UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
INFORME #
TTULO:

INTEGRANTES:

20131213 Ferrer Chvez, Ana

20121256 Jara Blas, Lucero

Pastrana Casas, Daniel

20131240 Rojas Guerra, Gonzalo

20140328 Velsquez Quispe, Laura

MESA:

NMERO 4

2016
1. INTRODUCCIN

2. MARCO TEORICO

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es

observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio.
El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el
crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial, ste debe
reunir una serie de condiciones tales como: temperatura, grado de humedad y presin de
oxgeno adecuadas, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de
cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar
exento de todo microorganismo contaminante.

Clasificacin de medios de cultivo:

o Segn su estado fsico:
Lquidos
Usualmente se denominan caldos ya que contienen los nutrientes disueltos en
agua. Permiten obtener suspensiones con un elevado nmero de
microorganismos. Ej. Caldo nutritivo.

Slidos
Se pueden preparar a partir de medios lquidos a los cuales se les aaden
agentes solidificantes como agar, gelatina o slica gel. Se utilizan con
frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los microorganismos en el
laboratorio. Ej. Agar nutritivo.
100 C, lo que permite su uso para la inmensa mayor a de los
microorganismos, que son mesfilos.

Segn la naturaleza de sus constituyentes:

Medios naturales, complejos o indefinidos

Estn constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal y
usualmente se complementan con el aadido de minerales y otras sustancias.
No se conocen todos los componentes del medio de cultivo, ni las cantidades
exactas en que estn presentes. Este tipo de medio es el ideal para cuando
simplemente se pretende obtener un buen crecimiento microbiolgico, ya que
su confeccin es fcil y rpida (Basta pesar una cierta cantidad del extracto
desecado, suministrado por casas comerciales, disolverlo en agua y esterilizar
en autoclave). Ej. Extracto de carne, extracto de levaduras.

Medios sintticos
Se preparan a partir de ingredientes qumicamente puros y por lo tanto se
puede conocer exactamente su composicin cuali y cuantitativa. Por su costo
slo se emplean en procedimientos especiales.

Medios mezcla de los anteriores

 Denominado medio semisinttico, llevan algunas sustancias qumicas cuya
naturaleza y cantidad se conoce, junto con sustancias de naturaleza y
composicin indefinida.

Segn sus propsitos de uso:

Medios de enriquecimiento
Se llama enriquecimiento a cualquier cultivo en medio lquido que resulte en un
incremento en el nmero de un tipo dado de microorganismo en relacin con el
nmero de otros tipos de microorganismos que puedan estar en el inculo.

Un medio de enriquecimiento puede contener sustancias que favorezcan el

crecimiento del microorganismo que nos interesa o que inhiban el crecimiento
de los otros tipos de microorganismos presentes. La selectividad de un cultivo
de enriquecimiento no est determinada nicamente por la composicin
qumica del medio usado, sino que en un medio dado puede ser variada
significativamente modificando otros factores tales como: temperatura, pH,
fuerza inica, iluminacin, aireacin, etc.

Ej. Caldo tetrationato utilizado para el enriquecimiento de las especies del

gnero Salmonella provenientes de muestras de heces, orina, agua o
alimentos.

Medios selectivos
Son bsicamente iguales a los de enriquecimiento, se diferencian por ser
medios slidos y estn diseados para el aislamiento de microorganismos
especficos. Ej. Agar desoxicolato citrato utilizado para el aislamiento de
patgenos entricos.

Medios diferenciales
No contienen sustancias inhibidoras, es decir, permiten el crecimiento de
muchos tipos de microorganismos, pero s contienen indicadores de productos
derivados de la actividad metablica de los microorganismos sobre algunos de
los componentes del medio. Se utilizan para la identificacin de los
microorganismos.

Ej.: Agar base rojo fenol utilizado para detectar fermentacin de carbohidratos.

Medios selectivos diferenciales

A veces se combinan en un mismo medio las caractersticas de ser selectivo y
diferencial.
Por ejemplo, el agar Mac Conkey, este medio contiene sales biliares y cristal
violeta, que inhiben el crecimiento de las bacterias gram positivas. Pero como
tambin contiene lactosa y un indicador de pH permite distinguir entre las
bacterias fermentadoras de lactosa y las que no lo son.
CONSTITUYENES HABITUALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

AGAR. Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. En el agar
bacteriolgico el componente dominante es un polisacrido que se obtiene de ciertas algas
marinas y que presenta la indudable ventaja de que a excepcin de algunos microorganismos
marinos, no es utilizado como nutriente. Un gel de agar al 1-2% se licua alrededor de los
100C y se gelifica alrededor de los 40C, dependiendo de su grado de pureza.
EXTRACTOS. Su preparacin consiste en que ciertos rganos o tejidos animales o vegetales
(p.e. carne, hgado, cerebro, semillas, etc.) son extrados con agua y calor y posteriormente
concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son a
menudo empleados en la elaboracin de los medios de cultivo. Los ms utilizados son el
extracto de carne, de levadura y el de malta.

PEPTONAS. Son mezclas complejas de compuestos orgnicos, nitrogenados y sales

minerales, que se obtienen por digestin enzimtica o qumica de protenas animales o
vegetales (soja casena carne, etc.). Las peptonas son muy ricas en ppticos y aminocidos,
pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales minerales.

FLUIDOS CORPORALES. Con frecuencia es necesario aadir a los medios de cultivo de

algunos patgenos sustancias como sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero
sanguneo, sobre todo para conseguir el primer aislamiento a partir del hospedador. La sangre
no puede ser esterilizada, y por tanto debe de ser obtenida en condiciones aspticas
directamente de un animal sano, y adicionada al medio de cultivo despus de que este haya
sido auto clavado. Los fluidos corporales no solo aportan factores de crecimiento sino que
tambin aportan sustancias que neutralizan a inhibidores del crecimiento de algunas bacterias.
Un ejemplo podra ser la catalasa presente en las clulas sanguneas destruye el perxido de
hidrgeno que algunas bacterias que no poseen este enzima acumulan como producto del
metabolismo del oxgeno.

SISTEMAS AMORTIGUADORES. Para mantener el pH dentro del rango optimo del

crecimiento bacteriano a veces, es necesario aadir algunos componentes al medio de cultivo.
Debido a que la mayora de as bacterias son neutrfilas, se suelen emplear sales del tipo de los
fosfatos bisodicos bipotsicos u otras sustancias como las peptonas para prevenir la
desviacin del pH.

INDICADORES DE PH. Con el objeto de poder detectar variaciones en el pH debido a

fermentaciones u otros procesos, se hace necesario a veces aadir indicadores acido-base que
nos lo indiquen.

AGENTES REDUCTORES. Con el objetivo de crear en los medios de cultivo condiciones que
permitan el desarrollo de los grmenes microaerofilos anaerobios se aaden estos agentes
reductores siendo, los mas empleados la cisteina y el tioglicolato entre otros.

AGENTES SELECTIVOS. La adicin de determinadas sustancias a un medio de cultivo puede

convertirlo en selectivo. As, por ejemplo, la adicin de cristal violeta, sales biliares, azida
sodica, telurito potasico, antibiticos, etc., a la concentracin adecuada har que acten como
agentes selectivos frene a determinados microorganismos.

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

En la actualidad, la mayora de los medios de cultivo se encuentran comercializados;

normalmente bajo la forma de liofilizados a los que es preciso rehidratar. En estos casos la
preparacin del medio de cultivo se reduce sencillamente a pesar la cantidad deseada del
mismo y disolverla en agua destilada siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias
termolbiles, se esterilizan por filtracin y se aaden al resto de los componentes despus de
que estos hayan sido previamente esterilizados en el autoclave y enfriados a temperatura
ambiente a 40-50C si se trata de medios con agar.

Antes de su esterilizacin los medios lquidos se reparten en los recipientes adecuados (tubos,
matraces, etc.). Si es un medio slido y se ha de distribuir en tubos en matraces ser
necesario fundir el agar en bao Maria u horno microondas, una vez fundido y homogenizado,
se distribuye en caliente a los tubos matraces (no en placas Petri) se tapa y se esteriliza en el
autoclave.

3. PROCEDIMIENTO

3.1. Materiales:

Agua destilada Algodn, gaza Balanza

Erlenmeyers Esptulas Marcador de vidrio

3.2. MTODOS

A) CALDO NUTRITIVO (extracto de carne, 0.3% y peptona, 0.5%)

1. Utilizando un trozo de papel aluminio pese cuidadosamente la cantidad de medio

deshidratado suficiente para preparar 100ml de caldo nutritivo.
2. Coloque el polvo en un erlenmeyer de 250ml limpio y seco, agregue cuidadosamente el
agua destilada medida en la probeta.
3. Mezcle la preparacion con movimientos giratorios hasta la completa disolucion.
4. Elabore tampones de algodn para 15 tubos.
5. Distribuya el medio liquido con una pipeta graduada a razon de 5ml en cada tubo.
6. Coloque en los tubos los tapones de algodn evitando que queden flojos o muy
compactos.
7. Disponga los tubos en un contenedor resistente al calor, envulvalos con papel,
identifiquelos con el nombre del medio, la fecha de preparacin y el nombre de la persona
responsable de la elaboracin.
8. Esterilice los tubos con medio en autoclave a 121C (15lb de presin) durante 15
minutos.

B) AGAR NUTRITIVO (extracto de carne, 0.3%; peptona, 0.5%; agar, 1.5%)

1. Prepare 200ml de caldo nutritivo. (Repita los pasos 1, 2 y 3 del rocedimiento anterior con
la correcion en el peso para la nueva cantidad solicitada y en el erlenmeyer a usar, debe
tener unas tres veces el volumen que tendr el medio).
2. Agregue 3g de agar y lleve a licuar en bao de agua en ebullicion hasta que el medio
luzca transparente a la luz.
3. Elabore tapones de algodn para 16 tubos.
4. Una vez licuado en el medio, dejalo enfriar ligeramente y distribuyalo en los tubos con
una pipeta graduada. Prepare 6 tubos con 12ml y 10 tubos con 7ml.
5. Repita los pasos 6, 7 y 8 de proceso anterior.
6. El medio restante debe ser acondicionado para su esterilizacion junto a lo anterior.

C) AGAR MAC CONKEY (peptona, 1.7%; proteosa-pentona, 0.3%; lactosa, 1%; sales
biliares, 0.15%; NaCl, 0.5%; agar, 1.5%; rojo neutro, 0.003%; cristal violeta, 0.0001%)

D) AGAR MANITOL SALADO (extracto de carme, 0.1%; proteosa-peptona, 1.0%; NaCl,

7.5%; manitol, 1.0%; agar, 1.5%; rojo fenol, 0.0025%)

1. Pese cuidadosamente la cantidad de medio deshidratado necesario para preparar 100ml

de cada uno. Observando la formulacion de cada medio comprobara que los pesos a
realizar son distintos.
2. Coloque el polvo de cada medio en erlenmeyers de 250ml y llevelos a licuar en baos
de agua caliente hasta la completa disolucion del agar.
3. Elabore tampones de algodn para cada erlenmeyer. Luego de colocarlos cubra los
recipientes con papel e identifique el material con el nombre del medio, fecha de
elaboracion y el nombre de la persona responsable de su preparacion.
4. Esterilice en autoclave.

E) AGAR ALMIDON (peptona, 1%; K2HPO4, 0.5%; almidon, 0.3%; agar, 1.5%)

1. Pese cuidadosamente el almidon necesaria para preparar 100ml de medio.

2. Coloque el polvo en un erlenmeyer de 250ml con un volumen pequeo del agua destilada
que ha metido en la probeta.
3. Caliente el recipiente con el almidon agitando constanteente hasta su disolucin.
4. Pese el resto de los ingredientes y agreguelos con la cantidad de agua destilada restante.
5. Licue el medio al bao de agua caliente hasta la completa disolucion del agar. Deje
enfriar ligeramente y ajuste el pH.
6. Coloque en el erlenmeyer un tapon de algodn a la medida, cubra con papel, identifique
el material y esterilice en autoclave.

F) AGAR GELATINA ( peptona, 0.1%; extracto de levadura, 0.3%; gelatina, 0.4%; agar,
1.5%)

1. Pese cuidadosamente el almidon necesaria para preparar 100ml de medio.

2. Coloque los ingredientes en un erlenmeyer de 250ml y agregue agua destilada medida
en probeta.
3. Lleve el recipiente a licuar en bao de agua en ebullicion hasta la completa disolucion
del agar. Deje enfriar ligeramente y ajuste el pH a 7.0.
4. Acondicione su medio para esterilizacion como en los procedimientos anteriores.
4. DISCUCIONES
En la prctica se prepararon diversos medios de cultivo, como el Caldo Nutritivo, Agar nutritivo,
Agar Mac Conkey, Agar Manitol Salado, Agar Almidn y Agar Gelatina.

Se prepar toda esta diversidad de medios de cultivo pues cada uno al diferir en sus
componentes tambin se diferenciaba en aplicacin. Cada medio de cultivo presentaba
ingredientes requeridos por un microorganismo para que produzcan ms como l.

Segn Sagardoy & Tandolesi (2004), el Agar Nutritivo y el Caldo Nutritivo son usados para
multiplicar grmenes poco exigentes, especialmente en la investigacin bacteriolgica de
aguas potables, aguas de uso industrial, aguas residuales, alimentos y productos estimulantes
entre otros. Estos dos medios de cultivo tienen otras aplicaciones, tales como: uso en cultivo y
conservacin de cepas, determinacin de sensibilidad y resistencia a antibiticos,
comprobacin de la esterilidad entre otros.

As mismo, Negroni (2009) afirma que casi todas las bacterias hetertrofas crecen mejor en
medios de cultivo complejos en los que es difcil conocer la cantidad exacta de cada compuesto
qumico. De esta manera, estos medios de cultivos particulares responden a necesidades
nutricionales particulares.

Nuestro grupo fue en encargado de preparar el Agar Manitol Salado el cual presento coloracin
roja en el medio de cultivo preparado.

En el medio de cultivo, el extracto de carne, la peptona de carne y la triptena, constituyen la

fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y minerales que promueven el desarrollo microbiano.
El manitol es el hidrato de carbono fermentable. El cloruro de sodio (que se encuentra en alta
concentracin) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompaante, el rojo
fenol es el indicador de pH y el agar es el agente solidificante.

Las bacterias que crecen en un medio con alta concentracin de sal y fermentan el manitol,
producen cidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo
al amarillo. Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal y pueden o no fermentar
el manitol. Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como
colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color. Los estafilococos que no fermentan
el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o purpura.
Este medio de cultivo es recomendado para el aislamiento de estafilococos patognicos a partir
de muestras clnicas, alimentos, productos farmacuticos, cosmticos y otros materiales de
importancia sanitaria.

CONCLUSIONES:

5. CUESTIONARIOS

5.1. Cules son las ventajas de los medios complejos para el cultivo de
microorganismos?
 Los medios complejos fueron los primeros utilizados, y los ms empleados. Se
preparan a partir de tejidos animales, y ms raramente de vegetales. Su composicin
no est exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto
puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la
reproductibilidad no podr ser exacta. En la prctica corriente estos medios dan
excelentes resultados y son los ms empleados por ser de menor costo que los
medios definidos.

5.2. Por qu no es necesario ajustar el pH en el caldo nutritivo y s lo es en el agar

de almidn?
Esto se debe a que el caldo nutritivo es un medio comn que permite el crecimiento
indiscriminado de todo tipo de microorganismos. Por otro lado, el agar almidn es un
medio especial; ste medio se utiliza para identificar los organismos que degradan el
almidn. El almidn solo puede ser utilizado por los microorganismos que secreten las
enzimas extracelulares necesarias, como la amilasa, para hidrolizarlos y dichas
enzimas trabajan a un pH ptimo alrededor de 7- 7.2, siendo necesario as ajustar el
pH del medio para que puedan actuar.

5.3. Determine la naturaleza qumica y la funcin nutritiva de cada uno de los

ingredientes que contienen los medios que ha utilizado

-Extracto de carne: Constituye una fuente de carbono, nitrgeno, sales inorgnicas y

otros nutrientes muy variados.

-Peptonas: Son protenas degradadas, ricas en nitrgeno y carbono, de fcil

disposicin.

-Cloruro sdico: Proporciona equilibrio osmtico.

-Tampones estabilizantes de pH: Contrarrestan las variaciones de pH por la

acumulacin de los productos resultantes del metabolismo bacteriano.

-Agentes solidificantes: Los contienen los medios slidos y semislidos. El agar es el

ms comn, la gelatina y la albmina se usan escasamente.

-Agentes reductores: Promueven la anaerobiosis. Entre los ms empleados estn:

tioglicolato sdico, cistena, cido ascrbico.

-Azcares: Se adicionan con fines de nutritivos o para investigar la actividad

metablica.

-Extracto de levadura: Es la parte soluble en agua de la autolisis de levadura, que es

cuidadosamente controlada para preservar la forma natural del complejo B.
 Estimulador del crecimiento de bacterias, es utilizado en la preparacin de medios de
cultivo microbiolgicos.

Describa el autoclave y su forma de uso

El aparato de laboratorio diseado para utilizar el vapor de agua saturado bajo presin
regulada, se llama autoclave, Es esencialmente, una cmara equipada con
dispositivos que permiten que sta se llene de vapor y a su vez mantienen la
temperatura y la presin necesarias por el tiempo requerido. En el autoclave, lo que
mata a los microorganismos no es la presin, sino la humedad combinada con la alta
temperatura del vapor. Cuando se opera el autoclave, es absolutamente necesario
que el aire este dentro de la cmara salga y sea totalmente reemplazado por vapor. Si
quedara aire en la cmara, la temperatura que se alcanzara a una presin dada es
menor. Es un quipo esencial en el laboratorio de microbiologa. Medios de cultivo,
soluciones, cultivos que se descartan y el material contaminado se esterilizan de rutina
en ste aparato. (Pelczar, Reid & Chan, 1986)
5.4. Qu otros mtodos de esterilizacin se emplean para medios de cultivo? Qu
ventajas otorgan?
La esterilizacin de los medios es indispensable antes de usarlos, para eliminar todos
los microorganismos presentes en ellos, cuidando que en los recipientes no vuelva a
entrar ningn otro. En esta forma, slo se cultivarn los organismos deseados. La
esterilizacin es un proceso mediante el cual se destruyen todas las formas de vida.
5.5. -Esterilizacin por radiacin (ultravioleta):

Las radiaciones electromagnticas ionizantes son una forma de esterilizacin fsica

muy efectiva pero su manejo se ve restringido por la necesidad de disponer de
instalaciones especiales para la emisin radioactiva. Durante las prcticas se
manejar material adquirido de casas comerciales esterilizado mediante radiacin ,
una radiacin muy penetrante y til para la esterilizacin de material termolbil como
el plstico. La luz ultravioleta (UV) tiene efecto biocida debido a que provoca la
formacin de dmeros de timina en el DNA. Esta radiacin tiene muy baja capacidad
de penetracin por lo que su uso se ve restringido al tratamiento de superficies o a la
esterilizacin del aire en "salas limpias" como los quirfanos o las instalaciones como
las unidades de cultivo celular.

5.6. -Esterilizacin por estufa:

Se mantiene una temperatura estable mediante termostatos de metal denominados de

par bimetlico, consistente en dos metales de distinto coeficiente de dilatacin.
Cuando uno se dilata, el otro no lo hace y se arquea. Uno de los extremos de ste
dispositivo se halla en contacto con un interruptor que corta la alimentacin de la
resistencia calefactora. Ventajas: No es corrosivo para metales e instrumentos.
Permite la esterilizacin de sustancias en polvo y no acuosas, y de sustancias
viscosas no voltiles.
 5.7. -Esterilizacin por tyndalizacin:
Esterilizacin por accin discontinua del vapor de agua, se basa en el principio de
Tyndall Las bacterias que resisten una sesin de calefaccin, hecha en determinadas
condiciones, pueden ser destruidas cuando la misma operacin se repite con
intervalos separados y en varias sesiones. Se efecta por medio del autoclave de
Chamberland, dejando abierta la vlvula de escape, o sea funcionando a la presin
normal. Puede tambin realizarse a temperaturas ms bajas, 56 u 80 para evitar la
descomposicin de las sustancias a esterilizar, por las temperaturas elevadas.
Ventajas: Rpido calentamiento y penetracin, destruccin de bacterias y esporas en
corto tiempo, no deja residuos txicos, hay un bajo deterioro del material expuesto,
econmico.

6. BIBLIOGRAFIA

KONEMAN, E. et al. Diagnostico Microbiolgico. Sexta Edicin. Editorial

Mdica Panamericana. 2008. Argentina. Pginas 861 y 862.
-MADIGAN, M. MARTINKO, J. DUNLAP & P. CLARK, D. (2009) Brock Biologa
de los microorganismos. Madrid, Espaa: Editorial Pearson Prentice Hall.
Duodcima edicin.
-NEGRONI, M. Microbiologa Estomatolgica. Fundamentos y gua de prctica.
Segunda edicin. Editorial Mdica Panamericana. 2009. Argentina. Pgina 51.
-PELCZAR, J.; REID, R. & CHAN, E. (1986). Microbiology. 5ta Edition. New
York, McGraw Hill, 952 pp.
-SAGARDOY, M. & TANDOLESI, M. Biologa del Suelo. Editorial de la
Universidad Nacional del Sur. 2004. Argentina. Pginas 38 y 39.
-STRYER, L; BERG, J.; TYMOCZKO, L. (2008). Bioqumica. Sexta Edicin.
Editorial Reverte. Espaa.