Sunteți pe pagina 1din 47

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI

DIN CLUJ-NAPOCA
Facultatea de tiina i Ingineria Mediului

CONTRIBUII PRIVIND INFLUENA


ANTIBIOTICELOR ASUPRA UNOR
FACTORI DE MEDIU
- REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT -

Conductor de doctorat:
Prof. Univ. Dr. Dumitru Ristoiu
Doctorand:
Ocsana-Ileana Axuc (Opri)

CLUJ-NAPOCA - 2012
UNIUNEA EUROPEAN GUVERNUL ROMNIEI Fondul Social European Instrumente Structurale OIPOSDRU UNIVERSITATEA TEHNIC
MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI I POSDRU 2007-2013 2007-2013 GHEORGHE ASACHI
PROTECIEI SOCIALE DIN IAI
AMPOSDRU

UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI
DIN CLUJ-NAPOCA

Facultatea de tiina i Ingineria Mediului

CONTRIBUII PRIVIND INFLUENA


ANTIBIOTICELOR ASUPRA UNOR
FACTORI DE MEDIU
- REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT -

Conductor de doctorat:
Prof. Univ. Dr. Dumitru Ristoiu

Doctorand:
Ocsana-Ileana Axuc (Opri)

CLUJ-NAPOCA - 2012
UNIUNEA EUROPEAN GUVERNUL ROMNIEI Fondul Social European Instrumente Structurale OIPOSDRU UNIVERSITATEA TEHNIC
MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI I POSDRU 2007-2013 2007-2013 GHEORGHE ASACHI
PROTECIEI SOCIALE DIN IAI
AMPOSDRU

Teza de doctorat a fost realizat cu sprijinul financiar al proiectului


Burse Doctorale pentru Performana n Cercetare la Nivel European
(EURODOC).

Proiectul Burse Doctorale pentru Performana n Cercetare la Nivel


European (EURODOC), POSDRU/88/1.5/S/59410, ID 59410, este un
proiect strategic care are ca obiectiv general Dezvoltarea capitalului uman
pentru cercetare prin programe doctorale pentru mbuntirea participrii,
creterii atractivitii i motivaiei pentru cercetare. Dezvoltarea la nivel
european a tinerilor cercettori care s adopte o abordare interdisciplinar
n domeniul cercetrii, dezvoltrii i inovrii.

Proiect finanat n perioada 2009 - 2012.

Finanare proiect: 18.943.804,97 RON

Beneficiar: Universitatea Tehnic Gheorghe Asachi din Iai

Partener: Universitatea Babe Bolyai din Cluj-Napoca

Director proiect: Prof. univ. dr. ing. Mihaela-Luminia LUPU

Responsabil proiect partener: Prof. univ. dr. ing. Alexandru OZUNU


UNIUNEA EUROPEAN GUVERNUL ROMNIEI Fondul Social European Instrumente Structurale OIPOSDRU UNIVERSITATEA TEHNIC
MINISTERUL MUNCII, FAMILIEI I POSDRU 2007-2013 2007-2013 GHEORGHE ASACHI
PROTECIEI SOCIALE DIN IAI
AMPOSDRU

Mulumiri

Adresez mulumiri domnului Prof. Dr. Dumitru Ristoiu, conductorul


tiinific al tezei de doctorat, pentru competena, ndrumarea tiinific,
observaiile i sprijinul acordat pe tot parcursul pregtirii acesteia.
Sincere mulumiri i deosebit recunotin adresez doamnei Dr.
Virginia Coman de la Institutul de Cercetri n Chimie Raluca Ripan
pentru discuiile utile i ncurajrile acordate pe tot parcursul pregtirii
tezei de doctorat, precum i pentru asigurarea materialelor i a
dispozitivelor necesare pentru buna desfurare a cercetrilor din
cadrul prezentului studiu.
Mulumesc domnilor Dr. Lucian Copolovici i Prof. Dr. lo Niinemets
de la Estonian University of Life Sciences, Institute of Agricultural and
Environmental Sciences, Tartu, Estonia, pentru sprijinul i ndrumrile
tiinifice acordate pe perioada stagiului extern de cercetare realizat n
cadrul acestui institut.
Mulumesc doamnelor Dr. Mihaela Vlassa, Dr. Miua Filip i domnului
Dr. tefan Kreibik (Institutul de Cercetri n Chimie Raluca Ripan),
doamnelor Dr. Loredana Soran i Codrua Varodi (Institutul Naional
de Cercetare-Dezvoltare pentru Tehnologii Izotopice i Moleculare),
Dr. Dorina Podar (Facultatea de Biologie i Geologie), Dr. Carmen
Roba (Facultatea de tiina i Ingineria Mediului) pentru ndrumarea
de specialitate n domeniile de cercetare care au fost abordate n
prezenta tez.
Adresez mulumiri domnului Lect. Dr. Simion Beldean-Galea de la
Facultatea de tiina i Ingineria Mediului pentru discuiile i
furnizarea de informaii utile pe perioada studiului de doctorat.
Mulumesc tuturor colegilor de la Facultatea de tiina i Ingineria
Mediului pentru ncurajrile i sfaturile colegiale acordate pe parcursul
elaborrii tezei de doctorat.
Mulumesc echipei manageriale care a realizat Proiectul EURODOC
Burse doctorale pentru performan de cercetare la nivel european,
ID 59410, proiect finanat de Fondul Social European al crui
beneficiar am fost n perioada elaborrii prezentei teze de doctorat.
Nu n ultimul rnd mulumesc familiei mele i ndeosebi soului meu
pentru rbdarea, nelegerea i susinerea acordate pe toat perioada
studiului de doctorat.

Noiembrie, 2012
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

CUPRINS

INTRODUCERE. IMPORTANA I ACTUALITATEA SUBIECTULUI ABORDAT ................... 1

PARTEA I. NOIUNI TEORETICE

Capitolul 1. Antibioticele .......................................................................................................................................................................... 5


1.1. Generaliti despre antibiotice ........................................................................................................................................................ 5
1.1.1. Definiia antibioticelor ......................................................................................................................................................... 5
1.1.2. Clasificrile antibioticelor .................................................................................................................................................. 6
1.1.3. Utilizrile antibioticelor ..................................................................................................................................................... 10
1.2. Antibioticele i mediul nconjurtor .......................................................................................................................................... 11
1.2.1. Principalele surse de poluare ale mediului nconjurtor cu antibiotice .................................................. 11
1.2.2. Msuri de prevenire a contaminrii mediului nconjurtor cu antibiotice ............................................ 14

Capitolul 2. Tehnici de pregtire i analiz utilizate pentru determinarea coninutului de


antibiotice din diferite probe ............................................................................................................................................................... 15
2.1. Prelevarea, conservarea i stocarea probelor de ap ........................................................................................................ 16
2.2. Parametrii fizico-chimici ai probelor de ap ........................................................................................................................ 18
2.3. Tehnici de extracie utilizate pentru izolarea/concentrarea antibioticelor din diferite probe ................... 19
2.3.1. Extracia pe faz solid ...................................................................................................................................................... 20
2.4. Tehnici de analiz utilizate pentru determinarea coninutului de antibiotice din diferite probe ............ 23
2.4.1. Cromatografia. Generaliti ............................................................................................................................................. 24
2.4.1.1. Cromatografia pe strat subire .................................................................................................................. 29
2.4.1.2. Cromatografia de lichide de nalt performan ............................................................................ 32

Capitolul 3. Ecotoxicologia antibioticelor .................................................................................................................................. 41


3.1. Influena antibioticelor asupra algelor ..................................................................................................................................... 42
3.2. Influena antibioticelor asupra plantelor ................................................................................................................................. 43

PARTEA A II-A. CONTRIBUII ORIGINALE

Capitolul 4. Cercetri privind elaborarea de proceduri pentru determinarea coninutului


de antibiotice din probe de ap de suprafa i probe de ap rezidual .............................................................. 47
4.1. Antibioticele luate n studiu i principalele caracteristici ............................................................................................. 48
4.2. Analiza antibioticelor din probe de ap de suprafa utiliznd tehnica cromatografiei pe strat
subire de nalt performan (HPTLC) ................................................................................................................................. 53
4.2.1. Izolarea/concentrarea antibioticelor din matrici lichide utiliznd tehnica extraciei pe
faz solid (SPE) .................................................................................................................................................................. 53
4.2.2. Analiza calitativ i cantitativ a antibioticelor utiliznd tehnica HPTLC .......................................... 56
4.2.3. Studii privind validarea procedurii SPE-HPTLC ................................................................................................ 58
4.2.4. Determinarea coninutului de antibiotice din probe de ap de suprafa utiliznd
procedura SPE-HPTLC ..................................................................................................................................................... 69
4.2.5. Concluzii privind analiza antibioticelor din probe de ap de suprafa utiliznd procedura
SPE-HPTLC ............................................................................................................................................................................ 71
4.3. Caracterizarea fizico-chimic a unor probe de ap rezidual. Analiza coninutului de
antibiotice utiliznd tehnica cromatografiei de lichide de nalt performan (HPLC) .............................. 72
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

4.3.1. Caracterizarea fizico-chimic a unor probe de ap rezidual ...................................................................... 72


4.3.1.1. Determinarea parametrilor fizico-chimici ai unor probe de ap rezidual.
Modul de lucru .................................................................................................................................................. 73
4.3.1.2. Rezultate i discuii privind parametrii fizico-chimici ai unor probe de ap
rezidual ................................................................................................................................................................ 74
4.3.1.3. Concluzii privind parametrii fizico-chimici ai unor probe de ap rezidual ................. 84
4.3.2. Analiza antibioticelor din probe de ap rezidual utiliznd tehnica cromatografiei de lichide
de nalt performan cuplat cu spectrofotometria cu serie de fotodiode cu baleiaj complet
i cu spectrometria de mas (HPLC-DAD/MS) .................................................................................................. 85
4.3.2.1. Izolarea/concentrarea antibioticelor din matrici lichide utiliznd tehnica SPE ........... 85
4.3.2.2. Analiza calitativ i cantitativ a antibioticelor utiliznd tehnica HPLC-DAD/MS . 87
4.3.2.3. Studii privind liniaritatea, limitele de detecie i de cuantificare, precizia i
acurateea procedurii SPE-HPLC-DAD/MS .................................................................................... 92
4.3.2.4. Determinarea coninutului de antibiotice din probe de ap rezidual utiliznd
procedura SPE-HPLC-DAD/MS ............................................................................................................ 99
4.3.2.5. Concluzii privind analiza antibioticelor din probe de ap rezidual utiliznd
procedura SPE-HPLC-DAD/MS ......................................................................................................... 103

Capitolul 5. Cercetri privind influena antibioticelor asupra algelor verzi


(Pseudokirchneriella subcapitata L.) i asupra plantelor de gru (Triticum aestivum L.) ...................... 105
5.1. Antibioticele luate n studiu i principalele caracteristici .......................................................................................... 105
5.2. Cercetri privind influena antibioticelor asupra densitii celulare a algelor verzi
(Pseudokirchneriella subcapitata L.) ................................................................................................................................... 107
5.2.1. Algele verzi (Pseudokirchneriella subcapitata L.), condiiile de cretere i tratamentele cu
antibiotice. Modul de lucru .......................................................................................................................................... 107
5.2.2. Rezultate i discuii privind influena antibioticelor asupra densitii celulare a algelor .......... 112
5.2.3. Concluzii privind influena antibioticelor asupra densitii celulare a algelor ................................ 117
5.3. Cercetri privind influena antibioticelor asupra plantelor de gru (Triticum aestivum L.) ................... 117
5.3.1. Plantele de gru (Triticum aestivum L.), condiiile de cretere i stresul abiotic indus de
antibiotice. Modul de lucru .......................................................................................................................................... 118
5.3.2. Influena antibioticelor asupra parametrilor fotosintetici ai plantelor de gru ................................ 120
5.3.2.1. Determinarea parametrilor fotosintetici ai plantelor de gru. Modul de lucru .......... 120
5.3.2.2. Rezultate i discuii privind influena antibioticelor asupra parametrilor
fotosintetici ai plantelor de gru ........................................................................................................... 121
5.3.2.3. Concluzii privind influena antibioticelor asupra parametrilor fotosintetici ai
plantelor de gru ............................................................................................................................................ 124
5.3.3. Emisiile de compui organici volatili din plantele de gru tratate cu antibiotice .......................... 124
5.3.3.1. Captarea i analiza compuilor organici volatili emii de plantele de gru.
Modul de lucru ............................................................................................................................................... 125
5.3.3.2. Rezultate i discuii privind emisiile de compui organici volatili din plantele
de gru tratate cu antibiotice .................................................................................................................. 127
5.3.3.3. Concluzii privind emisiile de compui organici volatili din plantele de gru tratate
cu antibiotice ................................................................................................................................................... 130
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

5.3.4. Influena antibioticelor asupra pigmenilor asimilatori din plantele de gru .................................... 130
5.3.4.1. Extracia i analiza pigmenilor asimilatori din plantele de gru. Modul de lucru .. 130
5.3.4.2. Rezultate i discuii privind influena antibioticelor asupra pigmenilor asimilatori
din plantele de gru ...................................................................................................................................... 133
5.3.4.3. Concluzii privind influena antibioticelor asupra pigmenilor asimilatori din
plantele de gru .............................................................................................................................................. 138
5.3.5. Influena antibioticelor asupra coninutului total de flavonoide din plantele de gru ................. 139
5.3.5.1. Optimizarea metodei de extracie i analiza coninutului total de flavonoide din
plantele de gru. Modul de lucru ......................................................................................................... 139
5.3.5.2. Rezultate i discuii privind influena antibioticelor asupra coninutului total de
flavonoide din plantele de gru ............................................................................................................. 143
5.3.5.3. Concluzii privind influena antibioticelor asupra coninutului total de flavonoide
din plantele de gru .................................................................................................................................... 144

CONCLUZII ............................................................................................................................................................................................... 145

BIBLIOGRAFIE ...................................................................................................................................................................................... 149

ANEXA I. ABREVIERI ...................................................................................................................................................................... 167

ANEXA II. LISTA PUBLICAIILOR REZULTATE N URMA TEZEI ..................................................... 169

n rezumatul tezei de doctorat sunt prezentate o parte din rezultatele cercetrilor experimentale proprii,
concluziile i bibliografia selectiv. La redactarea rezumatului au fost pstrate aceleai notaii pentru
capitole, figuri i tabele utilizate n textul tezei de doctorat.

CUVINTE CHEIE: antibiotice, extracie pe faz solid, cromatografie de lichide, Pseudokirchneriella


subcapitata L., densitate celular, Triticum aestivum L., parametri fotosintetici, pigmeni asimilatori,
compui organici volatili, flavonoide.
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

INTRODUCERE
IMPORTANA I ACTUALITATEA SUBIECTULUI ABORDAT
Compuii de interes din cadrul studiului de doctorat sunt antibioticele, medicamente care sunt
extrem de utilizate att n medicin ct i n domeniile conexe. Din punct de vedere chimic, antibioticele
sunt substane organice foarte variate, care sunt produse de microorganisme sau sunt obinute prin sintez
i semisintez. n doze foarte mici, antibioticele inhib dezvoltarea microorganismelor patogene sau pot
conduce chiar la distrugerea lor (Choma, 2004; Oniscu, 1988).
Antibioticele au fost detectate n diverse compartimente ale mediului nconjurtor precum ape de
suprafa, ape subterane, ape potabile, soluri i ape reziduale (Seifrtov et al., 2009). Datorit ineficienei
proceselor de epurare, staiile de epurare ale apelor reziduale i apele reziduale generate de spitale
contribuie major la prezena produselor farmaceutice n mediul nconjurtor. Astfel, aceste categorii de
ape reziduale pot ajunge mai departe n apele subterane i de suprafa, conducnd la poteniale riscuri
pentru organismele acvatice. Interesul pentru persistena i evoluia antibioticelor n mediul nconjurtor
este datorat faptului c acestea pot favoriza creterea rezistenei bacteriilor patogene. Administrarea
antibioticelor la animale (drept promotori de cretere) a fost asociat cu creterea ngrijortoare a
rezistenei la antibiotice, care poate conduce la un potenial impact i asupra sntii umane, precum i la
adsorbia lor pe sedimente i sol (Seifrtov et al., 2009).
Pentru prevenirea rezistenei la antibiotice sunt necesare att un control riguros al consumului
acestora, ct i monitorizarea, evoluia i eliminarea din mediul nconjurtor. Datorit rezistenei tot mai
crescute a organismului uman la tratamentele cu antibiotice, a multiplelor efecte adverse pe care le pot
cauza, precum i a faptului c la nivel naional sunt puine studii care vizeaz acest subiect, problematica
antibioticelor este de mare actualitate. Astfel, importana temei alese Contribuii privind influena
antibioticelor asupra unor factori de mediu este evident, deoarece n cantiti mici i prin aport
ndelungat, antibioticele pot avea efecte negative att asupra mediului nconjurtor, ct i asupra omului.
Datorit aspectelor menionate, prin acest studiu de doctorat s-a urmrit aducerea de contribuii
privind elaborarea de proceduri pentru determinarea antibioticelor din probe de ap de suprafa i probe
de ap rezidual, precum i evidenierea influenelor negative ale acestora asupra algelor verzi
(Pseudokirchneriella subcapitata L.) i asupra plantelor de gru (Triticum aestivum L.). Pentru realizarea
acestor cercetri au fost selectate nou antibiotice care aparin la cinci clase diferite: peniciline
(amoxicilin, ampicilin i penicilin G), cefalosporine (ceftazidim i ceftriaxon), tetracicline
(tetraciclin i doxiciclin), fluorochinolone (ciprofloxacin) i macrolide (eritromicin).
Prezenta tez de doctorat conine introducere, cinci capitole structurate n dou pri (noiuni
teoretice i contribuii originale), urmate de concluzii, bibliografie i dou anexe.
Astfel, partea nti cuprinde trei capitole n care sunt tratate aspecte generale referitoare la
antibiotice, principalele surse de poluare ale mediului nconjurtor cu antibiotice, msurile de prevenire a
contaminrii mediului nconjurtor cu antibiotice, precum i aspecte privind ecotoxicologia acestora. De
asemenea, partea nti a tezei ofer o imagine de ansamblu referitoare la cele mai adecvate i utilizate
tehnici pentru izolarea/concentrarea, identificarea i cuantificarea antibioticelor din probe de ap
rezidual i probe de mediu.
Contribuiile originale (modul de lucru i interpretarea rezultatelor experimentale) sunt prezentate
n cea de a doua parte a tezei de doctorat. Capitolul 4 cuprinde prezentarea a dou proceduri care au fost
elaborate n scopul determinrii antibioticelor din probe de ap de suprafa (rul Someul Mic, Cluj-

1
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

Napoca) i ap rezidual (colectate de la un spital clinic i de la o staie de epurare a apelor reziduale).


Izolarea/concentrarea antibioticelor din probele de ap investigate a fost realizat utiliznd tehnica
extraciei pe faz solid (SPE), iar identificarea i cuantificarea antibioticelor utiliznd dou tehnici,
corespunztoare fiecrei proceduri elaborate: cromatografia pe strat subire de nalt performan
(HPTLC) i cromatografia de lichide de nalt performan cuplat cu spectrofotometria cu serie de
fotodiode cu baleiaj complet (DAD) i cuplat cu spectrometria de mas (MS). Pentru validarea
procedurilor elaborate, SPE-HPTLC i SPE-HPLC-DAD/MS, au fost determinate selectivitatea,
liniaritatea, limitele de detecie i de cuantificare, preciza i acurateea. De asemenea, n Capitolul 4 sunt
prezentate caracteristicile fizico-chimice ale probelor de ap rezidual investigate, determinri care au
fost realizate n special pentru compararea celor dou tipuri de ap rezidual din punctul de vedere al
ncrcturii cu poluani organici provenii din cele dou surse.
Ultimul capitol al tezei de doctorat cuprinde rezultatele experimentale obinute n urma
cercetrilor efectuate privind influenele antibioticelor asupra densitii celulare a algelor verzi
(Pseudokirchneriella subcapitata L.) i asupra plantelor de gru (Triticum aestivum L.). Deoarece algele
reprezint baza lanului trofic, iar scderi uoare n populaia de alge pot afecta echilibrul ntr-un sistem
acvatic, n cadrul acestor cercetri, influena antibioticelor asupra algelor nu a putut fi exclus.
n cazul testelor pe plantele de gru (Triticum aestivum L.), s-a urmrit obinerea unei perspective
referitoare la efectele negative ale antibioticelor, precum i identificarea celor mai potrivite caracteristici
pentru o evaluare rapid a toxicitii acestora. Astfel, sunt prezentate efectele antibioticelor asupra
parametrilor fotosintetici (transportul de electroni, viteza net de asimilaie a CO2, conductana stomatal
de vaporizare a apei), compuilor organici volatili (monoterpene i produi de oxidare sub aciunea
lipoxigenazei), pigmenilor asimilatori (clorofilieni i carotenoizi) i asupra coninutului total de
flavonoide din plantele de gru.
Rezultatele obinute n urma cercetrilor realizate n cadrul studiului de doctorat au fost
comunicate la manifestri tiinifice i de asemenea publicate/acceptate/trimise spre publicare n reviste
de specialitate (ANEXA II).
Avnd n vedere faptul c reziduurile de antibiotice din mediul nconjurtor sunt suspecte de a
induce rezisten tulpinilor bacteriene, provocnd astfel o ameninare grav pentru sntatea public
(organismul uman, respectiv cel animal, i creaz rezisten la anumite tipuri de antibiotice), dezvoltarea
de proceduri pentru determinarea coninutului de antibiotice din probe de mediu, precum i evaluarea
impactului antibioticelor i a metaboliilor acestora asupra mediului nconjurtor reprezint o necesitate.

PARTEA A II-A. CONTRIBUII ORIGINALE

Capitolul 4. Cercetri privind elaborarea de proceduri pentru determinarea


coninutului de antibiotice din probe de ap de suprafa i probe de ap rezidual

Conform literaturii de specialitate, pentru extracia antibioticelor din diferite probe este utilizat
tehnica extraciei pe faz solid (Aperger et al., 2006; Feitosa-Felizzola et al., 2007; Kasprzyk-Hordern
et al., 2008; Mutavdi et al., 2006) urmat de identificarea i cuantificarea acestora utiliznd diferite
tehnici precum electroforeza capilar (Aperger et al., 2006; Garca-Campaa et al., 2009), cromatografia
pe strat subire (Aperger et al., 2006; Joshi et al., 2009; Mutavdi et al., 2006) i cromatografia de
lichide de nalt performan (Benito-Pea et al., 2006; Feitosa-Felizzola et al., 2007; Garca-Galn et al.,
2010).

2
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

n cadrul studiului de doctorat au fost elaborate dou proceduri care au avut drept scop
determinarea coninutului de antibiotice din probe de ap de suprafa i ap rezidual, utiliznd tehnica
cromatografiei de lichide.

4.1. Antibioticele luate n studiu i principalele caracteristici

n funcie de clasele de antibiotice care au fost determinate n probe de mediu i raportate n


literatura de specialitate, n cazul nostru, au fost selectate pentru a fi studiate apte dintre antibioticele cel
mai frecvent utilizate pentru tratarea sau prevenirea diferitelor afeciuni. Aceste antibiotice au fost
achiziionate de la diferii productori, n diferite moduri de prezentare (pulbere injectabil, capsule sau
comprimate). n toate experimentele care au fost realizate pe perioada studiului de doctorat, aceste
antibiotice au fost considerate drept referine. Tabelul 4.2 conine principalele caracteristici (formula
chimic, masa molecular, formula structural i modul de aciune) ale antibioticelor studiate.

Tabel 4.2. Formula chimic, masa molecular, formula structural i


modul de aciune ale antibioticelor studiate.
Masa
Formula Modul de
Antibiotic molecular Formula structural
chimic aciune1)
(g mol-1)
HO
O
H H H
N S CH3
AMOX C16H18N3O5SNa 387,39 Bactericid
NH2 N CH3
O
COONa

O
H H H
N S CH3
AMP C16H18N3O4SNa 371,39 Bactericid
NH2 N CH3
O
COONa

O
H H H
N S CH3
PENG C16H17N2O4SK 372,48 Bactericid
N CH3
O
COOK
O
H3C
H3C OH
N O
H
CFZ C22H22N6O7S2 546,58 S N
H
S Bactericid
N
O +
H2N N N
O
-
O O
S
O
H2N
N H H H
N S
CH3
N
CFX C18H16N8O7S3Na2 598,54 OCH3
N S N
N
Bactericid
O
COONa N
ONa
O
H HO CH3 H N(CH3)2
OH

TET C22H24N2O8.HCl 480,89 .HCl Bacteriostatic


CONH2
OH
OH O OH O

3
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

H H CH3 OH N(CH3)2
OH
DOXI C22H24N2O8.HCl 480,89 Bacteriostatic
.HCl
CONH2
OH
OH O OH O
1)
Antibioticele bactericide cum sunt -lactamele (penicilinele i cefalosporinele) acioneaz la nivelul peretelui
celular bacterian, inhibnd sinteza peptidoglicanului, un constituent esenial al peretelui celular. Antibioticele
bacteriostatice precum tetraciclinele inhib sinteza proteic, astfel blocnd introducerea de noi aminoacizi n lanul
polipeptidic (Dahl et al., 2006; Matinca, 2002).

4.2. Analiza antibioticelor din probe de ap de suprafa utiliznd tehnica cromatografiei pe strat
subire de nalt performan (HPTLC)

Cnd ntr-o matrice sunt prezeni mai mult dect un antibiotic este necesar separarea lor nainte
de a fi determinai. Tehnica cromatografiei pe strat subire este o tehnic ideal pentru determinarea unei
game variate de antibiotice deoarece este o tehnic necostisitoare, rapid, uor de utilizat, nu implic o
mentenan complicat i ofer posibilitatea analizei simultane a mai multor probe (Husain et al., 2004).
De aceea, n cazul nostru a fost utilizat aceast tehnic de analiz pentru determinarea unor antibiotice
(Tabel 4.2) din probe de ap de suprafa.

4.2.1. Izolarea/concentrarea antibioticelor din matrici lichide utiliznd tehnica extraciei pe


faz solid (SPE)

Modul de lucru
Soluia stoc de antibiotice studiate (5 mg mL-1 de AMOX, AMP i PENG; 1 mg mL-1 de CFZ,
CFX, TET i DOXI) a fost preparat n metanol (MeOH), ntr-un balon cotat de 5 mL. Soluiile de lucru
au fost preparate prin diluia soluiei stoc. Pentru a preveni fotodegragdarea, soluiile de antibiotice
proaspt preparate au fost depozitate n recipiente de culoare nchis.
Pentru prepararea probelor i a fazei mobile s-a folosit MeOH ( 99,9%, HPLC), acetat de etil
achiziionate de la Merck (Germania) i aceton de la Microchim (Romnia). Sarea disodic a acidului
etilendiamino-tetraacetic (Na2EDTA2H2O, notat cu EDTA) a fost achiziionat de la Fluka(Germania).
Pentru ajustarea pH-ului probelor s-a utilizat acidul clorhidric (HCl) achiziionat de la Poch (Polonia) i
hidroxidul de sodiu (NaOH) de la Merck (Germania). Apa ultrapur utilizat n toate experimentele a fost
preparat folosind un sistem de purificare Milli-Q (Millipore, SUA).
Pentru extracia simultan a antibioticelor studiate din matrici lichide, au fost selectate cartuele
polimerice SPE Oasis HLB (hydrophilic lipophilic balance, 6 mL, 200 mg) cu caracteristici hidrofile i
lipofile, achiziionate de la Waters (SUA). Stratul de adsorbant are la baz doi monomeri, unul hidrofilic
N-vinilpirolidon i unul lipofilic divinilbenzen. Acest tip de cartu este adecvat pentru a extrage o gam
variat de antibiotice, deoarece nu conine grupri silanol libere cu care compuii de interes s
interacioneze direct sau s formeze compleci metalici (Feitosa-Felizzola et al., 2007). Un alt avantaj al
acestei faze staionare este c are proprieti excelente de umezire datorate monomerului hidrofil N-
vinilpirolidon (Gmez et al., 2006). Capacitatea mare de retenie i gradele de recuperare mari ale unui
spectru larg de analii sunt meninute chiar dac se ntmpl, n unele situaii, ca faza staionar a
cartuului s rmn uscat pe parcursul extraciei SPE.
Protocolul de lucru urmat n vederea extraciei antibioticelor de interes din matrici lichide a
constat n mai multe etape:

4
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

condiionarea fazei staionare cu 10 mL MeOH i 10 mL ap ultrapur;


trecerea unui volum de 100 mL de prob prin cartuul de extracie; debitul volumului de
prob care a fost trecut prin cartu a fost de 1,2 mL min-1.
eluia antibioticelor reinute pe faza staionar a fost realizat cu 6 mL MeOH.
nainte de trecerea probei prin cartu, probele au fost prelucrate. Aceast etap a constat n
adugarea a 1 mL soluie apoas de EDTA 5% n volumul de prob de 100 mL luat n lucru. Adugarea
de EDTA a avut drept scop complexarea metalelor reziduale din ap (Feitosa-Felizzola et al., 2007). De
asemenea pH-ul probei a fost ajustat la valoarea 3 cu HCl 0,5 N.
Extractele astfel obinute, au fost evaporate pn la sec la temperatura de 40C cu ajutorul unui
rotaevaporator (Laborata 4000, Heidolph, Germania) i apoi reluate n 0,5 mL MeOH. Toate extraciile au
fost efectuate de trei ori i au fost evaluate utiliznd tehnica HPTLC.

Rezultate i discuii
Valorile gradelor de recuperare care au fost obinute sunt peste 80%, cu excepia AMP (64,5%)
(Opri et al., 2012a). Conform studiului realizat de ctre Granados et al., 2005, adugarea de EDTA n
matricea lichid mbuntete gradele de recuperare ale tetraciclinelor. n cazul nostru, pentru TET i
DOXI au fost obinute grade de recuperare de 90,9%, respectiv 99,5% (Figura 4.3).
Ajustarea pH-ului probelor sub valorile constantei de aciditate (pKa) ale antibioticelor studiate
mbuntete gradul de recuperare pe acest tip de cratu, Oasis HLB (Yang et al., 2005). Valorile pKa ale
antibioticelor studiate conform datelor din literatur sunt: peniciline pKa1 2-3 i pKa2 7 (Benito-Pea
et al., 2006); CFZ pKa1 = 1,9; pKa2= 2,7 i pKa3 4,1 (Abounassif et al., 1990); CFX pKa1 = 1,7; 3,1 i
pKa2 = pKa3 4,3 (Nakai et al., 2010); tetracicline pKa1 3, pKa2 7, pKa3 9) (Batt i Aga, 2005;
Seifrtov et al., 2009). Astfel, pentru a mbunti extracia antibioticelor studiate din probe de ap de
suprafa, pH-ul probelor a fost ajustat la valoarea 3.

120 112,8
Grad de recuperare (%)

100,8 99,5
91,8 90,9
90 82,6

64,5
Figura 4.3. Mediile gradelor de recuperare (
60 RSD, %, trei determinri) ale antibioticelor studiate
din matrici lichide obinute cu cartuele de extracie
30
Oasis HLB, pH 3.
0
FZ
G

XI
X

FX

T
TE
AM
O

O
C

C
AM

PE

4.2.2. Analiza calitativ i cantitativ a antibioticelor utiliznd tehnica HPTLC

Modul de lucru
Separarea cromatografic a fost realizat pe plci Alugram SIL G/UV254 (10 20 cm) prevzute
cu un strat de 0,20 mm silica gel 60 cu indicator de fluorescen (Macherey-Nagel, Germania). nainte de
aplicarea probelor sub form de band, plcile cromatografice au fost introduse n soluie EDTA 10%,
care a fost ajustat n prealabil la valoarea de pH 7,5 cu o soluie NaOH 1N. Aceast etap este necesar
pentru a evita formarea complecilor ioni de metal/tetracicline (Meisen et al., 2010). Uscarea plcilor a

5
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

avut loc la o temperatur de 125C timp de 30 min, ntr-o etuv Memmert (Germania). Cu ajutorul
aplicatorului Desaga AS 30 (Germania), pe plci au fost spotate benzi a cte 2 L i lime 5 mm din
fiecare soluie de antibiotic i de asemenea din extractele obinute cu metoda SPE. Developarea plcilor a
avut loc ntr-o camer de developare dublu compartimentat Desaga (Germania), ntr-un timp de 25 min,
iar distana de migrare a fazei mobile a fost de 8,5 cm. n prealabil, camera de developare a fost saturat
cu un amestec cuaternar de faz mobil compus din acetat de etil - metanol - aceton-ap 5 : 2,5 : 2,5 : 1,5
(v/v), timp de 30 min, la temperatura camerei de 23C. Dup developare, plcile au fost uscate la
temperatura camerei, sub ni. Utiliznd densitometrul Desaga CD-60 (Germania) plcile developate au
fost scanate n modulul de absorbie sub lumin UV, la lungimea de und de 254 nm (Opri et al., 2012a).

Rezultate i discuii
Antibioticele luate n studiu au fost foarte bine separate n urma utilizrii metodei HPTLC
propuse (Figura 4.6). Acest lucru este confirmat de rezoluia cromatografic (Rs) care ofer informaii cu
privire la separarea compuilor de interes. Valoarea Rs a dou benzi spotate una n apropierea celeilalte a
fost determinat prin calculul raportului dintre distana ntre maximele benzilor i media limii benzilor
la baz (Fried i Sherma, 2005). n cazul antibioticelor studiate, valorile Rs obinute au fost cuprinse ntre
2,00-8,59 (Rs CFZ-CFX = 4,10; Rs CFX-TET = 3,79; Rs TET-AMOX = 2,56; Rs AMOX-DOXI = 2,84; Rs DOXI-AMP =
2,00; Rs AMP-PENG = 8,59) (Opri et al., 2012a). Conform noiunilor teoretice, pentru a putea analiza un
component n bune condiii, acesta trebuie s fie separat de restul componenilor cu o rezoluie Rs 2
(Gocan, 2002).

Figura 4.6. Densitograma amestecului celor apte


antibiotice studiate.

4.2.3. Studii privind validarea procedurii SPE-HPTLC

n prezentul studiu, antibioticele considerate drept referine au fost medicamente coninnd


substana activ (antibiotic) i excipieni (Tabel 4.1). n acest sens, pentru fiecare antibiotic, cu ajutorul
cromatografului de lichide HPLC-DAD/MS (Shimadzu, Japonia) au fost nregistrate spectrele de mas cu
modulul de ionizare pozitiv prin electropulverizare. Tensiunea capilar a fost setat la 1,5 kV, curba
liniei de desolvatare i temperatura interfaei au fost setate la temperatura de 250C. Rezultatele
experimentelor HPLC-DAD/MS n ceea ce privete ionul molecular (m/z) au fost n concordan cu datele
raportate n literatur: 366 pentru AMOX (Lindberg et al., 2004), 350 pentru AMP (Li et al., 2009;
Lindberg et al., 2004; Pozo et al., 2006), 335 pentru PENG (Xu et al., 2010), 547 pentru CFZ (Abounassif
et al., 1990), 555 pentru CFX (Kato et al., 2008), 445 pentru TET (Feitosa-Felizzola et al., 2007; Hu et
al., 2010; Li et al., 2009), 445 pentru DOXI (Gruji et al., 2009). Spectrele de mas sunt prezentate n

6
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

Subcapitolul 4.3.2 n care este descris o alt procedur elaborat pentru determinarea antibioticelor, dar
din probe de ap rezidual.
Pentru determinarea antibioticelor de interes din probe de ap de ru, procedura SPE-HPTLC
elaborat a fost validat. Datele experimentale demonstreaz c procedura SPE-HPTLC propus este
selectiv i prezint liniaritate, precizie i acuratee foarte bune. De asemenea, n cadrul acestui studiu au
fost determinate limitele de detecie i de cuantificare.

4.2.4. Determinarea coninutului de antibiotice din probe de ap de suprafa utiliznd procedura


SPE-HPTLC

Modul de lucru
Probele de ap de suprafa au fost colectate n recipiente curate din polietilen, din rul Someul
Mic care traverseaz oraul Cluj-Napoca. n rul Someul Mic sunt deversate o varietate de reziduuri
organice provenite din diferite industrii, ape menajere i eflueni reziduali municipali. Probele au fost
colectate pe perioada unei sptmni i analizate n mai puin de 24 de ore de la prelevare.

Rezultate i discuii
n Figura 4.12 este prezentat o plac HPTLC pe care au fost spotate cteva extracte de ap de
ru n vederea determinrii coninutului de antibiotice. Aceast plac a fost spotat cu cele apte
antibiotice individuale considerate drept referin (poziiile 1-7), antibioticele referin n amestec
(poziiile 8 i 17), probe de ap de ru (poziiile 9-12) i probe de ap de ru cu adaos cunoscut de
antibiotice (poziiile 13-16) (Opri et al., 2012a).

Figura 4.12. Placa cromatografic HPTLC a


antibioticelor studiate. Poziiile 1-7 reprezint
referinele individuale antibiotice studiate: 1-CFZ,
2-CFX, 3-TET, 4-AMOX, 5-DOXI, 6-AMP, 7-
PENG; Poziiile 8 i 17 reprezint amestecul de
antibiotice referin; Poziiile 9-12 reprezint
extracte de ap de ru, iar poziiile 13-16 sunt
reprezentate de extractele de probe de ru cu adaos
cunoscut de antibibiotice.

Densitogramele suprapuse corespunztoare amestecului de antibiotice referine (17) i probei de


ap de suprafa (14) sunt prezentate n Figura 4.13.

7
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

Figura 4.13. Densitogramele suprapuse


corespunztoare amestecului de antibiotice
referine (17) i unei probe de ap de
suprafa cu adaos cunoscut de antibiotice
(14).

n Tabelul 4.7 sunt prezentate valorile concentraiilor de antibiotice care au fost determinate n
probele de ap de ru. n aceste probe au fost determinate dou dintre antibioticele studiate, AMOX i
TET, n concentraii cuprinse ntre 2115-2249 g L-1, respectiv 55-78 g L-1 (Opri et al., 2012a).

Tabel 4.7. Cantitile (g L-1) de antibiotice care au fost determinate n probele de ap de suprafa
prelevate din rul Someul Mic, Cluj-Napoca.

Nr. g L-1)
Cantitatea (
prob AMOX AMP PENG CFZ CFX TET DOXI
1 2201 nd nd nd nd nd nd
1)
2 nd nd nd nd nd 59 nd
3 nd nd nd nd nd 68 nd
4 nd nd nd nd nd nd nd
5 2115 nd nd nd nd 55 nd
6 2176 nd nd nd nd 78 nd
7 nd nd nd nd nd nd nd
8 2249 nd nd nd nd 64 nd
9 nd nd nd nd nd nd nd
10 nd nd nd nd nd nd nd
1)
nd - nu a fost detectat.

4.3. Caracterizarea fizico-chimic a unor probe de ap rezidual. Analiza coninutului de


antibiotice utiliznd tehnica cromatografiei de lichide de nalt performan (HPLC)

n cadrul Subcapitolului 4.3.1 este prezentat caracterizarea fizico-chimic a probelor de ap


rezidual generat de un spital clinic care este evacuat n reeaua de canalizare, precum i calitatea apelor
reziduale (influent i efluent) de la o staie de epurare colectoare de ape reziduale oreneti. De regul, n
cazul acestor dou tipuri de ape reziduale valorile parametrilor fizico-chimici nu sunt diferite (Abd El-
Gawad i Aly, 2011). Apele reziduale generate de spitale prezint o ncrctur cu substane poluante la
fel de mare ca n cazul celor din cadrul staiilor de epurare. Din acest motiv am urmrit compararea
indicatorilor de calitate a celor dou tipuri de ape reziduale. n cazul nostru, indicatorii de calitate
analizai nu au variat foarte mult n funcie de natura probelor de ap rezidual (colectate de la un spital
clinic i de la o staie de epurare). Acest aspect a fost observat n cazul indicatorilor de calitate consum
chimic i biochimic de oxigen (CCO-Cr i CBO5) i totalul de materii solide n suspensie (TMS).

8
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

4.3.2. Analiza antibioticelor din probe de ap rezidual utiliznd tehnica cromatografiei de lichide
de nalt performan cuplat cu spectrofotometria cu serie de fotodiode cu baleiaj complet i
cu spectrometria de mas (HPLC-DAD/MS)

n cadrul Subcapitolului 4.3.2 este prezentat o procedur SPE-HPLC-DAD/MS care a fost


elaborat pentru determinarea simultan a apte antibiotice din probe de ap rezidual colectate de la un
spital clinic i de la o staie de epurare. S-a urmrit determinarea coninutului de antibiotice din probe de
ap rezidual generat de spitalul clinic, deoarece spitalele se numr printre principalele surse de poluare
ale mediului nconjurtor cu antibiotice (Duong et al., 2008). Deoarece apele reziduale colectate de la o
staie de epurare ar putea s conin cantiti mai mici sau mai mari de antibiotice, n funcie de sursele de
la care provin, a fost urmarit prezena acestor antibiotice i n apele care intr, respectiv care ies din
staia de epurare. Pentru realizarea acestui studiu, antibioticele selectate au fost AMOX, AMP, PENG
CFZ, CFX, TET i DOXI (Subcapitolul 4.1).

4.3.2.1. Izolarea/concentrarea antibioticelor din matrici lichide utiliznd tehnica SPE

Modul de lucru
Soluiile stoc ale antibioticelor referin au fost preparate n ap ultrapur. Acetonitrilul de
puritate HPLC a fost achiziionat de la Sigma-Aldrich (Germania), iar acidul formic de la Cristal R Chim
(Romania). Pentru metoda SPE, metanolul (MeOH) a fost achiziionat de la Merck (Germania),
amoniacul de la Primexchim (Romania) i acidul clorhidric (HCl) de la Poch (Polonia). Sarea disodic a
acidului etilendiamino-tetraacetic (Na2EDTA2H2O, notat cu EDTA) a fost achiziionat de la Fluka
(Germania). Apa ultrapur utilizat n toate experimentele a fost preparat cu ajutorul unui sistem de
purificare Millipore, SUA. Extraciile SPE din cadrul acestui experiment au fost realizate cu ajutorul
cartuelor Oasis HLB (6 mL, 200 mg, Waters, SUA) i utiliznd un sistem cu vacuum model Supelco
(Sigma-Aldrich, Germania).
Principalele etape SPE au constat n:
condiionarea cartuului Oasis HLB cu 10 mL MeOH i 10 mL ap ultrapur;
introducerea unui volum de 100 mL prob de ap rezidual preparat anterior extraciei prin
adugarea de EDTA 5% pentru complexarea metalelor reziduale (Feitosa-Felizzola et al.,
2007);
eluia antibioticele reinute pe faza staionar a fost realizat cu 6 mL MeOH.
n vederea alegerii unei valori optime de pH pentru proba real, antibioticele studiate au fost
extrase din 100 mL ap ultrapur cu coninut de 120 g din fiecare antibiotic, la diferite valori ale pH-ului
(2, 3, 7 i 9). pH-ul probelor a fost ajustat cu HCl 0,5 N, respectiv cu NH4OH 5%.
Debitul de trecere a probei prin cartu a fost de 1,2 mL min-1. Extractele astfel obinute au fost
evaporate pn la sec la temperatura de 40C i reluate apoi n 2 mL ap ultrapur. Toate extraciile au
fost realizate de trei ori i analizate cu metoda HPLC-DAD/MS descris n Subcapitolul 4.3.2.2.

Rezultate i discuii
Dintre valorile de pH testate, cele mai bune grade de recuperare au fost obinute la pH 3 pentru
antibioticele CFZ, CFX, TET i la pH 7 pentru celelalte antibiotic studiate AMP, PENG i DOXI. n
cazul antibioticului AMOX, a fost obinut un grad de recuperare mai mic de 50% pentru ambele valori ale

9
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

pH-ului (3 i 7). n Figura 4.23 se observ efectul pH-ului asupra eficienei extraciei SPE a antibioticelor
studiate.
La pH 3 au fost obinute valori ale gradelor de recuperare relativ bune pentru antibioticele CFZ
de 68,7%, CFX de 110,1% i TET 102,6%. La pH 7, valorile gradelor de recuperare au fost mai mari
pentru celelalte antibiotic studiate AMP 88,8%, PENG 98,7%, TET 114,6 % i DOXI 84,4%, cu excepia
AMOX (42,9% la pH 3 i 31,7% la pH 7) (Tabel 4.9). Deoarece cele mai bune grade de recuperare ale
antibioticelor referin extrase din ap ultrapur au fost obinute la valorile de pH 3 i 7, aceste valori ale
pH-ului au fost aplicate n cazul tuturor probelor de ap rezidual care au fost analizate n cadrul acestui
studiu.

120 pH 2 pH 7
pH 3 pH 9
Grad de recuperare (%)

100

80 Figura 4.23. Gradele de recuperare ale


60 antibioticelor studiate extrase din ap ultrapur, la
40 valori ale pH-ului 2, 3, 7, 9, obinute cu cartuele
20 de extracie Oasis HLB.
0
G

FZ

XI
X

T
FX
TE
AM
O

O
C

C
AM

PE

4.3.2.2. Analiza calitativ i cantitativ a antibioticelor utiliznd tehnica HPLC-DAD/MS

Modul de lucru
Analizele au fost realizate cu ajutorul unui cromatograf de lichide de nalt performan HPLC
Shimadzu prevzut cu doi detectori: DAD i MS. Sistemul utilizat pentru analiza antibioticelor luate n
studiu este prevzut cu un generator de azot.
Separarea cromatografic a fost realizat pe coloan C18 Grace Alltima (100 3 mm, 3 m)
termostatat la 26C. Faza mobil utilizat a fost ap ultrapur cu acid formic la pH 3 (A) i acetonitril
(B). Eluia compuilor de interes a fost realizat cu gradientul de eluie prezentat n Tabelul 4.10, la un
debit 0,5 mL min-1. Timpul de echilibrare al coloanei a fost de 5 min, iar volumul de injecie utilizat a fost
de 20 L.

Tabel 4.10. Programul de gradient utilizat pentru separarea cromatografic a


antibioticelor studiate. Faza mobil: ap ultrapur cu acid formic la pH 3 (A) i acetonitril (B).
Timp (min) A (%) B (%)
0:00 90 10
6:00 30 70
10:00 20 20
10:01 90 10
15:00 Stop Stop

Rezultate i discuii
Toate antibioticele luate n studiu au fost separate i eluate ntr-un timp foarte scurt, de 7,5 min.
Picurile corespunztoare antibioticelor studiate au prezentat un maximum de absorbie, n domeniul UV-

10
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

Vis, dup cum urmeaz: AMOX, AMP, PENG, CFZ i CFX la 197 nm, TET i DOXI la 272 nm.
Parametrii pentru detecia MS au fost: 1,5 kV tensiunea capilar, 250C temperatura de desolvatare i
250C temperatura interfeei. Pentru nregistrarea spectrelor de mas a fost utilizat modulul de ionizare
pozitiv, prin electropulverizare (ESI - electrospray ionization). Toi compuii de interes au fost
confirmai pe baza timpului de retenie i pe baza ionilor moleculari (m/z) din spectrele de mas obinute.
Rezultatele obinute n ceea ce privete ionul molecular (m/z) sunt n concordan cu cele raportate n
literatur (vezi Subcapitolul 4.2.3). n Tabelul 4.11 sunt prezentai timpii de retenie corespunztori
fiecrui antibiotic studiat. Datorit diferenei dintre timpii de retenie, se poate observa c separarea
antibioticelor studiate este bun. De asemenea, conform spectrelor de mas nregistrate, Tabelul 4.11
conine raportul m/z i intensitatea relativ corespunztoare fiecrui antibiotic studiat.

Tabel 4.11. Parametrii HPLC-MS corespunztori antibioticelor studiate.


Timp de retenie Ionul molecular Intensitatea relativ
Antibiotic
(min) (m/z) (%)
AMOX 1,78 366 28
AMP 4,34 350 100
PENG 7,11 335 <10
CFZ 3,96 547 81
CFX 4,76 555 100
TET 5,39 445 100
DOXI 6,08 445 100

4.3.2.3. Studii privind liniaritatea, limitele de detecie i de cuantificare, precizia i acurateea


procedurii SPE-HPLC-DAD/MS

Pentru a realiza cuantificarea antibioticelor studiate n probe de ap rezidual cu ajutorul


procedurii SPE-HPLC-DAD/MS propuse, au fost elaborate studii de liniaritate i au fost determinate
limitele de detecie i de cuantificare, precizie i acuratee.

4.3.2.4. Determinarea coninutului de antibiotice din probe de ap rezidual utiliznd procedura


SPE-HPLC-DAD/MS

Modul de lucru
Probele au fost filtrate cu ajutorul unor filtre din hrtie Macherey-Nagel (MN 640 d 125 mm) i
depozitate n ntuneric la temperatura de 4C. Pentru a diminua degradarea antibioticelor, probele de ap
rezidual au fost supuse extraciei SPE n mai puin de 24 h de la prelevare. Probele de ap rezidual au
fost colectate n perioada februarie-septembrie 2011: proba nr. 1 a fost colectat n luna februarie, proba
nr. 2 n luna martie 2011, proba nr. 3 n luna mai 2011, proba nr. 4 n luna iunie, proba nr. 5 n luna
august 2011, iar probele cu nr. 6 i 7 n luna septembrie 2011.

Rezultate i discuii
a). Coninutul de antibiotice din probe de ap rezidual colectate de la un spital clinic
n probele de ap rezidual colectate de la spitalul clinic au fost detectate trei dintre antibioticele
studiate CFZ, TET i DOXI n cantiti cuprinse ntre 83-164 g L-1, 152-789 g L-1, respectiv 285-544
g L-1 (Tabel 4.15).

11
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

Tabel 4.15. Cantitile (g L-1) de antibiotice determinate n probele de ap rezidual


colectate de la un spital clinic.
Nr. Cantitatea (g L-1)
prob AMOX AMP PENG CFZ CFX TET DOXI
1 nd1) nd nd nd nd nd nd
2 nd nd nd nd nd 152 nd
3 nd nd nd 83 nd nd nd
4 nd nd nd nd nd 546 285
5 nd nd nd nd nd nd nd
6 nd nd nd nd nd nd nd
7 nd nd nd 164 nd 789 544
1)
nd - nu a fost detectat.

Una dintre metodele cele mai simple de identificare a unor componeni se numr compararea
cromatogramei etaloanelor cu cromatograma probelor (Gocan, 2002). Un astfel de exemplu este prezentat
n Figura 4.28 unde sunt suprapuse cromatograma nregistrat pentru o prob de ap rezidual n care au
fost detectate trei dintre antibioticele studiate (CFZ, TET i DOXI) i cromatograma nregistrat pentru
antibioticele referin studiate. De asemenea, au fost comparate i spectrele de mas ale antibioticelor
referin cu cele ale antibioticelor din probele de ap rezidual, confirmndu-se nc o dat prezena lor n
probele de ap rezidual colectate de la spital.

Figura 4.28. Cromatogramele HPLC-DAD


suprapuse corespunztoare amestecului de
antibiotice referin (a) i a unei probe de ap
rezidual colectat de la un spital clinic (b).

b). Coninutul de antibiotice din probe de ap rezidual colectate de la o staie de epurare


n probele de ap rezidual colectate de la staia de epurare au fost determinate antibiotice care
aparin acelorai clase (cefalosporine i tetracicline), la fel ca n cazul probelor de ap colectate de la un
spital clinic. Din clasa tetraciclinelor, au fost determinate att TET, ct i DOXI. Persistena lor poate fi
datorat i altor ape reziduale care sunt colectate n cadrul acestei staii de epurare, de la alte spitale, i
datorit faptului c sunt cele mai importante i utilizate antibiotice (Hernndez et al., 2003; Kim et al.,
2005). Spre deosebire de probele de ap colectate de la spitalul clinic n care a fost determinat antibioticul
CFZ, n probele de ap de la staia de epurare a fost determinat antibioticul CFX. Cantitile de antibiotice
determinate n probele de ap rezidual colectate de la staia de epurare sunt: 245 g L-1 CFX, 263-388 g
L-1 TET i 83 g L-1 DOXI.

12
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

De asemenea au mai fost colectate probe de ap rezidual de la staia de epurare, pe parcursul


unei zile, la ore diferite. Astfel au fost colectate trei probe de influent la orele 9, 12, 15 i efluenii
corespunztori acestora la orele 16, 19 i 22. n probele de influent au fost detectate doar trei antibiotice
din cele apte studiate, cu niveluri de concentraii diferite: 334 g L-1 CFX, 146 g L-1 TET i 110 g L-1
DOXI (Tabel 4.17).
n efluenii investigai nu a fost detectat nici un antibiotic din cele apte studiate n cadrul acestor
cercetri sau au fost prezente n cantiti mici, sub limita de detecie a procedurii propuse. Acest lucru
sugereaz faptul c procesul de epurare al apelor rziduale este eficient.

13
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

Tabel 4.16. Cantitile (g L-1) de antibiotice determinate n probele de ap rezidual prelevate de la o staie de epurare.
Cantitatea (g L-1)
Nr
AMOX AMP PENG CFZ CFX TET DOXI
prob
influent efluent influent efluent influent efluent influent efluent influent efluent influent efluent influent efluent
1 nd1) nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd
2 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd
3 nd nd nd nd nd nd nd nd 245 nd nd nd nd nd
4 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 263 nd nd nd
5 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd
6 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd
7 nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd 388 nd 83 nd
1)
nd - nu a fost detectat.

Tabel 4.17. Cantitile (g L-1) de antibiotice determinate n probele de ap rezidual colectate de la staia de epurare n aceeai zi, la intervale orare diferite.
Ora g L-1)
Cantitatea (
Apa rezidual
prelevrii AMOX AMP PENG CFZ CFX TET DOXI
9 Influent nd1) nd nd nd nd 146 110
12 Influent nd nd nd nd nd nd nd
15 Influent nd nd nd nd 334 nd nd
16 Efluent nd nd nd nd nd nd nd
19 Efluent nd nd nd nd nd nd nd
22 Efluent nd nd nd nd nd nd nd
1)
nd - nu a fost detectat.

14
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

Capitolul 5. Cercetri privind influena antibioticelor


asupra algelor verzi (Pseudokirchneriella subcapitata L.) i
asupra plantelor de gru (Triticum aestivum L.)

Monitorizarea i realizarea de studii de toxicitate ale produselor farmaceutice sunt necesare


pentru a evalua impactul lor asupra mediului nconjurtor (Choma, 2004). n prezenta tez de doctorat, au
fost realizate studii privind influena antibioticelor asupra algelor verzi de ap dulce (Pseudokirchneriella
subcapitata L.) (Subcapitolul 5.2) i asupra plantelor de gru (Triticum aestivum L.) (Subcapitolul 5.3). n
Subcapitolului 5.1 sunt prezentate antibioticele care au fost luate n studiu n cadrul acestor cercetri.

5.1. Antibioticele luate n studiu i principalele caracteristici

n experimentele ce au avut drept scop influena antibioticelor asupra algelor


(Pseudokirchneriella subcapitata L.) (Subcapitolul 5.2), au fost luate n studiu trei antibiotice care aparin
la dou clase diferite: peniciline (AMP PENG) i tetracicline (DOXI) (vezi Subcapitol 4.1). n cadrul
studiilor privind influena antibioticelor asupra plantelor de gru (Triticum aestivum L.) (Subcapitolul
5.2), au fost luate n studiu nou antibiotice (AMOX, AMP, PENG, CFZ, CFX, TET, DOXI,
ciprofloxacin - CIP i eritromicin - ERI). Cu excepia CIP i ERI, caracteristicile tuturor antibioticelor
menionate anterior sunt prezentate n cadrul Subcapitolului 4.1. Caracteristicile antibioticelor CIP i ERI
sunt prezentate n Tabelul 5.2.

Tabel 5.2. Formula chimic, masa molecular, formula structural i


modul de aciune ale antibioticelor ciprofloxacin i eritromicin.
Masa
Modul de
Antibiotic Formula chimic molecular Formula structural
aciune1)
(g mol-1)
HN
N N
CIP C17H18FN3O3.HCl 367,80 .HCl Bactericid
F COOH
O

CH3 CH3 CH3


O OH O
HO CH3
H3C O O
CH3

ERI C43H75NO16 862,05 CH2CH3 O


H3C
O
Bacteriostatic
O (CH3)2N OOCCH2CH2COOC2H5
HO OCH3

CH3

1)
Antibioticele bactericide precum fluorochinolonele inhib sinteza ADN-ului i sinteza proteic. Antibioticele
bacteriostatice precum macrolidele inhib sinteza proteic, mpiedicnd alungirea lanului polipeptidic (Dahl et al.,
2006; Matinca, 2002).

5.2. Cercetri privind influena antibioticelor asupra densitii celulare a algelor verzi
(Pseudokirchneriella subcapitata L.)

De regul, testele de toxicitate privind inhibarea creterii unor organisme vii se aplic pentru
determinarea prezenei unor substane toxice ce se gsesc n mediul nconjurtor. Algele verzi sunt
utilizate cu succes la determinarea efectelor toxice sau mutagene ale unor substane chimice, metale grele,

15
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

pesticide sau ale apelor reziduale generate de diferite industrii. Algele au un rol foarte important n
structura i funcionarea ntregului ecosistem acvatic (Yang et al., 2008).

5.2.1. Algele verzi (Pseudokirchneriella subcapitata L.), condiiile de cretere i tratamentele cu


antibiotice. Modul de lucru

Pentru a contura i motiva cercetrile urmtoare privind influena antibioticelor asupra plantelor de
gru (Triticum aestivum L.), au fost realizate studii privind influena antibioticelor asupra algelor verzi.
Testele au fost realizate pe algele de ap dulce Pseudokirchneriella subcapitata L., acestea fiind
considerate bioindicatori n evaluarea toxicitii unor substane chimice care se gsesc n mediul
nconjurtor.
Astfel, evaluarea rapid privind influenele negative ale celor trei antibiotice luate n studiu (AMP,
PENG i DOXI, vezi Subcapitolul 4.1) asupra algelor, a fost realizat prin determinarea densitii
celulare. Mediile nutritive de cretere ale algelor utilizate n cadrul acestui studiu au fost: mediu nutritiv
necesar creterii algelor n condiii normale (alge de referin sau control), mediu nutritiv de cretere a
algelor n prezena soluiilor de antibiotice (AMP, PENG i DOXI) de concentraie 1,5 mg L-1, precum i
mediu nutritiv de cretere a algelor n prezen de bicromat de potasiu (K2Cr2O7) de concentraie 1,5 mg
L-1 utilizat de asemenea drept referin pentru detectarea eventualelor condiii de testare nesatisfctoare
(Halling-Srensen, 2000). Concentraia de antibiotice selectat pentru acest studiu este intermediar
concentraiilor care sunt raportate n literatura de specialitate (Qin et al., 2012; van der Grinten et al.,
2010; Yang et al, 2008).
Densitatea celular a algelor a fost determinat cu ajutorul unui microscop optic (CETI, Anglia) i
a camerelor de numrare Neubauer (Weber Scientific International, Anglia). Numrarea celulelor algelor
a fost realizat utiliznd obiectivul de mrire de 40 de ori al microscopului optic, iar camerele de
msurare Neubauer au avut urmtoarele caracteristici: adncime 0,1 mm, dimensiune 1 4000 mm2. n
camerele de msurare Neubauer, au fost introduse cte 20 L de suspensie algal, corespunztoare
fiecrui test inclus n cadrul acestui experiment. Reeaua de numrare a camerei Neubauer a fost alctuit
din 9 cmpuri de msurare (ptrate mari, 1 1 mm), fiecare fiind mprit la rndul su n 16 ptrate mici.
Pentru a evita numrarea celulelor de dou sau mai multe ori i n scopul obinerii unor cifre precise,
numrarea celulelor a fost realizat n trei cmpuri diferite, care au fost selectate astfel nct dispunerea
lor s fie pe diagonal. Aceste msurtori au fost efectuate de trei ori i apoi a fost calculat media celor
trei determinri. Msurarea densitii celulare a algelor care au fost crescute n cele cinci medii diferite, a
fost realizat la trei intervale de timp: 24 h, 48 h i 72 h (EN ISO 8692:2004).

5.2.2. Rezultate i discuii privind influena antibioticelor asupra densitii celulare a algelor

La 24 h dup nceperea experimentului numrul de celule mL-1 a sczut semnificativ din punct de
vedere statistic, n cazul tuturor celor trei teste cu antibiotice (AMOX, PENG i DOXI). Fa de control,
scderea numrului de celule mL-1 a algelor care au fost crescute n mediul nutritiv cu coninut de
antibiotice a fost cuprins ntre 38,6-50,8%. Cea mai mare cantitate de celule mL-1 a fost inhibat de
antibioticul DOXI (50,8%).
n cadrul acestui studiu, al doilea set de msurtori a fost realizat la 48 h de la nceperea
experimentului. Densitatea celular n cazul algelor din mediul nutritiv cu coninut de DOXI 1,5 mg L-1 a
sczut cu 74,2% fa de densitatea celular a algelor control. Antibioticul PENG a contribuit de asemenea

16
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

la modificri n densitatea celular, aceasta crescnd semnificativ (31,8%) fa de algele control. A fost
observat o scdere n densitatea celular a algelor crescute n prezena antibioticului AMP, dar aceast
scdere este nesemnificativ din punct de vedere statistic.
Influena antibioticului DOXI asupra densitii celulare a algelor Pseudokirchneriella subcapitata
L., a fost observat i la 72 h de la nceperea experimentului. Densitatea celular a sczut fa de control
cu 66,9%. n cazul testului cu antibioticul AMP, scderea densitii celulare a algelor nu a fost att de
mare ca n cazul testului cu DOXI, aceast scdere fiind de 24,3% fa de algele control. Testul n care
algele au fost crescute n prezena antibioticului PENG a pstrat aceeai cretere n ceea ce privete
numrul celulelor de alge, la fel ca n cazul msurtorilor efectuate la 48 h de la nceperea experimentului.
La 72 h, numrul celulelor de alge crescute n prezena PENG a crescut cu 50% fa de control.
Testul n care a fost adugat soluie de K2Cr2O7 n mediul nutritiv de cretere, pentru detectarea
eventualelor condiii de testare nesatisfctoare, nu a fost diferit fa de control, n ceea ce privete
numrul de celule mL-1 (24 h, 48 h, 72 h).
De asemenea au fost calculate i vitezele de cretere (i) a celulelor algelor Pseudokirchneriella
subcapitata L., precum i procentele de inhibare a creterii celulare (Ii) pentru fiecare test realizat n
cadrul acestui studiu (EN ISO 8692:2004). Valorile vitezelor de cretere celular a variat ntre 0,054-
0,085 celule mL-1 h-1, cea mai mic valoare fiind n cazul testului cu antibioticul DOXI. Procentul de
inhibare celular a variat ntre 24,1-35,1%.

5.3. Cercetri privind influena antibioticelor asupra plantelor de gru (Triticum aestivum L.)

Pn n prezent, nelegerea efectelor antibioticelor asupra proceselor fiziologice ce au loc n


plante este nc limitat. Astfel, pentru a obine o perspectiv referitoare la aceste efecte negative i
pentru a identifica cele mai bune caracteristici pentru o evaluare rapid a toxicitii lor, n cadrul acestui
Subcapitol sunt prezentate influenele a nou antibiotice (AMOX, AMP, PENG, CFZ, CFX, TET, DOXI,
CIP i ERI, prezentate n Subcapitolele 4.1 i 5.1) de concentraii 0,5 mg L-1 i 1,5 mg L-1 asupra
parametrilor fotosintetici, compuilor organici volatili, pigmenilor asimilatori i asupra coninutului total
de flavonoide din plantele de gru (Triticum aestivum L. soiul Lovrin). Fotosinteza este considerat ca
fiind procesul biologic fundamental n creterea plantelor, asimilarea nutrienilor i care ofer rezisten
plantelor n condiii de stres biotic i abiotic. n general, se cunoate faptul c plantele emit compui
organici volatili n diferite condiii de stres biotic i abiotic (Loreto i Schnitzler, 2010; Niinemets, 2010).
n acest sens, n urma acestui studiu considerm c emisia de compui organici volatili este n strns
legtur cu stresul indus de antibiotice.

5.3.1. Plantele de gru (Triticum aestivum L.), condiiile de cretere i stresul abiotic indus de
antibiotice. Modul de lucru

Seminele de gru (Triticum aestivum L. soiul Lovrin, Fundulea, Romnia) au fost plantate n
recipiente din plastic (1 L, 10 10 10 cm), coninnd sol de grdin comercial care a fost fertilizat n
prealabil cu microelemente (Bioland, Finlanda). Plantele au fost crescute ntr-o camer special de
cretere numit fitotron (model Percival LT36VL, SUA), n condiii controlate de lumin (1000 mol m-2
s-1, timp de 12 ore) i temperatur (zi/noapte - 25/18 C).
Stresul abiotic la care au fost supuse plantele de gru a constat n udarea lor zilnic cu cte un
volum de 71 mL soluii apoase de antibiotice de concentraii 0,5 0,03 mg L-1 i 1,5 0,08 mg L-1. De
asemenea, au fost crescute i plante control (netratate cu antibiotice) care au fost udate cu acelai volum,

17
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

dar de ap distilat. Msurtorile experimentale au fost efectuate dup ce plantele au fost udate cu volume
totale de 0,5 L (dup o sptmn) i 1 L (dup dou sptmni) soluii de antibiotice (Opri et al.,
2012b).
n cazul nostru, dozele de antibiotice administrate plantelor de gru au fost mai sczute
comparativ cu cele utilizate n alte studii, dar au avut un timp de expunere mai ndelungat (Pan et al.,
2008; Xie et al., 2011). Astfel, aceste tratamente au o reflecie mai bun asupra rspunsului plantelor la
reziduurile de antibiotice ce se gsesc n mediul nconjurtor. Numeroase studii au demonstrat c
expunerea prelungit a unui numr de soluii de antibiotice de concentraii asemntoare cu cele utilizate
n cadrul acestui studiu, conduce la inhibarea semnificativ a creterii plantelor (Brain et al., 2004, 2005,
2008; Hillis et al., 2011; Liu et al., 2009; Pomati et al., 2004).

5.3.2. Influena antibioticelor asupra parametrilor fotosintetici ai plantelor de gru

Fotosinteza este considerat ca fiind cel mai amplu proces de sintez de pe suprafaa terestr. O
definiie general a fotosintezei ar fi c prin acest proces plantele verzi n prezena luminii preiau CO2 din
atmosfer i l transform n substane organice cu degajare de O2 (Dobrot, 2010). Astfel, n condiii de
stres, acest proces poate fi afectat, conducnd la o inhibare a dezvoltrii plantelor. n ceea ce privete
studiul efectelor antibioticelor asupra fotosintezei, s-a urmrit analiza a trei parametri fotosintetici: viteza
transportului de electroni (JETR - electron transport rate), conductana stomatal de vaporizare a apei (gs -
stomatal conductance to water vapor) i viteza net de asimilaie a CO2 (A - assimilation rate). Aceti trei
parametri sunt deosebit de importani n procesul de fotosintez. Transportul de electroni are rol n
formarea agentului reductor nicotinamid adenozin dinucleotid fosfat oxidaz (NADPH) i a
moleculelor energetice de adenozin trifosfat (ATP) care sunt utilizate n etapa de fixare i reducere a
CO2 (Dobrot, 2010). n plante, asimilaia de CO2 are loc concomitent cu eliminarea apei stomatale.

5.3.2.1. Determinarea parametrilor fotosintetici ai plantelor de gru. Modul de lucru

Determinarea parametrilor fotosintetici a fost realizat cu ajutorul unui sistem portabil schimbtor
de gaze GFS-3000 (Waltz, Germania). Acest sistem este prevzut cu o cuvet care are o fereastr cu aria
de 8 cm2 i posibilitatea iluminrii fluorimetrice a frunzei n vederea efecturii msurtorilor de
fluorescen clorofilian. Parametrii care au fost setai pentru efectuarea tuturor msurtorilor sunt: 385
mol mol-1 CO2, 1000 mol m-2 s-1 intensitate luminoas, temperatur 25C i 70% umiditate. Plantele au
fost introduse n cuvet astfel nct toat suprafaa ferestrei cuvetei s fie acoperit. Dup nchiderea
cuvetei, frunzele au fost supuse intensitii luminoase, iar ntr-un interval de timp de 20-30 min a avut loc
deschidere stomatei, obinndu-se valori stabile ale conductanei stomatale de vaporizare a apei i ale
vitezei nete de asimilaie a CO2. De asemenea, au fost nregistrate i valori ale fluorescenei iniiale (F -
fluorescence yield) i fluorescenei maxime (Fm - maximum fluorescence yield) obinute la intensitatea
luminoas de 4500 mol m-2 s-1, ntr-un timp de 1 s, necesare pentru calculul vitezei transportului de
electroni.
Valorile conductanei stomatale de vaporizare a apei i ale vitezei nete de asimilaie a CO2 au fost
calculate conform ecuaiilor propuse de ctre von Caemmerer i Farquhar (1981). Viteza transportului de
electroni a fost calculat din msurtorile de fluorescen clorofilian, conform ecuaiilor propuse de ctre
Genty et al. (1989). Pentru calculul acestui parametru a fost utilizat constanta de absorbie a frunzei de
0,85 i s-a presupus faptul c lumina a fost distribuit egal ntre cele dou fotosisteme (Niinemets et al,

18
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

2010a) PS I i PS II. n procesul de fotosintez este implicat interaciunea dintre dou reacii de lumin
PS I i PS II, care acioneaz n serie pentru a produce oxigenul molecular pentru formarea NADPH i
pentru sinteza de ATP (Bercea, 2008).

5.3.2.2. Rezultate i discuii privind influena antibioticelor asupra parametrilor fotosintetici ai


plantelor de gru

n Figura 5.12.a i b se observ o scdere a vitezei transportului de electroni, mai ales n cazul
concentraiei mari a soluiei de antibiotice (1,5 mg L-1) utilizate pentru udarea plantelor de gru.
Excepiile au fost doar n cazul tratamentelor cu CIP i ERI (Figura 5.12.b). Plantele de gru tratate cu
AMP nflueneaz negativ viteza transportului de electroni, acestea scznd n cazul ambelor concentraii
(0,5 mg L-1 i 1,5 mg L-1) de soluii de antibiotice utilizate pentru udarea plantelor (Figura 5.12.a i b)
(Opri et al., 2012b).
n general, n comparaie cu plantele control, cele mai mici valori ale vitezei transportului de
electroni (aproximativ cu 16% mai mici) au fost observate n cazul tratamentului cu antibioticul CFX la
concentraia de 1,5 mg L-1. Efectele antibioticelor din clasa penicilinelor i a tetraciclinelor asupra
valorilor vitezei transportului de electroni (Figura 5.12.a i b) sunt asociate cu scderea coninutului de
clorofile din plante (Figura 5.20). n cadrul acestui studiu, efectul antibioticului AMOX, la concentraia
cea mai mare, obinut asupra valorilor vitezei transportului de electroni este n concordan cu efectul de
inhibare a acestuia asupra PS II (Opri et al., 2012b). Acest aspect a fost constatat i de ctre ali
cercettori (Pan et al., 2008), dar la concentraii ale antibioticului AMOX relativ mai mari.
Valorile celui de-al doilea parametru fotosintetic analizat, conductana stomatal de vaporizare a
apei, au crescut n cazul tratamentelor n care au fost utilizate soluii de antibiotice de concentraie de 0,5
mg L-1 (Figura 5.12.c), cu excepia tratamentelor cu TET i ERI. n aceste ultime trei cazuri, plantele nu
au fost afectate la utilizarea a nici unuia dintre volumele de soluii de antibiotice utilizate (0,5 L i 1 L). n
cazul celei de a doua concentraii de soluii de antibiotice (1,5 mg L-1) din clasele cefalosporinelor (CFZ,
CFX) i tetraciclinelor (TET) (0,5 L i 1 L) utilizate, valorile conductanei stomatale de vaporizare a apei,
au sczut cu aproximativ 10-30% (Figura 5.12.d). De asemenea, au fost observate scderi ale
conductanei stomatale de vaporizare a apei i n cazul plantelor tratate cu tetraciclina DOXI i
fluorochinolona CIP, dar doar dup ce plantele au fost udate cu un volum de 1 L soluie de antibiotice
(Figura 5.12.d) (Opri et al., 2012b).
Valorile conductanei stomatale de vaporizare a apei fluctueaz n cazul anumitor antibiotice luate
n studiu (la concentraia de 0,5 mg L-1 soluii de antibiotice). n cazul tratamentului cu antibioticul AMP,
acest efect este asociat cu coninutul de zeaxantin (Figura 5.21) care se presupune a fi un precursor n
sinteza acidului abscisic (ABA), hormon responsabil pentru nchiderea stomatei (Milborrow, 2001). ABA
este un reglator de baz al rspunsului plantelor la factorii de stres, cretere i dezvoltare (Delian, 2006).
Cu toate acestea, doar o mic parte din carotenoide sunt implicate n sinteza ABA, iar modificrile n
coninutul de pigmeni carotenoizi nu poate fi asociat cu reducerea conductanei stomatale de vaporizare a
apei, la concentraia cea mai mare de soluii de antibiotice utilizate n acest experiment.

19
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

-1 -1
0,5 mg L 1,5 mg L
180 a b 0,5 L
1L
150

JETR (mol m s )
** * ** **

-1
** * *

-2
120

90

60

30

0
,
c *
500 *
**
*
* d
* * *
*
gs (mmol m s )

400 *
-1
-2

300 ** ** *

200

100

0
,,,,,,,,,, ,, ..
30
e f
25
A (mol m s )
-1

20 *
* ** **
-2

*
15

10

0
X

G
AM rol

PE P

FX

XI
IP

I
FZ

DO T

X
PE P

FX

P
G

XI

I
FZ

DO T
AM rol
ER

ER
TE
O
AM

TE
AM
N

CI
N
C
t

nt
C

C
C
on

Co
C

Figura 5.12. Modificri ale vitezei transportului de electroni (JETR, mol m-2 s-1) (a i b), ale conductanei
stomatale de vaporizare a apei (gs, mmol m-2 s-1) (c i d) i ale vitezei nete de asimilaie a CO2 (A, mol
m-2 s-1) (e i f) n plantele de Triticum aestivum L. soiul Lovrin tratate cu soluiile a nou antibiotice de
concentraii diferite 0,5 mg L-1 (a, c i e) i 1,5 mg L-1 (b, d i f). Msurtorile au fost efectuate dup ce
plantele au fost udate cu volume totale de soluii de antibiotice de 0,5 L (dup o sptmn) i 1 L (dup
dou sptmni). Fiecare coloan reprezint media (SE) a trei msurtori independente cu plante diferite
crescute n aceleai condiii. Simbolul * reprezint diferene semnificative din punct de vedere statistic
ntre o plant tratat cu antibiotic i o plant control (P < 0,05).

De asemenea, au fost observate scderi ale valorilor vitezei nete de asimilaie a CO2 n cazul
tratamentelor n care au fost utilizate soluii de antibiotice din clasa cefalosporinelor (CFX) i
fluorochinolonelor (CIP), de concentraie de 0,5 mg L-1. Acest efect a fost observat doar dup ce plantele
au fost udate cu un volum total de 1 L soluie de antibiotice (Figura 5.12.e). Utilizarea soluiilor de
antibiotice de concentraie mai mare (1,5 mg L-1) a condus la scderi mai pronunate ale valorilor vitezei
nete de asimilaie a CO2, chiar i la volumul de 0,5 L soluie de antibiotice utilizat. Aceste scderi au fost
observate tot n cazul tratrii plantelor cu soluii de antibiotice din clasa cefalosporinelor (Figura 5.12.f).
Efectul antibioticului CIP asupra plantelor a fost mai evident dup ce plantele au fost udate cu un
volum de 1 L de soluie (Figura 5.12.f) (Opri et al., 2012b). Efectele cauzate de antibioticul CIP sunt n

20
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

concordan cu studiul lui Aristilde et al. (2010) care demonstreaz c stuctura antibioticului CIP este
similar cu cea a inhibitorilor care au rol oxidativ n PS II. Scderea valorilor vitezei nete de asimilaie a
CO2 n plantele tratate cu antibioticele din clasa cefalosporinelor pot avea aceeai explicaie, inhibarea
activitii catalitice ale PS II putnd fi asociat cu gruparea NH2 din structura cefalosporinelor (Opri et
al., 2012b).
Scderea valorilor vitezei nete de asimilaie a CO2 n cazul tratamentelor cu soluii de antibiotice
de concentraie 1,5 mg L-1 este asociat cu scderea valorilor conductanei stomatale de vaporizare a apei
(Figura 5.12.d) i cu modificri nesemnificative din punct de vedere statistic n cazul vitezei transportului
de electroni, pentru tratamentele cu antibioticele CFZ i CIP (Figura 5.12.b). Astfel, cel puin pentru
aceste dou tratamente, reducerea intensitii fotosintezei nu a fost asociat cu inhibarea activitii PS II,
ci mai degrab reflect viteza de asimilaie a CO2 n frunze (Opri et al., 2012b). Acelai comportament a
fost observat pentru o varietate de plante de gru ca rspuns la un tratament cu 80 M oxitetraciclin (Li
et al., 2011).
n general, scderea valorilor vitezei nete de asimilaie a CO2 a fost moderat (au sczut cu 10-
17% comparativ cu plantele de gru utilizate drept control). Aceste efecte au crescut cu creterea dozei de
antibiotic administrate plantelor de gru (Opri et al., 2012b).

5.3.3. Emisiile de compui organici volatili din plantele de gru tratate cu antibiotice

O gam foarte variat de compui organici volatili (VOC - volatile organic compounds) este
emis de plantele care sunt supuse unor varieti de stres de natur biotic sau abiotic (Copolovici et al.,
2012). De aceea, pentru a obine o perspectiv ct mai complet referitoare la efectele antibioticelor
asupra plantelor, au fost analizate i emisiile de VOC. n cadrul studiului nostru, dintre VOC emii de
plantele de gru au fost analizai produii de oxidare sub aciunea lipoxigenazei (LOX - lipoxygenase
pathway products) i monoterpenele. Produii LOX sunt formai n urma oxidrii acizilor grai din plante,
sub aciunea enzimei lipoxigenaz. Cantitatea emisiilor de LOX este n concordan cu rspunsul plantei
la o varitate de condiii de stres i constituie primul rspuns al plantei n condiii de stres (Liavonchanka i
Fuessner, 2006). Monoterpenele sunt compui ai metabolismului secundar din plante, sunt insolubile n
ap i deriv din acetil coenzima A sau ali intermediari ai glicolizei. Multe dintre monoterpene i
derivaii lor sunt foarte importani ageni toxici mpotriva insectelor (Dobrot, 2005). Grul, n condiii
normale nu este considerat un emitor de monoterpene. Cu toate acestea, emisiile de monoterpene sunt
de obicei induse de rspunsul stresului biotic sau abiotic, la fel ca n cazul produilor LOX care sunt emii
de cele mai multe specii de plante (Copolovici et al., 2012; Niinemets, 2010; Niinemets et al., 2010b,
2010c).

5.3.3.1. Captarea i analiza compuilor organici volatili emii de plantele de gru. Modul de lucru

Prelevarea de VOC a fost realizat utiliznd acelai sistem portabil ca i n cazul msurtorilor
parametrilor fotosintetici. Dup ce au fost obinute valori stabile ale parametrilor fotosintetici, din cuveta
aparatului, un volum de aer de 3 L a fost prelevat n cartue de oel (10,5 3 cm, Supelco, SUA) cu
coninut de crbune activ numit strat adsorbant Carbopack (C 20/40 mesh, C 40/60 mesh, and X 20/40
mesh) optimizat pentru analiza cantitativ a LOX i a monoterpenelor (Copolovici et al., 2009, 2011;
Niinemets et al., 2010a). Aerul a fost prelevat cu ajutorul unei pompe 1003-SKC (SKC Inc., SUA) cu un
debit de 200 mL min-1 ntr-un timp de 15 min, la temperatura camerei. nainte i dup captarea de VOC

21
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

emii de plantele de gru tratate cu antibiotice, au fost prelevate i probe de aer control, din cuveta
sistemului schimbtor de gaze n care nu s-a introdus plant de gru.
Pentru analiza VOC a fost utilizat un sistem alctuit dintr-un dispozitiv prevzut cu termo-
desorbie (Shimadzu TD20, Japonia) i un cromatograf de gaze cuplat cu spectrometru de mas
(Shimadzu QP2010 Plus GC-MS, Japonia). Metoda utilizat pentru analiza de VOC a fost conform unei
metode descrise detaliat de ctre Copolovici et al. (2009) i Toome et al. (2010). Compuii analizai au
fost identificai comparnd spectrele de mas ale compuilor individuali cu spectrele standardelor
analizate (de puritate GC, Sigma-Aldrich, SUA) i cu spectrele de mas din baza de date NIST de spectre.
De asemenea, identificarea compuilor a fost realizat i pe baza timpilor de retenie.
n cadrul acestui studiu au fost determinate vitezele de emisie ale compuilor lipoxigenai (LOX),
nsumnd vitezele de emisie pentru 1-hexanol, (Z)-3-hexenol, (Z)-2-hexenal i (Z)-3-hexenil acetat. A
doua categorie de VOC analizat a fost monoterpenele. Datele experimentale obinute din analiza
monoterpenelor au fost interpretate ca vitez de emisie a monoterpenelor (MONOTERPENE), nsumnd
vitezele de emisie pentru -pinen, -pinen, camfen, limonen, 3-caren, p-cimen i -felandren (Opri et al.,
2012b).

5.3.3.2. Rezultate i discuii privind emisiile de compui organici volatili din plantele de gru tratate
cu antibiotice

Att vitezele de emisie ale compuilor lipoxigenai (LOX) ct i vitezele de emisie ale
monoterpenelor (MONOTERPENE) au fost foarte sczute n cazul plantelor control. Aceast scdere se poate
observa n Figura 5.16 (reprezentarea grafic a vitezelor de emisie a VOC analizai n cadrul acestui
studiu). Creterea de LOX a fost observat chiar i la concentraia de 0,5 mg L-1, 1 L soluie de AMP,
PENG, CFX, DOXI i CIP (Figura 5.16.a). La o concentraie mai mare de soluie de antibiotice utilizat
pentru udarea plantelor 1,5 mg L-1 i volum de 1 L, LOX a crescut n cazul tuturor tratamentelor cu
antibiotice, mai puin n cazul tratamentului cu AMP (Figura 5.16.b). De asemenea, n acest caz,
comparativ cu plantele control, LOX a crescut de patru ori mai mult. n general, fcnd o comparaie ntre
cele dou concentraii de soluii de antibiotice utilizate la udarea plantelor, LOX a crescut cu peste 100%
n cazul concentraiei de 1,5 mg L-1, dect n cazul concentraiei de 0,5 mg L-1. Plantele care au fost tratate
cu antibioticele AMP i CIP au fcut excepie de la aceast constatare general (Opri et al., 2012b).
n cazul tuturor celor nou antibiotice utilizate pentru tratamentul plantelor de gru a fost
observat o cretere a LOX care este dependent de creterea concentraiei soluiilor de antibiotice i de
volumul utilizat pentru udarea plantelor de gru (Figura 5.16.a i b). Concordane semnificative ntre
LOX i severitatea stresului au fost demonstrate pentru alte tipuri de stres indus plantelor: ozonul
(Beauchamp et al., 2005), temperatura (Copolovici et al., 2012) i excesul de ap (Copolovici i
Niinemets, 2010). Din studiul de fa, se poate concluziona faptul c LOX constituie un indicator sensibil
al rspunsului plantelor la condiii de stres induse de antibiotice.
MONOTERPENE a crescut n cazul ambelor concentraii de soluii de antibiotice utilizate n cadrul
acestui studiu (Figura 5.16.c i d). n general, aceste efecte au fost mai pronunate n cazul n care a fost
utilizat pentru udarea plantelor un volum de 1 L, dect n cazul unui volum de 0,5 L de soluii de
antibiotice. Diferene semnificative din punct de vedere statistic nu au fost observate ntre concentraiile
soluiilor de antibiotice utilizate, dect doar n cazul plantelor tratate cu ERI (Figura 5.16.c i d) (Opri et
al., 2012b).

22
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

-1 -1
0,5 mg L 1,5 mg L
1,2
a 0,5 L b #
&
#
#
1L * #
&
* &
*

LOX (nmol m s )
-1
&
0,9 & *
# *
-2
& &
* & *
* *
#
0,6
* * &
#
* * & *
*
#
0,3 *

0,0

c # d #
MONOTERPENE (nmol m s )

1,6
-1

* *
-2

&
# # *
1,2 * *
** **
* *
* # *
0,8 * ** * * *
* * * * *
*
* * *
*
0,4

0,0

XI
AM rol
X
PE P
G

FX

IP
FZ

D T

I
Z

XI

I
X
PE P
G

FX

P
AM rol

DO T

ER
ER

TE
O
AM
TE
CF

N
AM

CI
O

C
O
t

C
C
nt

on
C
Co

Figura 5.16. Vitezele de emisie ale produilor de oxidare sub aciunea lipoxigenazei (LOX, nmol m-2 s-1)
(a i b) i ale monoterpenelor (MONOTERPENE, nmol m-2 s-1) (c i d) din plantele de Triticum aestivum L.
soiul Lovrin tratate cu soluiile a nou antibiotice. Msurtorile au fost efectuate dup ce plantele au
fost udate cu diferite volume de soluii de antibiotice 0,5 L i 1 L de concentraii 0,5 mg L-1 (a i c) i 1,5
mg L-1 (b i d). LOX reprezint suma vitezelor de emisie pentru 1-hexanol, (Z)-3-hexenol, (Z)-2-hexenal
i (Z)-3-hexenil acetat, iar MONOTERPENE reprezint suma vitezelor de emisie pentru -pinen, -pinen,
camfen, limonen, 3-caren, p-cimen i -felandren. Fiecare coloan reprezint media (SE) a trei
msurtori independente cu plante diferite crescute n aceleai condiii, iar simbolurile situate deasupra
coloanelor reprezint diferene semnificative din punct de vedere statistic (P < 0,05). * - diferene
statistice ntre o plant tratat cu antibiotic i o plant control, # - diferene statistice ntre volumele de
soluii de antibiotice (0,5 L i 1 L) de aceeai concentraie (0,5 mg L-1 sau 1,5 mg L-1) utilizate pentru
udarea plantelor, & - diferene statistice ntre dou concentraii ale aceluiai antibiotic (0,5 mg L-1 i 1,5
mg L-1) pentru acelai volum de soluie (0,5 L sau 1 L) utilizat pentru udarea plantelor.

Cele mai mari cantiti de monoterpene au fost emise de plantele tratate cu soluii de TET i
DOXI (Figura 5.16.c i d) i au fost asociate cu scderea cantitii de carotenoide (Figurile 5.21.c i
5.22.d) (Opri et al., 2012b). n cazul plantelor tratate cu TET exist posibilitatea de activare sau
dezactivare a unor gene, procese ce au loc oricnd n timpul anumitor infecii patogene a plantelor
(Zarnack et al., 2006).

5.3.4. Influena antibioticelor asupra pigmenilor asimilatori din plantele de gru

n studiul nostru, pigmenii asimilatori care au fost determinai din plantele de gru, fac parte din
categoria pigmenilor clorofilieni (clorofila a i clorofila b) i a celor carotenoizi (-caroten, zeaxantina,
luteina, neoxantina i violaxantina). Pigmenii zeaxantin, lutein, neoxantin i violaxantin sunt

23
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

carotenoide sub form de xantofile, pigmeni n care radicalii liberi ai lanului de carbon sunt reprezentai
de grupri hidroxil -OH (Dobrot, 2010).
Clorofilele au rol deosebit de important n absorbia luminii, n procesul de fotosintez. Clorofila
a se gsete n toate plantele verzi care prin fotosintez elimin O2, iar clorofila b nsoete clorofila a n
toate plantele superioare, alge verzi i flagelate (Dobrot, 2010).
Pigmenii carotenoizi din plante sunt antioxidani lipo-solubili (Havaux, 1998; Havaux et al.,
1998), iar rolul lor fotoprotector poate fi privit ca o valv de siguran ce permite disiparea energiei n
exces nainte de apariia daunelor la nivelul celulei (Dobrot, 2010). Carotenoidele din plantele supuse
unor condiii severe de stres sunt foarte rapid distruse i ca urmare nu mai au rol de protecie mpotriva
distrugerii prin oxidare (Munn-Bosch i Alegre, 2000).

5.3.4.1. Extracia i analiza pigmenilor asimilatori din plantele de gru. Modul de lucru

Pentru determinarea coninutului de pigmeni clorofilieni i carotenoizi din plantele de gru au


fost luate probe de frunze cu aria total de 4 cm2, imediat dup ce au fost efectuate msurtorile
parametrilor fotosintetici i apoi au fost ngheate imediat n azot lichid. Pigmenii au fost extrai n 100%
aceton cu carbonat de calciu (ambele achiziionate de la Sigma-Aldrich, Germania). Suspensiile astfel
obinute au fost mojarate i apoi centrifugate cu ajutorul dispozitivului Hettch 320 R Universal (Hettich
GmbH, Germania) la 0C i 9500 g, timp de 3 min. Supernatantul a fost decantat, iar aceste etape ale
extraciei au fost repetate de cel puin trei ori, n cantiti foarte mici de aceton, pn cnd supernatantul
a rmas incolor. Extractele au fost aduse ntr-un volum final de 1 mL aceton i apoi filtrate cu ajutorul
unor filtre de teflon (0,45 m, VWR International, SUA) (Opri et al., 2012b).
Extractele astfel obinute au fost analizate cu ajutorul unui cromatograf de lichide de nalt
performan (HPLC, Agilent Technologies 1200, SUA) prevzut cu detector cu serie fotodiode cu baleiaj
complet (DAD). Metoda care a fost utilizat este o metod puin modificat fa de metoda descris de
ctre Niinemets et al. (1998), n cazul nostru fiind utilizat o coloan cu faz invers Zorbax Eclipse
XDB-C18 (4,6 150 mm, 5 m, Agilent Technologies, SUA). Temperatura coloanei de separare a fost
meninut la 10C, iar debitul fazei mobile a fost de 1,5 ml min-1. Faza mobil utilizat pentru eluia
cromatografic a fost compus din ap ultrapur cu HEPES [acid 4-(2-hidroxietil)-1-
piperazinetansulfonic] 0,1 M, pH 8 (A) i aceton (B) de puritate HPLC, ambele fiind achiziionate de la
Sigma-Aldrich (Germania). Programul de gradient utilizat pentru separarea pigmenilor asimilatori a fost:
7,5 min 25% A i 75% B, 5 min 0% A i 100% B, raport de solveni care a fost meninut timp de 3 min.
Etapa urmtoare a constat n revenirea la compoziia iniial a fazei mobile 25% A i 75% B n 2 min.
Calibrarea a fost realizat utiliznd pigmeni comerciali: clorofila a, clorofila b i -caroten care au fost
achiziionai de la Sigma-Aldrich (Germania), iar zeaxantina i luteina de la Fluka (Germania).
Unii cercettori (Niinemtes et al., 1998; Pocock et al., 2004; Polle et al., 2001) au obinut
referinele (standardele) pigmenilor de interes prin extracia lor din plante sau alge urmat de o purificare
pe plci cromatografice TLC. Dup separare, compuii de interes sunt reluai de pe plcile TLC n diferii
solveni, iar concentraia lor este determinat din calculul coeficientului de extincie, din msurtori
spectrofotometrice. n cazul nostru, pigmenii carotenoizi neoxantin i violaxantin au fost extrai din
frunze proaspete de Primula vulgaris L. care au fost mrunite cu azot lichid. Aceti doi pigmeni au fost
extrai n etanol 100% (Sigma-Aldrich, Germania). Separarea lor a fost realizat cu ajutorul tehnicii
cromatografice prin utilizarea de plci TLC preparative de silicagel (20 20, 500 m, Analtech, SUA).

24
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

Spotarea extractelor pe plcile TLC a fost realizat n band cu ajutorul unei microseringi Hamilton
model 705 RN SYR (50 L, Germania). Developarea plcilor TLC a fost realizat cu un amestec de
solvent care a fost compus din 400 mL eter de petrol (Sigma-Aldrich, Germania), 44 mL 2-propanol
(Romil Ltd.,UK) i 20 L ap ultrapur (aceeai componeni ai fazei mobile utilizai ca n cazul studiului
realizat de ctre Pocock et al., 2004, dar n raport diferit). Plcile TLC au fost developate ntr-o camer de
developare ntr-un timp de 15 min, iar distana de migrare a fazei mobile a fost de aproximativ 10 cm.
Uscarea plcilor developate a fost realizat la temperatura camerei. Placa cromatografic TLC obinut n
urma separrii pigmenilor de interes este prezentat n Figura 5.18.

Figura 5.18. Placa cromatografic TLC obinut


la separarea pigmenilor asimilatori extrai din
frunze de Primula vulgaris L. Poziiile A-F
reprezint spotarea n band a extractelor obinute,
iar poziiile 1-6 pigmenii: 1-neoxantina, 2-
violaxantina, 3-luteina, 4-clorofil b, 5-clorofil a
i 6--caroten.

Cu metoda TLC prezentat anterior, pe lng separarea pigmenilor neoxantin i violaxantin, au


fost separai i pigmenii lutein, clorofil b, clorofil a i -caroten, acetia din urm nefiind purificai i
cuantificai astfel, deoarece au fost folosite standarde comerciale. Reluarea pigmenilor violaxantin i
neoxantin de pe plcile TLC a fost realizat n 100% aceton, iar concentraia lor a fost calculat din
msurtorile spectrofotometrice utiliznd lungimi de und corespunztoare coeficienilor de extincie
pentru carotenoide (Davies, 1976). Pentru determinrile cantitative ulterioare ale neoxantinei i
violaxantinei din plantele de gru tratate cu antibiotice, referinele astfel obinute au fost analizate cu
sistemul HPLC-DAD obinnd un semnal corespunztor concentraiei obinute din calculele coeficienilor
de extincie, din msurtorile spectrofotometrice.
Din analiza HPLC-DAD a pigmenilor de interes, picurile au prezentat o intensitate maxim a
semnalului la urmtoarele lungimi de und: 430 nm pentru clorofila a, 450 nm pentru neoxantin i
violaxantin i 455 nm pentru restul pigmenilor, clorofil b, -caroten, zeaxantin i lutein (Opri et al.,
2012b).

5.3.4.2. Rezultate i discuii privind influena antibioticelor asupra pigmenilor asimilatori din
plantele de gru

Separarea tuturor pigmenilor asimilatori de interes a fost realizat ntr-un timp maxim de 19 min.
La concentraia de 0,5 mg L-1 (0,5 L i 1 L) coninutul total de clorofil a sczut doar n cazul
tratamentului cu CFX, iar n cazul tratamentului cu CIP doar dup un volum de 1 L soluie de antibiotic
(Figura 5.20.a). Tratamentele cu 1,5 mg L-1 soluie de antibiotice AMOX, TET DOXI, CIP i ERI au
redus coninutul total de clorofile (Figura 5.20.b). Efectele tratamentelor cu antibiotice au fost similare
pentru clorofila a i b, n special la tratamentele n care a fost utilizat concentraia de 1,5 mg L-1 (Figura
5.20.c i d). Raportul dintre clorofile (clorofila a/b) a fost crescut pentru tratamentele cu AMOX, CFX

25
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

(0,5 mg L-1, 0,5 L) i CFX (0,5 mg L-1, 1L), dar redus pentru tratamentul cu CIP (0,5 mg L-1, 1 L, vezi
Figura 5.20.c) (Opri et al., 2012b).

-1 -1
0,5 mg L 1,5 mg L
600
a #
b 0,5 L
Clorofila a +b (mg m ) 1L
-2

** &
* &*&*&*
* &
400 * *&* *
& &
*

200

0
5
c * * * d
4
Clorofila a /b

3 *

0
X

IP
AM rol

PE P

FX
FZ

D T
XI

I
AM rol
X
PE P
G

FX

IP
XI

I
FZ

D T

ER
ER

TE
TE

AM
O
O
AM

N
N

O
C
O
C

t
t

C
C

C
C

on
on

C
C

Figura 5.20. Modificri ale coninutului total de clorofile a+b (mg m-2) (a i b) i raportului acestora a/b
(c i d) n plantele de Triticum aestivum L. soiul Lovrin tratate cu nou antibiotice. Msurtorile au fost
efectuate dup ce plantele au fost udate cu diferite volume de soluii de antibiotice 0,5 L i 1 L de
concentraii 0,5 mg L-1 (a i c) i 1,5 mg L-1 (b i d). Semnificaia statistic este aceeai ca n legenda
Figurii 5.16.

n general, scderea coninutului de clorofile este dat de rspunsul plantelor la condiiile de stres,
fapt ce conduce la reducerea absorbiei luminii (Munn-Bosch i Alegre, 2000). n cazul nostru efectele
antibioticelor TET, CIP i ERI au fost mai pronunate la concentraia cea mai mare de soluie de
antibiotice utilizat pentru udarea plantelor de gru. Acest lucru este n concordan cu reducerea
coninutului de clorofil demonstrat de ctre Li et al. (2011), n cazul plantelor de gru tratate cu
oxitetraciclin i de asemenea, cu inhibarea sintezei clorofiliene n cazul plantelor tratate cu antibioticul
TET (Bradel et al., 2000). Brain et al. (2004) au ajuns la concluzia c din cele 25 de antibiotice studiate,
tetraciclinele au avut cea mai mare influen asupra coninutului de clorofil din plantele acvatice precum
sunt Lemna gibba L.
Referitor la studiul nostru, n cele mai multe dintre cazuri o parte din peniciline i cefalosporine
reduc coninutul de clorofile din plante (Figura 5.20) (Opri et al., 2012b). Acest fenomen poate fi asociat
cu anumite efecte ce au loc asupra multiplicrii cloroplastelor. O explicaie mult mai adecvat n cazul de
fa este faptul c antibioticele utilizate n acest studiu afecteaz anumite procese ce au loc n fotosintez
(vezi Subcapitolul 5.3.2), rezultnd condiii fotoinhibitoare care reduc seciunea transversal a PS II
(Osmond et al., 1999).
De asemenea, raportul de clorofil a/b ce caracterizeaz distribuia pigmenilor ntre centrii de
reacie i complecii responsabili pentru absorbia luminii (Bassi i Caffari, 2000), crete destul de mult
pentru plantele tratate cu o parte din peniciline i cefalosporine (Figura 5.20.c). Acest lucru sugereaz

26
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

reducerea complecilor responsabili pentru absorbia luminii a PS II, n comparaie cu centrii de reacie.
Valorile normale ale raportului clorofila a/b sunt cuprinse ntre 2,5-3,5 (Bercea, 2008). A fost observat c
n cazul plantelor tratate cu CIP, raportul clorofil a/b a sczut (Figura 5.20.c), ceea ce demonstreaz c
acest antibiotic are efect foarte puternic asupra numrului centrilor de reacie. n general scderea
coninutului de carotenoide datorit stresului indus de antibiotice este direct proporional cu modificrile
ce au loc n coninutul de clorofile, cu precdere n cazul tratamentelor cu TET, DOXI, CIP i ERI la
concentraia de 1,5 mg L-1 (Figurile 5.20.b i 5.21.c) (Opri et al., 2012b).
Coninutul de pigmeni carotenoizi (luteina, zeaxantina i -caroten) din plante nu a fost afectat la
concentraia de 0,5 mg L-1, 0,5 L soluie de antibiotice (Figura 5.21.a). Dup udarea plantelor cu 1 L de
soluii de antibiotice, a fost observat o scdere a coninutului de zeaxantin i -caroten pentru plantele
tratate cu CIP i de asemenea o scdere a coninutului de zeaxantin pentru plantele tratate cu AMP
(Figura 5.21.b) (Opri et al., 2012b).

-1 -1
0,5 mg L (0,5 L) 1,5 mg L (0,5 L)
60
a c Zeaxantina
50 Luteina
Carotenoide (mg m )
-2

-caroten
40 &
* *
* &
*
30 *

20 * &
* &
& *
10
* * * ** *

0
-1 -1
0,5 mg L (1 L) 1,5 mg L (1 L)
60
b d
50
Carotenoide (mg m )
-2

40

30 *
&
* *
20
* * * * * *
10

0
X
P

FX
G
AM rol

FZ

XI

I
IP
D T

ER

X
PE P

IP
NG

XI

I
Z

DO T
AM rol

ER
TE
O
AM

TE
CF
O
C

CF
AM
t

C
C
on

nt
PE

Co
C

Figura 5.21. Modificri ale coninutului de zeaxantin, lutein i -caroten (mg m-2) n plantele de
Triticum aestivum L. soiul Lovrin la rspunsul tratamentelor cu nou antibiotice dup ce acestea au fost
udate cu volume totale de 0,5 L i 1 L soluie de antibiotice de concentraii 0,5 mg L-1 (a i b) i 1,5 mg L-
1
(c i d). Semnificaia statistic este aceeai ca n legenda Figurii 5.16.

La cea de a doua concentraie de soluii de antibiotice (1,5 mg L-1) utilizate n cadrul acestui
studiu, coninutul de zeaxantin a sczut n aproape toate tratamentele, att la volumul de soluie de
antibiotice de 0,5 L ct i la volumul de 1 L, cu excepia tratamentului cu AMOX (Figura 5.21.c i d). -
carotenul i luteina au fost influenate doar n cazul anumitor tratamente cu antibiotice, iar n cazul
plantelor tratate cu peniciline i cefalosporine nu a fost observat nici o influen semnificativ din punct
de vedere statistic (Opri et al., 2012b).

27
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

Totui scderi semnificative n coninutul de zeaxantin au fost observate n cazul tratamentelor


cu AMP (Figura 5.21.b i d), PENG i CFX, CFZ (Figura 5.21.c) (Opri et al., 2012). Spre deosebire de
-caroten i lutein, o cantitate important de zeaxantin poate fi prezent n membranele tilacoide i de
asemenea n membranele ne-fotosintetice (Havaux i Niyogi, 1999; Mller-Moul et al., 2003). Formarea
zeaxantinei este corelat cu disiparea excesului de energie absorbit sub form de cldur, cu de-
epoxidarea ciclului xantofilic i cu atenuarea fluorescenei clorofiliene ne-fotochimice (Demmig-Adams
i Adams, 2006; Munn-Bosch i Alegre, 2000). Astfel, reducerea coninutului de zeaxantin poate
conduce la reducerea capacitii de disipare a energiei n exces, fapt care poate fi o explicaie mecanic
pentru reducerea vitezei transportului de electroni n cazul plantelor tratate cu antibioticele luate n studiu
(Figura 5.12.a i b) (Opri et al., 2012b).
n Figura 5.22 sunt prezentate cantitile de neoxantin i violaxantin care au fost determinate n
cadrul acestui studiu. Scderi semnificative din punct de vedere statistic au fost observate chiar i la
concentraia de 0,5 mg L-1, 0,5 L, dar n cazul violaxantinei.

-1 -1
0,5 mg L (0,5 L) 1,5 mg L (0,5 L)
c Neoxantina
a * *
Carotenoide (mg m )

Violaxantina
-2

30

20 * *
*

*
10 * *
* * * * * *
* *

0
-1 -1
0,5 mg L (1 L) 1,5 mg L (1 L)
b d
Carotenoide (mg m )
-2

30

*
20 *
* *

10
*
* * *
0
G

IP
XI

I
FZ

D T
AM rol
X
PE P

FX

X
PE P

FX

IP
NG
FZ

D T
XI

I
AM rol
ER

ER
TE
O
AM

TE
AM
O
N

C
O

C
O
t

t
C

C
C

C
on

on
C

Figura 5.22. Modificri ale coninutului de neoxantin i violaxantin (mg m-2) n plantele de Triticum
aestivum L. soiul Lovrin la rspunsul tratamentelor cu nou antibiotice dup ce acestea au fost udate cu
volume totale de 0,5 L i 1 L soluie de antibiotice de concentraii 0,5 mg L-1 (a i b) i 1,5 mg L-1 (c i d).
Semnificaia statistic este aceeai ca n legenda Figurii 5.16.

Aceste scderi au fost observate la plantele de gru care au fost tratate cu antibioticele din clasa
cefalosporinelor (CFX) i a tetraciclinelor (TET) (Figura 5.22.a). n cazul tratamentului cu CFX, aceast
scdere a coninutului de violaxantin a fost observat i dup ce plantele au fost udate cu un volum mai
mare de soluie de antibiotic (1L, Figura 5.22.b). Cel mai mic coninut de violaxantin care a fost obinut
la concentraia de 0,5 mg L-1, 1 L, a fost n cazul antibioticului CIP (15,32 mg m-2). La cea de a doua
concentraie de soluie de antibiotice utilizat pentru udarea plantelor (1,5 mg L-1), a fost observat c
odat cu creterea volumului de soluie de antibiotice utilizat pentru udarea plantelor, coninutul de

28
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

violaxantin scade (Figura 5.22.c i d). Astfel, fa de control, cel mai mic coninut al violaxantinei a fost
obinut n cazul tratamentului cu TET (14,11 mg m-2, Figura 5.22.d). n ceea ce privete coninutul de
neoxantin, acesta a variat n cele mai multe dintre cazuri, dar scderi semnificative din punct de vedere
statistic au fost obinute n cazul tratamentelor cu TET, CIP i ERI (Figura 5.22.d). Coninutul de
neoxantin i violaxantin scade cu creterea concentraiilor i volumelor de soluii de antibiotice utilizate
pentru udarea plantelor de gru.

5.3.5. Influena antibioticelor asupra coninutului total de flavonoide din plantele de gru

Flavonoidele sunt compui fenolici formai n ciclul acidului ikimic care are loc n cloroplaste.
Aceast clas de compui are rol de protecie mpotriva multiplelor condiii de stres biotic i abiotic
(Samanta et al., 2011). De aceea n cadrul studiului evalurii efectelor antibioticelor asupra plantelor, pe
lng analiza parametrilor fotosintetici, a compuilor organici volatili i a pigmenilor asimilatori, a fost
analizat i coninutul total de flavonoide din plantele de gru Triticum aestivum L.

5.3.5.1. Optimizarea metodei de extracie i analiza coninutului total de flavonoide din plantele de
gru. Modul de lucru

Prima etap efectuat n cadrul determinrii coninutului total de flavonoide din plante, a fost
optimizarea metodei de extracie. nainte de aplicarea metodei de extracie pe plantele de gru tratate cu
cele nou antibiotice luate n studiu, au fost realizate teste de extracie care au fost aplicate doar pe plante
de gru control. Acestea au fost crescute la temperatura camerei (22C), iar sursa de lumin a fost lumina
natural. Astfel, n vederea extraciei flavonoidelor totale din plante de gru control, au fost testate trei
tehnici de extracie: prin macerare, cu ultrasunete i cu microunde (Soran et al., 2012). n cazul fiecrei
tehnici de extracie utilizate pentru extracia flavonoidelor totale din plantele de gru au fost utilizate mai
multe rapoarte de solvent de extracie etanol : ap (v/v), dup cum urmeaz: A (100 : 0), B (80 : 20), C
(70 : 30), D (60 : 40), E (50 : 50) i F (40 : 60).
Cantitatea total de flavonoide din extractele astfel obinute a fost determinat spectrofotometric
(spectrofotometru UV-Vis 1800, Shimadzu, Japonia) cu clorur de aluminiu (AlCl3), la lungimea de und
de 420 nm i exprimat n cantitate de rutin (Farmacopeea Romn, 1993). Fcnd o comparaie ntre cele
trei tehnici testate pentru extracia flavonoidelor totale din plantele de gru (Figura 5.26) se observ c
cea mai mare cantitate de flavonoide totale extras din plantele de gru a fost obinut, n urma utilizrii
tehnicii cu ultrasunete (Soran et al., 2012; Opri et al., 2011).

0,08 Macerare
E (50 : 50)
0,06 Ultrasunete
B (80 : 20) Figura 5.26. Spectrele UV-Vis ale extractelor de
Absorbanta

Microunde
0,04
C (70 : 30)
flavonoide totale din plantele de gru, obinute cu
cele mai potrivite rapoarte de solvent de extraie
0,02
etanol : ap, v/v, corespunztoare celor trei tehnici
0,00 de extracie testate.
300 360 420 480 540
Lungimea de unda (nm)

29
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

Aceast tehnic, spre deosebire de tehnicile prin macerare i cu microunde, este mult mai rapid,
are o aplicabilitate mult mai simpl i nu este costisitoare. n urma stabilirii celei mai bune tehnici de
extracie a i a celui mai bun raport de solvent de extracie pentru extracia flavonoidelor totale din
plantele de gru (tehnica de extracie cu ultrasunete, raport solvent de extracie etanol : ap, 80 : 20, v/v),
au fost realizate studii privind influena celor nou antibiotice luate n studiu asupra plantelor de gru.

5.3.5.2. Rezultate i discuii privind influena antibioticelor asupra coninutului total de flavonoide
din plantele de gru

Creterea coninutului de flavonoide n plante este cauzat de prezena permanent a unui factor
de stres exterior precum sunt refrigerarea (Havaux i Kloppstech, 2001), radiaiile ultra-violete (Lavola,
1998) i vizibile (Havaux i Kloppstech, 2001) foarte puternice. Rolul coninutului de flavonoide mult
prea crescut n plantele supuse unor factori de stres nc nu este complet neles, dar a fost demonstrat c
flavonoidele au att rol fotoprotector ct i rol antioxidant (Havaux i Kloppstech, 2001; Neill et al.,
2002). Astfel, n cadrul evalurii efectelor antibioticelor asupra plantelor Triticum aestivum L., utilizarea
unui volum de 0,5 L, 1,5 mg L-1 soluii de PENG, CFX, TET i DOXI (Figura 5.27) poate indica o
cretere a capacitii antioxidante n aceste condiii de stres. Contrar, la volumul de 1 L soluie de
antibiotice de concentraie 1,5 mg L-1 (Figura 5.27), a fost observat o reducere a acestei capaciti
antioxidante.

-1 -1
0,5 mg L 1,5 mg L
400
a 0,5 L b *
*
Flavonoide totale (mg m )

*
-2

1L
300 * * *
*
*
&
* &
* *
200 &
* &
* &
&
&
* *
*
100

0
X
PE P

IP
NG

XI

I
Z

DO T
AM rol
X
AM rol

PE P

FX

IP
G

XI

I
FZ

D T

ER
ER

TE
CF
TE

CF
AM
AM
O

C
O
C

nt
t

C
C
on

Co
C

Figura 5.27. Modificarea coninutului total de flavonoide (mg m-2) n plantele de Triticum aestivum L.
soiul Lovrin la rspunsul tratamentelor cu nou antibiotice dup ce acestea au fost udate cu volume
totale de 0,5 L i 1 L soluie de antibiotice de concentraii 0,5 mg L-1 (a) i 1,5 mg L-1 (b). Semnificaia
statistic este aceeai ca n legenda Figurii 5.16.

CONCLUZII
Utilizarea excesiv a antibioticelor conduce la prezena lor n mediul nconjurtor. n ciuda
proprietilor benefice i a efectelor dorite n timpul aplicaiilor terapeutice, aceleai proprieti ale
antibioticelor pot fi dezavantajoase pentru mediul nconjurtor, cauznd efecte negative asupra
microorganismelor, plantelor, precum i poteniale riscuri asupra sntii umane.
Datorit acestor aspecte, prin prezentul studiu de doctorat s-a urmrit aducerea de contribuii
privind elaborarea de proceduri pentru determinarea antibioticelor din probe de ap de suprafa i probe
de ap rezidual, precum i evidenierea influenelor negative ale acestora asupra algelor verzi
(Pseudokirchneriella subcapitata L.) i plantelor de gru (Triticum aestivum L.). n cadrul acestor

30
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

cercetri au fost selectate nou antibiotice care aparin la cinci clase diferite: peniciline (amoxicilin,
ampicilin i penicilin G), cefalosporine (ceftazidim i ceftriaxon), tetracicline (tetraciclin i
doxiciclin), fluorochinolone (ciprofloxacin) i macrolide (eritromicin).
Au fost elaborate dou proceduri de determinare a apte antibiotice (amoxicilin, ampicilin,
penicilin G, ceftazidim, ceftriaxon tetraciclin i doxiciclin) din probe de ap de suprafa i probe de
ap rezidual. n cazul ambelor proceduri izolarea/concentrarea antibioticelor din diferite probe a fost
realizat utiliznd tehnica extraciei pe faz solid (SPE). Metodele SPE au fost realizate cu ajutorul unor
cartue cu faz staionar echilibrat hidrofilic-lipofilic, Oasis HLB, care au condus la grade de
recuperare bune.
Prima procedur, SPE-HPTLC, a fost elaborat pentru determinarea coninutului de antibiotice
din probe de ap de suprafa (Someul Mic, Cluj-Napoca).
Datele experimentale obinute n urma validrii procedurii SPE-HPTLC propuse au demonstrat c
aceasta este selectiv i prezint liniaritate, precizie i acuratee foarte bune.
n probele de ap de suprafa investigate au fost determinate dou dintre antibioticele studiate n
concentraii relativ mari, peste 2115 g L-1 amoxicilin i peste 55 g L-1 i tetraciclin.
n cazul probelor de ap rezidual (colectate de la un spital clinic i de la o staie de epurare:
influeni i eflueni), pe lng determinarea coninutului de antibiotice, a fost realizat i o caracterizare
fizico-chimic a acestora. Determinarea coninutului de antibiotice a fost realizat utiliznd cea de a doua
procedur elaborat (SPE-HPLC-DAD/MS) n cadrul studiului de doctorat. Concluziile desprinse n urma
acestor cercetri sunt:
Parametrii fizico-chimici analizai nu au variat foarte mult n funcie de natura probelor de ap
rezidual (colectate de la un spital clinic i de la o staie de epurare). Acest aspect a fost observat
n cazul urmtorilor indicatori de calitate ai apei: consumul chimic de oxigen, consumul
biochimic de oxigen i totalul de materii solide n suspensie.
Raportul consum chimic/biochimic de oxigen luat drept index al biodegradabilitii pentru apele
reziduale colectate de la spitalul clinic, arat c aceste ape pot fi considerate la limita
biodegradabilitii datorit consumului mare de medicamente i al produselor de curare utilizate
n cadrul spitalului.
Majoritatea parametrilor fizico-chimici determinai n probele de ap rezidual (efluent) colectate
de la staia de epurare, s-au ncadrat n limitele maxime admise prevzute n Anexa nr.1 NTPA
011/2005 din cadrul H.G. 352/11.05.2005, excepie fcnd coninutul de azot total.
Procedura SPE-HPLC-DAD/MS utilizat pentru determinarea coninutului de antibiotice din
probele de ap rezidual prezint liniaritate, limite de detecie i de cuantificare, precizie i
acuratee bune.
Utiliznd procedura SPE-HPLC-DAD/MS, n probele n probele de ap rezidual colectate de la
spitalul clinic au fost determinate trei dintre antibioticele studiate (ceftazidim, tetraciclin i
doxiciclin).
n probele de ap rezidual (influent) colectate de la staia de epurare, antibioticele ceftriaxon,
tetraciclin i doxiciclin au fost determinate utiliznd aceeai procedur SPE-HPLC-DAD/MS.
Antibioticele determinate n probele de ap rezidual investigate aparin claselor de antibiotice
(cefalosporine i tetracicline) cel mai frecvent utilizate n medicin i domeniile conexe.

31
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

n efluenii corespunztori influenilor colectai de la staia de epurare nu a fost detectat nici un


antibiotic din cele apte studiate n cadrul acestor cercetri. Acest lucru demonstreaz faptul c
procesul de epurare al apelor reziduale este eficient n ceea ce privete antibioticele studiate sau
sunt n cantiti mici care sunt sub limita de detecie a procedurii propuse.
Prezena antibioticelor n probe de ap rezidual (influent i efluent) este o problem de mediu n
continu dezvoltare, chiar dac n cazul nostru specific, prezena antibioticelor n probele de efluent nu a
fost detectat. Astfel, apele reziduale investigate n cazul nostru nu prezint un pericol pentru mediul
acvatic, din punct de vedere al coninutului de antibiotice.
Cercetrile privind influena a trei antibiotice (ampicilin, penicilin G i doxiciclin) asupra
densitii celulare a algelor Pseudokirchneriella subcapitata L., au condus la urmtoarele concluzii:
n cazul celor trei teste cu antibiotice a fost observat o scdere cu pn la 35,1% fa de control
n densitatea celular a algelor, la 24 h de la nceperea experimentelor.
Antibioticul din clasa tetraciclinelor (doxiciclina) a avut cel mai pronunat efect privind inhibarea
densitii celulare a algelor.
n cazul testului cu antibioticul ampicilin au existat inhibri ale densitii celulare a algelor, dar
nesemnificative din punct de vedere statistic.
Un studiu mult mai complex privind toxicitatea antibioticelor, a fost realizat pe plantele de gru
(Triticum aestivum L.). n cadrul acestor cercetri s-a urmrit influena celor nou antibiotice selectate
asupra parametrilor fotosintetici (transportul de electroni, viteza net de asimilaie a CO2 i conductana
stomatal de vaporizare a apei), asupra pigmenilor asimiliatori (clorofilieni i carotenoizi), asupra
compuilor organici volatili (monoterpene i produi de oxidare sub aciunea lipoxigenazei), precum i
asupra coninutului total de flavonoide din plante. n urma analizei datelor experimentale au fost
constatate urmtoarele:
n comparaie cu plantele control, cele mai mici valori ale vitezei transportului de electroni
(aproximativ cu 16% mai mici) au fost observate n cazul tratamentului cu antibioticul
ceftriaxon.
Efectele antibioticelor asupra fotosintezei plantelor au fost moderate i indirecte, fiind
reprezentate de modificri ale valorilor conductanei stomatale de vaporizare a apei i inhibri ale
proceselor de asimilaie a luminii. Aceste situaii au fost observate n cazul plantelor care au fost
tratate cu tetracicline, peniciline i cu cefalosporina ceftriaxon.
Efectele negative ale antibioticelor asupra parametrilor fotosintetici au crescut cu creterea dozei
de antibiotice administrat plantelor de gru.
Emisiile de monoterpene au crescut n cazul ambelor concentraii de soluii de antibiotice utilizate
n cadrul acestui studiu.
n cazul tuturor celor nou antibiotice utilizate pentru tratarea plantelor de gru a fost observat o
cretere a emisiilor de produi de oxidare sub aciunea lipoxigenazei, care este dependent de
concentraia i volumul soluiilor de antibiotice utilizate pentru udarea plantelor de gru.
Compuii organici volatili au fost cel mai sensibil indicator de toxicitate pentru plantele de gru
care au fost tratate cu antibiotice.
Coninutul de clorofile din plantele de gru tratate cu antibiotice a sczut cu pn la 10% fa de
plantele control. Aceast scdere poate fi asociat cu rspunsul plantelor la condiiile de stres i
cu reducerea absorbiei luminii.

32
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

Coninutul de carotenoide (zeaxantin, lutein, -caroten) a sczut cu pn la 3-4%, fa de


plantele control.
Cele mai semnificative scderi (cu pn la 69%) ale coninutului de neoxantin i violaxantin au
fost obinute n cazul tratamentului cu tetraciclin, scderi care pot fi asociate cu reducerea
capacitii fotoprotectoare a plantelor.
n cazul plantelor tratate cu antibioticele studiate, coninutul total de flavonoide a sczut
semnificativ, efect asociat cu scderea capacitii antioxidante a plantelor.

BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1. Abd El-Gawad H.A., Aly A.M., 2011. Assessment of aquatic environmental for wastewater
management quality in the hospitals: a case study. Australian Journal of Basic and Applied Sciences
5, 474-782.
2. Abounassif A.M., Mian N.A.A., Mian M.S., 1990. Analytical profile of ceftazidime, n Analytical
profile of drug substances, Vol. 19, editat de ctre Florey K., Academic Press Inc., San Diego,
California. p. 95-121.
3. Aristilde L., Melis A., Sposito G., 2010. Inhibition of photosynthesis by a fluoroquinolone antibiotic.
Environmental Science & Technology 44, 1444-1450.
4. Aperger D., Mutavdi D., Babi S., Horvat A.J.M., Katelan-Macan M., 2006. Solid-phase
extraction and TLC quantification of enrofloxacin, oxytetracycline, and trimethoprim in wastewater.
Journal of Planar Chromatography - Modern TLC 19, 129-134.
5. Bassi R., Caffarri S., 2000. Lhc proteins and the regulation of photosynthetic light harvesting
function by xanthophylls. Photosynthesis Research 64, 243-256.
6. Batt A.L., Aga D.S., 2005. Simultaneous analysis of multiple classes of antibiotics by ion trap
LC/MS/MS for assessing surface water and groundwater contamination. Analytical Chemistry 77,
2940-2947.
7. Beauchamp J., Wisthaler A., Hansel A., Kleist E., Miebach M., Niinemets ., Schurr U., Wildt J.,
2005. Ozone induced emissions of biogenic VOC from tobacco: relationships between ozone uptake
and emission of LOX products. Plant, Cell & Environment 28, 1334-1343.
8. Benito-Pea E., Partal-Rodera A.I., Len-Gonzlez M.E., Moreno-Bondi M.C., 2006. Evaluation of
mixed mode solid phase extraction cartridges for the preconcentration of beta-lactam antibiotics in
wastewater using liquid chromatography with UV-DAD detection. Analytica Chimica Acta 556, 415-
422.
9. Bercea V., 2008. Fotosinteza. Fotoreglare i fotoprotecie. Ed. Todesco, Cluj-Napoca. p. 36-49.
10. Bradel B.G., Preil W., Jeske H., 2000. Remission of the free-branching pattern of Euphorbia
pulcherrima by tetracycline treatment. Journal of Phytopathology 148, 587-590.
11. Brain R.A., Johnson D.J., Richards S.M., Sanderson H., Sibley P.K., Solomon K.R., 2004. Effects of
25 pharmaceutical compounds to Lemna gibba using a seven-day static-renewal test. Environmental
Toxicology and Chemistry 23, 371-382.
12. Brain R.A., Wilson C.J., Johnson D.J., Sanderson H., Bestari K.J., Hanson M.L., Sibley P.K.,
Solomon K.R., 2005. Effects of a mixture of tetracyclines to Lemna gibba and Myriophyllum
sibiricum evaluated in aquatic microcosms. Environmental Pollution 138, 425-442.

33
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

13. Brain R.A., Hanson M.L., Solomon K.R., Brooks B.W., 2008. Aquatic plants exposed to
pharmaceuticals: effects and risks. Reviews of Environmental Contamination & Toxicology 192, 67-
115.
14. Choma I., 2004. Antibiotics: Analysis by TLC, n Encyclopedia of chromatography, Update
Supplement, editat de ctre Cazes J., Marcel Dekker Inc., New York. p. 1-3.
15. Copolovici L., Knnaste A., Niinemets ., 2009. Gas chromatography-mass spectrometry method
for determination of monoterpene and sesquiterpene emissions from stressed plants. Studia
Universitatis Babe-Bolyai, Chemia 54, 329-339.
16. Copolovici L., Niinemets ., 2010. Flooding induced emissions of volatile signalling compounds in
three tree species with differing waterlogging tolerance. Plant, Cell & Environment 33, 1582-1594.
17. Copolovici L., Knnaste A., Remmel T., Vislap V., Niinemets ., 2011. Volatile emissions from
Alnus glutinosa induced by herbivory are quantitatively related to the extent of damage. Journal of
Chemical Ecology 37, 18-28.
18. Copolovici L., Knnaste A, Pazouki L., Niinemets ., 2012. Emissions of green leaf volatiles and
terpenoids from Solanum lycopersicum are quantitatively related to the severity of cold and heat
shock treatments. Journal of Plant Physiology 169, 664-672.
19. Dahl E.L., Shock J.L., Shenai B.R., Gut J., DeRisi J.L., Rosenthal P.J., 2006. Tetracyclines
specifically target the apicoplast of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Antimicrobial
Agents and Chemotherapy 50, 3124-3131.
20. Davies, B.H., 1976. Carotenoids, n Chemistry and biochemistry of plant pigments. Vol. I, 2nd
edition, editat de ctre Goodwin T.W., Academic Press, New York. p. 38-165.
21. Delian E., 2006. Fiziologia stresului biotic la plante. Ed. Cartea Universitar, Bucureti. p. 272-274.
22. Demmig-Adams B., Adams W.W., 2006. III. Photoprotection in an ecological context: the
remarkable complexity of thermal energy dissipation: Tansley review. The New Phytologist 172, 11-
21.
23. Dobrot C., 2005. Fiziologia plantelor. Ministerul Educaiei i Cercetrii - proiectul pentru
nvmntul rural. p. 138-142.
24. Dobrot C., 2010. Fiziologia plantelor. Vol. I. Ed. Risoprint, Cluj-Napoca. p.195-215.
25. Duong H.A., Pham N.H., Nguyen H.T., Hoang T.T., Pham H.V., Pham V.C., Berg M., Giger W.,
Alder A.C., 2008. Occurrence, fate and antibiotic resistance of fluoroquinolone antibacterials in
hospital wastewaters in Hanoi, Vietnam. Chemosphere 72, 968-973.
26. EN ISO 8692:2004. Water quality. Freshwater algal growth inhibition test with unicellular green
algae.
27. Farmacopeea Romn, 1993. Ediia a X-a. Ed. Medical, Bucureti.
28. Feitosa-Felizzola J., Temime B., Chiron S., 2007. Evaluating on-line solid-phase extraction coupled
to liquid chromatography-ion trap mass spectrometry for reliable quantification and confirmation of
several classes of antibiotics in urban wastewaters. Journal of Chromatography A 1164, 95-104.
29. Fried B., Sherma J., 2005. Thin layer chromatography. Fourth Edition, Revised and Expanded.
Marcel Dekker Inc., New York. Cap. 2, p. 8-21.
30. Garca-Campaa A.M., Gmiz-Gracia L., Lara F.J., del Olmo Iruela M., Cruces-Blanco C., 2009.
Applications of capillary electrophoresis to the determination of antibiotics in food and
environmental samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry 395, 967-986.

34
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

31. Garca-Galn M.J., Daz-Cruz M.S., Barcel D., 2010. Determination of 19 sulfonamides in
environmental water samples by automated on-line solid-phase extraction-liquid chromatography-
tandem mass spectrometry (SPE-LC-MS/MS). Talanta 81, 355-366.
32. Genty B., Briantais J.M., Baker N.R., 1989. The relationship between the quantum yield of
photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence. Biochimica et
Biophysica Acta 990, 87-92.
33. Gocan S., 2002. Cromatografie de nalt performan, partea a II-a, Cromatografia de lichide pe
coloan. Ed. Risoprint, Cluj-Napoca. p. 41-73, 281-298.
34. Gmez M.J., Petrovi M., Fernndez-Alba A.R., Barcel D., 2006. Determination of
pharmaceuticals of various therapeutic classes by solid-phase extraction and liquid chromatography-
tandem mass spectrometry analysis in hospital effluent wastewaters. Journal of Chromatography A
1114, 224-233.
35. Granados M., Encabo M., Campa R., Prat M.D., 2005. Determination of tetracyclines in water
samples using liquid chromatography with fluorimetric detection. Chromatographia 61, 471-477.
36. Gruji S., Vasiljevi T., Lauevi M., 2009. Determination of multiple pharmaceutical classes in
surface and ground waters by liquid chromatography-ion trap-tandem mass spectrometry. Journal of
Chromatography A 1216, 4989-5000.
37. Halling-Srensen B., 2000. Algal toxicity of antibacterial agents used in intensive farming.
Chemosphere 40, 731-739.
38. Havaux M., 1998. Carotenoids as membrane stabilizers in chloroplasts. Trends in Plant Science 3,
147-151.
39. Havaux M., Tardy F., Lemoine Y., 1998. Photosynthetic light-harvesting function of carotenoids in
higher-plant leaves exposed to high light irradiances. Planta 205, 242-250.
40. Havaux M., Niyogi K.K., 1999. The violaxanthin cycle protects plants from photooxidative damage
by more than one mechanism. Proceeding of the National Academy Science of the United States of
America 96, 8762-8767.
41. Havaux M., Kloppstech K., 2001. The protective functions of carotenoid and flavonoid pigments
against excess visible radiation at chilling temperature investigated in Arabidopsis npq and tt
mutants. Planta 213, 953-966.
42. Hernndez F., Borrull F., Calull M., 2003. Analysis of antibiotics in biological samples by capillary
electrophoresis. Trends in Analytical Chemistry 22, 416-427.
43. Hillis D.G., Fletcher J., Solomon K.R., Sibley P.K., 2011. Effects of ten antibiotics on seed
germination and root elongation in three plant species. Archives of Environmental Contamination
and Toxicology 60, 220-232.
44. Hu X., Luo Y., Zhou Q., 2010. Simultaneous analysis of selected typical antibiotics in manure by
microwave-assisted extraction and LC-MSn. Chromatographia 71, 217-223.
45. Husain S.W., Ghoulipour V., Sepahrian H., 2004. Chromatographic behaviour of antibiotics on thin
layers of an inorganic ion-exchanger. Acta Chromatographica 14, 102-109.
46. Joshi S., Sharma A., Rawat M.S.M., Dhiman C., 2009. Development of conditions for rapid thin-
layer chromatography of -lactam antibiotics. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC 22,
435-437.
47. Kasprzyk-Hordern B., Dinsdale R.M., Guwy A.J., 2008. The effect of signal suppression and mobile
phase composition on the simultaneous analysis of multiple classes of acidic/neutral pharmaceuticals

35
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

and personal care products in surface water by solid-phase extraction and ultra performance liquid
chromatography-negative electrospray tandem mass spectrometry. Talanta 74, 1299-1312.
48. Kato Y., Takahara S., Kato S., Kubo Y., Sai Y., Tamai I., Yabuuchi H., Tsuji A., 2008. Involvement
of multidrug resistance-associated protein 2 (Abcc2) in molecular weight-dependent biliary excretion
of -lactam antibiotics. Drug Metabolism and Disposition 36, 1088-1096.
49. Kim S., Eichhorn P., Jensen J.N., Weber A.S., Aga D.S., 2005. Removal of antibiotics in
wastewater: effect of hydraulic and solid retention times on the fate of tetracycline in the activated
sludge process. Environmental Science & Technology 39, 5816-5823.
50. Li B., Zhang T., Xu Z., Fang H.H.P., 2009. Rapid analysis of 21 antibiotics of multiple classes in
municipal wastewater using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.
Analytica Chimica Acta 645, 64-72.
51. Li Z.J., Xie X.Y., Zhang S.Q., Liang Y.C., 2011. Wheat growth and photosynthesis as affected by
oxytetracycline as a soil contaminant. Pedosphere 21, 244-250.
52. Liavonchanka A., Feussner N., 2006. Lipoxygenases: occurrence, functions and catalysis. Journal of
Plant Physiology 163, 348-357.
53. Lindberg R., Jarnheimer P.., Olsen B., Johansson M., Tysklind M., 2004. Determination of
antibiotic substances in hospital sewage water using solid phase extraction and liquid
chromatography/mass spectrometry and group analogue internal standards. Chemosphere 57, 1479-
1488.
54. Liu F., Ying G.G., Tao R., Zhao J.L., Yang J.F., Zhao L.F., 2009. Effects of six selected antibiotics
on plant growth and soil microbial and enzymatic activities. Environmental Pollution 157, 1636-
1642.
55. Loreto F., Schnitzler J.P., 2010. Abiotic stresses and induced BVOCs. Trends in Plant Science 15,
154-166.
56. Matinca D., 2002. Antibiotice. Ed. Medical Universitar Iuliu Haieganu, Cluj-Napoca. p. 5-19,
61-67, 71-80, 94-104.
57. Meisen I., Wisholzer S., Soltwisch J., Dreisewerd K., Mormann M., Mthing J., Karch H., Friedrich
A.W., 2010. Normal silica gel and reversed phase thin-layer chromatography coupled with UV
spectroscopy and IR-MALDI-o-TOF-MS for the detection of tetracycline antibiotics. Analytical and
Bioanalytical Chemistry 398, 2821-2831.
58. Milborrow B.V., 2001. The pathway of biosynthesis of abscisic acid in vascular plants: a review of
the present state of knowledge of ABA biosynthesis. Journal of Experimental Botany 52, 1145-1164.
59. Mller-Moul P., Havaux M., Niyogi K.K., 2003. Zeaxanthin deficiency enhances the high light
sensitivity of an ascorbate-deficient mutant of Arabidopsis. Plant Physiology 133, 748-760.
60. Munn-Bosch S., Alegre L., 2000. Changes in carotenoids, tocopherols and diterpenes during
drought and recovery, and the biological significance of chlorophyll loss in Rosmarin officinalis
plants. Planta 210, 925-931.
61. Mutavdi D., Babi S., Aperger D., Horvat A.J.M., Katelan-Macan M., 2006. Comparison of
different solid-phase extraction materials for sample preparation in the analysis of veterinary drugs in
water samples. Journal of Planar Chromatography - Modern TLC 19, 454-462.
62. Nakai Y., Tokuyama E., Yoshida M., Uchida T., 2010. Prediction of incompatibility of ceftriaxone
sodium with calcium ions using the ionic product. Yakugaku Zasshi 130, 95-102.

36
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

63. Neill S.O., Gould K.S., Kilmartin P.A., Mitchell K.A., Markham K.R., 2002. Antioxidant activities
of red versus green leaves in Elatostema rugosum. Plant, Cell & Environment 25, 539-547.
64. Niinemets ., Bilger W., Kull O., Tenhunen J.D., 1998. Acclimation to high irradiance in temperate
deciduous trees in the field: changes in xanthophyll cycle pool size and in photosynthetic capacity
along a canopy light gradient. Plant, Cell & Environment 21, 1205-1218.
65. Niinemets ., 2010, Mild versus severe stress and BVOCs: thresholds, priming and consequences.
Trends in Plant Science 15, 145-153.
66. Niinemets ., Copolovici L., Hve K., 2010a. High within-canopy variation in isoprene emission
potentials in temperate trees: Implications for predicting canopy-scale isoprene fluxes. Journal of
Geophysical Research 115, G0429, 19 pp., doi: 10.1029/2010JG001436.
67. Niinemets ., Arneth A., Kuhn U., Monson R.K., Peuelas J., Staudt M., 2010b. The emission factor
of volatile isoprenoids: stress, acclimation, and developmental responses. Biogeosciences 7, 2203-
2223.
68. Niinemets ., Monson R.K., Arneth A., Ciccioli P., Kesselmeier J., Kuhn U., Noe S.M., Peuelas J.,
Staudt M., 2010c. The leaf-level emission factor of volatile isoprenoids: caveats, model algorithms,
response shapes and scaling. Biogeosciences 27, 1809-1832.
69. Oniscu C., 1988. Chimia i tehnologia medicamentelor. Ed. Tehnic, Bucureti. p. 80.
70. Opri O., Copaciu F., Coman V., Ristoiu D., 2011. UV-VIS study regarding the influence of two
potential environmental pollutants on the total flavonoid content in Triticum aestivum L. and Secale
cereale L., Studia Universitatis Babe-Bolyai, Chemia 56, 17-25.
71. Opri O., Coman V., Copaciu F., Vlassa M., 2012a. Solid phase extraction and high performance
thin layer chromatography quantification of some antibiotics from surface waters. Journal of Planar
Chromatography - Modern TLC 25 (6), 516-522. Lucrare sub tipar - DOI: 10.1556/JPC.25.2012.6.0.
72. Opri O., Copaciu F., Soran L.M., Ristoiu D., Niinemets ., Copolovici L., 2012b. Influence of nine
antibiotics on key secondary metabolites and physiological characteristics in Triticum aestivum: leaf
volatiles as a promising tool to assess toxicity, Ecotoxicology and Environmental Safety. Lucrare sub
tipar - DOI: 10.1016/j.ecoenv.2012.09.019.
73. Osmond C.B., Anderson J.M., Ball M.C., Egerton J.G., 1999. Compromising efficiency: the
molecular ecology of light-resource utilization in plants, n Volumul Simpozionului The 39th
Symposium of the British Ecological Society (New York, 1998), edite par Press M.C., Scholes J.D.,
Barker M.G., Blackwell Science, Oxford. p. 1-24.
74. Pan X., Deng C., Zhang D., Wang J., Mu G., Chen Y., 2008. Toxic effects of amoxicillin on the
photosystem II of Synechocystis sp. characterized by a variety of in vivo chlorophyll fluorescence
tests. Aquatic Toxicology 89, 207-213.
75. Pocock T., Krl M., Huner N.P.A., 2004. The determination and quantification of photosynthetic
pigments by reverse phase high-performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, and
spectrophotometry, n Methods in molecular biology. Vol. 274: Photosynthesis Research Protocols,
editat de ctre Carpentier R., Ed. Humana Press Inc., Totowa, New Jersey. p. 137-148.
76. Polle J.E.W., Niyogi K.K., Melis A., 2001. Absence of the pigments lutein, violaxanthin and
neoxanthin affects the functional chlorophyll antenna size of photosystem-II but not that of
photosystem-I in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Plant & Cell Physiology 42, 482-491.
77. Pomati F., Netting A.G., Calamari D., Neilan B.A., 2004. Effects of erythromycin, tetracycline and
ibuprofen on the growth of Synechocystis sp. and Lemna minor. Aquatic Toxicology 67, 387-396.

37
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

78. Pozo O.J., Guerrero C., Sancho J.V., Ibez M., Pitarch E., Hogendoorn E., Hernndez F., 2006.
Efficient approach for the reliable quantification and confirmation of antibiotics in water using on-
line solid-phase extraction liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Journal of
Chromatography A 1103 83-93.
79. Qin H., Chen L., Lu N., Zhao Y., Yuan X., 2012. Toxic effects of enrofloxacin on Scenedesmus
obliquus. Frontiers of Environmental Science & Engineering 6, 107-116.
80. Samanta A., Das G., Das S.K., 2011. Roles of flavonoids in plants. International Journal of
Pharmaceutical Science and Technology 6, 12-35.
81. Seifrtov M., Novkov L., Lino C., Pena A., Solich P., 2009. An overview of analytical
methodologies for the determination of antibiotics in environmental waters. Analytica Chimica Acta
649, 158-179.
82. Soran L.M., Opri O., Copaciu F., Varodi C., 2012. Determination of flavonoids in Triticum
aestivum L. treated with ampicillin. Proceeding n Processes in isotopes and molecules (PIM
2011), editat de ctre Lazar M.D. American Institute of Physics, Melville, New York. AIP
Conference Proceedings 1425, 47-49.
83. Toome M., Randjrv P., Copolovici L., Niinemets ., Heinsoo K., Luik A., Noe S.M., 2010. Leaf
rust induced volatile organic compounds signalling in willow during the infection. Planta 232, 235-
243.
84. van der Grinten E., Pikkemaat M.G., van den Brandhof E.J., Stroomberg G.J., Kraak M.H.S., 2010.
Comparing the sensitivity of algal, cyanobacterial and bacterial bioassays to different groups of
antibiotics. Chemosphere 80, 1-6.
85. von Caemmerer S., Farquhar G.D., 1981. Some relationships between the biochemistry of
photosynthesis and the gas exchange of leaves. Planta 153, 376-387.
86. Xie X., Zhou Q., Lin D., Guo J., Bao Y., 2011. Toxic effect of tetracycline exposure on growth,
antioxidative and genetic indices of wheat (Triticum aestivum L.). Environmental Science and
Pollution Research 18, 566-575.
87. Xu Z., Wang H.Y., Huang S.X., Wei Y.L., Yao S.J., Guo Y.L., 2010. Determination of beta-
lactamase residues in milk using matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform mass
spectrometry. Analytical Chemistry 82, 2113-2118.
88. Yang S., Cha J., Carlson K., 2005. Simultaneous extraction and analysis of 11 tetracycline and
sulfonamide antibiotics in influent and effluent domestic wastewater by solid-phase extraction and
liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of
Chromatography A 1097, 40-53.
89. Yang L.H., Ying G.G., Su H.G., Stauber J.L., Adams M.S., Binet M.T., 2008. Growth-inhibiting
effects of 12 antibacterial agents and their mixtures on the freshwater microalga Pseudokirchneriella
subcapitata. Environmental Toxicology and Chemistry 27, 1201-1208.
90. Zarnack K., Maurer S., Kaffarnik F., Ladendorf O., Brachmann A., Kaemper J., Feldbruegge M.,
2006. Tetracycline-regulated gene expression in the pathogen Ustilago maydis. Fungal Genetics and
Biology 43, 727-738.

38
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

ANEXA I. ABREVIERI
A - net asimilation rate - vitez net de asimilaie a CO2
ABA - acid abscisic
ADN - acid deoxiribonucleic
AMOX - amoxicilin
AMP - ampicilin
ATP - adenozin trifosfat
CBO - consum biochimic de oxigen
CCO - consum chimic de oxigen
CFX - ceftriaxon
CFZ - ceftazidim
CIP - ciprofloxacin
DAD - diode array detector - detector cu serie de fotodiode cu baleiaj complet
DCI - denumire comun internaional
DOXI - doxiciclin
EC50 - effective concentration - concentraie inhibitoare efectiv
EDTA - acid etilendiamino-tetraacetic
ERI - eritromicin
ESI - electrospray ionization - ionizare prin electropulverizare
ETR - electron transport rate - viteza transportului de electroni
gs - stomatal conductance to water vapor - conductan stomatal de vaporizare a apei
HLB - hydrophilic lipophilic balanced - echilibrat hidrofilic lipofilic
HPLC - high performance liquid chromatography - cromatografie de lichide de nalt performan
HPTLC - high performance thin layer chromatography - cromatografie pe strat subire de nalt
performan
LC - liquid chromatography - cromatografie de lichide
LOD - limit of detection - limita de detecie
LOQ - limit of quantification - limita de cuantificare
LOX - lipoxygenase pathway products - produi de oxidare sub aciunea lipoxigenazei
MS - mass spectrometry - spectrometrie de mas
NADPH - nicotinamid adenozin dinucleotid fosfat oxidaz
PENG - penicilin G
PS I - photosystem I - fotosistem I
PS II - photosystem II - fotosistem II
RSD - relative standard deviation - deviaie standard relativ
SD - standard deviation- deviaie standard
SE - standard error - eroare standard
SPE - solid phase extraction - extracie pe faz solid
TET - tetraciclin
TLC - thin layer chromatography - cromatografie pe strat subire
TMS - total de materii solide n suspensie
UV-Vis - ultraviolet vizibil

39
Rezumatul tezei de doctorat: Contribuii privind influena antibioticelor asupra unor factori de mediu

VOC - volatile organic compounds - compui organici volatili

ANEXA II. LISTA PUBLICAIILOR REZULTATE N URMA TEZEI


1. Ocsana Opri, Florina Copaciu, Maria Loredana Soran, Dumitru Ristoiu, lo Niinemets, Lucian
Copolovici, 2012. Influence of nine antibiotics on key secondary metabolites and physiological
characteristics in Triticum aestivum: leaf volatiles as a promising tool to assess toxicity. Ecotoxicology
and Environmental Safety. Lucrare sub tipar - DOI: 10.1016/j.ecoenv.2012.09.019. Factor de impact
(2011): 2,294.
2. Ocsana Opri, Virginia Coman, Florina Copaciu, Mihaela Vlassa, 2012. Solid phase extraction and
high performance thin layer chromatography quantification of some antibiotics from surface waters.
Journal of Planar Chromatography - Modern TLC 25 (6), 516-522. Lucrare sub tipar - DOI:
10.1556/JPC.25.2012.6.0. Factor de impact (2011): 0,767.
3. Loredana Maria Soran, Ocsana Opri, Florina Copaciu, Codrua Varodi, 2012. Determination of
flavonoids in Triticum aestivum L. treated with ampicillin. Proceeding n Processes in isotopes and
molecules (PIM 2011), editat de ctre Lazar M.D. American Institute of Physics, Melville, New
York. AIP Conference Proceedings 1425, 47-49. Baze de date ISI.
4. Ocsana Opri, Florina Copaciu, Virginia Coman, Dumitru Ristoiu, 2011. UV-VIS study regarding the
influence of two potential environmental pollutants on the total flavonoid content in Triticum aestivum
L. and Secale cereale L. Studia Universitatis Babe-Bolyai Chemia 56 (4), 17-25. Factor de impact
(2011): 0,129.
5. Ocsana Opri, Carmen Roba, Florina Copaciu. Quality assessment of waste waters generated by
some important hospitals from Cluj County. Environmental Engineering and Management Journal.
Lucrare trimis spre publicare. Factor de impact (2011): 1,004.
6. Ocsana Opri, Maria-Loredana Soran, Virginia Coman, Florina Copaciu, Dumitru Ristoiu.
Determination of some frequently used antibiotics in waste waters using solid phase extraction
followed by high performance liquid chromatography with diode array and mass spectrometry
detection. Environmental Science: Processes & Impacts. Lucrare trimis spre publicare. Factor de
impact (2011): 1,991.

40