2017-5-28 Haplotipo del gen del factor VIII en el diagnostico molecular de la hemolia A: Estudio de una familia

RevistaHabaneradeCienciasMdicas MiSciELO
versinOnlineISSN1729519X
Serviciospersonalizados
Rev haban cienc mdv.9n.1Ciudad de La Habanaene.-mar.2010

ServiciosPersonalizados
CIENCIASBSICASBIOMDICAS
Articulo

Espaol(pdf)
UniversidaddeCienciasMdicasdeLaHabana(UCMH)
CentroNacionaldeGenticaMdica ArticuloenXML

Referenciasdelartculo

Comocitaresteartculo
HaplotipodelgendelfactorVIIIeneldiagnostico
Enviararticuloporemail
moleculardelahemofiliaA.Estudiodeuna
familia Indicadores

CitadoporSciELO

Linksrelacionados
FactorVIIIgenehaplotypeinthehaemophiliaa
moleculardagnosis.Afamilystudy Compartir

Otros

Otros

YaixaPilotoRoque1,ArletAcandadelaRocha2,IsmaelCervera Permalink
Garca3,YuliaClarkFeoktistova4,TeresaCollazoMesa5

CentroColaboradordelaOMSparaelDesarrollodeEnfoquesGenticosenlaPromocindeSalud.Calle146nm.
3102esq.Ave31.Marianao.CiudaddeLaHabana.Cuba.

LaboratorioBiologaMolecular.Telfonos:2089991/97ext.10421047.

1Lic.Bioqumica.AspiranteaInvestigador.Instructora.yaixa.piloto@infomed.sld.cu
2Lic.Bioqumica.AspiranteaInvestigador.arlet@cngen.sld.cu
3Lic.LaboratorioClnico.Instructor.icervera@infomed.sld.cu
4Lic.Bioqumica.AspiranteaInvestigador.yulia.clark@cngen.sld.cu
5Lic.Bioqumica.InvestigadoraAuxiliar.tcollazo@infomed.sld.cu

RESUMEN

LahemofiliaAsecaracterizaporserunaenfermedadcongnitadeltrastornodelacoagulacinyconstituyeun
desordenrecesivoligadoalcromosomaX.Elestudiomolecularserealizaporestudioindirecto,porsercausadapor
mutacionesheterogneasenelgendelfactorVIII.Seestudiunafamiliaafectada,paraladeteccindeportadora

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1729-519X2010000100004 1/5
2017-5-28 Haplotipo del gen del factor VIII en el diagnostico molecular de la hemolia A: Estudio de una familia
delagestanteyposteriormenteserealizeldiagnsticoprenatal.LaextraccindeADNsehizoporelmtodode
precipitacinsalinaSaltingOutatresmuestrasdesangreyunadelquidoamnitico.Seefectuelanlisisdelos
polimorfismosSt14,BclIyHindIII.Paraladeterminacindesexofetal,seestudielgenAMXY.Latcnica
empleadafuelareaccinencadenadelapolimerasa.

ElanlisisdelmarcadorBclIarrojquelagestanteeraportadoradehemofiliaA,peroalserhomocigticanoera
informativaelpolimorfismoSt14porssolonobrindabalainformacindelacondicindelagestante,peroalser
heterocigticaparaelmismoyconociendodeantemanolainformacindeserportadora,sepudorealizar
diagnsticoprenatal,graciasalanlisisconjuntodelosmarcadores.ElpolimorfismoHindIIInofueinformativo.El
fetoresultservarnsano.

Palabrasclave:HemofiliaA,BclI,St14,HindIII,factorVIII.

ABSTRACT

HemophiliaAisacoagulationdisordercongenitaldiseasewhichconsistinarecessivedisorderlinkedtoX
chromosome.HAiscausebyheterogeneousmutationsinfactorVIIIgen,thatswhy,thestudywascarryoutby
indirectstudies.Westudiedonefamilyafectedweweredeterminatedofcarrierstatusofpregnancywomanand
laterwerelizatedofprenataldiagnosis.TheDNAextractionfromthethreebloodsamplesandoneamnioticfluid
wasobtainedbythesalineprecipitationprocedure(SaltingOut).

WestudiedthepolymorphismsSt14,HindIIIandBcl1.ThedeterminationoffetalsexwasstudiedofAMXYgen.
ThetechniqueusedwasPolymeraseChainReaction.

TheBclImarkeranalysisshowedthatthemotherwasacarrierofhaemophiliaAbutbeinghomozygouswasnot
informative,ST14polymorphismalonedidnotprovideinformationontheconditionofthemotherbuttobe
heterozygousforitandknowingbeforehandinformationofbeingacarrierprenataldiagnosiswaspossiblethanks
tojointanalysisofthemarkers.HindIIIpolymorphismwasnotinformative.Themalefetuswasfoundtobe
healthy.

Keywords:HaemophiliaA,BclI,St14,HindIII,factorVIII.

INTRODUCCIN
LahemofiliaA(hemofiliaclsica,HA),enfermedadrecesivaligadaalcromosomaX,eslacoagulopatacongnita
severamscomnsedebealadeficienciaoausenciadelfactorVIII(FVIII).Debidoasupatrndeherencia,
sueleafectarcasiexclusivamentealosvarones,aunqueexistenreportesdemujeresheterocigticas.Presentauna
incidenciade1:5000a1:10000varones.1

ElgendeFVIIItiene186kbdelongitudesunodelosgenesmslargoscaracterizadoshastaelpresente,contiene
26exones(conunrangodelongitudesquevadesde69a3106paresdebases,pb)y25intrones(algunostan
largoscomo32,4kb)yestlocalizadoenlaregindistaldelbrazolargodelcromosomaXaniveldelabanda
Xq28.EstegenproduceunRNAmde9kb.1,2

LaHAnopresentaningunaalteracinvisibleconmtodoscitogenticos,yademselanlisisanivelmolecularha
sidomuydifcildebidoalgrantamaodelgen,asucomplejaorganizacingenmicayalaheterogeneidadallica
detectadaenlosdistintosindividuos.Enlaactualidad,sehanreportado65%demutacionespuntuales,28%de
delecionesy6%deinserciones.1,2

Ladeteccindeportadorassepudieraabordarpormtodosdirectoseindirectos.Eldiagnsticodirectocaracteriza
laalteracinmolecularenlospacientesysusfamilias.Sinembargo,esteanlisisesmuycomplicadoenesta
enfermedad,puesestegenesunodelosmsgrandesdelgenomaylamayoradelasmutacionessonpuntualesy
lafrecuenciadelasmismasesmenorde1%exceptounamutacincomplejaqueconsisteenunainversina
niveldelintrn22que,segnreportalaliteratura,afectaaproximadamentea50%delosenfermos.3

Porestarazn,elestudioindirectousandomarcadorespolimrficosasociadosalgendelfactorVIII,eslamejor
opcin.

EnCuba,paraladeteccindeportadorasydiagnsticoprenataldelaHAseempleanlosmarcadoresmoleculares
intragnicosBclIyHindIIIambossonpolimorfismosdelongituddefragmentosderestriccin(RFLP`s)yse
localizanenelintrn18y19,respectivamente.ElotropolimorfismousadoesSt14,elcualseencuentraenel
locusDXS52,esunVNTR(repeticionesentndemdenmerovariable),elcualpresentahasta14alelos,segn
reportalaliteratura.46

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1729-519X2010000100004 2/5
2017-5-28 Haplotipo del gen del factor VIII en el diagnostico molecular de la hemolia A: Estudio de una familia

MATERIALYMTODOS
Seestudiunafamiliadiagnosticadaclnicaybioqumicamente.Eluniversodeestudioestuvoconformadoporla
gestantequeeselpropsitodelestudio,elhermanohemoflico,osea,elenfermoylamadre.Nofueposible
estudiarlamuestradelpadre.SerealizlaextraccindeADNporelmtododeprecipitacinsalinaSaltingOut7a
partirde10mLdesangreperifricaconEDTA56mg/mLcomoanticoagulantey20mLdellquidoamnitico.

Seuslatcnicadereaccinencadenadelapolimerasa(RCP)yposteriordigestinenzimticaenlos
polimorfismosdelongituddefragmentosderestriccinBclIyHindIIIsevisualizaronlosresultadosengelde
agarosaa3%.ElproductodeamplificacindelpolimorfismoSt14setestdirectamenteengeldeagarosaa2%.
LascondicionesdePCRydigestionesenzimticasserealizaronsegnlodescritoporScottycol.5Ladeterminacin
delsexofetalsehizoestudiandoelgenAMXY,tcnicadescritaporMehraycol.8

RESULTADOS
Enlafigura1,semuestraelrbolgenealgicodelafamilia,analizadajuntoconelhaplotipodelosmarcadores
molecularesanalizados.ParaBcl1,elenfermotieneelalelo2delmarcadorylagestanteeshomocigticaparael
mismo.(figura2).ParalospolimorfismosSt14yHindIII,elenfermoposeeelalelo1paracadamarcador
respectivamentesinembargo,paraSt14laembarazadaesheterocigtica(1/3)yparaHindIIIeshomocigtica
(1/1).

Figura1.rbolgenealgicodelafamiliaanalizada.Alladodecadamiembroestudiado:I.1,II.1,II.2semuestran
losalelosencontradosdelosmarcadoresBclI,St14yHindIII,respectivamente.

Figura2.Geldeagarosaa3%,mostrandoelpolimorfismoBclI.Carrilera1(c+):controlpositivoheterocigtico,
laenzimaBclIyseobtienenlasbandascorrespondientesa142,99y43pb.CarrileraII.2:Madredelagestante,
presentalas3bandas,heterocigtica.CarrileraII.1:hemoflico,alelo2(bandas99y43pb).CarrileraI.2.
Gestantehomocigticaparaelalelo2(bandas99y43pb).

Alefectuarladeterminacindesexoresultserunfetovarn.LasbandashalladasenelestudiodelgenAMXY
fueronde1000pb,800pby470pb,talcomosemuestraenlafigura3.

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1729-519X2010000100004 3/5
2017-5-28 Haplotipo del gen del factor VIII en el diagnostico molecular de la hemolia A: Estudio de una familia

A:controlhembranormalB:casoenestudioC:controlvarnnormal
Lasbandasobservadascorrespondena1000pb,aleloenelcromosomaX800pb,aleloenelcromosomaY470
pb,controlinternodeamplificacin.(Esindudablequeennuestropacientelasbandassonlasesperadasenun
varn).

Cuandoserealizeldiagnsticoprenatal,seestudielmarcadorSt14elfetopresentelalelo3paraeste
marcador.(figura4).

Figura4.Geldeagarosaal2%mostrandoelpolimorfismoSt14.Carrilera1:controlpositivo.Carrilera2(III.1):
fetovarnsano(alelo3).Carrilera3(II.1):hemoflico,presentaelalelo1,Carrilera4(I.1):madredelagestante,
homocigticaparaelalelo1,Carrilera5(II.2):Gestante,presentaelalelo1y3.

DISCUSIN
AlanalizaralpolimorfismoBclI,seestablecequeelgenafectadoseestsegregandojuntoconelalelo2dedicho
marcador,comosemuestraenlaFigura2.Paralarealizacindelosestudiosindirectosengeneral,esnecesario
analizarvariosmiembrosdelafamiliaafectadaesimprescindibleelenfermoparaestablecerlafasedeligamiento,
peroademslospadresyencasodelahemofilia,debidoasupatrndeherencia,enocasionesesimprescindible
estudiarhastalosabuelos.Laobtencindemuestrasdelosmiembrosdelafamiliacomodelapacienteserealizan
bajolasnormasticas.Nofueposibleestudiaralpadredelagestante,peroellaresultser2/2portanto,se
infierequeheredelalelo2delpadreyel2delamadre,locualdeterminasucondicindeportadoradelalelo
afectado,peroalserhomocigticanoesinformativa.Conelestudiodelpolimorfismo
St14,nosepuedeconocersilagestanteesportadoraono,debidoaquesumadreeshomocigtica,pero,sin
embargo,seconocequeesportadoraporlainformacinqueofrecielotromarcadorylagestantees
heterocigtica,portanto,sepuederealizardiagnsticoprenatal.

ElpolimorfismoHindIIIfuenoinformativocomoseobservaenlaFigura1,lagestanteylamadreson
homocigticas.

EldiagnsticoprenatalserealizestudiandoalmarcadorSt14,pueseraelnicoparaelcuallagestanteera
heterocigticaelfetopresentelalelo3paraestemarcador(Figura4)porlotanto,esunfetovarnsano.

Conelestudiodeestostresmarcadores,seresaltalaimportanciadeestudiarvariospolimorfismosparala
deteccindeportadorasyeldiagnsticoprenataldelahemofiliaA.Elestudiodirectonospermitedetectarla
mutacinensqueestprovocandolaenfermedad,peroestaentidadesdegranheterogeneidadallicayadems
elporcientodelasmutacionesesmenorde1%esimposibledeterminarcadaunadelasmutacionesreportadas
enelgenafectadoy,porotraparte,lasecuenciaesunatcnicamuycara.Lanicamutacincandidataaestudiar
eslainversindelintrn22,quesegnreportalaliteraturasufrecuenciaesde50%enpacientesconhemofiliaA

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1729-519X2010000100004 4/5
2017-5-28 Haplotipo del gen del factor VIII en el diagnostico molecular de la hemolia A: Estudio de una familia

severa.9,10Conelanlisisdeestafamilia,presenciamoscmolainformacindelospolimorfismosse
complementanentres.Enenfermedadescomolahemofiliaesmuyimportanteelestudiopormtodosindirectos,
puesnosposibilitallegaraundiagnsticoenuncortoperododetiempo,yaqueelanlisisanivelmoleculares
muydifcildebidoalgrantamaodelgenysucomplejaorganizacingenmica.Deah,lasugerenciadeestudiar
otrospolimorfismosdelgendelfactorVIIIparagarantizarunmayorporcientodediagnsticoyconestoelevarla
calidaddelestudiomoleculardelasfamiliasafectadas,talescomo:VNTRdelintrn13ydelintrn22.1114

CONCLUSIONES
ConelestudiodelosmarcadoresmolecularesBclI,HindIIIySt14,sedeterminlacondicindeportadorade
hemofiliaAdelagestante.Adems,fueinformativaparaelmarcadorSt14y,portanto,serealizeldiagnstico
prenatal.Resultserunfetovarnsano.

REFERENCIASBIBLIOGRFICAS
1.WoodWI,CaponDJ,SimonsenCC.etal.ExpressionofactivehumanfactorVIIIfromrecombinantDNAclones.
Nature.(312):33061984.

2.VeharGA,KeytB,EatonD.etal.StructureofhumanfactorVIII.Nature.(312):337421984.

3.LiuQ,SommerSS.SubcyclingPCRformultiplexlongdistanceamplificationofregionswithhighandlowGC
content:applicationtotheinversionhotstopinthefactorVIIIgene.Biot.(25):1022281998.

4.OberleIG,CamerinoR,HeiligL,GrunebaumJP,CazenaveC,CrapanzanoPM,Mannucci&JLMandel.Genetic
screeningforhaemohiliaAwithapolymorphicDNAprobe.N.Engl.J.Med.(312):6826861985.

5.ScottC.KoganandJaneGitschier.GeneticpredictionofHemophiliaA.In:MichaelA.Innis,DavidH.Gelfand,
JohnJ.Sninsky,ThomasJWhite.PCRProtocols.Aguidetomethodsandapplications1990,p.288299.

6.XuefengW,YuanfangL,ZhiguangL,HaiyanC,XiaujieS,YishiF.etal.Carrierdetectionandprenataldiagnosis
ofhemophiliaA.ClinChemLabMed.(39):120412082001.

7.Miller,SA.AsimplesaltingoutprocedureforextractingDNAfromhumannucleatedcells.NucleicAcidsRes.16
(3):12151988.

8.MehraS,SchmidW,SpiegelR.RapiddetectionofsexchromosomalaneuploidiesbyPCR.IndianJMedRes.
(101):11141995,Mar.

9.LombardiAm,CabrioL,ZanonE,PellatiA,VettoreS,GinolaniA.ConfirmationoftheValueofaModifiedLong
distancePolymeraseChainReactionintheDetectionofInversionIntron22inSevereHemophiliaA:ATechnical
Note.ClinApplThrotnbosis/Hemostasis.11(4):493962005.

10.AhmedR,KannanM,ChoudhryV,SaxenaI.Mutationreports:Intron1and22inversionsinIndian
haemophilics.AnnHematol.(82):5465472006.

11.MartnezGR,BentezAH,NavarreteC,PealozaER,SalamancaGF,ArandaAD.PolymorphismDistributionof
Int13,Int22,andSt14VNTRsinaMexicanPopulationandTheirApplicationinCarrierDiagnosisofHemophiliaA.
AmJournofHematol.(77):162004.

12.ChodwdhyryMR,TwariM,KabraM.PrenataldiagnosisinHemophiliaAusingfactorVIIIgenepolymorphism
Indianexperience.AnnHematol.(82):427432003.

13.StonebrakerJS,BrookerM,AmandR,FarrugiasA,SrivastavaA.AstudyofreportedfactorVIIIusearoundthe
world.Haemophilia.(16):33462010.

14.JayandharanG,NairS,PoonnooseM,ThomasR,JohnJ,KeshovS.etal.PolymorphisminfactorVIIgene
modifiesphenotypeofseverehaemophilia.Haemophilia.(15):122812362009.

Todoelcontenidodeestarevista,exceptodndeestidentificado,estbajounaLicenciaCreative
Commons

Calle146No.2511esqAve31Playa,LaHabana,CP11600

cmrrhaban@infomed.sld.cu

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1729-519X2010000100004 5/5