INGENIERIA BIOQUMICA

EQUIPO 3
INFORME DE PRCTICA No. 3:
FERMENTACIN ALCOHLICA

Integrantes:
Castro Len Juan David.
Chvez Avils Dayana Itzel.
Chvez Navarro Diana Laura.
Patio Lpez Jessica Sara.
Ramrez Zavala Sandra Berenice.
Snchez Villegas Gilberto.
Zamora Aboytes Jos Manuel.
Zarate Rivas Jos Felipe.
 Practica 3: Fermentacin Alcohlica 2

INTRODUCCIN

La fermentacin alcohlica es una bioreaccin que permite degradar azcares en alcohol

y dixido de carbono. La conversin se representa mediante la ecuacin:

C6 H 12 O6 2C 2 H 5 OH + 2CO 2

En esta reaccin parte de los tomos de carbono terminan en CO2, una forma ms

oxidada que la de los tomos de carbono de la molcula que parti, mientras que los

otros tomos de carbono terminan en etanol, que es ms reducido que la glucosa (Brock

& Madigan, 1982).

Las principales responsables de esta transformacin son las levaduras. La

Saccharomyces cerevisiae, es la especie de levadura usada con ms frecuencia.

El cultivo inicia al inocular la levadura. Inicialmente predomina el metabolismo aerobio

a expensas del O2 disuelto en el mosto; cuando ste se termina, se establece el

metabolismo anaerobio, que se ve favorecido por la saturacin del medio con el CO2

desprendido. A partir de ese momento inicia la FERMENTACIN ALCOHLICA

PRIMARIA. En esta etapa, la cintica de produccin de etanol se presenta relacionada

directamente con las cinticas de crecimiento microbiano y de consumo de sustrato

(Quintero, 1993). Durante este perodo, se observa un burbujeo muy enrgico, mientras

que las tasas de consumo de sustrato y de formacin de productos son mximas.

 Practica 3: Fermentacin Alcohlica 3

MARCO TERICO

Las fuentes con alto contenido de azcares son materias primas que poseen un alto

contenido de azcares simples y fermentables, como la glucosa, la fructosa, la galactosa

y la sacarosa. Las ms importantes incluyen caa de azcar, frutas, melazas, tubrculos y

azcar de remolacha. La ventaja de utilizar este tipo de fuentes consiste en que no es

necesario realizar tratamientos previos para obtener los azcares fermentables, ya que

estos se encuentran presentes. Actualmente la fuente con alto contenido de azcares ms

empleada son las melazas, jarabes oscuros y de una alta viscosidad, las cuales son un

subproducto resultante del proceso de refinacin del azcar.

Inicialmente, el trmino melaza se refera especficamente al efluente final obtenido

luego del procesamiento de los jugos de la caa de azcar o de la remolacha para

obtener sacarosa (azcar comn), a partir de evaporacin, cristalizacin y centrifugacin

sucesivas.

Existen al menos seis tipos de melazas, las cuales pueden ser empleadas para

fermentacin alcohlica.

- Melazas de caa de azcar

- Melazas high-test

- Refinerscanemolasses

- Melazas de remolacha

- Refinersbeetmolasses

- Melazas ctricas
 Practica 3: Fermentacin Alcohlica 4

Las melazas comerciales usan comnmente la escala Brix como indicador de la

gravedad especfica y como una aproximacin al contenido de slidos totales. La escala

Brix mide la gravedad especfica de un lquido en relacin con una solucin de azcar

(sacarosa) en agua; en otras palabras, es el contenido de azcar en una solucin de

azcar que tiene la misma gravedad especfica del lquido de inters. As, una melaza de

80 Brix tiene una gravedad especfica de 1.416, la cual es la misma de una solucin de

sacarosa en agua que contiene 80% en peso de sacarosa. Es necesario aclarar que la

escala Brix no mide la concentracin real de azcares o de slidos totales en las melazas.

(Vzquez H. J. y Dacosta O. 2007)

Tratamientos previos de la melaza

Antes de realizar el proceso de fermentacin alcohlica, es necesario someter a las

melazas a tratamientos previos para condicionarla.

Esterilizacin: las melazas pueden contener microorganismos que pueden ser nocivos

para la fermentacin. El ms comn es la bacteria Leuconostocme-senteroides, el cual

polimeriza las molculas de sacarosa en dextranos no fermentables. Asimismo, puede

encontrarse en las melazas la bacteria Zymomonasmobilis; esta bacteria puede convertir

los azcares en etanol, pero tambin tienen el efecto de reducir los compuestos

azufrados para producir un olor similar al sulfuro de hidrgeno, lo cual es desastroso

para la produccin de ron de buena calidad.

Dilucin: la altsima concentracin de azcares y sales presentes en las melazas impiden

que los microorganismos puedan fermentarlas, debido a la gran presin osmtica que

generan sobre sus paredes celulares; asimismo, las melazas son altamente viscosas, y su
 Practica 3: Fermentacin Alcohlica 5

manipulacin es difcil en estas condiciones. Por estas razones, es necesario diluir las

melazas; para ello, se les agrega agua, hasta obtener diluciones de 25 Brix o menores; a

valores mayores se tiene el riesgo de inicios lentos de fermentacin y contaminacin

bacteriana.

Adicin de nutrientes: en ocasiones es necesario aadir algunos elementos adicionales,

con el fin de complementar los nutrientes necesarios para los microorganismos que

realizarn la fermentacin. Para las melazas de caa de azcar, es necesario aadir algo

de nitrgeno y fsforo. Para produccin de alcohol carburante, el nitrgeno puede

aadirse en forma de urea. Los requerimientos en fsforo pueden cubrirse con fosfato de

diamonio, con la correspondiente disminucin de urea o la fuente de nitrgeno usada.

Adems de lo anterior, hay otra serie de pretratamientos previos a la fermentacin,

encaminados en su mayora a reducir compuestos suspendidos o disueltos en las melazas

que pueden causar incrustaciones o bloqueo en los platos de las columnas de destilacin,

disminuyendo su capacidad. Algunos autores recomiendan realizar un enfoque

multietapa del problema, en lugar de invertir en costosos sistemas de pretratamiento de

melazas, con el fin de sedimentar los slidos en diversas etapas del proceso. Algunas de

estas recomendaciones se tienen.

Dilucin previa de las melazas a 45 Brix con agua caliente, manteniendo por algunas

horas una temperatura de alrededor de 70C; esto provoca la sedimentacin de una parte

considerable de los slidos suspendidos

En lo posible usar fermentadores con fondo de pendiente inclinada, para mejorar la

separacin de slidos.
 Practica 3: Fermentacin Alcohlica 6

Usar cido hidroclrico en lugar de cido sulfrico. Algunas de las sales de calcio de

la melaza reaccionan con el cido sulfrico, formando sulfato de calcio, cuya

insolubilidad aumenta con la temperatura. Esto representa un problema cuando el caldo

de fermentacin se somete a los procesos de destilacin y el sulfato de calcio se precipita

en los platos

Decantar los fondos de la destilacin en el tanque de fondos, antes de bombearlo al

evaporador, para evitar el envo de slidos a ste.

Luego que el pH del caldo de fermentacin se ajusta entre 4.0-5.0 (con cido mineral

diluido), se inocula con los microorganismos para iniciar la fermentacin.

Manejo de la temperatura de fermentacin.

La fermentacin alcohlica es una reaccin exotrmica, como se observa en el punto

anterior, provocando un aumento en la temperatura del sistema. En el caso de las

levaduras, la temperatura ptima de fermentacin es de 32 C, y su temperatura ptima

de reproduccin es de 28C. Si no se tiene un adecuado sistema de enfriamiento, el

aumento de la temperatura causa inhibicin en el proceso de fermentacin, ya que estos

microorganismos no toleran temperaturas tan altas.

Procesos de separacin por destilacin.

Luego del proceso de fermentacin, es necesario aplicar mtodos de separacin para

obtener el etanol. La operacin ms comn y ampliamente utilizada para obtener etanol

a altas concentraciones (por encima del 90%) es la destilacin convencional.

 Practica 3: Fermentacin Alcohlica 7

El lquido proveniente de la fermentacin se alimenta en la columna de destilacin,

dividindola en dos secciones: la seccin de agotamiento (por debajo del punto de

alimentacin) y la seccin de rectificacin (por encima del punto de alimentacin).

MATERIALES

Material de casa Equipo

Garrafn con agua de 4 lts 1 recipiente Autoclave
metlico de 40 50 cm de alto y 20 a 30 cm Balanza granataria y balanza digital
de dimetro Refrigerador con congelador
Algodn Incubadora o bao de temperatura
Cerillos o encendedor controlada
Cinta adhesiva tipo masking tape Cuaderno Parrillas de calentamiento y agitacin
de registros autoregulables
Papel aluminio Potencimetro
Papel estraza o reciclado Refrigerador
Pluma Plumn marcador negro Cubrebocas Refractmetro de Abb Densmetro (0 a 20 y
Tela paalina o gasa 40 a 60 grados Brix)
Tijeras
Trapo de franela

Material Reactivos
1 asa bacteriolgica Agua destilada o desionizada
1 bao de temperatura controlada Fructosa
2 barras agitacin magnticas Sulfato de amonio
2 embudos de 7 cm de dimetro Sulfato de magnesio
3 esptulas acero inoxidable Fosfato de amonio
1 gradilla Melaza
1 matraz Erlenmeyer de 500 ml Soluciones amortiguadoras de referencia pH
2 Mecheros Fischer con manguera 4.0 y 7.0
3 pipetas graduadas de 1 ml Azul de metileno
1 pipeta 5 ml Levadura seca de panificacin
5 pipetas de 10 ml
1 probeta de 250 ml
1 termmetro -10 a 50C
1 tubo de vidrio en U
4 tubos de ensaye 15 x 100 con tapn de
rosca
2 vasos de precipitado 50 ml
1 vaso de precipitado de 600 ml
1 vaso de precipitado de 1000 ml
1 equipo de destilacin simple
 Practica 3: Fermentacin Alcohlica 8

METODOLOGA

Activacin de levadura

i. Se plane tener un volumen total de mosto y levadura de aproximadamente 6 L.

la proporcin del mostro y la levadura es de 3:1, ya que se prepararon 4.5 L de

mosto se deber activas lavadura en un volumen de 1.5 L para respetar dicha

proporcin.

ii. Para llevar a cabo la inoculacin del mosto preparar previamente, 3 g de levadura

seca en 1.5 L de disolucin al 15% m/v de fructosa, 0.2 g/L de fosfato de amonio

y 0.01 g/L de sulfato de magnesio. Se dej que la levadura se activara hasta que

se observ el efecto de formacin de burbujas de CO2. Se regul la temperatura

entre 28 y 30 C. Agitando cuidadosamente, hasta que se dispers la levadura

(levadura activada).

Preparacin de mosto

i. Se lav con agua destilada y se enjuago con alcohol el material a utilizar en

la prctica para evitar el crecimiento microbiano diferente a la levadura.

ii. Se determin el contenido de solidos totales en la melaza usada para la

fermentacin. Para esto se utiliz el refractmetro de Abb para medir el

ndice de refraccin y los grados Brix de la melaza y as ajustarlos hasta 15

Brix realizando los clculos correspondientes para su dilucin en agua para

un volumen total de 3 L.
 Practica 3: Fermentacin Alcohlica 9

iii. Se agregaron nutrientes adicionales a la dilucin en al siguiente proporcin:

1.5 g/L de sulfato de amonio, 0.30 g/L de sulfato de magnesio y 1.3 g/L de

fosfato de amonio y se mezcl hasta disolver las sales agregadas.

iv. A continuacin, con la ayuda de un potencimetro se determin el pH de la

dilucin de melaza, dicha dilucin tuvo que ser modificado hasta un pH de

4.5 a 5. Esto se logr gracias a adicionar cuidadosamente cido sulfrico 3M.

v. Posteriormente, se calent la dilucin y se dej hervir durante 30 minutos. Al

concluir el tiempo se enfri hasta 32 C.

vi. Al llegar a la temperatura de 32 C se vaci el contenido del recipiente de

calentamiento al garrafn de 6 L previamente lavado. Al ser vaciado

completamente se adiciono la levadura activada (activado previamente).

vii. Finalmente, se cerr garrafn con un tapn de hule provisto de un tubo de

vidrio doblado en U (invertido), destinado a la expulsin del dixido de

carbono formado durante el proceso de fermentacin. En el otro extremo del

tubo en U, se coloc un trozo de manguera y un gotero, el cual se dej

sumergido en agua para asegurar condiciones anaerbicas en la cmara de

fermentacin.

viii. Se almacena durante 5 das y se procede a destilar

RESULTADOS
 Practica 3: Fermentacin Alcohlica 10

ANLISIS DE RESULTADOS

DISCUSIN Y CONCLUSIONES.

CUESTIONARIO.

1. Qu relacin existe entre gluclisis y fermentacin?

En la fermentacin, la nica va de extraccin de energa es la gluclisis, con uno

o dos reacciones extras al final.

La fermentacin y la respiracin celular comienzan del mismo modo, con la

gluclisis. Sin embargo, en la fermentacin, el piruvato producido en la

gluclisis no contina su oxidacin ni hacia el ciclo del cido ctrico, y no

funciona la cadena de transporte de electrones. Dado que la cadena de transporte

de electrones no es funcional, el NADH que se produce en la gluclisis no puede

+
entregar all sus electrones para regresar a NAD .
Entonces, el propsito de las reacciones extras en la fermentacin es regenerar el

+
acarreador de electrones NAD a partir del NADH producido en la gluclisis.

Las reacciones adicionales logran esto dejando que el NADH entregue sus

electrones a una molcula orgnica (como el piruvato, producto final de la

 Practica 3: Fermentacin Alcohlica 11

gluclisis). Esta entrega permite que contine la gluclisis al asegurar un

+
suministro constante deNAD .
2. Por qu en la respiracin anaerbica o fermentacin se produce menor

cantidad de energa (2ATP), que en la respiracin aerbica (38ATP)?

Porque en la respiracin anaerobia solo se realizan 2 etapas o vas degradativas;

la gluclisis anaerobia y la Fermentacin alcohlica, en cambio en la respiracin

celular aerobia se realizan las 3 vas degradativas; la gluclisis, el Ciclo de

Krebs y la Cadena Oxidativa. Esto se debe a que en la Respiracin anaerobia los

organismos que la realizan (levaduras, bacterias anaerobias obligadas y

facultativas) no poseen mitocondrias de manera tal que el Ciclo de Krebs y la

Cadena Oxidativa no se realizan, solo se produce ATP por gluclisis seguida de

la reduccin del cido Pirvico en Etanol

3. Cul es la importancia de la fermentacin en los microorganismos que la

realizan?

4. Indica y explica cules son las enzimas que participan en la va metablica

para la obtencin de los productos principales de la levadura.

5. Cules son los puntos crticos o de riesgo que encontraste en la prctica que

pueden influir en el resultado?

Cuando se lav el material, si no se tiene una cierta seguridad de que se tienen

condiciones aspticas otro tipo de microorganismos adicionales podran a ver

crecido en el mosto modificando o agregando metabolitos secundarios.

 Practica 3: Fermentacin Alcohlica 12

En la manipulacin de las diluciones y activacin de la levadura, si no se llevaba

a cabo una activacin adecuada el rendimiento de las levaduras habra

disminuido considerablemente.
En la disminucin de la temperatura hasta 32 C para adicionar la levadura

activada, ya que la levadura es un MO de tipo mesfilo no resiste temperaturas

muy altas. Por lo tanto, si la temperatura an era demasiado alta en la adicin de

la levadura activada dichas levaduras podran a ver sufrido dao celular.

REFERENCIAS

[1] Arteaga L., y Carvajal G. (2010). Proceso de produccin de etanol a partir

de melazas. Grupo de Investigacin INMECNAR.

[2] Vzquez, H. J. y Dacosta, O. (2007). Fermentacin alcohlica: Una opcin

para la produccin de energa renovable a partir de desechos agrcolas.

INGENIERIA-Investigacin y Tecnologa. Vol. 3, 249-259.