Sunteți pe pagina 1din 14

Sistemul complement

Complementul reprezint un constituent foarte important al aprrii naturale i respectiv o


component normal a serului. Sistemul complement (C) cuprinde circa 30 de componente
celulare sau plasmatice. Sistemul C se poate activa pe trei ci, repectiv calea clasic, calea
lectinic i calea altern. Activarea pe calea clasic este declanat n primul rnd de formarea
complexelor imune (Ag-Ac) dar i de apariia celulelor apoptotice, anumite virusuri sau de
proteina C reactiv cuplat cu anumii liganzi. Calea lectinic poate fi activat de
microorganisme care prezint n structur grupuri manoz-terminale. Calea altern poate fi
activat de bacterii, fungi, virusuri sau de celule tumorale etc.
Sistemul C prezint numeroase activiti biologice fiind implicat n inflamaie (componentele
C3a, C4a, C2b, C5a, complexul C5b7, C3e), n aprarea anti-infecioas (opsonizare, facilitarea
fagocitozei, liza microorganismului implicat), n metabolismul complexelor imune, clearance-ul
celulelor apoptotice sau n reglarea rspunsului imun. Cu toate c n mod obinuit are un rol
benefic, sistemul C poate avea i efecte duntoare.
Reacia de fixare a complementului (RFC)
Face parte dintre reaciile al cror rezultat nu poate fi vizualizat fr un artificiu tehnic, n acest
caz utilizarea unui sistem hemolitic indicator. Motivul pentru care este necesar acest sistem
indicator se datoreaz faptului c Ag este fie sub form macromolecular fie este reprezentat de
corpi microbieni de dimensiuni foarte mici, iar complexul Ag-Ac format nu devine vizibil cu
ochiul liber. RFC a fost imaginat nc din anul 1901 de ctre Jules Bordet i s-a perfecionat
destul de mult de-a lungul timpului. Aceast reacie este utilizat n peste 100 de sisteme Ag-Ac,
prin tehnici clasice sau tehnici care au suferit modificri, inclusiv introducerea micrometodelor
RFC.
Reacia de fixare a complementului se poate folosi att pentru identificarea Ag ct i n
diagnosticul serologic. Pentru c nu urmeaz s discutm pe larg prima variant, vom enumera
doar cteva dintre exemple, RFC permind identificarea unor Ag rickettsiene, chlamydiene,
virale etc. n diagnosticul serologic, cea mai cunoscut metod rmne nc RFC Bordet-
Wasserman, utilizat n diagnosticul serologic al sifilisului.
Subliniem faptul c RFC este o metod laborioas, n care nu se admit erori tehnice, dar fiind
executat corect este foarte exact, are o mare sensibilitate i specificitate. Este de asemenea una
dintre metodele cu un mare grad de reproductibilitate.
Principiu
RFC se bazeaz pe proprietatea sistemului C de a se fixa pe complexul imun Ag-Ac. n prima
faz a reaciei se introduce serul de cercetat iar dac acest ser conine Ac specifici fa de Ag
cunoscut se va forma un complex Ag-Ac, urmat de fixarea C, care se va activa pe calea clasic
i nu va mai fi disponibil pentru a se fixa pe sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac-
antihematie). n cazul n care serul de cercetat nu conine Ac specifici fa de Ag cunoscut, nu va
avea loc formarea unui complex Ag-Ac n prima etap a RFC. Dup introducerea n reacie a
sistemului hemolitic indicator, hematiile i Ac-antihematie se vor cupla, vor forma un complex
imun iar C liber se va fixa pe acesta. Dup fixare va urma activarea Ci respectiv liza
hematiilor, hemoliza putnd fi examinat cu ochiul liber.
Materiale i reactivi necesari:
serul de cercetat recoltat de la pacientul suspect sau o pereche de seruri, obinute n
dinamic
seruri de referin (martor pozitiv i negativ)
Ag cunoscut (suspensie corpuscular sau soluie coloidal, dup caz)
sistemul C obinut din ser proaspt sau conservat recoltat de la cobai
sistemul hemolitic indicator format din
hematii de berbec, soluie 4%, valabil timp de o sptmn la 4C
ser hemolitic anti-hematii de berbec (obinut prin injectri repetate de hematii de oaie la
iepurele de laborator, splate cu soluie salin fiziologic) titrat i conservat la 4C
baie de ap cu temperatur reglabil
plci cu godeuri, tuburi de hemoliz, pipete diferite etc.
Tehnica de lucru:
Aa cum am menionat, tehnica de lucru este laborioas i nu va fi prezentat n totalitate, n cele
ce urmeaz.
serul de cercetat se va menine 30 minute la 56C, n baia de ap, pentru inactivarea C
propriu
principial, RFC are loc n 2 etape
n prima etap se pun n reacie C, serul de cercetat i Ag cunoscut; exist 2 posibiliti:
a. n serul de cercetat exist Ac specifici, rezultnd un complex Ag-Ac pe care se va fixa C b.n
serul de cercetat nu exist Ac specifici, nu se formeaz complex Ag-Ac, Crmne liber
n a doua etap se introduce n reacie sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac anti-
hematie); exist 2 posibiliti: a. C nu este liber, nu are loc hemoliza, b. C se fixeaz pe
sistemul hemolitic, lizeaz hematiile i observm apariia hemolizei
toi reactivii utilizai trebuie standardizai, respectiv se vor realiza
omogenizarea suspensiei de hematii cu eventual etalonare prin spectrofotometrie
titrarea serului hemolitic
titrarea C n prezena Ag
titrarea bidimensional a Ag i a serului de referin
n RFC final se va proceda astfel
se dilueaz conform indicaiilor din protocolul de lucru reactivii utilizai (serul hemolitic,
serurile de cercetat, Ag, serurile de referin, C)
se repartizeaz n godeurile corespunztoare serurile de cercetat, Ag i C
pe o plac separat se prepar martorii (martor pentru sistemul hemolitic, martor pentru C
, martor pentru Ag, 2 martori pentru serul de referin, martor sigur negativ)
plcile se introduc pn a doua zi la 4C
a doua zi, plcile se menin la 37 C timp de 30 minute
se adaug n toate godeurile sistem hemolitic
plcile se menin la 37C timp de 30 minute
se pun plcile la 4C, pn la sedimentarea hematiilor
exist anumite diferene ntre tehnicile cantitative i cele calitative, dar principiile sunt
aceleai
n RFC Bordet-Wasserman, metod calitativ, reacia se realizeaz n eprubete, 2 pentru
reacia propriuzis (una cu ser diluat 1/8, celalt cu ser diluat 1/16, 2 pentru martori sigur pozitiv
i sigur negativ i cte una pentru fiecare din ceilali martori, respectiv martor pentru serul de
cercetat, martor pentru Ag, martor pentru C, martor pentru serul hemolitic)
Interpretare:
Iniial se verific rezultatele aprute pentru martori (fie c este vorba de o metod cantitativ sau
calitativ); spre ex. n cazul metodei calitative, n tubul martor pentru serul de cercetat trebuie s
fie hemoliz, la fel ca i n tuburile martor pentru Ag, C i ser sigur negativ. n tuburile martor
sigur pozitiv i martor pentru sistemul hemolitic, nu trebuie s fie hemoliz.
n tuburile cu serul de cercetat, dac apare hemoliza, nseamn c nu exist Ac iar testul este
negativ (lichidul din tub va avea un aspect rou, limpede).
Testul este pozitiv atunci cnd n tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliz, hematiile se
depun formnd un buton n partea inferioar a tubului (n serul de cercetat exist Ac). Pentru a
stabili diagnosticul final, este necesar ca RFC-BW s fie confirmat prin reacii specifice (vezi
capitolul 45).
Control de calitate:
Cu privire la controlul de calitate am menionat utilizarea martorilor, pentru fiecare reacie.
n RFC utilizat n diagnosticul serologic, Ag cunoscut va fi ales n funcie de suspiciunea de
diagnostic. RFC cantitativ se poate utiliza pentru diagnosticul serologic al infeciilor produse de
Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia spp., Rickettsia spp., Treponema pallidum, Leptospira
spp., Borrelia spp., Brucella spp., diferite virusuri etc.
n scopul creterii sensibilitii i specificitii se aleg proprietile Ag cunoscut, o anumit
temperatur de incubare (de ex. 4C n loc de 37C n RFC Kolmer) etc. Ac fixatori de C
apar precoce n cursul bolii astfel nct identificarea prezenei lor poate semnifica o infecie acut
sau recent.

La fel ca i RFC, n reacia de seroneutralizare (RSN) este necesar un artificiu


tehnic pentru a permite vizualizarea rezultatelor. n cazul RSN, Ag are o anumit proprietate
biologic (toxic, enzimatic) care poate fi blocat prin cuplarea cu Ac specific. Neutralizarea
efectului biologic respectiv se poate realiza doar n cazul n care determinantul pentru toxicitate
sau pentru activitatea enzimatic respectiv este acelai cu determinantul antigenic (epitop).
Reaciile de seroneutralizare ar putea fi utilizate n mai multe mprejurri, spre exemplu n:
diagnosticul microbiologic direct
identificarea Clostridium perfringens prin metoda plcilor semineutralizate (vezi cap. 44)
testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacterium diphteriae (test de seroprotecie, vezi
cap. 11)
toxinotipia n cazul suspicionrii unei toxi-infecii alimentare cu Clostridium botulinum
(vezi cap. 11 i 45)
diagnosticul serologic
reacia ASLO (vezi i cap. 25)
prevenirea unor boli infecioase prevenibile prin vaccinare i evaluarea eficacitii vaccinale
vaccinarea cu anatoxine (DTP, DT, ATPA, ADPA; vezi i cap. 22)
titrarea prezenei Ac anti-toxine (difteric, tetanic etc)
testarea prin IDR (intra-dermo-reacie) a susceptibilitii fa de o anumit boal
infecioas care are la baz drept mecanism patogenic efectul unei exotoxine
tratamentul / profilaxia unor boli infecioase prin utilizarea de imunoglobuline specifice omologe
sau utilizarea unor seruri hiperimune heterologe.
Reacia ASLO
Aceast reacie poate fi utilizat n diagnosticul retrospectiv al unei infecii streptococice sau
pentru confirmarea etiologiei unei boli poststreptococice (mpreun cu criteriile minore i majore
de diagnostic). Reacia ASLO determin titrul Ac anti streptolizin O (SLO).
Principiu:
Titrarea Ac anti-SLO se bazeaz pe faptul c SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de iepure
sau de berbec. n cazul n care n serul de cercetat exist Ac anti-SLO, aciunea hemolitic a SLO
este neutralizat. Combinnd diluii din serul de cercetat cu o cantitate constant de SLO vom
putea determina titrul ASLO.
Materiale i reactivi necesari:
ser de cercetat (sau seruri pereche, recoltate la interval de 2 sptmni)
SLO liofilizat (standardizat de ctre productor)
snge defibrinat de iepure / berbec
soluie salin izoton, soluie de rivanol 0,3%
eprubete, pipete gradate foarte curate
baie de ap, centrifug etc
Tehnica de lucru:
Trebuie urmate toate indicaiile din protocolul de lucru, respectiv
se omogenizeaz suspensia de hematii
se ndeprteaz inhitorii SLO din serul de cercetat (utilizm soluie de rivanol i suspensie de
crbune activ, realizm o diluie de 1/10 a serului care se va menine 30 minute la 56C)
se realizeaz diluiile de ser i se repartizeaz n tuburile de reacie (ser n diluii succesive)
mpreun cu SLO (n cantitate constant, cte 0,5 ml / tub); combinarea serului de cercetat cu
SLO reprezint prima etap a reaciei
se agit tuburile pentru omogenizare i se menin timp de 15 minute la 37C
urmeaz a doua etap a reaciei ASLO, respectiv adugarea suspensie de hematii (5%), cte 0,5
ml n fiecare tub
se agit pentru omogenizare i se incubeaz timp de 45 minute la 37C
se centrifugheaz tuburile timp de 1 minut (1.500 rotaii / minut) i se menin pn a doua zi la
4C (temperatura frigiderului).
Interpretare:
Pornind de la o diluie iniial a serului de 1/10, dup adugarea tuturor reactivilor titrul (numrul
de uniti ASLO) va fi 12, 50 n tubul urmtor, 100, 125, 166, 250, 333 etc n tuburile urmtoare.
Titrul reaciei ASLO este dat de cea mai mare diluie de ser la care lipsete complet hemoliza.
Pentru zona noastr geografic se accept ca normal un titru de 200 (maxim 250) uniti ASLO.
Exist teste serologice i pentru evidenierea prezenei i titrului anticorpilor fa de alte structuri
antigenice (de exemplu streptodornaz, hialuronidaz, streptokinaz).
Control de calitate:
Ultimele 2 tuburi sunt reprezentate de tubul martor pentru hematii, n care se verific rezistena
hematiilor i respectiv tubul martor pentru SLO n care se pun SLO i suspensia de hematii.
Exist i posibilitatea de a realiza o micrometod ASLO, reacia efectundu-se n plci de
material plastic cu godeuri.
Utilizarea RSN n profilaxia i tratamentul unor boli infecioase
Vaccinarea n scopul obinerii unei protecii prin seroneutralizare
Vaccinul DTP include o suspensie de germeni (Bordetella pertussis) n faza I, combinat cu
anatoxina difteric i tetanic. Primovaccinarea se ncepe vrsta de 2 luni a nou-nscutului,
administrndu-se 3 doze la interval de 2 luni (la 2, 4, 6 luni). Pentru meninerea imunitii se
practic revaccinarea I la 6 luni de la primo-vaccinare iar revaccinarea a II-a se practic la 36 de
luni de via a copilului respectiv. Datorit posibilelor reacii adverse (fa de componenta
pertussis) se recomand eliminarea acesteia la nou-nscuii cu probleme ale sistemului nervos, la
cei predispui la boal i la cei care au avut o reacie advers semnificativ la o administrare
anterioar a DTP-ului. Se studiaz posibilitatea utilizrii pe scar larg a unui vaccin acelular n
care s fie inclus toxina pertussis inactivat.
Evaluarea eficacitii vaccinurilor
Se recomand testarea strii de imunitate indus prin vaccinare, conform normativelor elaborate
de autoritile de sntate public; metodele au la baz titrarea Ac anti-toxin (difteric, tetanic
etc) n seruri prelevate de la copii vaccinai, prin diferite tehnici. Spre exemplu se consider c
un copil este protejat (prezint rezisten specific n cazul unei infecii difterice) dac titrul Ac-
anti toxin difteric este mai mare de 0,03 UAI / ml
Se pot face teste de susceptibilitate, in vivo, pentru a verifica dac persoana investigat este sau
nu protejat fa de o eventual infecie. n acest scop se practic IDR. n istoria medicinei au
intrat IDR Dick, care permite testarea susceptibilitii fa de scarlatin (toxina este elaborat de
ctre streptococul de grup A lizogenizat) i respectiv IDR Schick, care permite testarea
susceptibilitii fa de difterie (toxina este elaborat de ctre bacilul difteric lizogenizat).
ambele IDR se realizeaz similar din punct de vedere tehnic
spre ex. n cazul IDR Schick se injecteaz n treimea medie a antebraului, strict
intradermic o cantitate de 0,1 ml toxin difteric diluat corespunztor. n cazul n care n
sngele persoanei testate se gsete o cantitate de Ac anti-toxin mai mare de 0,03 UAI / ml,
toxina inoculat va fi neutralizat i nu va aprea nici o modificare la locul inoculrii (lipsa
eritemului semnific faptul c persoana testat nu este susceptibil s fac difterie, n cazul n
care se infecteaz cu un bacil difteric toxigen). n cazul n care persoana respectiv nu prezint
Ac anti-toxin difteric, Ag inoculat va conduce la apariia unui eritem la locul de inoculare
UAI = unitate anti-toxic internaional
Terapia sau profilaxia specific (imunoterapie pasiv)
Administrarea de imunoglobuline specifice omologe, obinute de la persoane imunizate (natural
sau artificial) fa de o anumit maladie infecioas, de ex. n imunoterapia infeciei cu
Clostridium tetani (tetanos) se pot administra intramuscular 3-6.000 UAI
Administrarea de seruri imune heterologe, obinute prin hiperimunizarea cailor, n tratamentul
tetanosului, difteriei, botulismului etc.
Terapia bolilor n care mecanismul patogenic implic exotoxine trebuie instituit ct mai rapid,
deoarece exotoxinele pot fi neutralizate numai atunci cnd se gsesc n circulaie

20. Reacii antigen-anticorp: reacii n care componentele


sunt marcate
Reamintim c, n funcie de natura antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare, scopul
urmrit exist mai multe tipuri de reacii Ag-Ac, i anume:
1. reacii de precipitare
2. reacii de aglutinare
3. reacia de fixare a complementului (RFC)
4. reacii de seroneutralizare.
Dac n cazul primelor 2 tipuri de reacii vizualizarea se poate face direct (cu ochiul liber, cu
ajutorul unei lupe etc) n cazul RFC i RSN este necesar utilizarea unor sisteme indicator. n
continuare vom discuta despre reaciile Ag-Ac n care pentru interpretare este necesar marcarea
reactanilor, ceea ce se poate face:
izotopic (radio immuno assay, RIA)
enzimatic (enyzme linked immuno assay, ELISA)
fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA)
chemiluminiscent (chemiluminiscent assay, CLA) etc.

Radioimunoanaliza (RIA)
Posibilitatea utilizrii izotopilor radioactivi n medicin a condus la multe descoperiri importante
n domeniu. Introducerea RIA, pentru determinarea cantitativ a prezenei unui mare numr de
substane prezente n cantiti foarte mici n lichidele biologice, a constituit un real succes. RIA a
fost i nc mai este utilizat n multe dintre specialitile medicale.
Pentru marcarea Ag se pot utiliza 3H, 125I, 14C etc. Se introduc n reacie o
cantitate cunoscut de Ag marcat radioactiv, Ag nemarcat pe care dorim
s l dozm i Ac cunoscui cu specificitate fa de Ag. Se va realiza o
competiie pentru cuplarea cu Ac ntre Ag marcat i Ag nemarcat
radioactiv. Dup respectarea timpilor din protocolul de lucru se msoar
radioactivitatea complexului Ag-Ac i aplicnd formule de calcul
corespunztoare se poate afla cantitatea de Ag nemarcat.
RIA este o tehnic obiectiv, cu foarte mare sensibilitate, permite cuantificarea unor cantiti
foarte mici de Ag sau de haptene dar, datorit problemelor legislative, costului aparaturii i
reactivilor, riscurilor implicate, este nlocuit din ce n ce mai mult cu tehnici de tip ELISA.

Analiza imunoenzimatic (ELISA, EIA)


Marcarea enzimatic a fost introdus pentru prima oar n histochimie, n 1966, dup 5 ani
devenind un marker i n cazul reaciilor Ag-Ac. Prezena complexelor Ag-Ac va
putea fi vizualizat i cuantificat deoarece unul dintre reactivi este
conjugat cu o enzim, iar dup adugarea n mediul de reacie a unui
substrat cromogen specific enzimei marker, densitatea optic a mediului
de reacie se va modifica iar valoarea densitii optice se poate
nregistra.
Reaciile imunoenzimatice pot avea lor n sistem omogen sau heterogen (activitatea markerului
enzimatic nu este influenat de ctre reacia Ag-Ac). n continuare nu vom discuta dect despre
al doilea tip de reacii, care sunt mai frecvent utilizate n microbiologie.
Tehnicile ELISA pot fi utilizate att pentru identificarea Ag ct i pentru identificarea i / sau
titrarea Ac. n general, reaciile imunoenzimatice se realizeaz n urmtoarea succesiune:
primul reactiv (Ag sau Ac, n funcie de ceea dorim s determinm)
este fixat pe un suport solid (foarte frecvent reprezentat de godeurile
unor plci de plastic, dar pot fi i bile, tuburi etc); de regul aceast
fixare se realizeaz de ctre companiile productoare
adugm al doilea reactiv, cel necunoscut (Ac sau Ag)
n cazul n care exist complementaritate structural i
electrochimic ntre cei doi reactivi, are loc cuplarea i formarea
complexului Ag-Ac; pentru eliminarea reactivilor care nu au intrat n
complex are loc o prim splare
reactivul adugat n urmtoarea etap variaz n funcie de tipul de
tehnic ELISA (n finalul acestui subcapitol vom prezenta pentru
exemplificare una dintre variantele tehnice); de ex. se poate aduga un
reactiv care se poate cupla cu Ac, iar acest reactiv este la rndul lui
cuplat cu enzima (conjugat enzimatic); n continuare are loc o nou
splare
pentru vizualizarea reaciei, adugm un substrat cromogen pe
care enzima poate aciona i conduce la apariia unei culori care se poate
vedea i cu ochiul liber, dar se citete cu ajutorului unui
spectrofotometru
valorile nregistrate pentru prob se compar cu valorile
nregistrate pentru martorul pozitiv i martorul negativ, se aplic formula
indicat de ctre productor, iar interpretarea se face aa cum este indicat
n protocolul tehnic care nsoete trusa ELISA.
Enzimele utilizate mai frecvent sunt fosfataza alcalin i peroxidaza. n cazul primei
enzime, substratul cromogen va fi p-nitro-fenil-fosfatul iar n cazul peroxidazei, substratul
cromogen va fi o-fenilen-diamina n soluie de ap oxigenat.
Prin tehnicile de tip ELISA se obine o specificitate bun sau foarte bun iar sensibilitatea este
comparabil cu cea obinut n cazul RIA. Tehnica este obiectiv, a devenit automatizat, iar prin
extinderea ofertei i creterea numrului celor care o utilizeaz preurile sunt competitive.
Exist mai multe modaliti de clasificare pentru aceste tehnici, spre exemplu:
n funcie de scopul urmrit, se poate determina prezena Ag n diferite produse patologice
sau prezena Ac n ser, LCR, alte umori
n funcie de tipul i ordinea reactivilor introdui n reacie tehnicile pot fi necompetitive
sau de competiie (directe sau indirecte)
n funcie de complexitatea tehnicii, putem discuta despre variantele clasice (aa cum a
fost descris mai sus i respectiv aa cum urmeaz s fie prezentat n exemplul concret) i
respectiv despre variantele simple / rapide.
n anumite situaii, rezultatele obinute prin ELISA trebuie confirmate prin metode mai specifice.
n continuare vom prezenta succint etapele ELISA n cazul determinrii prezenei de Ac anti-
mycobacterieni n ser. Nu exist nc o standardizare a diagnosticului serologic n tuberculoz
(vezi cap. 42) dar aa cum urmeaz s discutm, pentru a pune diagnosticul unei infecii cu M.
tuberculosis, toate datele care pot fi obinute sunt importante i trebuie analizate n context.
Principiu:
Anticorpii prezeni n serul de analizat se leag specific de Ag imobilizate pe
microplci Koh-I-Nor Hardmuth. Complexul imun format, reacioneaz prin
fragmentul Fc al imunoglobulinelor (n special IgG) cu conjugatul Protein A
stafilococic - peroxidaza din hrean (SpA-HRPO) care este pus n evidena cu orto-
fenilen-diamin HC1 (OPD). Reacia este cuantificat fotometric.
Materiale i reactivi necesari:
Plci sensibilizate (IC)
Tampon 1 (TFSTCH) este format din tampon fosfat salin pH 7.2, 0.15M, Tween 20 0.05%
casein Hammersten 0.5% i mertiolat de sodiu 0,1%. Se pstreaz la + 4oC. este utilizat pentru
rehidratare i diluri.
Tampon 2 (TFST) de 10 ori concentrat are aceeai compoziie ca Tamponul 1 cu excepia
caseinei Hammersten. este utilizat pentru splri.
Tampon citrat (3) pH 5.0, pentru dizolvarea OPD
Ortofenilen diamin (pastile de 9mg, cntrite de productor)
Ser de cercetat
Ser martor pozitiv (M+)
Ser martor negativ (M-)
Soluie concentrat de conjugat SpA-HRPO
Perhidrol (30% H2O2)
Tehnica de lucru
n godeurile plcii sensibilizate (Institutul Cantacuzino) se introduc 100 ml Tampon 1 i se
incubeaz 60 minute la 37oC.
Placa se golete de coninut (automat sau prin rsturnare i scuturare pe un strat de hrtie
de filtru).
Probele de ser de analizat i serurile martor (M+ i M-) se dilueaz 1/25 n Tampon 1 (25
ml ser + 0.6 ml Tampon 1). Serurile se repartizeaz cte 100 ml n 3 godeuri paralele, notndu-se
n caietul de lucru poziia serurilor.
Incubm placa la 37o timp de 60 min, n atmosfera umed.
Placa se spal de 3 ori cu Tampon 2 i de 2 ori cu ap distilat, pentru nlturarea spumei.
Pentru aceast operaie, nti se dilueaz Tamponul 2 concentrat prin amestecarea unui volum
Tampon 2 cu 9 volume ap distilat.
Conjugatul SpA - HRPO se dilueaz 1/500 n Tampon 1 (30 ml conjugat + 15 ml Tampon
1) i se repartizeaz cte 100 ml /godeu
Se incubeaz 60 min la 37o n camer umed.
Se nltur din godeuri conjugatul i se spal ca mai sus de 3 ori cu Tampon 2 i de 2 ori
cu ap distilat.
Se prepar soluia de OPD prin adugarea a 15 ml Tampon 3 si 8 ml perhidrol,
repartizndu-se cte 100 ml /godeu.
Se incubeaz la temperatura camerei, ferit de lumin direct, pna n momentul apariiei n
godeul corespunztor serului M+ a unei culori galbene intense iar corespunztor serului M- lipsa
apariiei culorii. Aceasta se realizeaz n circa 10-30 min.
Analiza se face cu ajutorul unui fotometru (l = 450 nm) fr blocare cu acid.
Interpretare:
Rezultatele se exprim n Uniti Imuno Enzimatice (UIE) dupa relaia: (OD X - OD M- /
OD M+ - OD M -) 100
* n care OD X reprezint densitatea optic a probei de analizat, OD M- este densitatea optic a
serului martor negativ iar OD M+ densitatea optic a serului martor pozitiv.
Valorile de pn la 10 UIE sunt considerate nesemnificative, dei pot indica un nceput de
sintez de anticorpi, repetarea determinrii dup 1-2 luni, putnd indica o cretere a titrului.
Indiferent de valoarea obinut rezultatele se vor interpreta n contextul clinic,
epidemiologic i paraclinic, innd cont de rezultatele examenului microbiologic direct.

Imunofluorescena (FIA, IF)


Imunofluorescena poate fi utilizat att n diagnosticul microbiologic direct (pe p.p. recoltat de
la bolnav sau pe cultura pur) ct i n diagnosticul serologic. Unul dintre reactivi (Ag, Ac
sau Ac anti-Ac) este marcat fluorescent. Posibilitatea cuplrii stabile a Ac cu fluorocromi,
fr alterarea specificitii Ac, a fost evideniat nc din anul 1942.
Fluorocromii sunt compui organici care, dup iradiere cu radiaii ultraviolete absorb radiaia
excitant, intr n stare de excitaie iar atunci cnd revin n starea normal pierd energia
acumulat emind radiaii luminoase (vezi i cap. 8). Dintre fluorocromi am putea aminti
auramina O, rhodamina B, acridin-oranj R sau tripaflavina. Lumina vizibil emis depinde de
fluorocromul utilizat (spre exemplu culoarea este galben pentru auramina O, galben-portocalie
pentru combinaia de auramin O rhodamin B etc).
Tehnicile IF pot fi de tip direct sau de tip indirect.
n cazul IF direct, Ag este necunoscut i se poate afla ntr-o cultur, etalat pe frotiu ca atare
sau parazitnd anumite celule (ex. se poate utiliza o prob recoltat prin biopsie). Produsul
care urmeaz a fi analizat este incubat n prezena Ac marcai fluorescent, cunoscui. Spre ex. n
cazul frotiului colorat fluorescent, dup realizarea frotiului acoperim lama cu serul care
conine Ac marcai fluorescent, incubm timp de 30 minute la 37 C, splm cu tampon fosfat
salin i apoi cu ap distilat (pentru ndeprtarea Ac care nu au intrat n complexul Ag-Ac),
ateptm s se usuce i examinm cu microscopul cu fluorescen. Putem identifica astfel Ag
aparinnd speciilor Legionella pneumophila, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis,
Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Cryptococcus neoformans, Histoplasma
capsulatum, Pneumocystis carinii etc. Metoda este rapid i aplicabil pentru frotiuri din p.p. sau
din cultur dar i n anatomia patologic sau n histochimie. Pentru fiecare Ag de cercetat trebuie
preparat serul care conine Ac specifici, marcai fluorescent.
IF indirect presupune realizarea unui frotiu pornind de la Ag cunoscut. Frotiul se acoper
cu ser de cercetat i dup o incubaie de 30 minute la 37 C splm cu tampon fosfat salin i cu
ap distilat pentru ndeprtarea reactivilor care nu au intrat n reacia Ag-Ac. Pe frotiu se pune
un ser cu Ac anti-Ig de om, marcai fluorescent i se incubeaz timp de 30 minute la 37 C, se
spal, se ateapt uscarea frotiului, urmnd examinarea la microscopul cu fluorescen. n
situaia n care n serul de cercetat exist Ac specifici Ag cunoscut, are loc formarea complexului
Ag-Ac iar n etapa urmtoare, Ac anti-Ig de om se cupleaz pe complex i n mod indirect, prin
fluorescen, identificm (i n unele variante tehnice putem titra) Ac. Metoda poate fi utilizat n
diagnosticul serologic al infeciilor produse de Legionella pneumophila, Mycoplasma
pneumoniae, Leptospira spp., Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum, Helicobacter pylori,
Toxoplasma gondii, Pneumocystis carinii etc.

Teste imunobiologice, prin tehnica intradermoreaciei (IDR), folosind antigene care stimuleaz
rspunsul imun de tip celular (ntrziat); n literatura internaional este recomandat o
baterie de antigene, patru-cinci dintre antigenele menionate n continuare
Candidin (antigen extras din Candida albicans, un extract apos realizat n diluie 1 / 10;
antigenul este numit i Dermatophyton O)
Coccioidin (antigen extras din Coccidioides immitis) care ns poate interfera cu testele
serologice realizate pentru histoplasmoz
Histoplasmin (antigen extras din Histoplasma capsulatum) care produce i o cretere a
titrului anticorpilor fixatori de complement
Antigenul extras din virusul urlian
Fitohemaglutinin (mai rar folosit in vivo)
Lizat din cultur de Staphylococcus aureus
O combinaie ntre streptokinaz i streptodornaz
Toxoid tetanic, cu concentraia de 10 limes floculans / ml (diluat)
Toxoid difteric, cu concentraia de 30 limes floculans / ml (nediluat); pentru ultimele 2
antigene pot aprea reacii de hipersensibilitate de tip umoral ceea ce poate crea probleme
importante n ceea ce privete evaluarea rspunsului imun de tip celular
Tricofitin (extras din Trichophyton spp.)
Tuberculin (derivat proteic purificat, PPD, extras din cultura de Mycobacterium
tuberculosis).
n cele ce urmeaz vom discuta despre IDR cu PPD.
Principiul metodei
Tuberculina reprezint un amestec relativ bine standardizat de antigene proteice mycobacteriene,
utilizat n mod curent pentru decelarea infeciei tuberculoase (TB), individual sau populaional.
Acest extract se poate utiliza n cadrul unei baterii de teste IDR pentru evaluarea reactivitii
din punct de vedere al rspunsului imun de tip celular (RIC). Dup ce o persoan dat se
infecteaz cu mycobacterii, urmeaz sensibilizarea i proliferarea anumitor populaii de limfocite
T (LT). Injectarea intradermic a tuberculinei stimuleaz LT i declaneaz o serie de evenimente
ce conduc la un apariia unui RIC i a unor manifestri de hipersensibilitate de tip IV. Reaciile
implic vasodilataie, edem i infiltrat cu limfocite, bazofile, monocite, neutrofile. LT antigen-
specifice prolifereaz i elibereaz limfokine care mediaz acumularea local a diferitelor alte
celule. Rspunsul maxim se constituie la circa 48 ore dup injectare. Aria induraiei (infiltratului
celular) reflect hipersensibilitatea de tip ntrziat. Eritemul reprezint o reacie inflamatorie
acut, cauzat de vasodilataia capilar iar apariia eritemului nu va fi interpretat drept o reacie
pozitiv. Limfocitele sensibilizate ating un nivel adecvat pentru a conduce la apariia unui
rspuns interpretabil dup 2-4 sptmni de la infecia iniial cu M. tuberculosis. Sensibilitatea
poate persista mai muli ani, dar reactivitatea scade de regul o dat cu vrsta.
Materiale i reactivi necesari
Pornind de la tuberculina preparat de Koch (Old-tuberculin, 1891), n 1901 a fost realizat
produsul New tuberculin, iar ulterior derivatul proteic purificat (PPD-S, preparat de Seibert n
anul1941), adoptat ca Standard Internaional pentru PPD. Metoda de obinere a fost reprezentat
de precipitarea proteinelor din filtratul mediului de cultur concentrat la cald, cu soluie 50%
sulfat de amoniu. Unitatea internaional pentru PPD este definit drept activitatea biologic
coninut n 0,000028 mg de PPD-S (0,00002 mg PPD + 0,000008 mg sruri). PPD-RT 23
reprezint lotul de tuberculin purificat n anul 1958 n Danemarca i asigur omogenitatea
produsului antigenic folosit in studii epidemiologice n lumea ntreag. Din produsul realizat
iniial se prepar diluiile necesare (etalonate) la care se adaug Tween 80 n scopul reducerii
absorbiei pe peretele de sticl al fiolei. n mod uzual se utilizeaz 2 UI/doz, echivalentul a 5 UI
PPD-S. n raport cu PPD-RT23, n Romnia se utilizeaz PPD IC-65 produs de ctre INCDMI
Cantacuzino.
Tehnica de lucru
n ara noastr se utilizeaz tehnica injectrii intradermice (Mantoux).
controlm produsul biologic pe care urmeaz s l utilizm din punct de vedere al
perioadei de eficacitate, conservrii n condiiile prevzute de ctre productor;
utilizm numai seringi cu volumul de maxim 1 ml i cu diviziuni clar marcate, cel puin
pentru fiecare 1/10 ml precum i ace pentru injecie intradermic, de unic ntrebuinare;
agitm energic fiola pentru a omogeniza concentraia produsului biologic, tiut fiind c, n
timpul unei conservri mai ndelungate, tuberculina tinde s se absoarb pe pereii de sticl ai
fiolei;
aspirm n sering o cantitate suficient de soluie pentru a putea elimina integral orice
bul de aer aprut ntre piston i orificiul acului;
poziionm acul astfel nct bizoul s fie aliniat diviziunilor seringii;
antiseptizm cu alcool (minim 3 minute) o arie situat pe faa anterioar a antebraului
stng, la unirea treimii medii cu cea superioar;
cuprindem zona respectiv a antebraului n palm, ntinznd pielea ct mai uniform ntre
extremitatea inferioar a eminentei tenare i hipotenare pe de o parte i cele patru degete strns
lipite, pe de alt parte;
ptrundem cu acul aproape tangent la suprafaa antebraului, cu bizoul n sus, pn acesta
este situat n derm;
eliberm tegumentul i fixm seringa presnd-o pe antebraul subiectului, avnd grij s
nu se acopere diviziunile seringii pentru a putea urmrii cantitatea injectat;
injectm strict 0,10 ml; dac injectarea s-a fcut strict intradermic apare o bul uor
denivelat, cu margini relativ abrupte, cu aspect de coaj de portocal i diametru de 5-8 mm; n
lipsa apariiei acestei bule (n cazul injectrii hipodermice sau cnd se pierde soluie ntre sering
i acul incorect montat), este recomandat s se reia manevra cu mai mult atenie, repetnd
injectarea la o distan de 3-5 cm sau la antebraul opus.
La persoanele infectate anterior (sensibilizate), la locul injectrii apare o reacie constnd din
eritem-edem-induraie ncepnd dup circa 6 ore i atingnd un nivel maxim dup circa 36-60
ore, care se retrage n urmtoare cteva zile. Pe locul reaciei poate persista o perioad
ndelungat o zon de hiperpigmentaie.
Citirea rezultatului
Citirea rezultatului se face de regul dup 72 ore, asigurnd o bun iluminare a zonei examinate
(este de preferat lumina natural). Recomandm o prim citire la 24 ore (pentru a surprinde o
eventual hipersensibilitate de tip umoral fa de antigenul inoculat care are structur proteic), o
a doua citire la 48 ore i citirea final la 72 de ore.
Identificm existena unei eventuale arii intens eritemato-violacee, care circumscrie zona n care
am fcut inocularea. n cazul existenei unei astfel de reacii, apreciem tactil (prin micri
repetate, atingnd zona respectiv) cu pulpa policelui sau inelarului limitele zonei de infiltraie
dermic (perceput ca fiind reliefat) corespunznd din punct de vedere histopatologic
inflamaiei (edem, limfocite, macrofage, PMN) i care reprezint reacia nespecific i specific
fa de antigenul injectat.
Msurm diametrul maxim al zonei de infiltraie. Notm i semicantitativ intensitatea
infiltraiei dermice ("tip Palmer"), semnificaia fiind urmtoarea:
tip I, induraie ferm sau prezena unei flictene;
tip II, induraie elastic;
tip III, infiltraie depresibil;
tip IV, fr infiltraie aparent.
Citirea reaciei tuberculinice reprezint o evaluare subiectiv, existnd posibilitatea unor
importante variaii inter- i intraindividuale din partea persoanelor care efectueaz lectura. Dubla
citire "n orb" fr cunoaterea rezultatului celeilalte lecturi, poate reduce variaiile grosiere, cu
condiia ca ambele persoane care citesc rezultatul s aib experien cu aceast tehnic.
Interpretarea rezultatului testului tuberculinic (IDR cu PPD).
n funcie de analizele statistice efectuate, exist cteva recomandri cu privire la interpretarea
IDR cu PPD.
Centrul de control i prevenire a bolilor Atlanta-Georgia (CDC) a modificat relativ recent
clasificarea reactivitii la testul cutanat efectuat cu 5 UI PPD dup cum urmeaz:
1. Reacia este considerat a fi pozitiv dac diametrul induraiei este >5 mm n urmtoarele
cazuri:
persoane care au avut un contact recent cu un caz de TB;
persoane cu semne radiologice de TB;
persoane infectate cu HIV.
2. Reacia este considerat a fi pozitiv dac diametrul induraiei este 10 mm n cazul
persoanelor care nu intr in categoriile menionate mai sus dar au ali factori de risc, spre
exemplu:
persoane nscute n ri n care prevalena TB este crescut (din Asia, Africa, America
Latin etc);
persoane care folosesc droguri inoculate pe cale injectabil;
persoane fr adpost sau care locuiesc n azile sau n instituii corecionale;
persoane care prezint afeciuni care cresc riscul apariiei TB (silicoz, diabet zaharat, boli
hematologice i ale sistemului reticuloendotelial, malnutriie) sau sunt tratate cu medicamente
imunosupresive.
3. Reacia este considerat a fi pozitiv dac diametrul induraiei este 15 mm n cazul altor
situaii dect cele menionate mai sus
NB. Persoanele infectate cu alte tipuri de mycobacterii pot prezenta reacii pozitive dup IDR cu
PPD, ns de regul diametrul induraiei <10 mm, excepiile (diametru > 10mm) putnd apare n
special la debutul infeciei.
n ara noastr se consider drept pozitive reaciile atunci cnd diametrul este 9 mm. Aceast
definiie convenional se bazeaz pe rezultatele unor testri efectuate pe eantioane
semnificative statistic, la care analiza epidemiologic a distribuiei valorilor a artat c plasarea
limitei ntre valorile de 9-10 mm separ cel mai bine cele 2 categorii (neinfectai i infectai)
asigurnd cel mai sczut procent de rezultate fals pozitive i respectiv fals negative. Clasificarea
indivizilor dintr-o populaie n negativi i pozitivi la testul tuberculinic servete la msurarea
extinderii infeciei TB n acea populaie (prevalena infeciei) oferind un plus de informaie prin
analiza separat pe grupe de vrst. Dac se repet determinarea prevalenei infeciei pe vrste la
intervale definite de timp, dinamica prevalenei infeciei n fiecare cohort permite determinarea
riscului anual de infecie, indicator fiabil al evoluiei endemiei tuberculoase.
n ceea ce privete investigarea reactivitii din punctul de vedere al RIC pentru un anumit
subiect, la care s-a utilizat o baterie de antigene, dac spre exemplu rezultatul este negativ
pentru fiecare dintre cele 4-5 antigene folosite se poate presupune faptul c subiectul respectiv
este anergic n ceea ce privete RIC i se recomand efectuarea unor investigaii suplimentare.