Sunteți pe pagina 1din 26

CAPITOLUL 3

SISTEME DE TESTE CARE UTILIZEAZ GENELE REPORTER


PENTRU INVESTIGAREA RECEPTORILOR CUPLAI CU
PROTEINA G IMPLICAI N DESCOPERIREA DE NOI
MEDICAMENTE

3.1. Receptorii i comunicarea celular


Organismele superioare, printre care, i omul, conin milioane de celule care au
un rol important n reglarea funciilor fiziologice. n consecin, celulele au
capacitatea de a comunica una cu cealalt i o disfuncie de comunicare celular
poate conduce la diverse boli. n controlul funciei celulare, o influen considerabil
o au moleculele de semnalizare extracelular i complementar acestora numeroase
proteine receptor [Uings IJ, 2000]. Fiecare celul rspunde la un anumit set de
semnale care acioneaz n diverse combinaii pentru a regla comportamentul
celulelor. Din cauza structurii unice tridimensionale a proteinei receptor, numai
cteva molecule de semnalizare sunt capabile de a se lega de un anumit receptor. Prin
urmare, fiecare celul acioneaz ntr-un mod caracteristic i programat. Cele mai
multe molecule de semnalizare extracelular, cum ar fi adrenalina, serotonina,
dopamina i neuropeptidul Y sunt hidrofile, i pot activa receptorii proteinelor numai
la suprafaa celulelor int. n consecin, receptorii transmit semnalul prin conversia
evenimentelor extracelulare n semnale intracelulare care modific comportamentul
celulelor int. Exist trei mari familii de receptori de suprafa celular, care aparin
la aceeai familie de proteine transmembranare: i) receptorii cuplai cu canale ionice,
ii) receptorii de suprafa cu activitate enzimatic i iii) receptorii cuplai cu proteine
G. Fiecare familie asigur o transducie specific a semnalelor extracelulare.

1
3.1.1. Receptorii cuplai cu canale ionice
Una din clasele de receptori de suprafa celular sunt receptorii cuplai cu
canale ionice, cunoscui, de asemenea, ca i canale ionice dependente de ligand
(LGICs). Aceti receptori sunt diferii de receptorii cuplai cu proteine G (GPCRs) i
sunt implicai n semnalizarea sinaptic rapid prin circulaia ionilor prin canalele cu
poart controlate de neurotransmitori. De obicei, canale ionice cu poart
dependente de ligand sunt nchise n stare de repaus, dar se deschid ca rspuns la
agoniti. Dup activare, canalele implicate se desensibilizeaz spontan. Schimbrile
de potenial membranar produse constituie un semnal care poate fi ulterior prelucrat
de ctre celule receptoare.
n prezent,se cunosc trei superfamilii de canale ionice cu poart dependente de
ligand: superfamilia de receptori nicotinici, familia de receptori glutamatergici i de
receptorii ATP.
Superfamilia de receptori nicotinici este compus din mai multe familii de
receptori, inclusiv receptorii nicotinici pentru acetilcolin, receptorii 5-
hidroxitriptamin (HT)3 pentru serotonin, receptori pentru acidul -aminobutiric
GABAA i GABAc, i receptorii pentru glicin sensibili la stricnin [Chebib M,
2000]. Cei mai studiai i cel mai bine-nelei dintre aceti receptori sunt receptori
GABA i cei pentru acetilcolin. Acetia se consider a fi compui pentamerici ai
subunitilor de proteine i sunt caracterizai printr-un domeniu N-terminal
extracelular mare. Cea de-a doua superfamilie de receptori, receptorii glutamatergici
excitatori sunt abundeni n cele mai multe regiuni ale sistemului nervos central la
mamifere. Din aceast superfamilie fac parte: receptorii pentru N metil- D-aspartat
(NMDA), receptorii pentru acidul propionic -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol
(AMPA) i receptorii kainat [Burnashev N, 2000]. Receptorii nativi conin patru sau
cinci subuniti care sunt asamblai ca homomeri, dublei sau triplete.
Subtipul de receptori ATP P2x sunt membrii ai celei de a treia superfamilii, i au
o distribuie larg n cadrul sistemului nervos central i sistemului cardiovascular.

2
3.1.2. Receptorii de suprafa cu activitate enzimatic
Receptorii cu activitate enzimatic sunt legai de proteinele transmembrane
prin domeniul de legare al ligandului de pe suprafaa exterioar a membranei
plasmatice.
Domeniul lor citosolic fie are o activitate enzimatic intrinsec, fie este asociat
direct cu o enzim. Fiecare subunitate a unui receptor catalitic are doar un domeniu
transmembranar. Cei mai importani receptori din aceast familie sunt receptorii
tirozin kinazici i receptori asociai tirozin kinazei.
Muli receptori cunoscui, cum ar fi receptorii factorului de cretere epidermic
(EGF) [Leof EB., 2000], receptorii pentru insulin, receptorii pentru factorul de
crestere derivat din trombocite (PDGF) i receptorii pentru factorul de cretere al
endoteliului vascular (VEGF) aparin grupului de receptori tirozin kinazici [Simon
MA. 2000].
Aceti receptori sunt singurii cu helixuri transmembranare care dimerizeaz
dup legarea ligandului, excepia fiind cea a receptorului de insulin, ce este deja un
dimer transmembranar [Cruce M, 2000]. Dup dimerizare, are loc autofosforilarea
receptorilor, care determin fosforilarea a mai multor tipuri de molecule de
semnalizare la nivelul resturilor tirozin specifice. De exemplu, activitatea Ras este
stimulat, i, astfel, nivelul de mesager secund crescut moduleaz factori de
transcripie i alte proteine celulare. Receptorii tirozin kinazici joac un rol important
n reglarea metabolismului celular, proliferarea i diferenierea celular.
Receptorii pentru citokine aparin receptorilor asociai tirozin kinazei. Acetia
prezint un domeniu extracelular de legare al ligandului, un singur domeniu
transmembranar i un domeniu intracelular. Domeniul intracelular nu are activitate
catalitic. Receptorii pentru interleukine sunt exemple de receptori asociai tirozin
kinazei. Dup legarea ligandului, o tirozin kinaza asociat cu receptorul este activat
prin fosforilare. Kinazele Src sau Jak sunt exemple de tirozin kinaze de acest tip.

3
Activarea tirozin kinazei are ca rezultat fosforilarea proteinelor cu rol n
transducia semnalului i activarea transcripiei (STAT) care acioneaz ca factori de
transcriere.
Mai mult dect att, receptorii serin/treonin kinazici mai sunt cunoscui sub
numele de receptori cu activitate enzimatic de suprafa, fiind implicai n mai multe
procese celulare, cum ar fi proliferarea, migrarea i diferenierea. Aceti receptori
conin o mic regiune extracelular, un singur domeniu transmembranar i o regiune
citoplasmatic, care acioneaz ca o serin/treonin kinaz. Un reprezentant al acestei
familii [Zhu HJ, 2001.] este receptorul factorului de cretere transformant (TGF)-.
O alt familie de receptori celulari de suprafa cu activitate enzimatic sunt
receptorii pentru guanilil/guanilat ciclaza. Receptorul pentru peptidul natriuretic atrial
este cel mai cunoscut membru al acestei familii i catalizeaz formarea de GMPc.
Efectele majore sunt natriureza, diureza i inhibarea sintezei de aldosteron.

3.1.3. Receptori cuplai cu proteina G (GPCRs)


GPCRs reprezint cea mai mare i cea mai important familie de receptori
transmembranari caracterizai prin secvene de aminoacizi, care conin apte domenii
hidrofobe. Aceste domenii reprezint regiuni transmembranare ntinse ale proteinelor
(7 domenii transmembranare) care au dat cel de-al doilea nume pentru aceast
superfamilie - 7TM / receptorii n heptahelix [Lefkowitz RJ., 2000]. La mamifere,
aceast familie conine mai mult de 600 de membri. Ei sunt implicai ntr-un spectru
larg de procese biologice care au rol n medierea semnalelor pentru o mare varietate
de stimuli, cum ar fi hormoni peptidici (glucagonul, angiotensina, bradykinina),
neurotransmitori (adrenalina, serotonina, dopamina), neuropeptidele (neuropeptidul
Y), lumina i odorizantele. n consecin, ei joac un rol important n reglarea
fiziologic, iar funcionarea lor defectuoas poate s induc numeroase boli.
n general, ligandul se leag la GPCRs i produce o schimbare conformaional
care conduce la asocierea de proteine G intracelulare. Aceste proteine G sunt
membrii ai superfamiliei de GTP-aze ce sunt caracterizate printr-o compoziie
heterotrimeric ce cuprinde subunitile , i . Clasificarea structural i
4
funcional a proteinelor G - a fost definit de subunitile , n funcie de care pot fi
mprite trei clase de proteine: Gs, Gi i Gq (Fig. 3.1). Asocierea proteinei G la
receptorul transmembranar provoac modificri conformaionale n proteinele G care
faciliteaz eliberarea GDP i legarea GTP. Legarea GTP determin separarea
subunitii de subunitile i (Cruce M,2000). Proteinele Gs cunoscute ca
proteine G de stimulare, activeaz adenilil ciclaza (AC) care catalizeaz producerea
de mesager secund AMPc. n schimb, proteina Gi inhib AC, conducnd la
scderea nivelului de AMPc (Fig. 3.1). Activarea proteinei Gq este urmat de
stimularea fosfolipazei C (PLC) care induce producerea celui de-al doilea mesager
secund diacilglicerolul(DAG) sau inozitol trifosfatul (IP3) (Fig. 3.1), n timp ce Gq
interacioneaz cu canalele de K. Activarea celui de-al doilea mesager conduce la o
amplificare imens a semnalului. [Marinissen MJ i colab., 2001]. De exemplu,

AMPc poate activa protein kinaza A (PKA), care stimuleaz fosforilarea altor
proteine (Fig. 3.1). n plus, se tie c subunitatea a proteinelor G poate activa
proteina activatoare a mitozei (MAP) pe calea MAPK kinazei (Fig. 3.1).

5
Fig. 3.1 Diagrama schematic a cilor de transducie a semnalului de la GPCR i a
diferitelor ci ale mesagerilor secunzi care comunic cu elemente promotor nucleare. (AC,
adenilil ciclaza; CRE, elementul de rspuns la AMPc; proteina de legare CREB; DAG, diacil
glicerol, IP3, inozitol trifosfat; MAPK, protein kinaza mitogen activat; MEK, MAPK kinaza; NF-
AT, factor nuclear al celulelor T activate; NF-AT-RE, elementul de rspuns NF-AT; PKA, protein
kinaza A; PKC, protein kinaza C; PLC, fosfolipaza C; PIP2, fosfatidilinozitol-4 ,5-bifosfat; SRE,
element de rspuns seric; SRF,factor de rspuns seric; TPA, 12-O-tetradecanoilforbol - 13-acetat;
TRE, TPA- elementul de rspuns).
Pe lng cile clasice, exist ci independente de proteina G, ceea ce nseamn
c GPCRs poate activa molecule cum ar fi kinaza 2 legat la semnal extracelular
(ERK) 2 sau STATS fr stimularea proteinei G [Cruce i colab., 2004].
GPCRs au fost clasificai n trei subfamilii: subfamilia rodopsinei (clasa 1),
subfamilia calcitoninei (clasa 2) i subfamilia receptorilor pentru glutamatul
metabotropic (clasa 3) [Beck-Sickinger AG., 1996]. Clasa 1 conine aproximativ 90%
din toi GPCRs i se caracterizeaz printr-un segment N-terminal care este puternic
glicozilat, i dispune de o punte disulfidic caracteristic ntre bucla 1 extracelular i
bucla 2 extracelular. Odorizantele, peptidele i alte molecule mici, precum i multe
glicoproteine se leag de receptorii familiei din clasa 1, cum ar fi receptorii pentru
adrenalin, serotonin sau pentru neuropeptidul Y. Cel mai cunoscut membru din
aceast familie este rodopsina, care confer ntreagii familii numele su. Structura
cristalizat a rodopsinei a fost determinat de ctre Palczewski i colab. (2000).
n principal, hormonii peptidici i neuropeptidele, cum ar fi secretina,
glucagonul i calcitonina se leag de receptorii din familia GPCR din clasa 2. Acetia

6
au un domeniu extracelular N-terminal mare, comun, care conine ase reziduri de
cistein. Cel de-al treilea i, de departe, cel mai mic grup de GPCRs (clasa 3) se
caracterizeaz printr-un domeniu uria N-terminal constituit din dou lobi care se
nchid asemntor plantei Venus flytrap pe ligandul prins. Receptorii pentru
glutamatul metabotropic i receptorii GABAb aparin acestei subfamilii de receptori.
Mai muli receptori pentru liganzii de fungi i de plante au fost, de asemenea,
caracterizai i clasificai n subtipuri speciale. GPCRs sunt proteine cheie n reglarea
fiziologic i funcionarea lor defectuoas determin cteva boli,ale cror mecanisme
au fost elucidate prin studii pe oareci GPCR knockout [Edwards SW i colab.,
2001]. n prezent, GPCRs sunt intele pentru mai mult de 50% din actualii ageni
terapeutici i, ca atare, industria farmaceutic, este interesat foarte mult de
investigarea GPCRs [Sautel M, 2000]. n ceea ce privete dezvoltarea de noi
medicamente, este important s se produc compui foarte specifici care se leag cu
un nalt grad de afinitate i selectivitate de un anumit GPCR. Numai aceste
caracteristici sunt garania eficienei terapeutice n special n ceea ce privete
tolerabilitatea i specificitatea reaciilor adverse.

3.2. Afinitatea i activitatea liganzilor GPCR


Dup cum s-a menionat mai sus, GPCRs sunt inte pentru o varietate de
medicamente, pentru c afinitatea i activitatea unui ligand pentru receptor trebuie s
fie cunoscute n scopul producerii de noi medicamente. Afinitatea ca proprietate
descrie aviditatea sau tenacitatea cu care un ligand se va leaga de receptorul su. De
asemenea, activitatea numit eficacitate intrinsec, este proprietatea unui ligand de a
produce un rspuns biologic. Potenialele medicamente ar trebui s aib o mare
afinitate i selectivitate. O selectivitate nalt garanteaz o reducere a reaciilor
adverse, iar o afinitate mare permite reducerea dozei de medicament. Liganzii
naturali ai GPCR sunt adesea folosii ca ablon pentru design-ul medicamentelor i de
aceea sunt generai noi liganzi cu structuri similare.

7
Teste convenionale cu un radiotrasor sunt n general utilizate pentru a
determina afinitatea unui ligand de un receptor. Toate celulele sau membranele
celulare ce exprim GPCRs sunt incubate cu un ligand radiomarcat n prezena
ligandului nemarcat care trebuie investigat. Sunt utilizate o concentraie constant de
radiotrasor i diferite concentraii de ligand nemarcat. Dup ce se ajunge la echilibru,
celulele sau membranele sunt separate de supernatant i radioactivitatea ligandului
radiomarcat legat poate fi msurat cu un aparat de msurare. Radioactivitatea
msurat este proporional cu concentraia de ligand radiomarcat, care se leag de
receptor. Curba de legare poate fi determinat prin utilizarea de concentraii diferite
de ligand nemarcat n prezena unui radiotrasor cu concentraie constant i valoarea
IC50 poate fi obinut i transformat n valoare Ki conform ecuaiei Cheng-Prussof.
Ki reflect afinitatea ligandului pentru GPCR, o valoarea Ki este cu att este mai
mic, cu ct afinitatea este mai mare.
Pentru a determina eficacitatea intrinsec a liganzilor, potenialul lor agonist
sau antagonist, au fost introduse diferite teste care msoar activitatea proteinelor G
sau mesagerilor secundari intracelulari dup legarea de ligand. Mesagerii secundari
investigai depind de receptorii de activare a proteinelor G. Aceste metode sunt de
cele mai multe ori mari consumatoare de timp i foarte costisitoare. Mai nti, este
posibil s se msoare legarea GTP dup activarea receptorilor prin intermediul
ligandului. Celule sau membranele care exprim receptorii sunt incubate n prezena
GTP-ului radiomarcat i ligandului cercetat. Radioactivitatea poate fi msurat dup
separarea celulelor sau membranelor de supernatant. Valorile radioactivitii sunt
corelate cu stimularea receptorilor care sunt asociai cu proteina G.
Testele ELISA convenionale pot fi utilizate pentru a msura mesagerii secunzi
ca: AMPc, GMPc, diacil glicerol sau IP3. Concentraia de AMPc mesager secund
depinde de tipul de protein G activat i poate duce fie la creterea (Gs,) sau fie la
scderea (Gi ) mesagerului secund. Determinarea semnalului de la nivelul celui de-
al doilea mesager este uneori foarte dificil pentru c nu toate celulele exprim optim
proteine G sau mesagerul secund care este imediat degradat. Prin urmare, genele
reporter n combinaie cu promotori speciali i elemente intensificatoare sunt folosite
8
pentru a genera un set nou de tehnici. Dup legarea ligandulului la GPCR, este
modulat concentraia de mesager secund, activitile enzimelor, i prin urmare
legarea factorilor de transcriere de elementele intensificatoare. n consecin, expresia
genelor reporter este dependent direct de activarea GPCR i de calea de transducie a
semnalului activat. Semnalul rezultat este mai stabil i mai uor de cuantificat.

3.3. Rolul factorilor de transcripie n expresia genelor


Informaia necesar pentru sinteza unei anumite proteine este codificat n
secvena de nucleotide din ADN. Aceste informaii trebuie s fie transcrise n ARN,
molecula mesager, care este apoi este tradus n citoplasm, de aparatul de sintez
proteic. Enzime specializate, numite ARN polimeraze, catalizeaz procesul de
transcripie al ADN-ului n ARN. ARN polimeraza II transcrie majoritatea genelor; cu
toate acestea, multe alte proteine accesoare care interacioneaz cu polimeraza sunt
eseniale pentru transcripia genelor. Numeroi factori de transcripie nucleari sunt
cunoscui i rolul lor este, fie de a activa, fie de a inhiba expresia genelor [Brivanlou
AH i colab., 2002]. Ei se leag de secvenele scurte cu semnificatie biologic, din
regiunile de ADN dublu catenar, de lungimi variabile, de obicei 5-20 bp. Aceste
secvene scurte sunt situate n amonte de promotorul de baz i, n general, sunt
specifice pentru un singur factor de transcripie sau pentru un membru al unei singure
familii de factori de transcripie. Factorii de transcripie se pot lega ca monomeri,
homodimeri sau heterodimeri la secvenele repetitive specifice. Dup legarea de
situsul lor specific de legare, factorii de transcripie interacioneaz ntre ei, cu ARN
polimeraza II i cu ali factori bazali pentru a regla expresia genei.
n prezent, mai mult de 300 de factori de transcriptie au fost identificai n
genomul vertebratelor. Activitatea unor factori de transcriere este modulat de
fosforilarea lor. Dintre factorii de trascripie bine nelei i studiai sunt: proteina de
legare a elementului de rspuns la AMPc (CREB), factorul de legare a elementului de
rspuns seric, factorul nuclear al celulelor T activate (NF-AT), proteinele c-Jun i
STAT. Situsurile de recunoatere a acestor factori de transcripie sunt adesea folosite

9
n promotori pentru realizarea de sisteme de teste care utilizeaz genele reporter
pentru investigarea GPCRs (Fig. 3.1).

3.3.1. CREB
CREB este implicat n calea AMPc. Dup activarea receptorilor cuplai cu
proteina Gs, care regleaz pozitiv AC, nivel intracelular de AMPc este crescut.
AMPc activeaz proteina kinaza A (PKA), care permite unitii catalitice a PKA s
intre n nucleu unde fosforileaz CREB, pe serin n poziia 133.
CREB fosforilat se leag de elementul intensificator al elementului de rspuns
la AMPc (CRE). Transcrierea genelor linkate este activat dup legarea proteinei de
legare CREB (CBP) la CREB. Stimularea GPCRs cuplai cu Gi scade AMPc
intracelular i determin o reducere a transcripiei genei reporter CRE-linkat.

3.3.2. SRF
Calea MAPK este o cale foarte important de semnalizare pentru receptorii
tirozin kinazici i este necesar pentru fosforilarea SRF. SRF se leag la elementul de
rspuns seric, la situsul de legare ADN prezent, de exemplu, n promotorul c-FOS,
care conduce la transcrierea c-FOS, un alt factor de transcriere. Numai n combinaie
cu factorul complexului ternar (TCF/Elk1), SRF se poate lega la SRE i activa
transcripia genei. Ambii factori de transcripie, SRF i TCF sunt activai prin
fosforilarea MAPK. S-a artat c subunitile ale proteinelor Gi activeaz aceast
cale, via activarea MAPK RAS-dependent. Stimularea MAPK via receptori cuplai
cu Gq are n principal ca rezultat activarea protein kinazei C (PKC) [Cruce M i
colab.,2004].

3.3.3. Proteinele STAT


Proteinele care sunt factorii de transcriere STAT sunt activate dup stimularea
receptorilor de citokine i receptorilor tirozin kinazici. n prezent, sunt cunoscute 6
proteine STAT (STAT1-STAT6). Dup activarea receptorilor prin legarea ligandului
aceti receptori se asociaz cu tirozin kinaza JAK kinaza, care, la rndul su este
10
fosforilat. Ulterior, JAK kinazele activate pot activa din nou proteinele STAT prin
fosforilare, urmate de formarea dimerilor. Dimerii sunt translocai n nucleu i se
leag de situsurile de legare ADN ale elementului de rspuns stimulate de interferon
(ISRE), i este iniiat transcrierea genelor. Studii recente demonstreaz activarea i
implicarea cii Stat3 n cile Gi i Go protein mediate [Ram PT, 2001].

3.3.4. c-Jun
Factorul de transcripie c-Jun este fosforilat de o protein kinaz, JNK (c-Jun-N-
terminal kinaza), care este un membru nou al familiei MAPK. De asemenea acest
kinaz, fosforileaz factorul de transcripie ATF2. ATF2 i c-Jun constituie un
heterodimer, care se leag de situsul de legare ADN al elementului de rspuns TPA
(TRE) n promotorul c-Jun.

3.3.5. NF-AT
NF-AT este prezent ca factor de transcriere n limfocite i este indus de
stimularea receptorului antigenic. NF-AT este fosforilat i situat n citoplasma
celulelor n repaus. Controlul transcripiei mediat de NF-AT n limfocite este
dependent de semnalizarea simultan prin Ca i MAPK care sunt activate dup
stimularea receptorilor de antigen. Calea Ca activeaz calcineurin fosfataza.
Calcineurina defosforileaz NF-AT i conduce la o translocare nuclear a NF-AT.
Apoi, NF-AT se asambleaz ntr-un complex multimeric cu AP1 i se leag n amonte
la un intensificator major al genei pentru citokina IL-2 dup care are loc transcripia
genei. Izoforme distincte de NF-AT se gsesc la oameni i oareci, care sunt
exprimate n celulele nonlimfoide.

3.4. Genele reporter


O gen reporter este o secven de ADN, al crei produs este sintetizat ca
rspuns la activarea cascadei de semnalizare investigat. Expresia genelor reporter
poate fi controlat de elemente intensificatoare, i situsuri de legare pentru factorii de

11
transcripie specifici. Alegerea unei gene reporter specifice, depinde de urmtoarele
condiii:
linia de celule utilizat pentru experimente; activitatea endogen din fiecare
celul este diferit i este important s demonstram c linia de celule utilizat
nu exprim gena reporter aleas;
natura experimentului, deoarece trebuie s fie utilizate gene reporter diferite
pentru investigarea dinamicii expresiei genei i a eficienei transfecei n
acelai experiment;
alegerea genei reporter depinde de asemenea, de metoda de detecie.

Genele reporter au caracteristici speciale. Ele sunt caracterizate printr-o


secven definit de nucleotide, activitate de fond sczut, sensibilitate mare i
rspunsul care trebuie s fie uor de detectat fenotipic. n scopul de a efectua
msurtori, activitatea genelor reporter trebuie s fie cantitativ, rapid, uoar,
reproductibil i sigur. Metodele de msurare care sunt folosite de cele mai multe
ori sunt msurtori de radioactivitate, fluorescen, luminiscen i colorimetrie.
Semnalul genelor reporter trebuie s fie semnificativ peste activitatea bazal care
depinde de chimia reporterului, linia de celule utilizat, sensibilitatea instrumentelor
i interferenele activitilor chimice.
Sisteme genetice reporter au fost elaborate cu scopul de a studia expresia i
reglarea genelor de la eucariote. Mai mult, ele sunt utilizate pentru studiul
promotorului i secvenelor intensificatoare, mediatorilor cum ar fi factorii de
transcripie, procesarea ARNm i translaia. De asemenea, sistemele de gene reporter
sunt aplicate pentru a monitoriza eficiena transfeciei i pentru a studia interaciunea
protein-protein, localizarea subcelular a proteinelor i de asemenea indicatorii
activitii transcripionale n celule. n zilele noastre, sistemele de gene reporter au
aplicaii n screeningul biologic pentru descoperirea de noi medicamente [high-
throughput screening = screening de mare capacitate (HTS)] [Goetz AS i colab.,
2000], pentru investigarea ci lor de semnalizare i n terapia genic. Acestea sunt, de

12
asemenea utilizate pentru investigarea interaciunilor receptor-ligand, n special
pentru investigarea GPCRs.
Sunt cunoscute mai multe gene reporter, de exemplu, cloramfenicol
acetiltransferaza (CAT), -galactozidaza (-Gal), -glucuronidaza, fosfataza alcalin
(AP), fosfataza alcalin secretat (SEAP), -lactamaza, luciferaza i proteina
fluorescent verde (GFP). Avantaje i dezavantajele lor sunt prezentate n tabelul 3.1.
Unele din aceste gene reporter sunt utilizate pentru investigarea GPCRs.

3.4.1. CAT
CAT a fost prima gen reporter utilizat pentru a monitoriza activitatea
transcripional n celule. CAT a fost izolat din Escherichia coli i este o protein
trimeric care este format din trei subuniti identice, fiecare cu o greutate
molecular de 25 kDa [Leslie AG i colab., 1988]. n celulele de mamifere, proteina
CAT este relativ stabil, i fr transfecie nu exist exprimare endogen. CAT are
proprietile necesare pentru a fi utilizat n teste tranzitorii concepute, pentru a
investiga acumularea proteinelor exprimate. Reacia enzimatic natural a CAT,
transferul gruprii acetil de la acetil-CoA la poziia 3-hidroxil a cloramfenicolului,
este utilizat pentru a efectua teste reporter. Acetil-CoA radiomarcat permite
transferul de acetil radiomarcat la substratul de cloramfenicol. Produii formai pot fi
determinai prin separare fizic utiliznd cromatografia n strat subire (TLC). TLC
separ substratul i produsul, radioactivitatea putndu-se observa prin expunerea
plcii de TLC pe filme de radiografie sau prin fosfoimagini. Metoda TLC permite
vizual confirmarea reaciei. Cuantificare este posibil prin rzuirea spoturilor, TLC,
extragerea cu un solvent organic i numrarea probelor cu un dispozitiv de numrare
pe baz de scintilaie. Alte teste izotopice se bazeaz pe extracia organic direct a
celor mai muli produi nepolari. Alternativ, anticorpii mpotriva CAT sunt acum
disponibili i ei permit cuantificarea prin Western blotting sau ELISA.

Tabelul 3.1. Comparea celor mai frecvent utilizate gene reporter

Gena reporter Avantaje Dezavantaje

13
Cloramfenicol -fr expresie endogen n -costuri ridicate pentru
acetiltransferaza celule mamiferelor izotopi i sisteme TLC
(CAT) -confirmarea vizual a activitii -radioactivitate
enzimei -liz celular
-substraturi suplimentare
-Galactosidase -formate de teste variate pentru - teste colorimetrice nu
( -Gal) utilizare cu extract celular foarte sensibile
-uor de testat -activitate endogen n
anumite tipuri de celule
-liz celular
-Glucuronidaza -formate de teste variate -activitate endogen n
celulele mamiferelor
-liz celular
Fosfataza alcalin -formate de teste variate -activitate endogen n
(AP) -uor de testat celulele mamiferelor
-necostisitor - teste colorimetrice nu
foarte sensibile
-liz celular
Fosfataza alkalin - protein secretat -adiie de substrat
secretat (SEAP) -formate de teste variate
-sensibil (teste fluorimetrice)
Luciferaza -rapid i uoar -liz celular
-de mare sensibilitate -adiie de substrat
-fr activitate endogen -protein relativ stabil
Proteina fluorescent -variante GFP pot fi detectate n -cititor fluorescent sensibil
verde aceeai celul
(GFP) -investigaii n celule vii
-autofluorescen (nu necesit
substrat)

3.4.2. -Gal
-Gal este o enzim bacterian bine caracterizat i este compus din patru
subuniti, fiecare cu o greutate molecular de 116 kDa. Cataliza hidrolizei
zaharurilor de -Gal cum ar fi lactoza este raportat ca un test funcional. Activitatea
enzimatic din extractele celulare poate fi analizat cu diferite substraturi speciale,
care s permit cuantificarea activitii enzimei cu un spectrofotometru, fluorimetru
sau luminometru. De asemenea, au fost dezvoltate metode de colorimetrie simpl cu
o-nitrofenil-BD-galactopiranozid (ONPG) sau clorofenol rou BD-galactopiranzoid
(CPRG) [Eustice DC i colab., 1991]. Metodele colorimetrice, care nu sunt foarte
sensibile i au doar o gama dinamic ngust, au fost nlocuite n mare parte cu
metode fluorescente sau luminiscente mai sensibile. Substraturi, cum ar fi -metil
umbeliferil galactozidul i fluorescein digalactozidul (FDG) pot fi folosite pentru
14
teste bazate pe fluorescen, iar 1,2-dioxetanul pentru teste pe baz de luminescen.
Testele reporter cu galactozidaz sunt larg utilizate, n special pentru a monitoriza
eficiena transfeciei.

3.4.3. -Glucuronidaza
-Glucuronidaza este o glicoprotein tetrameric de la E. coli, format din
patru subuniti identice de 68 kDa, localizate n special n mediul acid al lizozomilor.
Enzima nltur rezidurile de acid -glucuronic terminale de la captul neredus al
glicozaminoglicanilor i altor glicoconjugai. Teste colorimetrice ce pot fi detectate
prin spectrofotometrie, au fost elaborate cu scopul de a msur activitatea acestei
enzime. Metodele chemiluminescente au fost create pentru mbuntirea
sensibilitii. -glucuronidaza este de cele mai multe ori folosit pentru investigaii la
plante superioare, i din cauza activitii sale endogene n unele celule de mamifere
[Paigen K., 1989].

3.4.4. AP
AP este o protein relativ stabil i care la pH alcalin defosforileaz o gam
larg de substraturi . Metode spectrofotometrice standard se bazeaz pe hidroliza p-
nitrofenil fosfatului (PNPP) de AP. Acest test este ieftin, rapid i simplu, dar i
lipsete sensibilitatea obinut prin alte metode. O metod bioluminescent n 2 trepte
a fost elaborat cu scopul de a mbunti sensibilitatea. n aceast abordare cu dou
etape, mai nti AP hidrolizeaz d-luciferin-O-fosfatul la d-luciferin, care servete n
cea de a doua etap ca un substrat pentru luciferaz. Dei sensibilitatea este mult mai
mare, manipularea este mai puin convenabil. Ca o alternativ a fost dezvoltat o
metod chemiluminescent pentru detecia AP ntr-o singur etap [Schaap A, 1989].

3.4.5. SEAP
SEAP este o form mutant de AP placentar uman, creia i lipsesc 24 de
aminoacizi la captul C-terminal al proteinei. Eliminarea acestor aminoacizi
mpiedic ancorarea enzimei la membrana plasmatic, i, n consecin, este secretat
15
de celule i poate fi detectat prin prelevarea de probe din mediu de cultur [Berger J
i colab., 1988]. Celule rmne intacte i viabile pentru experimente ulterioare. SEAP
poate fi uor detectat prin hidroliza p-nitrofenol fosfatului, care determin o
schimbare de culoare. Aceast modificare poate fi cuantificat. Metodele
chemiluminescente pot fi, de asemenea, utilizate n plus fa de metodele
colorimetrice. Un avantaj major al SEAP este stabilitatea la cldur a enzimei i la L-
homoarginina fosfataz inhibitoare. Prin urmare, celulele lizate pot s fie tratate cu
cldur sau L-homoarginin pentru a inactiva activitatea bazal a AP , n celule n
care poate a intrat n mediul de cultur. Astfel, activitatea bazal observat cu sisteme
reporter AP este, n principal, eliminat cu sistemul SEAP. Asocierea de proteine
reporter secretate, cu activitate de fond puin endogen, precum i cu o varietate
larg de teste uoare i sensibile fac din SEAP un sistem convenabil i flexibil.

3.4.6. -lactamaza
Proteina lactamaza (penicilin amido- -lactamhidrolaza) este o protein
monomeric de 29-kDa, izolat din E. coli. Aceast enzim are activitate esterazic i
funcia sa natural este clivarea ampicilinei i altor antibiotice, de exemplu, penicilina
i cefalosporina. lactamaza este produs industrial n trei forme: secretat,
citosolic i asociat membranei plasmatice [Moore JT i colab., 1987]. n
consecin, activitatea enzimei poate fi analizat din extracte celulare sau, atunci cnd
este secretat, direct din mediu. Metode colorimetrice sunt aplicate pentru
msurtori, de exemplu pentru substraturi ca nitrocefin sau (PADAC) [acid 3 -(2,4-
dinitrostiril)-(6R, 7R)-7-(2-tienilacetamido)-cef-3-em-4-carboxilic] i schimb
culoarea dup reacia cu -lactamaza. Activitatea enzimei cu PADAC ca substrat este
monitorizat prin scderea absorbanei la 570 nm i cu nitrocefin prin creterea
absorbanei la 570 nm. Recent, un substrat fluorescent foarte sensibil pentru
-lactamaz a fost dezvoltat ca un ester membranar permeabil, care ar putea fi aplicat
pentru a monitoriza expresia genei la o singur celul vie. Acest substrat fluorogenic
CCF2/AM este o cefalosporin derivat, ataat la doi fluorofori. n cazul n care
substratul fluorogenic este intact, fluorescena cu transfer de energie prin rezonan
16
(FRET) apare ntre cei doi fluorofori [Zlokarnik G i colab., 1998]. n cazul n care
substratul este de clivat de ctre -lactamaz, cele dou pri fluorescente ale
moleculei sunt separate i efectul FRET este ntrerupt. Schimbarea lungimi de und
rezultat este detectabil n suspensie celular folosind sortarea celular pe baz de
fluorescen, n monostraturile celulare utiliznd cititoare de plci conveninale iar n
celule individuale utiliznd microscopia confocal. Tehnicile de gene reporter cu
-lactamaz sunt foarte sensibile, la utilizarea acestui substrat fluorogenic, dar i
costisitoare.

3.4.7. Luciferaza
Luciferaza se refer la o familie de enzime care catalizeaz oxidarea de
substraturi diferite ca luciferina i coelenterazina, ceea ce conduce la emisie de
lumin. Lucifereazele cunoscute sunt luciferaza bacterian, luciferaza Firefly
(Photinus pyralis) (firefly = gndac nocturn din America tropical care produce
lumina, corpul este luminiscent datorita organelor abdominale), i mai recent,
luciferaza renilla din panseaua de mare bioluminiscent, Renilla reniformis.
Luciferazele bacteriene sunt, n general, proteine dimerice labile termic. n
consecin, aplicarea lor ca gene reporter n celulele de mamifere este limitat.
Cea mai cunoscut luciferaz este luciferaza firefly. Acest enzim de 60kDa, o
monooxigenaz, catalizeaz o reacie utiliznd D-luciferin i ATP, n prezena
oxigenului i Mg, conducnd la emisie de lumin [Branchini BR i colab., 2001].
Valoarea total a luminii msurate ntr-un anumit interval de timp este proporional
cu activitatea luciferazei din prob. Structura cu raze X a acestei luciferaze,
descoperit n 1996, a evideniat c arginina din pozitia 218 constituie situsul de
legarea al luciferinei. Mai recent, au fost dezvoltai reactivi care prelungesc timpul
de njumtire a flash-ului. Prelungirea luminii produse crete sensibilitatea testului
i asigur o mai mare durat de njumtire a luminiscenei i, astfel, o perioad mai
lung de msurare.
Luciferaza din R. reniformis [Lorenz WW i colab., 1996] catalizeaz oxidarea
coelenteramidei i este de cele mai multe ori folosit n formate de testare cu
17
luciferaze duale. Aceste teste permit msurarea ambelor luciferaze firefly i renilla
din acelai extract celular. Prin urmare, luciferaza firefly poate fi folosit ca gen
reporter i luciferaza renilla ca un standard intern pentru a cuantifica eficienei
transfeciei [Parsons SJ i coalb., 2000]. Luciferaza firefly, este utilizat de cele mai
multe ori pentru studiul reglrii promotorului i efectelor reglatoare ale agenilor ce
cresc AMPc. n prezent, luciferaza rmne n continuare reporterul ales pentru
msurtorile dinamice ale expresiei genelor, datorit sensibilitii nalte i duratei de
njumtire a vieii, relativ scurt. Aceasta a permis, de exemplu, investigarea
ritmurilor circadiene la plante. Mai mult dect att, tehnici de gene reporter cu
luciferaza firefly au fost generate pentru investigarea GPCRs i pentru identificarea
receptorilor agoniti i antagoniti. Acest sistem este foarte popular n industria
farmaceutic i este utilizat pentru HTS.

3.4.8 Proteina fluorescent verde (GFP)


GFP din petele jeleu Aequorea victoria este o fotoprotein cu 238 amino-acizi
care emite lumin verde, cu o emisie maxim la 509 nm dup excitarea la 488 nm
[Tsien RY., 1998]. ADNc a fost clonat n 1991 i structura cristalin identificat n
1996 [Ormo M, 1996]. GFP are marele avantaj c este un fluorescent natural, care nu
are nevoie de oricare alte substraturi, iar fluorescena nu este specific speciei. Mai
mult dect att, GFP poate fi folosit n celulele vii i pentru producerea de proteine de
fuziune . Cromoforul activ din GFP, necesar pentru fluorescen, este un hexapeptid
care conine un trimer ciclizat Ser-dehidroTyr-Gly [Fukuda H, 2000]. Acest cromofor
este situat n centrul proteinei, a crei structur este menionat ca o posibil structur
. Mutaii n cromoforul activ al alelei GFP de tip slbatic a condus la dezvoltarea de
variante GFP cu fluorescen verde mbuntit. Au rezultat trei variante mutante:
proteina fluorescent albastru-glbuie (PCP), proteina galben fluorescent (YFP) i o
protein albastru fluorescent (BFP). Expresia GFP poate fi monitorizat direct n
organismele vii, ca i n celule. Alte avantaje sunt stabilitatea termic, pH-ul extrem
i denaturanii chimici.

18
n ultimii ani, mai multe proteine de fuziune cu GFP au fost construite pentru a
investiga proteinele de transport i localizarea lor [Welsh S, 1997]. Imaginea
expresiei genei este uor de realizat datorit proprietilor GFP [Chalfie M, 1994].
Dezvoltarea GFP i a variantelor sale spectrale permit urmrirea simultan a
diferitelor proteine la celulele vii. Mai mult, investigarea interaciunii protein-
protein este posibil cu ajutorul tehnicii FRET, pentru c GFP i variantele sale pot
fi utilizate ca perechi FRET [Sorkin A, 2000].
S-au efectuat experimente cu proteine de fuziune GFP pentru a investiga
reglarea GPCR. GFP a fost de asemenea utilizat pentru a genera sisteme de teste de
gene reporter pentru investigarea GPCRs. Dinger i Beck-Sickinger (2002) au
identificat agonitii i au determinat afinitatea ligandului.

3.5 Sisteme de teste bazate pe gene reporter pentru investigarea GPCRs


n ultimii ani, sisteme de teste bazate gene reporter au fost dezvoltate pentru
investigarea GPCRs, sisteme care ofer o alternativ la testele biochimice
convenionale, cum ar fi testele de competiie i testele AMPc. Acum este posibil
investigarea cilor de transducie a semnalului de la nivelul receptorilor de la
suprafaa celulelor pn la transcripia genelor nucleare n celule. Prin utilizarea
aceste sisteme de testare poate fi uor msurat schimbarea mesagerului secund dup
activarea GPCR prin creterea sau scderea exprimrii genei reporter. Pn acum
nivelul intracelular de mesager secund trebuia s fie detectat prin metode metabolice
speciale, dificile tehnic, incomode, consumatoare de timp i de cele mai multe ori
costisitoare.
Dezvoltarea vectorilor de gene reporter cu o secven promotor i o secvent
gen reporter este esenial n scopul de a investiga GPCRs cu un sistem de teste pe
baz de gene reporter. Alegerea promotorului depinde de natura cii de semnalizare
pentru GPCR studiat, i determin sensibilitatea i specificitatea reporterului.
Situsurile ADN de legare ale factorilor de transcripie, numite elemente
intensificatoare sunt utilizate n combinaie cu un promotor de baz care controleaz

19
transcripia genei reporter. n consecin, calea pentru GPCR studiat trebuie s fie
cunoscut (Fig. 3.1).
Dezavantajul promotorilor naturali, cum ar fi c-FOS este c trebuie s conin
situsuri de legare pentru un numr de factori de transcripie i, astfel, reglarea unor
astfel de promotori depinde de mai muli factori de transcripie. Cu scopul de a
genera teste pe baz de gene reporter pentru o singur cascad de semnalizare, au fost
construii promotori sintetici care conin numai un singur tip de situsuri pentru
legarea factorilor de transcripie. Secvenele promotorilor sintetici cele mai cunoscute
pentru investigarea GPCRs cuprind: elemente CRE, elemente SRE, elemente TRE i
elementul intensificator NF-AT; promotorul natural c-FOS, situsul de legare AP1 i
secvena activatoare GAL4 . Datele publicate demonstreaz c luciferaza este cea mai
popular gen reporter pentru investigarea GPCRs. n plus, punerea n practic a -
lactamazei i SEAP este, de asemenea, posibil. Recent, a fost prezentat o GFP ca
gen reporter pentru investigarea GPCRs , care prezint unele avantaje fa de alte
gene reporter menionate.

3.5.1. Aplicarea luciferazelor ca gene reporter


Luciferaza firefly (3.4.7) este cea mai utilizat gen reporter pentru
investigarea GPCRs [Stratowa C i colab., 1995]. Gena pentru luciferaz este
asociat cu diferite elemente promotor cum ar fi: elementele CRE, elementele TRE,
promotorul c-FOS i elementul intensificator NF-AT. Elementul intensificator CRE
este folosit pentru investigarea receptorilor cuplai cu Gs i Gi. Prin urmare,
expresia luciferazei este reglat de creterea sau scderea AMPc. Dup stimularea
receptorilor cuplai cu Gs, urmeaz o cretere a nivelului de AMPc. AMPc
determin fosforilarea CREB urmat de creterea expresiei luciferazei. n scopul de a
efectua teste cu receptori cuplai cu Gs, testele sunt de obicei, efectuate n prezen
de forskolin, un stimulator al AC, care crete nivelul de AMPc, astfel nct inhibiia
este mai uor detectabil. Stimularea forskolinei este msurat n paralel (Fig. 3.2).

20
Fig. 3.2. Sisteme de teste bazate pe gene reporter ce utilizeaz elemente CRE i
luciferaza pentru investigarea GPCRs. Celulele ce coexprim GPCR, cuplai fie cu Gs, fie cu
Gi au fost incubate cu ligandul. Dup ce are loc stimularea sau inhibarea AC se produce o cretere
sau respectiv, o scdere a AMPc. O cretere a nivelului de AMPc conduce la activarea PKA, care
activeaz prin CREB fosforilarea. Forma fosforilat a CREB interacioneaz cu elemente CRE.
Ulterior, este iniiat transcripia luciferazei. Pentru investigarea receptorilor cuplai cu Gi, celulele
trebuie s fie incubate cu ligandul n prezena forskolinei. Luciferaza este exprimat n citoplasm,
i activitatea poate fi msurat dup liza celulelor i adugarea substratului, de exemplu luciferin
luciferaza. O activitate mare a luciferazei cauzeaz o luminiscen puternic. Activitatea luciferazei
poate fi corelat cu activitatea ligandului care activeaz GPCR. (AC, adenilil ciclaza; CRE,
elementul de legare AMPc; CREB, proteina de legare CRE; G, proteina G.)
Himmler i colab. (1993) a utilizat sisteme de teste pe baz de gene reporter cu
CRE i luciferaza pentru a investiga receptorii dopaminergici D1 i D5 la om, ambii
receptori fiind cuplai cu Gs. Ei au observat o cretere a expresiei luciferazei dup
stimularea cu forskolin sau cu agoniti ai dopaminei.
Identificarea compuilor agoniti sau antagoniti a fost o reuit. Un test
similar a fost aplicat pentru investigarea comportamentului de legare a diferiilor
liganzi de serotonin, receptori 5-HT1B i receptori C1A de calcitonin [George SE i
colab., 1997].
21
De asemenea, luciferaza n asociere cu CRE este folosit n industria
farmaceutic pentru realizarea unor screeninguri de mare capacitate (HTSs). Punerea
n aplicare a acestui sistem a fost raportat de diferite grupuri care au stabilit teste
pentru investigarea rapid i sensibil a receptorilor cuplai cu Gi i Gs. Testele
pentru screeningurile de mare capacitate sunt realizate de cele mai multe ori n
microplci.
Cu scopul de a investiga receptorii cuplai cu Gs, Gi i Gq prin acelai
sistem de teste, elemente CRE au fost combinate cu elemente MRE. De asemenea,
acest sistem permite investigarea receptorilor cuplai cu Gq [Fitzgerald LR i colab.,
1999]. Aceast regiune promotor poate rspunde la creterea intracelular de calciu,
pentru a stimula PKC i pentru a schimba nivelurile de AMPc. Rspunsul poate fi
msurat prin creterea sau scderea activitii luciferazei, i este util pentru
caracterizarea farmacologic a agonitilor i antagonitilor. Parsons i colab. (2000)
au utilizat luciferaza firefly i renilla n asociere cu CREs pentru investigarea
receptorilor factorilor 1 i 2 umani de eliberare a corticotropinei (CRFR1 i CRFR2).
De asemenea s-a reuit identificarea agonitilor i antagonitilor.
n scopul de a investiga receptorii a cror ci de transducie a semnalului
modific nivelul intracelular de AMPc sau nivelurile IP3/DAG, s-a fost folosit ca
sistem pentru testele celulare o gen, luciferaza cu elemente TRE ca promotor. Acest
sistem a permis caracterizarea receptorilor diferitelor neurokinine NK1, NK2 i NK3.
Mai mult dect att, un alt sistem ce folosete luciferaza i elemente TRE a fost
dezvoltat pentru de screeningul liganzilor [Kotarsky K i colab., 2001]. Sistemul a
fost, de asemenea, cuplat cu GFP, n scopul de a selecta celulele care exprim stabil
sistemul reporter. Aceste celule au fost folosite pentru investigarea GPCRs. Agonitii
i antagonitii receptorilor hormonului de eliberare a gonadotropinei (GnRH
receptorii) au fost investigai cu succes, cu un sistem de teste bazat pe gene reporter
pentru luciferaz n combinaie cu promotorul C-FOS. Receptorii GnRH sunt cuplai
la calea inozitol-fosfolipid i, dup activarea receptorului, transcripia genei
luciferaza este indus de promotorul c-FOS.

22
3.5.2 Utilizarea altor gene reporter pentru investigarea GPCRs
De asemenea s-a raportat utilizarea lactamazei i SEAP pentru investigarea
GPCRs. Xing i colab. (2000) au realizat un sistem de teste bazat pe gene reporter cu
lactamaza ca gen reporter, n combinaie cu promotorul NF-AT [Xing H i colab.,
2000] i l-a folosit pentru a investiga GPCRs care sunt cuplai cu proteinele Gq.
Schimbarea concentraiei mesagerului secund ar putea fi detectat prin creterea
expresiei lactamazei. Pollok i colab. (1999) a folosit, de asemenea, acest sistem,
pentru a investiga receptorii cuplai cu proteina Gi. Pentru a efectua aceste teste,
semnalul proteinei Gi a fost convertit n semnal de la protein Gq i activitatea
lactamazei a putut fi msurat.
Liganzi DP i PE pentru receptorii prostanoizi GPCRs au fost caracterizai prin
tehnica CRE-SEAP [Durocher Y i colab., 2000]. Activarea receptorilor ar putea fi
detectat prin schimbarea nivelurilor intracelulare ale SEAP. Un dezavantaj important
de msurare a activitii luciferazei i lactamazei l constituie necesitatea de a
pregti extracte de celule i de a aduga un substrat. Aceste celule nu pot fi utilizate
pentru o analiza ulterioar, iar prepararea celulelor lizate este consumatoare de timp,
adiia unui substrat putnd perturba sistemul celulelor sensibile. n consecin, un
sistem de teste pe baz de gene reporter cu elemente CRE i GFP ca gen reporter a
fost dezvoltat pentru investigarea GPCRs pentru celule vii (Fig. 3.3). Avantajul
acestui sistem l constituie faptul c adugarea substratului nu este necesar i nu
necesit liza celulelor.

23
Fig. 3.3. Sisteme de teste bazate pe gene reporter utiliznd GFP i CREs pentru
investigarea GPCRs. Cu ajutorul vectorului de gen reporter ce conine GFP i CRE are loc
transfecia n celulele care exprim o GPCR, fie o Gs sau Gi cuplat. Dup legarea ligandului
este indus stimularea sau inhibarea AC, ceea ce determin o cretere sau o scdere a AMP. O
cretere a nivelului de AMPc duce la activarea PKA care activeaz CREB prin fosforilare. Forma
fosforilat a CREB se leag acum la elementele CRE. n consecin, transcripia GFP este iniiat.
Pentru investigarea receptorilor cuplai cu Gi, celulele trebuie s fie incubate cu un ligand n
prezena forskolinei. GFP este exprimat n citoplasm i poate fi msurat n mod direct n celule
n via, folosind un cititor de fluorescen. Liza celulelor sau adiia substratului nu este necesar
(AC, adenilil ciclaza; CRE, elementul de legare AMPc; CREB, proteina de legare CRE; G, proteina
G; GFP, proteina verde fluorescent)

Diferii vectori cu gene reporter cu prezint un numr crescut de elemente


CRE (4, 8 i 12) au fost clonai pentru stabilirea acestui sistem nou. Studiile au
demonstrat c sensibilitatea acestui test a fost dependent de numrul de CREs -
vectorul cu 12 elemente CRE a furnizat cele mai semnificative date. Acest sistem
poate fi, de asemenea, aplicat la celulele vii i a fost folosit pentru investigarea
24
receptorului NPY Y5, o Gi cuplat cu GPCR. Receptorul NPY activat de ligand
determin o scdere a nivelului de AMPc i, n consecin, o expresie sczut a GFP
(Fig. 3.3).
S-a determinat expresia dependent de doz a neuropeptidului Y i valoarea
EC50 gsit a fost comparabil cu valoarea EC 50 obinut prin teste de competiie.
Acum, un astfel de sistem este disponibil i el ne permite efectuarea de msurtori
ntr-o singur celul. Pentru prima oar GFP a fost folosit ca gen reporter n teste
pentru investigarea GPCR cuplai cu Gi. n plus, noul sistem de teste bazat pe gene
reporter are unele caracteristici unice, care l fac superior oricrui alt test. Datele
prezentate arat c testul este cel puin la fel de sensibil ca testul pentru luciferaz. n
celulele vii, analiza este mai rapid i mai uoar, fr tulburarea sensibilitii
sistemului celular.
n afar de investigarea GPCRs, sistemele de teste bazat pe gene reporter pot fi
folosite, de asemenea pentru a investigarea cilor de transducie a semnalului. Fiecare
treapt a cii de transducie a semnalului poate fi perturbat, iar efectele pot fi uor
msurate. Deoarece producerea de gene reporter este punctul final al unei ntregi de
cascade de semnalizare, funcionalitatea fiecrui pas al cii de semnalizare poate fi
descifrat. n plus, este posibil s se determine care reactiv poate influena calea de
transducie a semnalului, iar prin utilizarea sistemului de teste bazate pe gene reporter
GFP fiecare pas al semnalului de transducie poate fi cu uurin detectat. Dup
investigare celulele sunt nc n via i pot fi utilizate pentru alte analize.
n general, sistemele de teste bazate pe gene reporter sunt sisteme convenabile
i uor de detectat pentru investigarea GPCRs (Tabelul 3.2), dar i pentru ali
receptori ca receptorii tirozin kinazici. n consecin, aceste sisteme reprezint
oportuniti pentru screening-ul rapid al liganzilor i pentru investigarea interaciunii
receptor-ligand. Mai mult, investigarea i caracterizarea receptorilor orfani este mult
mai uoar, iar evidenierea liganzilor lor naturali este accelerat.

25
Tabelul 3.2 Aplicaiile i limitrile testelor pentru genele reporter
Aplicaiile testelor de gene reporter Probleme i limitri

Identificarea agonitilor GPCR Aparatura sensibil pentru msurtori


Studii farmacologice pe celulele vii Dezvoltarea unui sistem de testare adecvat
Identificarea cilor mesagerilor secunzi de Transfecia celulelor
la receptor la nucleu
Screening de medicamente de mare Nu toate sistemele sunt disponibile
capacitate comercial
Identificarea receptorilor orfani i a
liganzilor

Cu toate acestea, interpretarea datelor din testele pentru genele reporter


necesit unele precauii. Testele pentru genele reporter necesit o incubaie de 4-6 h
pentru exprimarea produsului genei reporter i expunerea la unii agoniti ai GPCRs
pentru aceast perioad de timp determin desensibilizarea receptorilor i pot induce
o schimbare a valorii EC50.
De asemenea expresia bazal a produsului genei reporter poate determina o
serie de probleme. Pentru a nltura acest impediment, celulele trebuie s fie
investigate pentru expresia lor endogen i o gen reporter potrivit trebuie s fie
selectat. Avnd n vedere c produsul genei reporter este punctul final al ntregii
cascade de semnalizare, exist de asemenea multe posibiliti pentru interferene cu
cile de semnalizare de la alte surse. De exemplu, activitatea reporterului CRE poate
fi, de asemenea, activat de ser. Ligandul poate activa n aval ali componeni ai
cascadei de semnalizare care pot influena citirea reporterului. Cercetatori trebuie s
fie contieni de aceste probleme care pot fi detectate prin feed-back negativ.
n concluzie, teste de gene reporter sunt instrumente valoroase pentru
investigarea GPCRs. Aceste teste sunt rapide, sigure, comode, simple i ieftine.
Determinarea activitii ligandului este posibil i aceste teste reprezint un ajutor
extraordinar n cutarea continu de noi medicamente.

26

S-ar putea să vă placă și