Tehnici combinate de extracie

Produi ai metabolismului primar proteine i

compui nrudii
 Compoziie
Compoziie necunoscut Izolarea produilor naturali
cunoscut
sau parial - tehnici combinate de extracie -
cunoscut

Separare primar
Material brut Omogenizare, filtrare, separare
granulometric
Liofilizare

Centrifugare / centrifugare fracionat

SPE / SPME
Separri specifice SFE
Extracii specifice Separri din mediu acid / bazic, etc.
adaptate la compoziie

Extracie cu solveni
n ordinea seriei eluotrope, ex:
n-alcan > cicloalcan > CCl4 > Solvent i
> h.aromatice > eter etilic > screening GC-MS / derivatizare /
Fracie i d.probe / HPLC-MS / MALDI,etc.
> CH2Cl2 > cloroform > MEC >
> aceton > pentanol > THF >
> MTBE > acetat de etil > Separare secundar Separri LC preparative
> acetonitril > butanol >
> alc.izopropilic > etanol >
> metanol > DMFA > ap
Fracii i,j Studii spectrale avansate
 Produi naturali
alegerea solvenilor de extracie
Produi naturali
 Produi ai metabolismului primar
proteine - caracteristici
Simple (conduc numai la aminoacizi prin hidroliz)

Monomere (conin un singur lan polipeptidic)

Oligomere (conin mai multe subuniti protomeri)

fr legare covalent ncruciat (pot fi separate n mediu acid, bazic sau cu sruri
concentrate)
cu legare covalent ncruciat prin puni disulfurice (pot fi separate prin reducere,
urmat de obicei de alchilare, sau oxidare la acid cisteic)

Conjugate (conduc la aminoacizi i ali compui organici sau anorganici prin hidroliz
sunt clasificate pe baza naturii chimice a gruprii prostetice)

Nucleoproteine
Lipoproteine
Fosfoproteine
Metaloproteine
Glicoproteine
Produi ai metabolismului primar
proteine - caracteristici
 Produi ai metabolismului primar
proteine importana interaciei prin
legturi slabe i cu apa

5 molecule de ap prinse n structura citocromului f (molecul

de tip electron carrying n procesul de fotosintez), formeaz
un canal ce permite transferul de proton
 Produi ai metabolismului primar
proteine importana interaciei prin legturi slabe i cu apa
 Produi ai metabolismului primar
proteine caracteristici

1.0 D-Alanine, 99+%

Propylamine
Propionic acid
0.9

0.8

0.7

0.6
Absorbance

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

3500 3000 2500 2000 1500 1000

Wavenumbers (cm-1)
Produi ai metabolismului primar
proteine caracteristici
 Produi ai metabolismului primar
proteine proprieti acido-bazice, punct izoelectric
Produi ai metabolismului primar
proteine proprieti acido-bazice
Produi ai metabolismului primar
proteine caracteristici
 Produi ai metabolismului primar
proteine structur

Reprezentri ale triozofosfat izomerazei figura final arat suprafaa accesibil solventului rou-acid,
albastru-bazic, polar-verde, nepolar-alb
 Produi ai metabolismului primar
proteine structur
Etapele analizei unei structuri proteice

extracie i purificare
pentru oligoproteine
scindarea structurii cuaternare pentru proteinele conjugate

pentru legare covalent ncruciat

reducerea punilor disulfurice

alchilarea gruprilor sulfhidril

denaturarea n mediu acid, bazic sau cu sruri concentrate

(desfacerea lanurilor oligomere i modificarea structurii

teriare)
hidroliz total pentru determinarea aminoacizilor (pentru fiecare
lan n cazul oligoproteinelor)
identificarea capetelor N- i C- terminale
hidroliza chimic i enzimatic n peptide mai mici (prin mai multe
metode complementare)
separarea peptidelor i determinarea secvenei de aminoacizi
asamblarea secvenei de aminoacizi din datele fragmentrilor
complementare n peptide
determinarea poziiei punilor disulfurice
alternativ secvenierea ADN-ului
modelarea structurii moleculare
modelarea suprafeei de interacie cu solventul
studiul interaciei cu gruprile prostetice
 Produi ai metabolismului primar
proteine extracie i purificare
Metode de extracie i purificare

Obinerea extractului brut din materialul iniial prin omogenizare, distrugerea esuturilor i a
celulelor, centrufugare/centrufugare fracionat, microfiltrare, uneori tratare cu (NH 4)2SO4
pentru precipitarea unor proteine, dializ pentru eliminarea moleculelor mici, etc.
Separare prin cromatografie pe coloan
schimb ionic (cationit)

excluziune steric

afinitate

HPLC

Electroforez
Centrifugare n gradient de densitate
Precipitare izoelectric / isoelectric focusing
Salifiere (creterea triei ionice la o anumit valoare
proteina poate precipita complet)
Fracionare cu solveni
Separare prin adsorbie selectiv, etc.
 Produi ai metabolismului primar
proteine extracie i purificare schimb ionic
 Produi ai metabolismului primar
proteine extracie i purificare afinitate
 Produi ai metabolismului primar
proteine extracie i purificare excluziune steric
 Produi ai metabolismului primar
proteine extracie i purificare electroforeza
 Produi ai metabolismului primar
proteine extracie i purificare isoelectric focusing
 Produi ai metabolismului primar
proteine extracie i purificare separri bidimensionale
Produi ai metabolismului primar
proteine elucidarea structurii
scindarea punilor -S-S-
 Produi ai metabolismului primar
proteine elucidarea structurii
determinarea numrului de capete N- terminale
 Produi ai metabolismului primar
proteine elucidarea structurii secvenierea
Produi ai metabolismului primar
proteine elucidarea structurii
utilizarea MS
 Produi ai metabolismului primar
proteine elucidarea structurii utilizarea MS
 Produi ai metabolismului primar
proteine elucidarea structurii utilizarea MS
 Produi ai metabolismului primar
proteine elucidarea structurii utilizarea MS
 Produi ai metabolismului primar
proteine elucidarea structurii utilizarea MS
 Produi ai metabolismului primar
proteine elucidarea structurii utilizarea MS
nomenclatura si probleme de rezolutie
 Produi ai metabolismului primar
proteine elucidarea structurii utilizarea MS
utilizarea MS n
Produi ai metabolismului primar
proteine elucidarea structurii
sinteza peptidica
Produi ai metabolismului primar
proteine denaturare / renaturare
 Produi ai metabolismului primar
proteine enzibiotice (enzime cu efect antibiotic)

Enzime de interes potenial

Lizinele determin liza celulei bacteriene n faza final a interaciei cu un bacteriofag

Autolizinele determin liza celulei bacteriene, fiind generate de propiile celule
Bacteriocine determin inhibiia altor specii ntr-o cultur a unei specii
ex. lizostaphin generat de Staphylococcus simulans mpotriva S.aureus

Lizozine sunt hidrolaze ce rup specific legturi n peptidoglicani au nu numai efect

antibacterian ci i antiviral, antiinflamator, antitumoral i imunomodulator

Elemente importante n utilizarea enzibioticelor

Risc minor n apariia rezistenei

Au fost identificate enzime capabile sa acioneze i asupra bacteriilor gram-negative