Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
1
3.1.1. Receptorii cuplai cu canale ionice
Una din clasele de receptori de suprafa celular sunt receptorii cuplai cu
canale ionice, cunoscui, de asemenea, ca i canale ionice dependente de ligand
(LGICs). Aceti receptori sunt diferii de receptorii cuplai cu proteine G (GPCRs) i
sunt implicai n semnalizarea sinaptic rapid prin circulaia ionilor prin canalele cu
poart controlate de neurotransmitori. De obicei, canale ionice cu poart
dependente de ligand sunt nchise n stare de repaus, dar se deschid ca rspuns la
agoniti. Dup activare, canalele implicate se desensibilizeaz spontan. Schimbrile
de potenial membranar produse constituie un semnal care poate fi ulterior prelucrat
de ctre celule receptoare.
n prezent,se cunosc trei superfamilii de canale ionice cu poart dependente de
ligand: superfamilia de receptori nicotinici, familia de receptori glutamatergici i de
receptorii ATP.
Superfamilia de receptori nicotinici este compus din mai multe familii de
receptori, inclusiv receptorii nicotinici pentru acetilcolin, receptorii 5-
hidroxitriptamin (HT)3 pentru serotonin, receptori pentru acidul -aminobutiric
GABAA i GABAc, i receptorii pentru glicin sensibili la stricnin [Chebib M,
2000]. Cei mai studiai i cel mai bine-nelei dintre aceti receptori sunt receptori
GABA i cei pentru acetilcolin. Acetia se consider a fi compui pentamerici ai
subunitilor de proteine i sunt caracterizai printr-un domeniu N-terminal
extracelular mare. Cea de-a doua superfamilie de receptori, receptorii glutamatergici
excitatori sunt abundeni n cele mai multe regiuni ale sistemului nervos central la
mamifere. Din aceast superfamilie fac parte: receptorii pentru N metil- D-aspartat
(NMDA), receptorii pentru acidul propionic -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol
(AMPA) i receptorii kainat [Burnashev N, 2000]. Receptorii nativi conin patru sau
cinci subuniti care sunt asamblai ca homomeri, dublei sau triplete.
Subtipul de receptori ATP P2x sunt membrii ai celei de a treia superfamilii, i au
o distribuie larg n cadrul sistemului nervos central i sistemului cardiovascular.
2
3.1.2. Receptorii de suprafa cu activitate enzimatic
Receptorii cu activitate enzimatic sunt legai de proteinele transmembrane
prin domeniul de legare al ligandului de pe suprafaa exterioar a membranei
plasmatice.
Domeniul lor citosolic fie are o activitate enzimatic intrinsec, fie este asociat
direct cu o enzim. Fiecare subunitate a unui receptor catalitic are doar un domeniu
transmembranar. Cei mai importani receptori din aceast familie sunt receptorii
tirozin kinazici i receptori asociai tirozin kinazei.
Muli receptori cunoscui, cum ar fi receptorii factorului de cretere epidermic
(EGF) [Leof EB., 2000], receptorii pentru insulin, receptorii pentru factorul de
crestere derivat din trombocite (PDGF) i receptorii pentru factorul de cretere al
endoteliului vascular (VEGF) aparin grupului de receptori tirozin kinazici [Simon
MA. 2000].
Aceti receptori sunt singurii cu helixuri transmembranare care dimerizeaz
dup legarea ligandului, excepia fiind cea a receptorului de insulin, ce este deja un
dimer transmembranar [Cruce M, 2000]. Dup dimerizare, are loc autofosforilarea
receptorilor, care determin fosforilarea a mai multor tipuri de molecule de
semnalizare la nivelul resturilor tirozin specifice. De exemplu, activitatea Ras este
stimulat, i, astfel, nivelul de mesager secund crescut moduleaz factori de
transcripie i alte proteine celulare. Receptorii tirozin kinazici joac un rol important
n reglarea metabolismului celular, proliferarea i diferenierea celular.
Receptorii pentru citokine aparin receptorilor asociai tirozin kinazei. Acetia
prezint un domeniu extracelular de legare al ligandului, un singur domeniu
transmembranar i un domeniu intracelular. Domeniul intracelular nu are activitate
catalitic. Receptorii pentru interleukine sunt exemple de receptori asociai tirozin
kinazei. Dup legarea ligandului, o tirozin kinaza asociat cu receptorul este activat
prin fosforilare. Kinazele Src sau Jak sunt exemple de tirozin kinaze de acest tip.
3
Activarea tirozin kinazei are ca rezultat fosforilarea proteinelor cu rol n
transducia semnalului i activarea transcripiei (STAT) care acioneaz ca factori de
transcriere.
Mai mult dect att, receptorii serin/treonin kinazici mai sunt cunoscui sub
numele de receptori cu activitate enzimatic de suprafa, fiind implicai n mai multe
procese celulare, cum ar fi proliferarea, migrarea i diferenierea. Aceti receptori
conin o mic regiune extracelular, un singur domeniu transmembranar i o regiune
citoplasmatic, care acioneaz ca o serin/treonin kinaz. Un reprezentant al acestei
familii [Zhu HJ, 2001.] este receptorul factorului de cretere transformant (TGF)-.
O alt familie de receptori celulari de suprafa cu activitate enzimatic sunt
receptorii pentru guanilil/guanilat ciclaza. Receptorul pentru peptidul natriuretic atrial
este cel mai cunoscut membru al acestei familii i catalizeaz formarea de GMPc.
Efectele majore sunt natriureza, diureza i inhibarea sintezei de aldosteron.
AMPc poate activa protein kinaza A (PKA), care stimuleaz fosforilarea altor
proteine (Fig. 3.1). n plus, se tie c subunitatea a proteinelor G poate activa
proteina activatoare a mitozei (MAP) pe calea MAPK kinazei (Fig. 3.1).
5
Fig. 3.1 Diagrama schematic a cilor de transducie a semnalului de la GPCR i a
diferitelor ci ale mesagerilor secunzi care comunic cu elemente promotor nucleare. (AC,
adenilil ciclaza; CRE, elementul de rspuns la AMPc; proteina de legare CREB; DAG, diacil
glicerol, IP3, inozitol trifosfat; MAPK, protein kinaza mitogen activat; MEK, MAPK kinaza; NF-
AT, factor nuclear al celulelor T activate; NF-AT-RE, elementul de rspuns NF-AT; PKA, protein
kinaza A; PKC, protein kinaza C; PLC, fosfolipaza C; PIP2, fosfatidilinozitol-4 ,5-bifosfat; SRE,
element de rspuns seric; SRF,factor de rspuns seric; TPA, 12-O-tetradecanoilforbol - 13-acetat;
TRE, TPA- elementul de rspuns).
Pe lng cile clasice, exist ci independente de proteina G, ceea ce nseamn
c GPCRs poate activa molecule cum ar fi kinaza 2 legat la semnal extracelular
(ERK) 2 sau STATS fr stimularea proteinei G [Cruce i colab., 2004].
GPCRs au fost clasificai n trei subfamilii: subfamilia rodopsinei (clasa 1),
subfamilia calcitoninei (clasa 2) i subfamilia receptorilor pentru glutamatul
metabotropic (clasa 3) [Beck-Sickinger AG., 1996]. Clasa 1 conine aproximativ 90%
din toi GPCRs i se caracterizeaz printr-un segment N-terminal care este puternic
glicozilat, i dispune de o punte disulfidic caracteristic ntre bucla 1 extracelular i
bucla 2 extracelular. Odorizantele, peptidele i alte molecule mici, precum i multe
glicoproteine se leag de receptorii familiei din clasa 1, cum ar fi receptorii pentru
adrenalin, serotonin sau pentru neuropeptidul Y. Cel mai cunoscut membru din
aceast familie este rodopsina, care confer ntreagii familii numele su. Structura
cristalizat a rodopsinei a fost determinat de ctre Palczewski i colab. (2000).
n principal, hormonii peptidici i neuropeptidele, cum ar fi secretina,
glucagonul i calcitonina se leag de receptorii din familia GPCR din clasa 2. Acetia
6
au un domeniu extracelular N-terminal mare, comun, care conine ase reziduri de
cistein. Cel de-al treilea i, de departe, cel mai mic grup de GPCRs (clasa 3) se
caracterizeaz printr-un domeniu uria N-terminal constituit din dou lobi care se
nchid asemntor plantei Venus flytrap pe ligandul prins. Receptorii pentru
glutamatul metabotropic i receptorii GABAb aparin acestei subfamilii de receptori.
Mai muli receptori pentru liganzii de fungi i de plante au fost, de asemenea,
caracterizai i clasificai n subtipuri speciale. GPCRs sunt proteine cheie n reglarea
fiziologic i funcionarea lor defectuoas determin cteva boli,ale cror mecanisme
au fost elucidate prin studii pe oareci GPCR knockout [Edwards SW i colab.,
2001]. n prezent, GPCRs sunt intele pentru mai mult de 50% din actualii ageni
terapeutici i, ca atare, industria farmaceutic, este interesat foarte mult de
investigarea GPCRs [Sautel M, 2000]. n ceea ce privete dezvoltarea de noi
medicamente, este important s se produc compui foarte specifici care se leag cu
un nalt grad de afinitate i selectivitate de un anumit GPCR. Numai aceste
caracteristici sunt garania eficienei terapeutice n special n ceea ce privete
tolerabilitatea i specificitatea reaciilor adverse.
7
Teste convenionale cu un radiotrasor sunt n general utilizate pentru a
determina afinitatea unui ligand de un receptor. Toate celulele sau membranele
celulare ce exprim GPCRs sunt incubate cu un ligand radiomarcat n prezena
ligandului nemarcat care trebuie investigat. Sunt utilizate o concentraie constant de
radiotrasor i diferite concentraii de ligand nemarcat. Dup ce se ajunge la echilibru,
celulele sau membranele sunt separate de supernatant i radioactivitatea ligandului
radiomarcat legat poate fi msurat cu un aparat de msurare. Radioactivitatea
msurat este proporional cu concentraia de ligand radiomarcat, care se leag de
receptor. Curba de legare poate fi determinat prin utilizarea de concentraii diferite
de ligand nemarcat n prezena unui radiotrasor cu concentraie constant i valoarea
IC50 poate fi obinut i transformat n valoare Ki conform ecuaiei Cheng-Prussof.
Ki reflect afinitatea ligandului pentru GPCR, o valoarea Ki este cu att este mai
mic, cu ct afinitatea este mai mare.
Pentru a determina eficacitatea intrinsec a liganzilor, potenialul lor agonist
sau antagonist, au fost introduse diferite teste care msoar activitatea proteinelor G
sau mesagerilor secundari intracelulari dup legarea de ligand. Mesagerii secundari
investigai depind de receptorii de activare a proteinelor G. Aceste metode sunt de
cele mai multe ori mari consumatoare de timp i foarte costisitoare. Mai nti, este
posibil s se msoare legarea GTP dup activarea receptorilor prin intermediul
ligandului. Celule sau membranele care exprim receptorii sunt incubate n prezena
GTP-ului radiomarcat i ligandului cercetat. Radioactivitatea poate fi msurat dup
separarea celulelor sau membranelor de supernatant. Valorile radioactivitii sunt
corelate cu stimularea receptorilor care sunt asociai cu proteina G.
Testele ELISA convenionale pot fi utilizate pentru a msura mesagerii secunzi
ca: AMPc, GMPc, diacil glicerol sau IP3. Concentraia de AMPc mesager secund
depinde de tipul de protein G activat i poate duce fie la creterea (Gs,) sau fie la
scderea (Gi ) mesagerului secund. Determinarea semnalului de la nivelul celui de-
al doilea mesager este uneori foarte dificil pentru c nu toate celulele exprim optim
proteine G sau mesagerul secund care este imediat degradat. Prin urmare, genele
reporter n combinaie cu promotori speciali i elemente intensificatoare sunt folosite
8
pentru a genera un set nou de tehnici. Dup legarea ligandulului la GPCR, este
modulat concentraia de mesager secund, activitile enzimelor, i prin urmare
legarea factorilor de transcriere de elementele intensificatoare. n consecin, expresia
genelor reporter este dependent direct de activarea GPCR i de calea de transducie a
semnalului activat. Semnalul rezultat este mai stabil i mai uor de cuantificat.
9
n promotori pentru realizarea de sisteme de teste care utilizeaz genele reporter
pentru investigarea GPCRs (Fig. 3.1).
3.3.1. CREB
CREB este implicat n calea AMPc. Dup activarea receptorilor cuplai cu
proteina Gs, care regleaz pozitiv AC, nivel intracelular de AMPc este crescut.
AMPc activeaz proteina kinaza A (PKA), care permite unitii catalitice a PKA s
intre n nucleu unde fosforileaz CREB, pe serin n poziia 133.
CREB fosforilat se leag de elementul intensificator al elementului de rspuns
la AMPc (CRE). Transcrierea genelor linkate este activat dup legarea proteinei de
legare CREB (CBP) la CREB. Stimularea GPCRs cuplai cu Gi scade AMPc
intracelular i determin o reducere a transcripiei genei reporter CRE-linkat.
3.3.2. SRF
Calea MAPK este o cale foarte important de semnalizare pentru receptorii
tirozin kinazici i este necesar pentru fosforilarea SRF. SRF se leag la elementul de
rspuns seric, la situsul de legare ADN prezent, de exemplu, n promotorul c-FOS,
care conduce la transcrierea c-FOS, un alt factor de transcriere. Numai n combinaie
cu factorul complexului ternar (TCF/Elk1), SRF se poate lega la SRE i activa
transcripia genei. Ambii factori de transcripie, SRF i TCF sunt activai prin
fosforilarea MAPK. S-a artat c subunitile ale proteinelor Gi activeaz aceast
cale, via activarea MAPK RAS-dependent. Stimularea MAPK via receptori cuplai
cu Gq are n principal ca rezultat activarea protein kinazei C (PKC) [Cruce M i
colab.,2004].
3.3.4. c-Jun
Factorul de transcripie c-Jun este fosforilat de o protein kinaz, JNK (c-Jun-N-
terminal kinaza), care este un membru nou al familiei MAPK. De asemenea acest
kinaz, fosforileaz factorul de transcripie ATF2. ATF2 i c-Jun constituie un
heterodimer, care se leag de situsul de legare ADN al elementului de rspuns TPA
(TRE) n promotorul c-Jun.
3.3.5. NF-AT
NF-AT este prezent ca factor de transcriere n limfocite i este indus de
stimularea receptorului antigenic. NF-AT este fosforilat i situat n citoplasma
celulelor n repaus. Controlul transcripiei mediat de NF-AT n limfocite este
dependent de semnalizarea simultan prin Ca i MAPK care sunt activate dup
stimularea receptorilor de antigen. Calea Ca activeaz calcineurin fosfataza.
Calcineurina defosforileaz NF-AT i conduce la o translocare nuclear a NF-AT.
Apoi, NF-AT se asambleaz ntr-un complex multimeric cu AP1 i se leag n amonte
la un intensificator major al genei pentru citokina IL-2 dup care are loc transcripia
genei. Izoforme distincte de NF-AT se gsesc la oameni i oareci, care sunt
exprimate n celulele nonlimfoide.
11
transcripie specifici. Alegerea unei gene reporter specifice, depinde de urmtoarele
condiii:
linia de celule utilizat pentru experimente; activitatea endogen din fiecare
celul este diferit i este important s demonstram c linia de celule utilizat
nu exprim gena reporter aleas;
natura experimentului, deoarece trebuie s fie utilizate gene reporter diferite
pentru investigarea dinamicii expresiei genei i a eficienei transfecei n
acelai experiment;
alegerea genei reporter depinde de asemenea, de metoda de detecie.
12
asemenea utilizate pentru investigarea interaciunilor receptor-ligand, n special
pentru investigarea GPCRs.
Sunt cunoscute mai multe gene reporter, de exemplu, cloramfenicol
acetiltransferaza (CAT), -galactozidaza (-Gal), -glucuronidaza, fosfataza alcalin
(AP), fosfataza alcalin secretat (SEAP), -lactamaza, luciferaza i proteina
fluorescent verde (GFP). Avantaje i dezavantajele lor sunt prezentate n tabelul 3.1.
Unele din aceste gene reporter sunt utilizate pentru investigarea GPCRs.
3.4.1. CAT
CAT a fost prima gen reporter utilizat pentru a monitoriza activitatea
transcripional n celule. CAT a fost izolat din Escherichia coli i este o protein
trimeric care este format din trei subuniti identice, fiecare cu o greutate
molecular de 25 kDa [Leslie AG i colab., 1988]. n celulele de mamifere, proteina
CAT este relativ stabil, i fr transfecie nu exist exprimare endogen. CAT are
proprietile necesare pentru a fi utilizat n teste tranzitorii concepute, pentru a
investiga acumularea proteinelor exprimate. Reacia enzimatic natural a CAT,
transferul gruprii acetil de la acetil-CoA la poziia 3-hidroxil a cloramfenicolului,
este utilizat pentru a efectua teste reporter. Acetil-CoA radiomarcat permite
transferul de acetil radiomarcat la substratul de cloramfenicol. Produii formai pot fi
determinai prin separare fizic utiliznd cromatografia n strat subire (TLC). TLC
separ substratul i produsul, radioactivitatea putndu-se observa prin expunerea
plcii de TLC pe filme de radiografie sau prin fosfoimagini. Metoda TLC permite
vizual confirmarea reaciei. Cuantificare este posibil prin rzuirea spoturilor, TLC,
extragerea cu un solvent organic i numrarea probelor cu un dispozitiv de numrare
pe baz de scintilaie. Alte teste izotopice se bazeaz pe extracia organic direct a
celor mai muli produi nepolari. Alternativ, anticorpii mpotriva CAT sunt acum
disponibili i ei permit cuantificarea prin Western blotting sau ELISA.
13
Cloramfenicol -fr expresie endogen n -costuri ridicate pentru
acetiltransferaza celule mamiferelor izotopi i sisteme TLC
(CAT) -confirmarea vizual a activitii -radioactivitate
enzimei -liz celular
-substraturi suplimentare
-Galactosidase -formate de teste variate pentru - teste colorimetrice nu
( -Gal) utilizare cu extract celular foarte sensibile
-uor de testat -activitate endogen n
anumite tipuri de celule
-liz celular
-Glucuronidaza -formate de teste variate -activitate endogen n
celulele mamiferelor
-liz celular
Fosfataza alcalin -formate de teste variate -activitate endogen n
(AP) -uor de testat celulele mamiferelor
-necostisitor - teste colorimetrice nu
foarte sensibile
-liz celular
Fosfataza alkalin - protein secretat -adiie de substrat
secretat (SEAP) -formate de teste variate
-sensibil (teste fluorimetrice)
Luciferaza -rapid i uoar -liz celular
-de mare sensibilitate -adiie de substrat
-fr activitate endogen -protein relativ stabil
Proteina fluorescent -variante GFP pot fi detectate n -cititor fluorescent sensibil
verde aceeai celul
(GFP) -investigaii n celule vii
-autofluorescen (nu necesit
substrat)
3.4.2. -Gal
-Gal este o enzim bacterian bine caracterizat i este compus din patru
subuniti, fiecare cu o greutate molecular de 116 kDa. Cataliza hidrolizei
zaharurilor de -Gal cum ar fi lactoza este raportat ca un test funcional. Activitatea
enzimatic din extractele celulare poate fi analizat cu diferite substraturi speciale,
care s permit cuantificarea activitii enzimei cu un spectrofotometru, fluorimetru
sau luminometru. De asemenea, au fost dezvoltate metode de colorimetrie simpl cu
o-nitrofenil-BD-galactopiranozid (ONPG) sau clorofenol rou BD-galactopiranzoid
(CPRG) [Eustice DC i colab., 1991]. Metodele colorimetrice, care nu sunt foarte
sensibile i au doar o gama dinamic ngust, au fost nlocuite n mare parte cu
metode fluorescente sau luminiscente mai sensibile. Substraturi, cum ar fi -metil
umbeliferil galactozidul i fluorescein digalactozidul (FDG) pot fi folosite pentru
14
teste bazate pe fluorescen, iar 1,2-dioxetanul pentru teste pe baz de luminescen.
Testele reporter cu galactozidaz sunt larg utilizate, n special pentru a monitoriza
eficiena transfeciei.
3.4.3. -Glucuronidaza
-Glucuronidaza este o glicoprotein tetrameric de la E. coli, format din
patru subuniti identice de 68 kDa, localizate n special n mediul acid al lizozomilor.
Enzima nltur rezidurile de acid -glucuronic terminale de la captul neredus al
glicozaminoglicanilor i altor glicoconjugai. Teste colorimetrice ce pot fi detectate
prin spectrofotometrie, au fost elaborate cu scopul de a msur activitatea acestei
enzime. Metodele chemiluminescente au fost create pentru mbuntirea
sensibilitii. -glucuronidaza este de cele mai multe ori folosit pentru investigaii la
plante superioare, i din cauza activitii sale endogene n unele celule de mamifere
[Paigen K., 1989].
3.4.4. AP
AP este o protein relativ stabil i care la pH alcalin defosforileaz o gam
larg de substraturi . Metode spectrofotometrice standard se bazeaz pe hidroliza p-
nitrofenil fosfatului (PNPP) de AP. Acest test este ieftin, rapid i simplu, dar i
lipsete sensibilitatea obinut prin alte metode. O metod bioluminescent n 2 trepte
a fost elaborat cu scopul de a mbunti sensibilitatea. n aceast abordare cu dou
etape, mai nti AP hidrolizeaz d-luciferin-O-fosfatul la d-luciferin, care servete n
cea de a doua etap ca un substrat pentru luciferaz. Dei sensibilitatea este mult mai
mare, manipularea este mai puin convenabil. Ca o alternativ a fost dezvoltat o
metod chemiluminescent pentru detecia AP ntr-o singur etap [Schaap A, 1989].
3.4.5. SEAP
SEAP este o form mutant de AP placentar uman, creia i lipsesc 24 de
aminoacizi la captul C-terminal al proteinei. Eliminarea acestor aminoacizi
mpiedic ancorarea enzimei la membrana plasmatic, i, n consecin, este secretat
15
de celule i poate fi detectat prin prelevarea de probe din mediu de cultur [Berger J
i colab., 1988]. Celule rmne intacte i viabile pentru experimente ulterioare. SEAP
poate fi uor detectat prin hidroliza p-nitrofenol fosfatului, care determin o
schimbare de culoare. Aceast modificare poate fi cuantificat. Metodele
chemiluminescente pot fi, de asemenea, utilizate n plus fa de metodele
colorimetrice. Un avantaj major al SEAP este stabilitatea la cldur a enzimei i la L-
homoarginina fosfataz inhibitoare. Prin urmare, celulele lizate pot s fie tratate cu
cldur sau L-homoarginin pentru a inactiva activitatea bazal a AP , n celule n
care poate a intrat n mediul de cultur. Astfel, activitatea bazal observat cu sisteme
reporter AP este, n principal, eliminat cu sistemul SEAP. Asocierea de proteine
reporter secretate, cu activitate de fond puin endogen, precum i cu o varietate
larg de teste uoare i sensibile fac din SEAP un sistem convenabil i flexibil.
3.4.6. -lactamaza
Proteina lactamaza (penicilin amido- -lactamhidrolaza) este o protein
monomeric de 29-kDa, izolat din E. coli. Aceast enzim are activitate esterazic i
funcia sa natural este clivarea ampicilinei i altor antibiotice, de exemplu, penicilina
i cefalosporina. lactamaza este produs industrial n trei forme: secretat,
citosolic i asociat membranei plasmatice [Moore JT i colab., 1987]. n
consecin, activitatea enzimei poate fi analizat din extracte celulare sau, atunci cnd
este secretat, direct din mediu. Metode colorimetrice sunt aplicate pentru
msurtori, de exemplu pentru substraturi ca nitrocefin sau (PADAC) [acid 3 -(2,4-
dinitrostiril)-(6R, 7R)-7-(2-tienilacetamido)-cef-3-em-4-carboxilic] i schimb
culoarea dup reacia cu -lactamaza. Activitatea enzimei cu PADAC ca substrat este
monitorizat prin scderea absorbanei la 570 nm i cu nitrocefin prin creterea
absorbanei la 570 nm. Recent, un substrat fluorescent foarte sensibil pentru
-lactamaz a fost dezvoltat ca un ester membranar permeabil, care ar putea fi aplicat
pentru a monitoriza expresia genei la o singur celul vie. Acest substrat fluorogenic
CCF2/AM este o cefalosporin derivat, ataat la doi fluorofori. n cazul n care
substratul fluorogenic este intact, fluorescena cu transfer de energie prin rezonan
16
(FRET) apare ntre cei doi fluorofori [Zlokarnik G i colab., 1998]. n cazul n care
substratul este de clivat de ctre -lactamaz, cele dou pri fluorescente ale
moleculei sunt separate i efectul FRET este ntrerupt. Schimbarea lungimi de und
rezultat este detectabil n suspensie celular folosind sortarea celular pe baz de
fluorescen, n monostraturile celulare utiliznd cititoare de plci conveninale iar n
celule individuale utiliznd microscopia confocal. Tehnicile de gene reporter cu
-lactamaz sunt foarte sensibile, la utilizarea acestui substrat fluorogenic, dar i
costisitoare.
3.4.7. Luciferaza
Luciferaza se refer la o familie de enzime care catalizeaz oxidarea de
substraturi diferite ca luciferina i coelenterazina, ceea ce conduce la emisie de
lumin. Lucifereazele cunoscute sunt luciferaza bacterian, luciferaza Firefly
(Photinus pyralis) (firefly = gndac nocturn din America tropical care produce
lumina, corpul este luminiscent datorita organelor abdominale), i mai recent,
luciferaza renilla din panseaua de mare bioluminiscent, Renilla reniformis.
Luciferazele bacteriene sunt, n general, proteine dimerice labile termic. n
consecin, aplicarea lor ca gene reporter n celulele de mamifere este limitat.
Cea mai cunoscut luciferaz este luciferaza firefly. Acest enzim de 60kDa, o
monooxigenaz, catalizeaz o reacie utiliznd D-luciferin i ATP, n prezena
oxigenului i Mg, conducnd la emisie de lumin [Branchini BR i colab., 2001].
Valoarea total a luminii msurate ntr-un anumit interval de timp este proporional
cu activitatea luciferazei din prob. Structura cu raze X a acestei luciferaze,
descoperit n 1996, a evideniat c arginina din pozitia 218 constituie situsul de
legarea al luciferinei. Mai recent, au fost dezvoltai reactivi care prelungesc timpul
de njumtire a flash-ului. Prelungirea luminii produse crete sensibilitatea testului
i asigur o mai mare durat de njumtire a luminiscenei i, astfel, o perioad mai
lung de msurare.
Luciferaza din R. reniformis [Lorenz WW i colab., 1996] catalizeaz oxidarea
coelenteramidei i este de cele mai multe ori folosit n formate de testare cu
17
luciferaze duale. Aceste teste permit msurarea ambelor luciferaze firefly i renilla
din acelai extract celular. Prin urmare, luciferaza firefly poate fi folosit ca gen
reporter i luciferaza renilla ca un standard intern pentru a cuantifica eficienei
transfeciei [Parsons SJ i coalb., 2000]. Luciferaza firefly, este utilizat de cele mai
multe ori pentru studiul reglrii promotorului i efectelor reglatoare ale agenilor ce
cresc AMPc. n prezent, luciferaza rmne n continuare reporterul ales pentru
msurtorile dinamice ale expresiei genelor, datorit sensibilitii nalte i duratei de
njumtire a vieii, relativ scurt. Aceasta a permis, de exemplu, investigarea
ritmurilor circadiene la plante. Mai mult dect att, tehnici de gene reporter cu
luciferaza firefly au fost generate pentru investigarea GPCRs i pentru identificarea
receptorilor agoniti i antagoniti. Acest sistem este foarte popular n industria
farmaceutic i este utilizat pentru HTS.
18
n ultimii ani, mai multe proteine de fuziune cu GFP au fost construite pentru a
investiga proteinele de transport i localizarea lor [Welsh S, 1997]. Imaginea
expresiei genei este uor de realizat datorit proprietilor GFP [Chalfie M, 1994].
Dezvoltarea GFP i a variantelor sale spectrale permit urmrirea simultan a
diferitelor proteine la celulele vii. Mai mult, investigarea interaciunii protein-
protein este posibil cu ajutorul tehnicii FRET, pentru c GFP i variantele sale pot
fi utilizate ca perechi FRET [Sorkin A, 2000].
S-au efectuat experimente cu proteine de fuziune GFP pentru a investiga
reglarea GPCR. GFP a fost de asemenea utilizat pentru a genera sisteme de teste de
gene reporter pentru investigarea GPCRs. Dinger i Beck-Sickinger (2002) au
identificat agonitii i au determinat afinitatea ligandului.
19
transcripia genei reporter. n consecin, calea pentru GPCR studiat trebuie s fie
cunoscut (Fig. 3.1).
Dezavantajul promotorilor naturali, cum ar fi c-FOS este c trebuie s conin
situsuri de legare pentru un numr de factori de transcripie i, astfel, reglarea unor
astfel de promotori depinde de mai muli factori de transcripie. Cu scopul de a
genera teste pe baz de gene reporter pentru o singur cascad de semnalizare, au fost
construii promotori sintetici care conin numai un singur tip de situsuri pentru
legarea factorilor de transcripie. Secvenele promotorilor sintetici cele mai cunoscute
pentru investigarea GPCRs cuprind: elemente CRE, elemente SRE, elemente TRE i
elementul intensificator NF-AT; promotorul natural c-FOS, situsul de legare AP1 i
secvena activatoare GAL4 . Datele publicate demonstreaz c luciferaza este cea mai
popular gen reporter pentru investigarea GPCRs. n plus, punerea n practic a -
lactamazei i SEAP este, de asemenea, posibil. Recent, a fost prezentat o GFP ca
gen reporter pentru investigarea GPCRs , care prezint unele avantaje fa de alte
gene reporter menionate.
20
Fig. 3.2. Sisteme de teste bazate pe gene reporter ce utilizeaz elemente CRE i
luciferaza pentru investigarea GPCRs. Celulele ce coexprim GPCR, cuplai fie cu Gs, fie cu
Gi au fost incubate cu ligandul. Dup ce are loc stimularea sau inhibarea AC se produce o cretere
sau respectiv, o scdere a AMPc. O cretere a nivelului de AMPc conduce la activarea PKA, care
activeaz prin CREB fosforilarea. Forma fosforilat a CREB interacioneaz cu elemente CRE.
Ulterior, este iniiat transcripia luciferazei. Pentru investigarea receptorilor cuplai cu Gi, celulele
trebuie s fie incubate cu ligandul n prezena forskolinei. Luciferaza este exprimat n citoplasm,
i activitatea poate fi msurat dup liza celulelor i adugarea substratului, de exemplu luciferin
luciferaza. O activitate mare a luciferazei cauzeaz o luminiscen puternic. Activitatea luciferazei
poate fi corelat cu activitatea ligandului care activeaz GPCR. (AC, adenilil ciclaza; CRE,
elementul de legare AMPc; CREB, proteina de legare CRE; G, proteina G.)
Himmler i colab. (1993) a utilizat sisteme de teste pe baz de gene reporter cu
CRE i luciferaza pentru a investiga receptorii dopaminergici D1 i D5 la om, ambii
receptori fiind cuplai cu Gs. Ei au observat o cretere a expresiei luciferazei dup
stimularea cu forskolin sau cu agoniti ai dopaminei.
Identificarea compuilor agoniti sau antagoniti a fost o reuit. Un test
similar a fost aplicat pentru investigarea comportamentului de legare a diferiilor
liganzi de serotonin, receptori 5-HT1B i receptori C1A de calcitonin [George SE i
colab., 1997].
21
De asemenea, luciferaza n asociere cu CRE este folosit n industria
farmaceutic pentru realizarea unor screeninguri de mare capacitate (HTSs). Punerea
n aplicare a acestui sistem a fost raportat de diferite grupuri care au stabilit teste
pentru investigarea rapid i sensibil a receptorilor cuplai cu Gi i Gs. Testele
pentru screeningurile de mare capacitate sunt realizate de cele mai multe ori n
microplci.
Cu scopul de a investiga receptorii cuplai cu Gs, Gi i Gq prin acelai
sistem de teste, elemente CRE au fost combinate cu elemente MRE. De asemenea,
acest sistem permite investigarea receptorilor cuplai cu Gq [Fitzgerald LR i colab.,
1999]. Aceast regiune promotor poate rspunde la creterea intracelular de calciu,
pentru a stimula PKC i pentru a schimba nivelurile de AMPc. Rspunsul poate fi
msurat prin creterea sau scderea activitii luciferazei, i este util pentru
caracterizarea farmacologic a agonitilor i antagonitilor. Parsons i colab. (2000)
au utilizat luciferaza firefly i renilla n asociere cu CREs pentru investigarea
receptorilor factorilor 1 i 2 umani de eliberare a corticotropinei (CRFR1 i CRFR2).
De asemenea s-a reuit identificarea agonitilor i antagonitilor.
n scopul de a investiga receptorii a cror ci de transducie a semnalului
modific nivelul intracelular de AMPc sau nivelurile IP3/DAG, s-a fost folosit ca
sistem pentru testele celulare o gen, luciferaza cu elemente TRE ca promotor. Acest
sistem a permis caracterizarea receptorilor diferitelor neurokinine NK1, NK2 i NK3.
Mai mult dect att, un alt sistem ce folosete luciferaza i elemente TRE a fost
dezvoltat pentru de screeningul liganzilor [Kotarsky K i colab., 2001]. Sistemul a
fost, de asemenea, cuplat cu GFP, n scopul de a selecta celulele care exprim stabil
sistemul reporter. Aceste celule au fost folosite pentru investigarea GPCRs. Agonitii
i antagonitii receptorilor hormonului de eliberare a gonadotropinei (GnRH
receptorii) au fost investigai cu succes, cu un sistem de teste bazat pe gene reporter
pentru luciferaz n combinaie cu promotorul C-FOS. Receptorii GnRH sunt cuplai
la calea inozitol-fosfolipid i, dup activarea receptorului, transcripia genei
luciferaza este indus de promotorul c-FOS.
22
3.5.2 Utilizarea altor gene reporter pentru investigarea GPCRs
De asemenea s-a raportat utilizarea lactamazei i SEAP pentru investigarea
GPCRs. Xing i colab. (2000) au realizat un sistem de teste bazat pe gene reporter cu
lactamaza ca gen reporter, n combinaie cu promotorul NF-AT [Xing H i colab.,
2000] i l-a folosit pentru a investiga GPCRs care sunt cuplai cu proteinele Gq.
Schimbarea concentraiei mesagerului secund ar putea fi detectat prin creterea
expresiei lactamazei. Pollok i colab. (1999) a folosit, de asemenea, acest sistem,
pentru a investiga receptorii cuplai cu proteina Gi. Pentru a efectua aceste teste,
semnalul proteinei Gi a fost convertit n semnal de la protein Gq i activitatea
lactamazei a putut fi msurat.
Liganzi DP i PE pentru receptorii prostanoizi GPCRs au fost caracterizai prin
tehnica CRE-SEAP [Durocher Y i colab., 2000]. Activarea receptorilor ar putea fi
detectat prin schimbarea nivelurilor intracelulare ale SEAP. Un dezavantaj important
de msurare a activitii luciferazei i lactamazei l constituie necesitatea de a
pregti extracte de celule i de a aduga un substrat. Aceste celule nu pot fi utilizate
pentru o analiza ulterioar, iar prepararea celulelor lizate este consumatoare de timp,
adiia unui substrat putnd perturba sistemul celulelor sensibile. n consecin, un
sistem de teste pe baz de gene reporter cu elemente CRE i GFP ca gen reporter a
fost dezvoltat pentru investigarea GPCRs pentru celule vii (Fig. 3.3). Avantajul
acestui sistem l constituie faptul c adugarea substratului nu este necesar i nu
necesit liza celulelor.
23
Fig. 3.3. Sisteme de teste bazate pe gene reporter utiliznd GFP i CREs pentru
investigarea GPCRs. Cu ajutorul vectorului de gen reporter ce conine GFP i CRE are loc
transfecia n celulele care exprim o GPCR, fie o Gs sau Gi cuplat. Dup legarea ligandului
este indus stimularea sau inhibarea AC, ceea ce determin o cretere sau o scdere a AMP. O
cretere a nivelului de AMPc duce la activarea PKA care activeaz CREB prin fosforilare. Forma
fosforilat a CREB se leag acum la elementele CRE. n consecin, transcripia GFP este iniiat.
Pentru investigarea receptorilor cuplai cu Gi, celulele trebuie s fie incubate cu un ligand n
prezena forskolinei. GFP este exprimat n citoplasm i poate fi msurat n mod direct n celule
n via, folosind un cititor de fluorescen. Liza celulelor sau adiia substratului nu este necesar
(AC, adenilil ciclaza; CRE, elementul de legare AMPc; CREB, proteina de legare CRE; G, proteina
G; GFP, proteina verde fluorescent)
25
Tabelul 3.2 Aplicaiile i limitrile testelor pentru genele reporter
Aplicaiile testelor de gene reporter Probleme i limitri
26