarea lui de mai departe. Fiecare ciclu, la rndul su, const din cteva etape:
Denaturarea ADN-ului la temperatur nalt.
Alipirea la lanurile unicatenare de ADN a aa numitor primeri oligonucleotide complementare
succesivitii nucleotidice cunoscute a ADN-ului testat.
Sinteza fragmentelor noi de ADN cu ajutorul fermentului ADN-polimeraza. (fig.28).

n cadrul unui ciclu din o caten de ADN se sintetizeaz dou catene, complementare ADN-
ului testat. Repetarea ciclurilor reaciei de mai multe ori (numrul de cicluri poate fi programat)
duce la acumularea fragmentelor de ADN (fig.29).

82 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

III.Detecia fragmentelor acumulate pot fi detectate prin diferite metode: electroforez, tehnici
ELISA, fluorometrie etc.
Figura 28. Strategia PCR

ADN-ul iniial

SECVENA CLONAT Denaturarea

Praimeri
Alipirea
praimerilor
ADN
polimeraza

Extinderea
praimerilor

ADN-ul
Sintetizat la finele ciclului

Sursa: webpage http://www2.mtroyal.ab.ca/~tnickle/3311/supplement/PCR_and_sequencing.html

Instruciuni metodice 83
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Figura 29. Acumularea fragmentelor de ADN

ADN
nucleotide

O molecul
ADN Secvena
int

Ciclul I

Dou molecule
ADN

Ciclul II
Patru molecule
ADN

Opt Ciclul III


molecule
ADN

Sursa: webpage http://academic.brooklyn.cuny.edu/biology/bio4fv/page/genetic-engin/pcr.html

84 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Rezumat
PCR metod n trei etape (denaturarea ADN-ului, alipirea praimerilor la catenele de ADN,
sintetiza moleculelor noi de ADN), poate fi repetat de mai multe ori. Acest proces PCR se nu-
mete amplificare, deoarece are loc copierea succesivitii nucleotidice iniiale i apoi fiecare
copie, la rndul su, se multiplic din nou, pn cnd numrul lor atinge milioane. Fiecare caten
nou de ADN servete ca matri pentru sinteza fermentativ (cu ajutorul fermentului ADN-
polimeraza) a catenelor noi n ciclul urmtor.
Teoretic, fiecare ciclu dubleaz numrul de copii ADN; n primul ciclu se sintetizeaz dou
catene din una, apoi patru, apoi opt etc., are loc creterea exponenial a cantitii de copii. PCR
permite obinerea cantitii suficiente de ADN pentru identificarea lui de mai departe.
n dependen de tehnica de executare i de modul de detecie a ADN-ului difereniem mai
multe modificri PCR:
1. Reacia de polimerizare n lan calitativ prin aceast metod se determin pre-
zena sau absena ADN-ului, ARN-ului n prob.
Proba se compar cu setul de controale pozitive i negative. Se consider pozitive acele pro-
be care au migrat la electroforez (n cazul identificrii prin electroforez) la fel ca i controlul
pozitiv.
2. Reacia de polimerizare n lan cantitativ permite determinarea concentraiei
ADN-ului, ARN-ului (ncrctura viral).
Determinarea concentraiei ADN/ARN n hepatitele virale, la momentul actual, este un test
obligator la iniierea tratamentului antiviral. Acest test permite:
stabilirea gravitii bolii
aprecierea pronosticului bolii
monitorizarea eficacitii tratamentului, cu posibilitatea schimbrii preparatelor medicale n cazul
rspunsului neadecvat la tratament.

Calculul ncrcturii virale se efectueaz automat, la compararea cu setul de standarde cu


diferite concentraii cunoscute.
PCR cantitativ n regim Real time este una dintre variantele de perspectiv nalt a
metodei cantitative de determinare a agentului patogen. n reacie se folosesc sonde speciale
(praimeri), marcate cu colorani fluoresceni. Alipirea sondelor la catenele de ADN produce
un semnal fluorescent care este detectat de canalul de citire i transmis pe calculator. O parti-
cularitate deosebit a PCR Real time este posibilitatea de a primi informaia despre cantitatea
ADN-ului n proba testat nemijlocit n timpul reaciei. Calculul rezultatelor se efectueaz auto-
mat, comparnd semnalul fluorescent produs de proba testat cu curba de calibrare construit
dup semnalele fluorescente primite de la setul de standarde, prezente n trusele de detecie, cu
concentraii diferite, cunoscute.
Necesitatea testrii:
1. Soluionarea rezultatelor suspecte la testarea serologic.
2. Diagnosticul diferenial al hepatitelor virale.
3. Identificarea perioadelor acute a bolii, n comparaie cu infecia suportat
4. Identificarea agentului patogen n perioada de incubare a bolii, pn la apariia antigenelor i
anticorpilor specifici, la persoanele cu risc major de infectare, persoanelor care au fost n contact
cu bolnavii.
5. Monitorizarea eficacitii tratamentului antiviral.
6. Se consider criteriu de finalitate posibil i credibil a terapiei.

Instruciuni metodice 85
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Tabelul 23. Avantajele PCR n comparaie cu alte metode de diagnostic

Parametrii Caracteristica
Metoda este bazat pe principiul exponenial de acumulare a
Sensibilitate nalt produsului amplificat, pentru identificare este suficient prezena n
proba testat a unui singur virus.
Bazat pe identificarea secvenelor de material genetic unic pentru
Specificitate nalt microorganism, ce determin particularitile de clas, toxicitate i
alte particulariti specifice ale agentului patogen.
Timp scurt de efectuare 2-6 ore de la nceputul examinrii.
Procedur universal de Procedura de efectuare a reaciei este standard practic pentru toi
executare agenii patogeni.
Agentul patogen poate fi identificat n orice lichid biologic al
organismului uman i de asemeni n materialele primite n urma
Materialul biologic
biopsiei. Nu este necesar creterea culturii pe medii, sau izolarea
culturii curate de agent patogen.
Diagnosticul diferitor Este posibil diagnosticul formelor acute, cronice, trenante, forme
procese patologice seronegative.
Diagnosticul oricrui tip Identificarea microorganismelor ce pot fi cultivate, microorganisme
de microorganism ce nu pot fi cultivate, forme persistente.
Este posibil identificarea agentului patogen nu numai n perioada de
stare sau cronic, dar i n perioada de incubare a bolii fereastra
Perioada bolii imunologic , perioada dintre momentul infectrii i apariia
anticorpilor sau antigenelor specifice (depistarea ADN-ului, ARN-ului
dup o sptmn sau dou de la momentul infectrii).
Cantitatea agentului Este suficient prezena unui singur microorganism n materialul
patogen n proba testat testat.
Este metod direct de identificare a agentului patogen, bazat
Metoda pe modalitatea universal de pstrare i transmitere a informaiei
genetice la materia vie.

Importan major n asigurarea calitii PCR prezint colectarea corect a materialului bio-
logic i pregtirea materialului biologic.
Reguli generale de recoltare i transportare a materialului biologic pentru investigaiile PCR
Recoltarea probelor se efectueaz cu instrumentar steril, de unic folosin, n eprubete, containere etc.
Imediat dup recoltarea probelor, eprubetele cu materialul biologic se nchid, fr s fie atins partea
intern a capacului cu minile.
La transferarea materialului biologic din eprubete, containere se folosesc vrfuri cu bar de unic folosin.
Probele se pstreaz n frigider, congelator. Nu se permite congelarea repetat a probelor.
Eprubetele, containerele trebuie s fie etichetate.
Transportarea materialului biologic se efectueaz n termocontainere cu elemente de rcire sau n
termos cu ghea, nchise etan, impermeabile pentru lichide i etichetate corespunztor coninutului.
Containerele trebuie s fie rezistente la dezinfectani, autoclavabile. Trebuie s fie decontaminate
dup fiecare utilizare.
Toate materialele care au fost n contact cu proba se vor evacua n containere pentru deeuri
medicale, ce urmeaz s fie autoclavate.

86 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Controlul calitii tehnicii PCR


Controlul intern al calitii n reacia de polimerizare n lan este asigurat, n primul rnd, de
utilizarea pentru fiecare prob n parte a controlului intern preparat de ARN sau ARN sinte-
tizat artificial, cu aceleai uniti structurale recunoscute de praimeri ca i ADN-ul sau ARN-ul
microorganismului, dar care se deosebete dup lungimea prii de amplificare, temperatura de
topire, consecutivitatea nucleotidic. Controlul intern parcurge toate etapele reaciei de polime-
rizare n lan mpreun cu proba testat.
Controlul intern este elementul obligator al etapei de prelucrare a materialului biologic
(izolarea ADN-ului, ARN-ului). El face posibil controlul asupra :
eficacitii izolrii ADN-ului, ARN-ului din proba biologic testat
eficacitii nlturrii inhibatorilor reaciei de polimerizare n lan
controlul calitii lucrului personalului

Numai folosirea controlului intern n aceast reacie permite monitorizarea izolrii calitative
a ADN-ului, ARN-ului agentului patogen din proba testat.
Controlul calitii este asigurat i de utilizarea serurilor de control pozitive i negative, folo-
site pentru fiecare etap a reaciei, prezente n trusele PCR i de asemeni de utilizarea panouri-
lor standarde, elaborate de firmele productoare de truse de diagnostic.

Metoda hibridizrii
Metoda hibridizrii in situ metod direct de identificare a acizilor nucleici n structurile
celulare, ce permite n acelai timp studierea morfologiei lor.
Aceast metod a fost elaborat n anul 1969 de Pardiu i Goll, i independent de Djons.
Metoda este bazat pe legarea sondelor marcate de hibridizare (structuri moleculare ge-
noinginerice sau sintetice, care sunt formate din consecutiviti de nucleotide complementare
fragmentelor de ADN sau ARN).
Principiul:
Sondele de hibridizare marcate cu radioizotopi sau marcheri neradioactivi se leag specific
cu ADN-ul sau ARN-ul din proba testat.
Calculul rezultatelor se efectueaz dup intensitatea semnalului emanat de marcherul son-
dei de hibridizare din complexul format.
Astzi, metodele de hibridizare completeaz cu succes metodele de rutin de diagnostic,
permind identificarea diferitor microorganisme n culturi celulare i esuturi.
Figura 30. Echipament pentru detecia molecular

Instruciuni metodice 87
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

4.3. Metode de testare rapid


(metode expres, metode imunocromatografice)
1. ADVANCED QUALITY One Step HBsAg Test (Bionike Inc.)
Metoda imunochromatografic pentru determinarea Ag HBs din ser ntr-o singur etap.
Metod calitativ. Godeu pentru
prob

Bandda Bandda test


control
2. Determine HBsAg (Abbott Laboratories)
Metod calitativ de determinare a Ag HBs in serul, plasma i sngele integru.

3. ImmunoComb II 90 (Orgenics)
Metod calitativ, 1 singur etap, pentru detecia Ag HBs n ser i plasma.

88 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

4.4.teste de confirmare
testul Western Blot
Testul Western Blot determin mai muli anticorpi din snge care s-au format contra anumitor
componente proteice a virusului Hepatitelor virale. Testul Western-Blot este mai complicat i mai
scump dect testul ELISA, acestea fiind unele din motivele pentru care este aplicat doar ca o confir-
mare a unui test pozitiv ELISA, efectuat anterior.
1) Proteinele sunt separate electroforetic n gel poliacrilamid. Sub aciunea cmpului electric are
loc difuzia proteinelor conform greutii moleculare a proteinelor, aranjndu-se n zone liniare
subiri. Ele se repartizeaz n modul urmtor: mai aproape de start se aranjeaz proteinele cu mas
molecular mare (120-150 kDa), la final se aranjeaz proteinele cu mas molecular mic (5-10kDa).
2) Apoi lamela de gel este transferat pe o foaie de nitrocelulos amplasat ntre electrozii unei surse de
curent continuu. Sub aciunea cmpului electric are loc trecerea proteinelor din gel pe nitroceluloz,
unde se fixeaz foarte bine pe hrtie. Proteinele fixate sunt marcate cu o enzim (e.g. alkaline
phosphatase sau peroxidase) incolor. Apoi hartia se taie n fii scurte care vor conine toate
fraciile proteice. Procedura ulterioar de montare a reaciei este similar tehnicii ELISA.

Figura 31. Principiul metodeie Western Blots

RIBA-HCV metoda recombinant de imunoblot, produs de firma Ortho Diagnostic Sys-


tems i menit pentru confirmarea rezultatelor pozitive la detecia anticorpilor VHC. Pe msura
acumulrii informaiei privind hepatita C au fost elaborate i produse 3 variante de teste: RIBA-VHC
I generaie (2 proteine recombinate: 100-3 i 5-1-1), II generaie (4 proteine recombinate: 5-1-1;
100-3; i 22) i a III generaie la care suplimentar au fost adugate proteinele, codificate n
zona virusului ARN VHC - NS 5. Proteinele recombinate sunt plasate pe membrana de nitroceluloz
sub form de striuri.
Schema general a reaciei: incubarea materialului examinat cu striul de nitroceluloz (are
loc interaciunea dintre Ac cercetai cu proteinele recombinate de pe membrana de nitroceluloz);
incubarea cu conjugat anticorpi contra IgG uman, marcat cu peroxidaza de hrean; incubarea cu
soluia de substrat. Citirea rezultatului se face vizual. La apariia benzilor colorate identice locului
adsorbiei proteinelor recombinate testul se consider pozitiv.
TEST DE CONFIRMARE AgHBs (Confirmatory test) Testul de confirmare se utilizeaz
pentru confirmarea AgHBs, decelat prin metoda ELISA, RIA. Principiul const n neutralizarea AgHBs
din proba testat cu ser anti HBs, dup care AgHBs i pierde capacitatea de a fi detectat prin meto-
dele imunofermentative sau RIA.
Schema general a reaciei: testarea serului ce conine AgHBs se face paralel n 2 eprubete:
n 1 se adaug serul bolnavului cu ser ce conine anti-HBs, n a II-doar materialul de cercetat, fr
anti-HBs. Dup incubare i detecia AgHBs conform instruciunii din trusele comerciale, se analizea-
z rezultatele obinute. Dac valoarea reaciei din proba n care au fost adugai anticorpi anti-HBs
este de 50% mai mic dect valoarea probei nr. 2, aceast prob se determin ca pozitiv.

Instruciuni metodice 89
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

4.5. metode de diagnostic clasice


Reacia de imunofluorescen (RIF)
n 1979 Curry R.E, Heizmann H i colaboratorii (Clinical Chem, 1979, 25/9, 1591), propun
o alt alternativ neizotopic a metodei RIA i anume imunofluorescen. Aceasta a fost
printre primele metode care au utilizat markeri luminoi pentru marcarea anticorpilor sau a
liganzilor n sistemul de dozare.
Fluorocromii:
se leag covalent de proteine (imunoglobuline) = conjugat
emit fluorescen dac se expun la raze UV
izotiocianatul de fluorescein (galben-verzui), rodamin (portocalie)
nu sunt stabili n timp

1.1 Metoda direct


Preparatul de examinat se monteaz pe lam. Se adaug conjugatele. n cazul n care se g-
sesc Ag corespunztoare anticorpilor marcai, se formeaz complexele imune. Prin splare se
ndeprteaz conjugatele nelegate. Preparatul se examineaz la microscopul cu fluorescen.
Puncte fluorescente pe fond ntunecat: n preparatul examinat au fost prezente antigenele cu-
tate (rezultat pozitiv).
- Absena punctelor fluorescente: n preparat nu au fost prezente antigenele cutate (rezultat negativ).

1.2 Metoda indirect


La preparatul montat i fixat pe lam se adaug anticorpi specifici nemarcai. n cazul n care
exist Ag corespunztoare anticorpilor, se formeaz complexele imune. Prin splare se nde-
prteaz Ac nelegai. Se adaug anticorpi antiglobulinici marcai cu fluorocrom. Dac exist n
preparat complexe imune, conjugatele se vor lega de imunoglobuline. Examinarea: identic ca
i metoda direct.

90 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

MICROSCOPIA IMUNOELECTRONIC (Immune electron microscopy) Repre-


zint metoda de vizualizare propriu - zis a interaciunii dintre Ag-Ac. A fost propus pentru
prima dat de J. Almeid i A. Wotwrson n 1969. Etapele
1. Materialul patologic n care se presupune prezena virusului cutat se amestec i se
incubeaz cu serul imun standardizat.
2. Complexul Ag-Ac se precipit/sedimenteaz prin centrifugare.
3. La sedimentul obinut se adaug substana de contrast i preparatul se studiaz la micro-
scopul electronic.
Test pozitiv vizualizarea agregatelor caracteristice formate din particule virale unite ntre
ele prin puni de anticorpi. Sensibilitatea metodei date nu este prea nalt. Decelarea virusului din
preparatul studiat se face n cazul concentraiei virale din materialul patologic nativ de 104 106
particule virale /ml. Avantaje se poate de vizualizat forma, dimensiunile, configuraia. Aceast
metod a fost utilizat n primele etape de studiere a virusurilor hepatice n scop de diagnostic
i tiinific. Prin metoda dat a fost identificat VHA i VHE. Dup apariia metodelor noi care per-
mit investigarea unui numr mare de pacieni aceast metoda i-a pierdut din utilitatea practic,
fiind utilizat n continuare doar n cercetri tiinifice cu studierea morfostructurii antigenelor.
ContrAimunoelectroforeza (Counter immunoelectrophoresis) me-
toda de identificare a Ag i Ac, bazat pe formarea precipitatului vizibil n gel agar la locul de n-
tlnire i legare a Ag i Ac specifici, care difundeaz n gel unul fa de altul sub aciunea cmpului
electric. Metoda dat are multiple modificaii, fiind diferite dup timpul de executare a electro-
forezei, a soluiilor bufer, intensitatea cmpului electric, etc. La sfritul anilor 60-70 contraimu-
noelectroforeza era o metod foarte utilizat n detecia HBsAg. Dup sensibilitate metoda dat
ntrece reacia de precipitare n gel de 2-4 ori. Rezultatele reaciei se pot citi dup 1,5-2 ore de
la nceputul electroforezei. La moment are o utilizare limitat.
REACIA DE HEMAGLUTINARE INDIRECT (Indirect hemaglutination test)
metoda deteciei Ag sau Ac, bazat pe proprietatea eritrocitelor la suprafa crora sunt
prealabil absorbite Ag sau Ac s se aglutineze n prezena serurilor omologe sau antigenelor
respective. La identificarea Ag reacia se numete reacia de hemaglutinare pasiv indirect RPHAI
(reversed passive hemagglutination test). RPHAI a fost larg utilizat pentru identificarea marche-
rilor serologici a hepatitei B, n special al Ag HBs. La moment, sunt diferite metode de obinere a
diagnosticumurilor eritrocitare, ce se pot deosebi, att dup metoda de sensibilizare (cu ajutorul
taninei, aldehidei de glutarat, rivanolului), dup apartenena de specie (eritrocite de om, ber-
bec, curcan, .a.), dup varianta de montare a reaciei (microplanete, macroplanlete, eprubete,
.a.) ct i dup citirea rezultatului (vizual sau instrumental). Se comercializeaz diagnosticumuri
eritrocitare, att pentru detecia AgHBs, ct i a anti HBs. Avantaje costuri mici pentru apa-
ratur i teste, simplicitate n executare, rapiditate. Sensibilitate mai mare fa de testele RFC,

Instruciuni metodice 91
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

RPG de 200-400 ori. Prin metoda dat se poate determina AgHBs n concentraii de 6-10 ng/ml.
Dezavantaje - sensibilitate mult mai mic ca ELISA. Necesit metode de confirmare. La mo-
ment utilizare limitat.
RIA REACIA RADIOIMUNOENZIMATIC (Radioimmunoassay) metoda de
detecie a Ag i Ac, bazat pe determinarea complexului Ag-Ac n baza introducerii la unul din
componente a marcajului prin izotop radioactiv i detecia ei ulterioar n aparate speciale.
Rezumat
Primele aplicaii ale radioizotopilor sunt legate de principalele etape n istoria descoperirii
izotopilor iodului, a cercetrii metabolismului lui i folosirii radioiodului n scop diagnostic i
terapeutic. Metoda a fost pus la punct n a. 1960.
In 1959 R.Yelow si S. Berson au efectuat cercetri pentru introducerea unei metode directe
de imunoanaliz. Ei au preparat un ser anti-insulin pe care l-au incubat cu insulina marcat cu
131 I i insulina nemarcat obinut de la cobai i au pus acest complex s migreze cromato-
grafic, urmrind curba doza-efect. Aceast lucrare i experimentele celor doi au pus bazele
radio-imunoanalizei (RIA).
Metodele RIA au fost precursoarele metodelor ELISA, Chemiluminiscena, imunofluores-
cente, etc., care astzi sunt larg utilizate.
Pn la 1975, sistemele RIA, utilizau anticorpi policlonali, de bun calitate, dar cu o speci-
ficitate nu foarte mare. In 1975, Kohler i Milstein ( Nature, 1975, 256, 495) obin in vitro an-
ticorpi monoclonali formai dintr-o populaie molecular omogen avnd o monospecificitate
pentru un epitop determinat. Ei pot fi obinui ntr-o manier aproape nelimitat ceea ce d o
reproductibilitate mare n timpul dozrilor imunologice. Producerea de anticorpi monoclonali
a determinat:
creterea specificitii i sensibilitii sistemelor RIA.
apariia unor noi tehnici imunometrice neizotopice de tip sandwich care astzi sunt foarte mult
utilizate.

Tabelul 24. Avantajele metodei RIA


Metoda Marcher Avantaje Dezavantaje
RIA: Izotopi Sensibilitate: mare Timp de via: scurt
radioactivi
competiie ntre Specificitate: mare Produs: radioactiv
Ag ce se studiaz i I125 I131 H3
Pre: mic/mediu Deeuri: radioactive
Ag marcat pentru
legare la acelai Ac Sistem: deschis Costuri analizor (gamma counter): mare
specific.
Condiii de lucru: speciale, autorizate

Reacia de precipitare n gel, RPG (Gel precipitation test) metoda


deteciei Ag i Ac bazat pe principiul difuziei componentelor date n stratul de gel agar cu for-
marea liniilor specifice vizibile de precipitare n sectoarele unde interacioneaz i se obine o
concentraie echivalent de componente. Cel mai des se utilizeaz metoda de difuziune dup .
Ouhterlony n 1948, dup care Ag i Ac se pun n godeuri unul fa de altul fcute n stratul de
gel, dup o perioad n grosimea pe gel se formeaz nite linii de precipitare corespunztoare
numrului de Ag i Ac specifici. Metoda a fost larg utilizat pentru detecia AgHBs n anii 60-70.
Prin aceast metod s-a decelat pentru prima dat prezena AgHBe.

92 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

5. CONTROLUL CALITII N LABORATOARELE MEDICALE


Laboratorul trebuie s elaboreze un sistem de control intern al calitii care s verifice n-
deplinirea performanelor de calitate a rezultatelor. Sistemul de control trebuie s ofere colec-
tivului laboratorului informaii clare i uor de neles pe care s-i poat baza deciziile tehnice
i medicale (ISO 15189)
Controlul Intern de Calitate cuprinde tehnici i activiti operaionale din cadrul unui labo-
rator care sunt folosite pentru a ndeplini cerinele calitii.
Scopul controlului intern de calitate:
1. Rezultatele msurrilor sunt suficient de sigure pentru a fi eliberate.
2. Permite eliminarea neconformitilor care apar la anumite etape ale managementului calitii.
CALITATE (Uniunea European) referit ctre serviciile furnizate de laboratoarele medi-
cale este:
indicarea corect i oportun a unui sau mai multor teste;
executarea testelor ntr-o sistem analitic sigur;
eficiena informaiei de laborator prin interpretarea i aplicarea adecvat

ASIGURAREA CONTROLULUI INTERN DE CALITATE


Etapele procesului de cercetare:
I. Epata pre-analitic 57,3%
extralaborator 20,2%
intralaborator 37,1%

II. Etapa analitic 25,1%

III. Etapa post-analitic 17,3%


intralaborator 13,6%
extralaborator 3,7%

I. ETAPA PRE-ANALITIC
n asigurarea calitii la etapa pre-analitic vor servi realizarea unor msuri bazate pe conlu-
crare ntre serviciile clinico-sanitare i laboratoarele medicale.
1. Respectarea regulamentelor de obinere i ndreptare a materialelor biologice pentru investigare.
2. Asigurarea condiiilor standardizate de colectare, pstrare i transportate a biomaterialelor pentru
prevenirea contaminrii sau degradrii acestora.

Msuri de asigurare a calitii la etapa pre-analitic:


1. Elaborarea algoritmului de testare
2. Respectarea condiiilor de recoltare a biomaterialelor pentru investigare.
3. Asigurarea calitii completrii documentaiei de nregistrare:
completarea formularelor de ndreptare la investigaii
elaborarea registrelor de eviden a biomaterialelor expediate
elaborarea formelor de marcare a recipientelor

4. Respectarea condiiilor de pstrare i transportare.


5. Elaborarea criteriilor de acceptare a probelor pentru testare.

Instruciuni metodice 93
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

94 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Condiii de recoltare:
starea fizic a pacientului
timpul de recoltare
recipientele: tuburi de plastic sau sticl, prezena aditivilor
instrumentar pentru recoltare sisteme de unic folosin

Standardizarea condiiilor de recoltare a probelor biologice primare:


O perioad standard de post de 12 ore (min-4 ore);
O perioad de 12 ore de efort fizic redus;
30 min repaus fizic nainte de recoltare;
Aceiai poziie a pacientului la recoltare;
Acelai interval de timp al recoltrii (7-9);
1. Se aplic garoul pe ante-
Aceiai durat de aplicare a garoului (max 1-2 min);
bra. Se palpeaz vena cubita-
Evitarea nchiderii i deschiderii repetate a pumnului;
l i se dezinfecteaz.
n timpul perfuziilor i transfuziilor recoltarea se va face de la cellalt bra;
Dac este necesar s se repete flebotomia, recoltarea se va face de la cellalt bra;
Pe formularul de solicitare trebuie specificat medicaia administrat: cu ce, de cnd, ct timp;

Calitatea completrii documentaiei:


completarea formularelor de ndreptare la investigaii
2. Se introduce acul n ven i
elaborarea registrelor de eviden a biomaterialelor expediate 3. Se astup etan tubul cu
se extrage sngele n tub.
elaborarea formelor de marcare a recipientelor dop. Se marcheaz eticheta
de pe tub conform registrului.
Formularul de ndreptare va include urmtoarele puncte:
Informaie ce permite identificarea unic a pacientului;
Data i ora cnd a fost colectat proba;
Tipul probei;
Investigaiile solicitate;
Data i ora cnd proba a fost recepionat de laborator;
Informaie clinic relevant
Localul unde urmeaz a fi trimise rezultatele;
Numrul de acces n laborator
Persoana responsabil de testele solicitate

Transportarea probelor
Trebuie s existe proceduri pentru transportul probelor colectate, incluznd temperatura
optimal, protecia mpotriva luminii, precauii la staionare, intervalul de timp permis nainte de
pre-examinare (centrifugare, deproteinizate), n cazuri speciale condiii de depozitare.
Pentru minimalizarea riscului de ncurcare a probelor trebuie s existe proceduri pentru
trimiterea probelor la alte laboratoare cu respectarea completrii formularelor i acordurilor
necesare.
Toate probele se transport n ambalaje perfect nchise;
Probele biologice transportate se eticheteaz Probe diagnostice / pericol infecios;
Dac distanele sunt mari se prefer sngele recoltat pe anticoagulant i pe gel separator;

Instruciuni metodice 95
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Se evit expunerea la lumin (condiioneaz micorarea coninutului de bilirubin, vitamina C,


porfirinele, creatinkinazei);
Poziia vertical a tuburilor n timpul transportului accelereaz coagularea;
Se evit agitarea probelor de snge, risc de hemoliz;
Se evit pstrarea sngelui integru.

Pentru a face posibil repetarea examinrii dup raportarea rezultatelor sau pentru exami-
nri adiionale, probele primare trebuie pstrate pentru un interval de timp n care se asigur
stabilitatea proprietilor acesteia.
Figura 32. Prelevarea probelor de snge

Obinerea probelor:
1. Recoltarea sngelui cu respectarea regulamentelor de securitate i antiseptic
2. Asigurarea condiiilor de obinere a serului:
poziie vertical
pstrarea tuburilor cu snge la t- 22 - 24C - pn la 2 ore
la t- 4-8 C - pn la 48 ore
regim de centrifugare: 1000- 1500 rot/min 10 min

Acceptarea probelor i asigurarea calitii


Inspectarea probelor la primirea n laborator.
Se verific:
Concordana dintre marcajul tubului, flaconului, containerului i datele din formularul de solicitare.
Acceptarea duratei dintre recoltarea i primirea probei n laborator.
Dac proba a fost rcit sau au fost adugai conservani n cazul n care transportul a fost ntrziat.
Integritatea tuburilor, containerului i condiia n care se afl.
Volumul materialului suficient pentru testrile solicitate.
Prezena sau absena conservanilor chimici, indicate pentru testele solicitate.
Probele primare se verific dac nu sunt hemolizate, lipemice, etc.
Dac proba primar nu satisface condiiile necesare personalul responsabil:

96 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

comunic unitii corespunztoare;


noteaz incidentul n registrul corespunztor;
returneaz proba primar.

Nu se arunc proba inacceptabil nainte de a consulta personalul clinic i a stabili


o decizie de comun acord.
Personalul laboratorului la recepionarea probelor:
le atribuie un numr de identificare n laborator;
transfer identificarea i testele solicitate n registrul de primire a probelor i/sau n listele de lucru;
documenteaz listele de lucru;
distribuie probele pe departamente.
Sursele de erori la etapa pre-analitic:
neidentificarea corect a pacientului
neidentificarea corect a probei
date eronate n formularele de nsoire
hemoliz, contaminarea probei
devierea activitii specifice a componentului cauzat de nerespectarea condiiilor de recoltare,
transportare i pstrare

II. Etapa analitic


Obiectivul de baz a controlului calitii la etapa analitic este dirijarea calitii analizelor
pentru asigurarea rezultatelor exacte i veridice.
Controlul calitii sistemei analitice:
Utilizarea test-sistemelor cu caracteristice performante
Utilizarea utilajului metrologic testat
Personal instruit

Monitorizarea calitii investigaiilor:


Utilizarea materialelor de control cu valori predeterminate, dup rezultatele crora poate fi
apreciat calitatea examinrilor efectuate i exactitatea rezultatelor obinute.
Pentru implementarea controlului intern de calitate la etapa analitic sun necesare:
1. Material de control
2. Cerine de organizare
3. Metode de control
4. Reguli de apreciere
Material de control
Caracteristici de calitate: stabil la pstrare, omogen la diluie, valabil la t 2-8 C nu mai puin de 1 an,
dup diluie valabil timp de 4-8 ore la t 20-25 C, timpul de reconstituire - nu mai puin de 30 min,
comod i simplu n utilizare
preferabil de origine uman
cu valori predeterminate
minimum 2 nivele de concentraii (normal i patologic)
Cerinele n organizarea Controlului Intern de Calitate:
testarea materialelor de control trebuie s fie inclus n regimul obinuit de lucru;
testarea materialelor de control se va efectua de persoana care nfptuiete zilnic metoda de cercetare;
materialele de control se vor testa prin aceleai metode de cercetare care sunt utilizate n laborator

Instruciuni metodice 97
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

pentru investigarea probelor biologice;


laboratorul va fi asigurat cu materiale pentru controlul zilnic n cantitate suficient.

METODELE CONTROLULUI INTERN DE CALITATE


Metode cu aplicarea materialelor de control
Hrilor de control
Criteriilor Westgard

Metode cu aplicarea rezultatelor pacienilor


Probelor paralele
Prin amestec
Prin adaus
Mediei normale
Compararea metodelor
Delta control

Strategia controlului statistic:


1. Stabilirea limitelor de control:
testarea materialului de control n cteva serii (preferabil nu mai puin de 20 de valori);
aprecierea limitelor de control prin calcularea: mediei Xm; DS; CV

Xm = Xi_
n
DS = (Xi Xm)2 / n - 1

CV (%) = _ DS_ 100


X
Unde: Xm - media valorilor determinate
n - numrul de determinri
Xi - suma valorilor determinate
DS - deviaia standard
CV coeficientul de variaie

Limita controlului nu poate fi mai mare de Xm 3DS


Dup ce sunt efectuate calculele rezultatele se pot reprezenta pe Harta Levey Jennings.
Regulile Westgard (6 reguli)
12S : un rezultat al unui singur nivel de control se situeaz dincolo de medie 2DS
Este un semnal de alarm care imune analiza i a altora rezultate i reguli. n absena altor
semnale de alarm, nu se impune rejectarea controlului i a rezultatelor pacienilor. Este un in-
dice de eroare ntmpltoare.
13S :un singur rezultat se situeaz dincolo de limitele 3DS
Semnific o eroare ntmpltoare, dar poate s fie nceputul unei erori sistematice grave.
22S : dou rezultate consecutive se situeaz dincolo de medie 2DS
Semnific o nceputul unei erori sau prezena unei erori sistematice care afecteaz curba.

98 Instruciuni metodice
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

R4S : un rezultat dincolo de medie + 2DS, cellalt dincolo de medie 3DS


Deci, o diferen de 4 DS, semnific eroare ntmpltoare.
41S : patru rezultate consecutive dincolo de 1 DS
Semnific eroare sistematic. Se disting 2 situaii:
cnd ambele nivele de control se situeaz de 2 ori consecutiv, pe aceiai parte a mediei, dincolo de 1 DS
cnd cel puin un nivel de control se situeaz de 4 ori consecutiv, de aceiai parte a mediei, dincolo
de 1 DS
10X : 10 rezultate de aceiai parte a mediei, indiferent de dimensiunea deviaiei
Semnific eroare sistematic. Se disting 2 situaii:
cnd ambele nivele de control se situeaz de 5 ori consecutiv de aceiai parte a mediei
cnd cel puin un nivel de control se situeaz de 10 ori consecutiv pe aceiai parte a mediei.

Oricare din situaiile 13S 22S R4S 41S 10X semnific rezultate inacceptabile pen-
tru controlul intern i impun rejectarea seriei de analize. Analizele pacienilor se
refac dup ce sunt nlturate cauzele ce au generat erori i recontrolarea s-a dove-
dit acceptabil.
Sursele i tipurile de erori analitice:
a. Erori grave:
s-au ncurcat reagenii
s-a omis sau exclus unul din reageni
deteriorarea, afectarea neprevzut a aparatajului
deconectarea neprevzut a sursei de energie
un reagent necalitativ din completul test-sistemei
b. Erori ntmpltoare:
erori la pipetare
erori de oboseal, neatenie
instabilitatea funcionrii aparatajului
instabilitatea a parametrilor de calitate a test-sistemelor
a. Erori sistematice:
nerespectarea sistematic a etapelor procesului tehnologic de investigare
eroare permanent la calcularea rezultatelor
afectarea curbei de calibrare n urma instabilitii funcionrii aparatajului
afectarea curbei de calibrare n urma utilizrii calibratorilor necalitativi
aplicarea unui lot de test-sisteme necalitative

III. ETAPA POST-ANALITIC


1. Forma de eliberare a rezultatelor.
2. Obinerea rezultatelor n interval de timp optimal i informarea specialitilor.
3. Interpretarea corect a rezultatelor.
4. Utilizarea adecvat a rezultatelor (diagnosticare sau monitorizare).

Instruciuni metodice 99
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

6. CERINE DE SECURITATE BIOLOGIC PENTRU LABO-


RATOARE MEDICALE
Laboratory biosafety manual.Third edition. World Health Orgaizations. Geneva 2004
Toate laboratoarele medicale trebuie concepute conform unui nivel de biosiguran 2 sau mai
mare. Deoarece nici un laborator nu are un control complet asupra probelor pe care le primete,
personalul din laborator poate fi expus la microorganisme din grupuri de risc superioare celor
anticipate. Aceast posibilitate trebuie luat n considerare cnd se elaboreaz planurile i politi-
cile de biosiguran. De regul, precauiile standard trebuie adoptate i aplicate ntotdeauna.

6.1. Codul de practici


Acest cod este o list a celor mai importante practici i proceduri de laborator care stau la
baza practicilor microbiologice corecte (good microbiological techniques = GMT). n multe
laboratoare i programe naionale n care acestea particip, acest cod se poate utiliza pentru ela-
borarea de reguli i proceduri scrise pentru efectuarea n siguran a operaiunilor n laborator.
Fiecare laborator trebuie s adopte un manual de siguran sau de operaiuni care s identi-
fice pericolele cunoscute sau poteniale precum i procedurile i practicile specifice pentru eli-
minarea sau reducerea la minimum a acestor pericole. GMT sunt fundamentale pentru sigurana
activitilor de laborator. Echipamentul special de laborator este un element suplimentar, care
nu va putea ns niciodat s nlocuiasc aplicarea procedurilor corecte. Cele mai importante
concepte sunt enumerate mai jos.
Accesul
1. Sigla internaionala de avertizare i inscripia Pericol biologic trebuie s fie afiate pe uile
ncperilor unde sunt manipulate microorganisme aparinnd grupului de risc 2 sau mai mare.
2. Numai persoanele autorizate vor fi lsate s intre n zonele de lucru ale laboratorului.
3. Uile laboratorului trebuie s stea nchise.
4. Copiii nu trebuie autorizai sau lsai s intre n zonele de lucru ale laboratorului.
5. Accesul n biobaze trebuie s se fac numai pe baza unei autorizaii speciale.
6. Nu se admite accesul altor animale n afara celor folosite pentru activitile de laborator
Protecia individual a personalului
1. Salopetele de laborator, halatele sau uniformele trebuie purtate tot timpul ct se lucreaz n laborator.
2. Mnui corespunztoare de protecie trebuie purtate n timpul tuturor procedurilor care pot implica
contactul direct sau accidental cu snge, cu alte umori sau fluide ale organismului, cu alte materiale
potenial infecioase sau cu animale infectate. Dup utilizare, mnuile se scot aseptic i se spal
minile.
3. Personalul trebuie s se spele pe mini dup manipularea materialelor infecioase i a animalelor
infectate i nainte de prsirea zonei de lucru a laboratorului.
4. Ochelarii de protecie, ecranele de protecie facial sau alte dispozitive de protecie trebuie purtate ori
de cte ori este necesar protecia ochilor i a feei de stropi i surse artificiale de radiaii ultraviolete.
5. Este interzis purtarea mbrcmintei protectoare de laborator n afara laboratorului, de exemplu n
cantine, camere de oficiu, biblioteci, toalete, etc.
6. nclmintea decupat n partea din fa (sandale) este improprie purtrii n laborator.
7. Consumul de alimente, buturi, machiajul i manipularea lentilelor de contact sunt interzise n zonele
de lucru ale laboratorului.
8. Depozitarea de alimente sau buturi oriunde n zona de lucru a laboratorului este interzis.
9. mbrcmintea i nclmintea de protecie ce a fost utilizat n laborator nu trebuie s fie
depozitat n aceleai dulapuri cu mbrcmintea i nclmintea de strad.

100 Instruciuni metodice


DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Procedurile
1. Pipetarea cu gura este strict interzis.
2. Nici un material nu trebuie dus la gur. Etichetele nu trebuie umectate cu limba nainte de lipire.
3. Toate procedurile tehnice trebuie efectuate ntr-un mod care s reduc la minimum
formarea de aerosoli i picturi.
4. Folosirea acelor i seringilor hipodermice trebuie limitat. Ele nu trebuie folosite ca
substituente ale dispozitivelor de pipetare sau pentru oricare alt manoper ce nu
reprezint injecii parenterale sau aspirarea de fluide de la animalele de laborator.
5. Toate stropirile accidentale i expunerile evidente sau posibile cu material infecios trebuie raportate
responsabilului laboratorului. Se va pstra o eviden scris a acestor accidente i incidente.
6. Se va elabora i aplica o procedur scris pentru curarea-inactivarea substanelor vrsate.
7. Lichidele contaminate trebuie decontaminate (chimic sau fizic) naintea evacurii lor n reeaua de
canalizare. n funcie de riscul evaluat se poate dezvolta un sistem de tratare a acestor lichide.
8. Documentele ce urmeaz a fi scoase din laborator trebuie s fie protejate pe toat perioada ct se
afl n laborator, pentru a nu fi contaminate.
Zonele de lucru ale laboratorului
1. n laborator trebuie pstrat curenia i ordinea, eliminndu-se toate materialele care nu sunt
necesare pentru munca desfurat n laborator.
2. Suprafeele de lucru trebuie decontaminate dup fiecare vrsare de materiale potenial
periculoase precum i la sfritul zilei de lucru.
3. Toate materialele contaminate, probele i culturile, trebuie decontaminate nainte de a fi ndeprtate
sau curate pentru refolosire.
4. Ambalarea i transportul trebuie s respecte reglementrile naionale i/sau internaionale n vigoare.
5. Ferestrele ce pot fi deschise trebuie prevzute cu plase/ecrane pentru insecte.
Managementul biosiguranei
1. eful de laborator (persoana care poart n mod direct responsabilitatea laboratorului) are obligaia
s asigure elaborarea i adoptarea unui plan de management al biosiguranei i ale unui manual de
siguran i operaiuni.
2. Responsabilul cu activitatea laboratorului (subordonat efului laboratorului) trebuie s asigure
instruirea periodic a personalului laboratorului n domeniul siguranei.
3. Personalul trebuie avertizat asupra pericolelor speciale i are obligaia s citeasc manualul de
siguran i operaiuni i s respecte procedurile i practicile standard. Responsabilul laboratorului
trebuie s se asigure c toi membrii personalului i-au nsuit aceste reguli. O copie a manualului de
siguran i operaiuni trebuie s existe permanent n laborator pentru a putea fi consultat n orice
moment.
4. Trebuie s existe un program de dezinsecie i deratizare.
5. Trebuie asigurate, n caz de necesitate, pentru toi membrii personalului, o evaluare medical
adecvat, supraveghere i tratament, i trebuie inute evidene medicale adecvate.

Instruciuni metodice 101


DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

6.2. Echipamentele de laborator


mpreun cu procedurile i practicile corecte, utilizarea echipamentelor de siguran con-
tribuie la reducerea riscului. Acest capitol trateaz principiile de baz legate de echipamentele
utilizate n toate laboratoarele, indiferent de nivelul de biosiguran. Exigenele legate de echi-
pamentul de laborator pentru nivelele superioare de biosiguran sunt tratate n capitolele
respective.
eful de laborator are obligaia ca, dup consultarea cu responsabilul cu biosigurana i co-
lectivul de siguran, s asigure ca echipamentul adecvat s fie procurat i folosit corespunztor.
Echipamentul va fi ales lund n considerare cteva principii generale, de exemplu:
1. S fie conceput astfel nct s previn sau s limiteze contactul dintre operator i
materialul infecios
2. S fie confecionat din materiale impermeabile la lichide, rezistente la coroziune i
corespunztoare ca structur.
3. S fie confecionat astfel nct s nu aib asperiti, margini ascuite i pri mobile
neprotejate
4. S fie proiectat, construit i instalat pentru a facilita operarea simpl i ntreinerea,
curarea, decontaminarea i testarea n vederea certificrii; ori de cte ori este posibil, seva evita
utilizarea sticlriei i a altor materiale casante.
5. Este util s se consulte n detaliu documentaia privind performanele i specificaiile de construcie
ale echipamentelor pentru a dobndi convingerea c prezint caracteristicile de siguran necesare.
Echipamente eseniale pentru asigurarea biosiguranei
1. Dispozitive de pipetare, pentru a evita pipetarea cu gura. Sunt disponibile diverse modele.
2. Hotele de biosiguran, ce trebuie folosite ori de cte ori se manipuleaz materiale infecioase;
aceste materiale pot fi centrifugate n spaiul
deschis al laboratorului dac se folosesc cupe de centrifug cu dispozitiv de securizare i dac sunt
introduse i descrcate ntr-o hot de biosiguran exist risc crescut de infecii aerogene se folosesc
proceduri cu potenial ridicat de producere de aerosoli: centrifugarea, mojararea, secionarea,
agitarea sau mixarea viguroas, dezintegrarea sonic, deschiderea containerelor cu material infecios
cu presiune intern diferit de presiunea ambiant, inocularea intranazal a animalelor i recoltarea
de esuturi infectate de la animale i ou, etc.
3. Anse de transfer de unic folosin din plastic. Alternativ, n scopul reducerii producerii de aerosoli,
n interiorul hotei de biosiguran se pot folosi incineratoare electrice n scopul reducerii producerii
de aerosol.
4. Tuburi i flacoane cu capace prevzute cu filet.
5. Autoclave sau alte mijloace folosite pentru decontaminarea materialului infecios
6. Pipete Pasteur de unic folosin din plastic, ori de cte ori este posibil, evitnd utilizarea celor din
sticl
7. Echipamentele precum autoclavele i hotele de biosiguran trebuie validate cu metode adecvate
nainte de a fi introduse n uz. Acestea trebuie recertificate la intervale regulate de timp, n acord cu
instruciunile productorului.

102 Instruciuni metodice


DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

6.3. Manipularea deeurilor


Se consider deeuri toate materialele care se arunc.
n laboratoare, n desfurarea activitii cotidiene, decontaminarea deeurilor i eliminarea
final a acestora sunt strns legate. Un numr foarte mic de materiale contaminate necesit
ndeprtarea efectiv din laborator sau distrugerea. Majoritatea sticlriei, instrumentelor i ar-
ticolelor de mbrcminte sunt refolosite sau reciclate. Principiul general ce trebuie s funci-
oneze este c toate materialele infecioase vor fi decontaminate, autoclavate sau incinerate n
laborator.
Principalele probleme care se pun, nainte de eliminarea oricrui obiect sau material din
laboratoarele ce lucreaz cu microorganisme potenial infecioase sau esuturi de la animale,
sunt:
1. Au fost obiectele sau materialele respective eficient decontaminate sau dezinfectate printr-o
procedur autorizat.
2. Dac nu, au fost ele ambalate ntr-un mod autorizat pentru incinerare imediat la faa locului sau
pentru transfer ntr-o alt locaie cu posibiliti de incinerare.
3. Aruncarea obiectelor sau materialelor decontaminate implic eventual alte pericole
adiionale, biologice sau de alt tip, pentru cei care ndeplinesc procedurile de eliminare sau care ar
putea veni n contact cu obiectele eliminate n afara perimetrului respectiv.
Decontaminarea
Autoclavarea cu abur este metoda de elecie pentru toate procesele de decontaminare.
Materialele care urmeaz s fie decontaminate i eliminate vor fi puse n containere adecvate
(ex. saci din plastic autoclavabil, cu coduri de culori care indic destinaia coninutului acestora
pentru autoclavare i/sau incinerare). Pot fi luate n consideraie i metode alternative doar dac
acestea ndeprteaz i/sau omoar microorganismele.
Procedurile de manipulare i eliminare a materialelor contaminate i a deeu-
rilor
Trebuie adoptat un sistem de identificare i de separare a materialelor infecioase i a con-
tainerelor respective. Vor fi obligatoriu respectate reglementrile naionale i internaional n
domeniu. Categoriile care se includ sunt urmtoarele:
1. Deeurile necontaminate (neinfecioase) care pot fi refolosite, reciclate sau eliminate ca deeuri
generale sau menajere
2. Obiectele ascuite (tietoare-neptoare) contaminate (ex. ace hipodermice, bisturie, cuite i
cioburi de sticl); acestea vor fi ntotdeauna colectate n containere rezistente la nepare-tiere,
prevzute cu capace i vor fi tratate ca infecioase.
3. Materialul contaminat destinat decontaminrii prin autoclavare urmat de splare i
refolosire sau reciclare.
4. Materialul contaminat destinat autoclavrii i eliminrii.
5. Materialul contaminat destinat incinerrii directe.
Obiectele ascuite
Dup utilizare, acele hipodermice nu trebuie reacoperite, tiate sau detaate din seringile de
unic folosin. ntregul ansamblu trebuie plasat n containerul pentru obiecte ascuite. Seringile
de unic folosin, folosite separat sau cu ace, trebuie plasate n containere i incinerate, cu au-
toclavare prealabil dac este necesar.
Containerele pentru obiecte ascuite (tietoare-neptoare) trebuie s fie rezistente la ne-
pare-tiere i nu trebuie umplute la capacitatea maxim. Cnd sunt umplute pe 3/4, aceste con-
tainere trebuie plasate n containere pentru deeuri infecioase i incinerate, cu autoclavare
prealabil dac practica laboratorului o necesit. Containerele pentru obiecte tietoare-nep-
toare nu trebuie aruncate n mediul nconjurtor.

Instruciuni metodice 103


DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Surse bibliografice de baz:


1. World Health Organisation. Hepatatis B Geneva, WHO, Department of Communicable Diseases
Surveillance and Responce 2002; http://www.who.int/emc
2. CDC. Guidelines for Laboratory Testing and Result Reporting of Antibody to Hepatitis C Virus //
Recommendations and Reports MMWReport, February 7, 2003 / Vol. 52 / No. RR-3 www.cdc.gov/hepatitis
3. Centers for Disease Control and Prevention. Hepatitis Surveillance Report No. 58. Atlanta, GA:
U.S Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, 2003
2003CDC_2003_Surveill58.pdf
4. CDC. Recommendations for prevention and control of hepatitis C virus (HCV) infection and HCV-
related chronic disease. MMWR 1998; 47(RR:19), www.cdc.gov/hepatitis
5. WHO. HEPATITIS B SURFACE ANTIGEN ASSAYS: OPERATIONAL CHARACTERISTICS (Phase I)
REPORT 2, 2003. www.who.int/eht
6. Foundation For Liver Research. Hepatitis B: Out of the shadows. A report into the impact of
hepatitis B on the nations health. October 2004, www.ucl.ac.uk/liver-research
7. Elvira Snzeana Ciufecu.Virusologie medical. Editura Medical Naional, 2003, Bucureti, Romnia
8. The National Academy of Clinical Biochemistry. Laboratory Guidelines for Screening, diagnosis and
monitoring of hepatic injury. Laboratory medicine practice guidelines.Volume 12/2000
9. Technical Guide for ELISA Where Better Science Begins w w w. k p l . c o m
10. Centers for Disease Control and Prevention. Guidelines for laboratory testing reporting
of antibody to hepatitis C virus. MMWR 2003;52(No.RR-11): 1-15 2003CDC_2003_
LabTestingResultReportingAnti-HCV.pdf

Surse bibliografice suplimentare:


1. World Health Organisation. Hepatatis B Geneva, WHO, Department of Communicable Diseases
Surveillance and Responce 2002; http://www.who.int/emc
2. CDC. Guidelines for Laboratory Testing and Result Reporting of Antibody to Hepatitis C Virus //
Recommendations and Reports MMWReport, February 7, 2003 / Vol. 52 / No. RR-3 www.cdc.gov/hepatitis
3. Centers for Disease Control and Prevention. Hepatitis Surveillance Report No. 58. Atlanta, GA:
U.S Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, 2003
2003CDC_2003_Surveill58.pdf
4. CDC. Recommendations for prevention and control of hepatitis C virus (HCV) infection and HCV-related
chronic disease. MMWR 1998; 47(RR:19), www.cdc.gov/hepatitis
5. WHO. HEPATITIS B SURFACE ANTIGEN ASSAYS: OPERATIONAL CHARACTERISTICS (Phase I) REPORT 2,
2003. www.who.int/eht
6. Foundation For Liver Research. Hepatitis B: Out of the shadows. A report into the impact of hepatitis B
on the nations health. October 2004, www.ucl.ac.uk/liver-research
7. Elvira Snzeana Ciufecu. Virusologie medical. Editura Medical Naional, 2003, Bucureti, Romnia
8. The National Academy of Clinical Biochemistry. Laboratory Guidelines for Screening, diagnosis and
monitoring of hepatic injury. Laboratory medicine practice guidelines. Volume 12/2000
9. Technical Guide for ELISA Where Better Science Begins w w w. k p l . c o m
10. Centers for Disease Control and Prevention. Guidelines for laboratory testing reporting
of antibody to hepatitis C virus. MMWR 2003;52(No.RR-11): 1-15 2003CDC_2003_
LabTestingResultReportingAnti-HCV.
11. .
. .., , 2004.
12.
. .., , 2004.

104 Instruciuni metodice


DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

13. Hepatologie bazat pe dovezi. Ghid practic naional.V.-T.Dumbarav, Chiinu, 2005.


14. . ..,
15. Glebe D. Recent advances in hepatitis B virus research: A German point of view. World J Gastroenterol
2007; 13(1):8-13 http://www.wjgnet.com/1007-9327/13/8.asp.
16. Locarnini S. HBV drug resistance. Abstracts of the XV International Drug Resistance Workshop; June
13-17, 2006; Sitges, Spain. Abstract P2.
17. Locarnini S. Molecular virology and the development of resistant mutants: implications for therapy.
Semin Liver Dis. 2005;25(suppl 1):9-19. Abstract
18. Centers for Disease Control & Prevention: Hepatitis A vaccination coverage among children aged
24-35 months--United States, 2003. MMWR 2005;54:141-4
19. Finelli L, Miller JT, Tokars JI, et al. National surveillance of dialysis-associated diseases in the United
States, 2002. Semin Dial 2005;18:52-61.
20. Centers for Disease Control & Prevention: Hepatitis C Virus Transmission from an Antibody-Negative
Organ and Tissue Donor United States, 2000-2002. MMWR 2003; 52:273-276. (Barna Tugwell, Priti Patel
21. Centers for Disease Control and Prevention. Global progress toward universal childhood hepatitis B
vaccination, 2003. MMWR2003;52(36):867-868. 2003CDC_2003_GlobalProgressHBVvacc.pdf
22. Centers for Disease Control and Prevention. Transmission of hepatitis B and C Viruses in outpatient
settingsNew York, Oklahoma, and Nebraska, 2000-2002.MMWR 2003 52(38) 901-904, 906.
2003CDCTransHB HCVoutpatients.pdf
23. Gilbert LK, Bulger J, Scanlon K, et al. Integrating Hepatitis B Prevention Into Sexually Transmitted
Disease Services: U.S. Sexually Transmitted Disease Program and Clinic Trends - 1997 and 2001.
Sexually Transmitted Diseases 2005; 32(6); p. 346-350.
24. Nainan OV, Armstrong GL, Han X-H, et al. Hepatitis A molecular epidemiology in the United States:
sources of infection and implications of vaccination policy. J Infect Dis 2005;191:957-63.
25. Shepard CW, Finelli L, Fiore AE, et al. Epidemiology of Hepatitis B and Hepatitis B Virus Infection in
United States Children. Pediatric Infectious Disease Journal 2005; 24(9):755-760.
26. Shepard CW, Finelli L, Alter MJ. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infec Dis
2005;Vol. 5: 558-567.
27. Comstock RD, Mallonee S, Fox JL, et al. A large nosocomial outbreak of hepatitis C and hepatitis B
among patients receiving pain remediation treatments. Infect Control Hosp Epidemiol 2004;25:576-83.
28. Garfein RS, Bower WA, Loney CM, et al. Factors associated with fulminant liver failure during an
outbreak among injection drug users with acute hepatitis B. Hepatology 2004;40:865-73.
29. Hauri AM, Armstrong GL, Hutin YJF. The global burden of disease attributable to contaminated
injections given in health care settings. Int J STD AIDS. 2004;15:7-16.
30. Luman ET, Fiore AE, Strine TW, Barker LE. Impact of thimerosal-related changes in hepatitis B vaccine
birth-dose recommendations on childhood hepatitis B vaccination coverage in the United States.
JAMA 2004;291:2351-8.
31. Mast EE, Mahoney F, Kane M, Margolis H. Hepatitis B vaccine. In: Plotkin S, Orenstein W, Offit P,
editors.Vaccines. Philidelphia: Saunders, 2004: 299-337.
32. Samandari T, Bell BP, Armstrong GA. Quantifying the impact of hepatitis A immunization in the United
States, 1995-2001.Vaccine 2004;22:4342-50.
33. Vong S, Bell BP. Chronic liver disease mortality in the United States, 1990-1998. Hepatology
2004;39:476-83
34. Alter MJ. Epidemiology and prevention of hepatitis B. Semin Liver Dis 2003; 23(1):39-46.
35. Alter MJ. Epidemiology of hepatitis B in Europe and worldwide. Journal of Hepatology 2003; 39:S64-S69.
36. Alter MJ. Management of HCV-infected health care workers. Hepatology 2003; 37(6):1498-1499.
37. Alter MJ. Do patients who fail to complete a hepatitis A or hepatitis B vaccination series have to
restart it? Cleve Clin J Med 2003; 70(3):234.

Instruciuni metodice 105


DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

38. Armstrong GL. Commentary - Modeling the epidemiology of hepatitis C and its complications. Int J
Epidemiol 2003;32:725-6
39. Armstrong GL, Perz JF, Alter MJ. Perinatal hepatitis C virus transmission--role of human
immunodeficiency virus infection and injection drug use. J Infect Dis 2003; 187(5):872-874.
40. Bardenheier B, Gonzalez IM, Washington ML, et al. Parental knowledge, attitudes, and practices
associated with not receiving hepatitis A vaccine in a demonstration project in Butte County,
California. Pediatrics 2003; 112(4):e269.
41. Bell BP, Shapiro CN. Hepatitis A virus. In: Long S, Prober C, Pickering L, editors. Principles & Practice
of Pediatric Infectious Diseases. New York: Churchill Livingstone, 2003: 1188-1192.
42. Bower, WA, Goldstein ST. Hepatitis delta virus. Principles & Practice of Pediatric Infectious Diseases.
New York: Churchill Livingstone, 2003: 1097-1101.
43. Datta SD, Armstrong GL, Roome AJ, Alter MJ. Blood exposures and hepatitis C virus infections
among emergency responders. Arch Intern Med 2003; 163:2605-2610.
44. Fiore AE, Goldstein ST. Hepatitis B virus. In: Long S, Prober C, Pickering L, editors. Principles &
Practice of Pediatric Infectious Diseases. New York: Churchill Livingstone, 2003: 1086-1097.
45. Gunn RA, Murray PJ, Brennan CH, et al. Evaluation of screening criteria to identify persons with
hepatitis C virus infection among sexually transmitted disease clinic clients: results from the San
Diego Viral Hepatitis Integration Project. Sex Transm Dis 2003; 30(4):340-344.
46. Navarro VJ, St Louis TE, Bell BP. Identification of patients with hepatitis C virus infection in New
Haven County primary care practices. J Clin Gastroenterol 2003; 36(5):431-435.
47. Schrag SJ, Fiore AE, Gonik B, et al.Vaccination and perinatal infection prevention practices among
obstetrician-gynecologists. Obstet Gynecol 2003; 101(4):704-710.
48. Williams IT, Goldstein ST, Tufa J. Long term antibody response to hepatitis B vaccination beginning at
birth and to subsequent booster vaccination. Pediatr Infect Dis J 2003; 22(2):157-163.
49. CDC. Update: recommendations to prevent hepatitis B virus transmission---United States. MMWR
1999;48:33--4.
50. CDC. National, state, and urban area vaccination coverage among children aged 19--35 months---
United States, 2004. MMWR 2005;54:717--21.
51. Alter MJ. Prevention of spread of hepatitis C. Hepatology 2002; 36(5 Suppl 1):S93-S98.
52. Alter MJ. Hepatitis C: fact versus fiction. In: Margolis HS, Alter MJ, Liang J, Dienstag J, editors.Viral
Hepatitis and Liver Disease. Atlanta: International Medical Press, 2002: 310-315.
53. Arauz-Ruiz P, Norder H, Robertson BH, Magnius LO. Genotype H: a new Amerindian genotype of
hepatitis B virus revealed in Central America. J Gen Virol 2002; 83(Pt 8):2059-2073.
54. Fraser MR, Buffington J, Lipson L, Meit, M. Hepatitis C prevention Programs: Assessment of Local
Health Department Capacity. J Public Health Management Practice 2002; 8:46-9.
55. FitzSimons D,Van Damme P, Emiroglu N, et al. Strengthening immunizations systems and introduction
of hepatitis B Vaccine in central and eastern Europe and the Newly Independent States.Vaccine 2002;
20:1475-9.
56. Goldstein ST, Alter MJ, Williams IT, et al. Incidence and Risk Factors for Acute Hepatitis B in the
United States, 1982-1998: Implications for Vaccination Programs. J of Infect Dis 2002; 185:713-9.
57. Hutin YJ, Stilwel B, Hauri AM, et al. Transmission of bloodborne pathogens through unsafe injections
and proposed approach for the Safe Injection Global Network.Viral Hepatitis and Liver Disease
2002:219-27.
58. Kamili S. Immunity to hepatitis E Virus: new insights and future challenges. Indian Journal of
Gasroenterol 2002; 21: 136-138.
59. Kamili S, Spelbring J, Krawczynski k. DNA vaccination against hepatitis E virus infection in
cynomolgus macaques. J Gastroenterol Hepatol 2002;17:S365-9.

106 Instruciuni metodice


DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

60. Kapadia F,Vlahov D, Des Jarlais D. Does bleach disinfection of syringes protect against hepatitis C
infection among young adult injection drug users? Epidemiology 2002;13(6):738-741.
61. Khan, AJ, Cotter SM, Schulz B, et al. Nosocomial transmission of hepatitis B virus infection among
residents with diabetes in a skilled nursing facility. Infect Control Hosp Epidemiol 2002;23(6):313-8.
62. Khudayakov YE, Dou X-G, Chang J, et al. Impact of sequence heterogeneity on antigenic properties
of hepatitis C virus proteins. Proceedings of the 10th International Symposium on Viral Hepatitis and
Liver Disease; 2000 April 9-13; Atlanta. International Medical Press;2002. p.369-373.
63. Krawczynski K, Kamili S, Aggarwal R. Clinical spectrum and epidemiology of hepatitis E virus
infection. Proceedings of the 10th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease;
2000 April 9-13; Atlanta: International Medical Press;2002. p.90-6.
64. Margolis HS, Hepatitis update: The role of primary care practioners in prevention, treatment, and
vaccination. Ethn Dis 2002;12:33-5.
65. Masalova OV, Lakina EI, Abdulmedzhidova AG, et al. Characterization of monoclonal antibodies and
epitope mapping of the NS4 protein of hepatitis C virus. Immunol Lett 2002; 83:187-196.
66. Meng J, Dai X, Rak J, et al. Mapping of the neutralizing antigenic epitope(s) of the hepatitis E virus
Proceedings of the 10th International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease; 2000 April
9-13; Atlanta. International Medical Press;2002. p.108-111.
67. Murrill CS, Weeks H, Castrucci BC, et al. Age-specific seroprevalence of HIV, hepatitis B virus, and
hepatitis C virus infection among injection drug users admitted to drug treatment in 6 US cities. Am
J Public Health 2002; 92(3):385-7.
68. Nainan OV, Khristova ML, Byun K, et al. Genetic variation of hepatitis B surface antigen coding region
among infants with chronic hepatitis B virus infection. J Med Virol 2002; 68(3):319-327.
69. Obriadina A, Meng J, Lopareva E, et al. Antigenic properties of recombinant proteins of hepatitis E
virus. In: Margolis HS, Alter MJ, Conlon R, Dienstag J, Liang J, editors.Viral Hepatitis and Liver Disease.
Atlanta: International Medical Press, 2002: 119-123.
70. Obriadina A, Meng J, Ulanova T, et al. A new enzyme immunoassay for the detection of antibody to
hepatitis E virus. J Gastroenterol Hepatol 2002; 17 Suppl 3:S360-S364.
71. Pisu M, Meltzer MI, Lyerla R. Cost-effectiveness of hepatitis B vaccination of prison inmates.Vaccine
2002; 21(3-4):312-321.
72. Roberts EA,Yeung L. Maternal-Infant Transmission of Hepatitis C Virus Infection. Hepatology; 36(5):
s106-s113.
73. Robertson BH, Margolis HS. Primate hepatitis B viruses - genetic diversity, geography and evolution.
Rev Med Virol 2002; 12(3):133-141.
74. Thorpe LE, Ouellet LJ, Hershow R, et al. Risk of hepatitis C virus infection among young adult
injection drug users who share injection equipment. Am J Epidemiol 2002; 155(7):645-653.
75. Tokars JI, Frank M, Alter MJ, et al. National surveillance of dialysis-associated diseases in the United
States, 2000. Semin Dial 2002; 15(3):162-171.
76. Williams IT, Gretch D, Fleenor ME, et al. Hepatitis C virus RNA concentration and chronic hepatitis
in a cohort of patients followed after developing acute heaptitis C. In: Margolis H.S., Alter MJ, Liang TJ,
Dienstag JL, editors.Viral Hepatitis and Liver Disease. Atlanta: International Medical Press, 2002: 341-344.
77. Yokosawa J, Ulanova T, Ioshimoto LM, et al. Antigenic properties of wild-type and mutant hepatitis B
virus surface antigens. In: Margolis HS, Alter MJ, Dienstag J, Liang J, editors.Viral Hepatitis and Liver
Disease. Atlanta: International Medical Press, 2002: 155-159.
78. National Committee for Quality Assurance. State of health care quality report, 2003: adolescent
immunization status. Washington, DC: National Committee for Quality Assurance; 2005. Available at
http:// www.ncqa.org/sohc2003/adolescent_immunization_status.htm.
79. Laboratory biosafety manual. Third edition. World Health Orgaizations. Geneva 2004

Instruciuni metodice 107


DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

Anexa
algoritmul de testare a hepatitelor virale
(recomandri CDC, OMS)

IMPORTANA DETERMINRII
MARKERILOR HEPATITELOR VIRALE

DETERMINAREA EVALUAREA
DIAGNOSTIC PROGNOSTIC EFICACITII
STADIEI MALADIEI
TRATAMENTULUI

STABILIREA APRECIEREA DETERMINAREA DETERMINAREA


INDICAIILOR NIVELULUI DE GRAVITII RSPNDIRII
PENTRU IMUNITATE MALADIEI MALADIEI
VACCINARE

108 Instruciuni metodice


DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

1. Algoritmul de testare pentru hepatita acut


INDICAII PENTRU TESTARE
Debut acut cu:
Febr Anorexie
Icter Urina brun

TESTAI:
IgM VHA anti - VHC
anti - HBc IgM AgHBs i confirmarea lui

AgHBs + Lipsa virusurilor


IgM VHA+ anti - VHC+
Anti HBc IgM + hepatice

Hepatita B viral Hepatita C viral acut Testai pentru alte maladii


Hepatita A viral acut (vezi algoritmul (vezi algoritmul de Hepatitele autoimune
Hepatitele toxice
acut de testare pt hepatita B) testare pt hepatita C) Maladii hepatice induse de alcool
Steatoza hepatic non-alcoolic
Alte hepatite virale
Eptein Barr
Cytomegalovirus
Enterovirus
Hepatita E n zonele endemice
Altele
Maladii granulomatoase
Tuberculoza
Sarcoidoza
Ischemice
Ereditare
Boala Wilson
Hemocromatoza
Deficiena -1-antitripsinei

2. Algoritmul de testare pentru hepatita cronic


INDICAII PENTRU TESTARE
Suspecie pentru hepatita cronic
Creteri moderate de transaminaze
n anamnez - transfuzii de snge i/sau produse sanguine
Hemofilia

anti-VHC + anti-HBc IgM +


AgHBs +

Vezi algoritmul Vezi algoritmul


de testare pentru de testare pentru
hepatita viral C hepatita viral B

Instruciuni metodice 109


DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

3. Algoritmul de Testare pentru hepatita viral B

INDICAII PENTRU TESTARE INDICAII PENTRU TESTARE


Infecie acut Infecie cronic
Debut acut cu: Creteri moderate de
Icter transaminaze (ALT/AST)
Simptome pseudogripale (Posibil n anamnez semne de hepatit)

Testare Testare
AgHBs AgHBs
Anti-HBc IgM anti-HBc total
anti- VHD (doar n infecie cu VHB) anti-HBs

AgHBs + AgHBs +
HEPATITA B ACUT anti HBc + HEPATITA B Cronica
anti HBc IgM + Anti-HBs -

Repetai testul la 4-6 spt.


Repetai testul peste 4-6 spt. Pentru monitorizarea terapiei
antivirale, testai: ADN VHB,
AgHBs, anti-HBs, AgHBe i anti-HBe.
AgHBs + Posibil infecie cronic
cu VHB sau contami
anti HBc IgM -
narea probelor AgHBs - posibil anti-HBc fals +
anti HBc + sau infecie cronic cu
Anti-HBs - VHB;
Repetai testul peste 4-6 spt. testai ADN
VHB i/sau efectuai
vaccinarea cu testarea
serologic
AgHBs - Posibil infecie cronic
anti HBc IgM + cu VHB sau contami
narea probelor Repetai testul la 4-6 spt.
Pentru monitorizarea terapiei
antivirale, testai: ADN VHB,
AgHBs - Testai pentru alte maladii AgHBs, anti-HBs, AgHBe i anti-HBe.
Hepatite autoimune
anti HBc IgM - Hepatite toxice
Maladii hepatice induse de alcool
Steatoza hepatic non-alcoolic Vindecare dup
Alte hepatite virale AgHBs -
Eptein Barr anti HBc + infecia cu VHB
Cytomegalovirus Anti-HBs + suportat
Enterovirus
Hepatita E n zone endemice
Altele
Maladii granulomatoase AgHBs - Rspuns serologic
Tuberculoza anti HBc - dup vaccinarea
Sarcoidoza Anti-HBs + contra VHB
Ischemice
Ereditare
Boala Wilson
Hemocromatosa
Deficiena -1-antitripsinei

110 Instruciuni metodice


DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

4. Algoritmul de testare a Persoanelor cu AgHBs pozitiv

AgHBs +

AgHBe - AgHBe + AgHBe


ALT valori normale ALT valori normale ALT valori crescute

Anual testai La 3-6 luni testai Anual testai


probele ficatului probele ficatului probele ficatului
- fetoproteina Ag HBe - fetoproteina
- fetoproteina

Seroconversia
ALT - valori crescute
AgHBe (anti-HBe)

Observare continu la medicul Investigaii suplimentare:


de familie cu atenie sporit la
afeciunile comorbide
Examinarea ultrasonografic

fetoproteina

ADN VHB

Biopsia ficatului (dac probele


clinice, biochimice i/sau radiologice
presupun semne de ciroz)

Se necesit aplicarea
tratamentului cu interferon sau
analogii de nucleozide

Instruciuni metodice 111


DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

5. Algoritmul de testare pentru hepatita viral C

INDICAII PENTRU TESTARE


conform algoritmului de testare
a hepatitei acute
Anti-VHC pozitiv (ELISA)

anti-VHC titru nalt anti-VHC titru slab

ARN VHC anti - VHC


PCR Real-Time Cantitativ RIBA test

negativ pozitiv pozitiv sau nedeterminat negativ

anti - VHC ARN VHC nu a fost


RIBA test PCR Real-Time infectat
Cantitativ niciodat;
posibil fals
pozitiv negativ pozitiv
negativ nedeterminat pozitiv

infectat infectat, dar


nu a fost posibil infectat, recent n recuperare
infectat infectat, dar n
niciodat; dar n recuperare
recuperare Infecie cronic
posibil fals
pozitiv cu VHC

Genotiparea VHC
PCR & Secveniere
Biopsia hepatic

Tratament antiviral

Monitorizarea tratamentului
ARN VHC
PCR Real-Time

Sfritul tratamentului
ARN VHC
PCR Real-Time

112 Instruciuni metodice


DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

6. Algoritmul DE testare pentru hepatita viral d

INDICAII PENTRU TESTARE


Semne i simptome a hepatitei acute
Infecia hepatic cronic cu VHB confirmat cu
agravare brusc

Infecia hepatic cu VHB confirmat

Suspecie sigur pentru VHD

anti VHD

pozitiv negativ

Ag VHD (ELISA) Testai pentru alte maladii


IgM anti-VHD (ELISA) Hepatitele autoimune
Hepatitele toxice
Maladii hepatice induse de alcool
Steatoza hepatic non-alcoolic
Alte hepatite virale
Ag + Ag + Ag - Ag - Eptein Barr
IgM + IgM - IgM + IgM - Cytomegalovirus
Enterovirus
Hepatiata E n zonele
Infecie acut Infecie cronic Infecie acut , Infecie cu endemice
cu VHD cu VHD posibil n VHD n Altele
recuperare recuperare
Maladii granulomatoase
Tuberculoza
Sarcoidoza
Ischemice
Ereditare
Boala Wilson
Hemocromatoza
Deficiena -1-antitripsinei

Instruciuni metodice 113


DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL HEPATITELOR VIRALE B, C i D

114 Instruciuni metodice


Proiectul USAID Prevenirea HIV/SIDA si Hepatitelor B si C
Date de contact:
202 Stefan cel Mare Ave, 8th floor
Chisinau MD-2004
Republic of Moldova

Tel.: (+373 22) 755 536


Fax.: (+373 22) 755 510
E-mail: office@phh.md

USAID Preventing HIV/AIDS and Hepatitis B&C Project


Contact information:
202 Stefan cel Mare Ave, 8th floor
Chisinau MD-2004
Republic of Moldova

Tel.: (+373 22) 755 536


Fax.: (+373 22) 755 510
E-mail: office@phh.md